Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Summary

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Abstract

Danio pręgowany stał się potężnym modelem różnych chorób ludzkich i użytecznym narzędziem do coraz szerszego zakresu badań eksperymentalnych, począwszy od podstawowej biologii rozwojowej, a skończywszy na badaniach genetycznych i chemicznych na dużą skalę. Jednak wiele eksperymentów, zwłaszcza tych związanych z infekcjami i modelami ksenoprzeszczepów, opiera się na mikroiniekcjach i obrazowaniu zarodków i larw, które są pracochłonnymi technikami wymagającymi umiejętności i wiedzy. Aby poprawić precyzję i wydajność obecnych technik mikroiniekcji, opracowaliśmy serię mikrostrukturalnych urządzeń do orientacji i stabilizacji zarodków danio pręgowanego po 2 dniach od zapłodnienia (dpf) w orientacji brzusznej, grzbietowej lub bocznej przed zabiegiem. Aby pomóc w obrazowaniu zarodków, zaprojektowaliśmy również proste urządzenie z kanałami, które ustawiają 4 danio pręgowane równolegle na szklanym szkiełku nakrywkowym. Narzędzia, które tutaj prezentujemy, pokazują skuteczność podejść fotolitograficznych do generowania użytecznych urządzeń do optymalizacji technik danio pręgowanego.

Introduction

Danio pręgowany stał się potężnym modelem dla wielu dziedzin, od badań nad podstawową biologią rozwojową po badania genetyczne i chemiczne na dużą skalę^1,2. Rutynowe manipulacje genetyczne, takie jak nadekspresja genów, knockdown, mutageneza CRISPR/Cas9 i transgeneza, opierają się na mikroiniekcji materiału genetycznego do zygoty jednokomórkowej, co doprowadziło do opracowania prostych, łatwych w użyciu, dostępnych na rynku narzędzi do orientacji i stabilizacji komórek jajowych do wstrzyknięcia³. Inne podejścia, takie jak przeszczep i infekcja, często wymagają mikroiniekcji do zarodków ....

Protocol

Mikroiniekcja larw została zatwierdzona przez Podkomitet Szpitala Ogólnego Massachusetts ds. Badań nad Zwierzętami na mocy Protokołu 2011N000127.

1. Produkcja urządzeń

UWAGA: Wszystkie pliki CAD używane do projektowania opisywanych tutaj masek fotolitografii (Rysunek 1) są dostępne do pobrania. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać linki.

1. Wyprodukuj płytkę wzorcową w pomieszczeniu czystym klasy 1,000 przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych⁷. W przypadku układów i kanałów mikrostrukturalnych należy sekwencyjnie ułożyć neozystor na bazie ....

Results

Opisane tutaj podejście demonstruje projektowanie (Rysunek 1) i produkcję urządzeń do użytku z 2 dpf danio pręgowanego, przy użyciu technik fotolitograficznych (Rysunek 2) i miękkich litografii (Rysunek 3). Metoda ta pozwala na szybkie testowanie wielu iteracji i modyfikacji projektu, a zmiany i optymalizacja wymiarów mikrostruktury do stosowania z danio pręgowanym na innych etapach rozwoju może rozszerzyć ich.......

Discussion

W tym miejscu opisujemy zastosowanie urządzeń, które niedawno opracowaliśmy, aby ułatwić mikroiniekcję danio pręgowanego z 2 dpf⁵ i wprowadzamy proste urządzenie montażowe bez agarozy do wygodnego obrazowania zarodków. Narzędzia te podkreślają użyteczność technik fotolitograficznych do wytwarzania urządzeń przydatnych w technikach grybowanych.

Odkryliśmy, że urządzenia MSA są szczególnie przydatne do wstrzykiwania komórek lub cząstek podatnych na agregację w igle do mik.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polidimetylosiloksan (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0,5KG	Do odlewania urządzeń. Zestaw zawiera monomer PDMS i inicjator
Agaroza o niskiej temperaturze żelowania	Sigma Aldrich	A9414-10G	Do odlewania urządzeń agarozowych
PFDTS silan	Sigma	Aldrich 448931-10G	Do odlewania ujemnych form PDMS
Tricaine (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	Do znieczulania danio pręgowanego
Rodamina Dekstran 70 000 Da	ThermoFisher	D1818	Do śledzenia mikroiniekcji
Leukotrien B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Chemoatraktant neutrofili
N-formylometyno-leucylo-fenyloalanina (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Chemoatraktant neutrofili
15 cm szalka Petriego	Fisher scientific	08-757-148	Do odlewania z płytki głównej
Płytki 6-dołkowe ze szklanym dnem	MatTek	P06G-0-20-F	Do urządzeń do obrazowania
Mikrokapilary ze szkła borokrzemianowego	World Scientific Instruments	TW-100-4	Do igieł do mikroiniekcji
Pipety transferowe	Sigma Aldrich	Z350796	Do przenoszenia zarodków danio pręgowanego
Końcówki do mikroładowarek	Fisher	scientific E5242956003	Do ładowania igieł do mikroiniekcji
Dziurkacz Harris Uni-Core 1,5 mm	Ted Pella Inc.	15111-15	Do dziurkowania portów w urządzeniach do obrazowania PDMS
nr 11 Skalpel	Fine Science Tools	10011-00	Do cięcia PDMS
Dumont No. 5 Kleszcze	Fine Science Tools	11252-10	Do dekorionacji zarodków i łamania końcówek igieł do mikroiniekcji
Mikromanipulator Marzhauser	ASI	MM33-R Do	manipulowania igłą do mikroiniekcji
Stojak	magnetycznyMSC	SPI - 87242624	Do montażu mikromanipulatora
MPPI-3 Sterownik pompy pikopompowej	ASI	MPPI-3	Do kontroli objętości i czasu mikroiniekcji
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny EVOS	ThermoFisher	EVOS FL	Do obrazowania wstrzykniętych zarodków
Mikroskop preparacyjny	Nikon	SMZ745	Do wizualizacji mikroinfekcji
Oprogramowanie AutoCAD Autodesk			Pobierz pliki AutoCAD z: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 oraz na stronie wiki protokołów społeczności ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki