Method Article

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

DOI:

10.3791/56606

⸱

February 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki odpornościowe są ważnymi składnikami mikrośrodowiska guza i wpływają na wzrost i ewolucję guza na wszystkich etapach kancerogenezy. Warto zauważyć, że obecnie dobrze wiadomo, że naciek immunologiczny w ludzkich nowotworach może korelować z rokowaniem i odpowiedzią na terapię. Analiza nacieku immunologicznego w mikrośrodowisku guza stała się dużym wyzwaniem dla klasyfikacji pacjentów i odpowiedzi na leczenie.

Współekspresja receptorów hamujących, takich jak Białko Śmierci Komórki 1 (PD1; znane również jako CD279), Cytotoksyczne Białko Związane z Limfocytami T 4 (CTLA-4), Immunoglobulina komórek T i Białko Zawierające Mucynę-3 (Tim-3; znane również jako CD366) oraz Gen Aktywacji Limfocytów 3 (Lag-3; znany również jako CD223), jest cechą charakterystyczną wyczerpania limfocytów T. Opracowaliśmy wieloparametryczne barwienie immunofluorescencyjne in situ, aby zidentyfikować i określić ilościowo na poziomie komórkowym koekspresję tych receptorów hamujących. W retrospektywnej serii zamrożonych tkanek raka nerkowokomórkowego (RCC), przy użyciu technologii fluorescencyjnego obrazowania wielospektralnego w połączeniu z oprogramowaniem do analizy obrazu, stwierdzono, że koekspresja PD-1 i Tim-3 na naciekających nowotwór limfocytach T CD8 + jest skorelowana ze złym rokowaniem w RCC. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie pokazujące, że ta zautomatyzowana technologia multipleksów in situ może mieć pewne znaczenie kliniczne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat, immunoterapia stała się bardzo obiecującym sposobem leczenia wielu rodzajów nowotworów, w tym RCC. W szczególności stwierdzono, że immunoterapia oparta na hamowaniu hamujących punktów kontrolnych, takich jak PD-1 i CTLA-4, jest klinicznie skuteczna1,2,3,4,5,6. Przeciwciała monoklonalne przeciwko CTLA-4, PD-1 lub Program Death Ligand 1 (PD-L1) są już zatwierdzone w kilku nowotworach i prowadzą do długotrwałych odpowiedzi klinicznych u ponad 20% pacjentów7. Niemniej jednak nie wszyscy pacjenci reagują na leczenie, koszt leczenia jest wysoki, a leczenie jest toksyczne, co prowadzi do potencjalnych poważnych skutków ubocznych podobnych do autoimmunologicznych. Dlatego obecnym wyzwaniem jest zidentyfikowanie markerów predykcyjnych dla tych nowych immunoterapii. Doniesiono, że częstość mutacji w guzie, ekspresja PD-L1 lub poziomy wewnątrznowotworowej infiltracji limfocytów T CD8 + korelują z odpowiedzią kliniczną. Jednak związek ten jest nadal zbyt słaby, aby zalecić stosowanie tych biomarkerów klinicznych w praktyce klinicznej, z wyjątkiem testu towarzyszącego dla PD-L1 przed podaniem pembrolizumabu pacjentom z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC)8,9,1011,12. Wykazano, że koekspresja wielu receptorów hamujących, takich jak PD-1, Tim-3, Lag-3 i CTLA-4, indukuje fenotyp wyczerpania komórek i oporność na terapię13,14,15. Ponieważ krew obwodowa nie jest reprezentatywna dla mikrośrodowiska guza, bardzo interesująca jest analiza cech fenotypowych komórek in situ. Wiadomo, że limfocyty T o współekspresji PD-1 i Tim-3 są funkcjonalnie upośledzonymi komórkami w kilku kontekstach13,16,17. W tym badaniu oceniono prognostyczny wpływ koekspresji dwóch receptorów hamujących PD-1 i Tim-3 na limfocyty T CD8 +.

Do tej pory badanie koekspresji wielu markerów na limfocytach naciekających nowotwór (TIL) było głównie przeprowadzane za pomocą analizy cytometrii przepływowej, co powodowało konieczność pracy nad świeżymi guzami, a tym samym uniemożliwiało analizy retrospektywne. W przypadku konwencjonalnego barwienia in situ można wykonać tylko jedno barwienie na raz, a scharakteryzowanie typu komórki, która ulega koekspresji markerów, nie jest możliwe. Na przykład PD-L1 ulega ekspresji w wielu typach komórek mikrośrodowiska nowotworu, co utrudnia określenie za pomocą konwencjonalnej analizy immunohistochemicznej, które komórki wyrażające PD-L1 są bardziej istotne dla badań korelacyjnych. W tej pracy opracowaliśmy innowacyjną wieloparametryczną metodę immunofluorescencji in situ z liczeniem komputerowym w celu skorelowania koekspresji PD-1 i Tim-3 przez infiltrujące nowotwór limfocyty T CD8 + z wynikami klinicznymi w RCC. Technika ta ma kilka zalet, w tym możliwość analizy na poziomie pojedynczej komórki i wielu markerów w tym samym czasie przy użyciu kamery wielospektralnej, która może rejestrować ograniczone odstępy czasu >10 nm przez filtry ciekłokrystaliczne18. Co więcej, procedura jest automatyczna, co umożliwia odtwarzalność między operatorami i skróconą analizę w porównaniu z technikami ręcznymi19. W dziedzinie nowotworów kilka badań wykazało przekonujące wielokrotne barwienie cząsteczek odpornościowych, takich jak PD-1, PD-L1 i CD8 w raku z komórek Merkla, raku płuc oraz raku głowy i szyi20,21,22,23. Automatyczne zliczanie komórek jest możliwe po przeszkoleniu przez użytkownika (etap fenotypowania). Fluorescencję mierzy się w różnych przedziałach komórkowych (jądra, cytoplazma i błona).

Tutaj policzono różne podzbiory infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8+ wyrażających PD-1 i/lub Tim-3 w dużej kohorcie RCC, a wyniki zostały skorelowane z klinicznymi wynikami grawitacji i parametrami przeżycia. Możliwa była również analiza intensywności fluorescencji błony w rozdzielczości komórkowej za pomocą danych dotyczących średniej intensywności fluorescencji (MFI), takich jak w cytometrii. O ile nam wiadomo, jest to pierwsze badanie przedstawiające wyniki prognostyczne przy użyciu tej techniki liczenia opartej na obrazowaniu wielospektralnym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Świadomą zgodę uzyskano od uczestnika włączonego do kohort.

1. Materiał tkankowy

  1. Pobrać próbki tkanek RCC w dniu zabiegu. Z próbką chirurgiczną należy obchodzić się w temperaturze pokojowej (oddział patologii).
  2. Zbierz próbkę guza o wymiarach około 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm w suchej probówce. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
  3. Pokryj próbki związkiem o optymalnej temperaturze skrawania. Próbki należy podzielić za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C na odcinki o grubości 4–6 μm. Pozostawić próbki do wyschnięcia na szkiełkach podstawowych przez 12 godzin i bezpośrednio przechowywać je w temperaturze -80 °C, aby uniknąć wysuszenia.
  4. Sprawdź jakość próbki, przeglądając sekcję barwioną hematoksyliną i eozyną.

2. Barwienie immunofluorescencyjne in situ TIL

  1. Wytyczne proceduralne
    1. Wykonaj wszystkie kroki eksperymentalne w temperaturze pokojowej.
    2. Na wszystkich etapach należy wykonać rozcieńczenia roztworem soli fizjologicznej Tris Buffer (TBS; patrz Tabela Materiałów).
    3. Wykonać płukanie w TBS dla wszystkich etapów z wyjątkiem po inkubacji przeciwciał pierwotnych. W tym ostatnim przypadku użyj Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, patrz tabela materiałów). Skład buforu i jego rozpuszczenie, patrz Tabela uzupełniająca 1.
    4. Użyj komory wilgotnościowej do inkubacji przeciwciał i słoika do barwienia do mycia.
    5. Nie pozwól, aby sekcja wyschła podczas zabiegu.
  2. Wstępnej obróbki
    1. Rozmrozić szkiełko zawierające próbkę tkanki i ostrożnie osuszyć szkiełko wokół próbki ręcznikiem papierowym. Określić obszar reakcji, w którym znajduje się tkanka, za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (patrz tabela materiałów). Suszyć przez 2 min.
    2. Utrwal próbki w 100% acetonie na 5 minut, wysusz przez 2 minuty i myj TBS przez 10 minut.
  3. Nasycenie i blokada
    1. Wstępnie traktuj szkiełka przez 10 minut 3 kroplami awidyny 0,1%, dotknij i/lub przesuń szkiełko, aby rozprowadzić awidynę i usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie traktuj przez 10 minut 3 kroplami biotyny 0,01% (patrz tabela materiałów), dotknij i/lub przesuń. Umyć TBS.
    2. Wykonaj blokadę receptorów Fc. Nałożyć 100 μl 5% objętości normalnej surowicy rozcieńczonej w TBS. Użyć surowicy tego samego gatunku gospodarza, co znakowane przeciwciało drugorzędowe lub trzeciorzędowe (patrz tabela materiałów); Tutaj używano osłego surowicy. Inkubować przez 30 minut.
    3. Podczas inkubacji krótko odkręć przeciwciała anty-CD8, PD-1 i Tim-3 (tabela materiałów). Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w TBS zgodnie z opisem w tabeli uzupełniającej 2.
  4. Barwienie immunologiczne dla CD8, PD-1 i Tim-3
    1. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwotnych. Patrz Tabela materiałów i Tabela Uzupełniająca 2 dla zastosowanych przeciwciał (anty-CD8, PD-1, Tim-3 i odpowiadające im przeciwciała drugorzędowe) oraz ich stężeń.
    2. Dotknij i/lub strzepnij pozostałą surowicę osła (dodaną w kroku 2.3.2). Inkubować szkiełka z 100 μl nieznakowanej mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
    3. Podczas inkubacji należy krótko zakręcić cyjaniną 5 przeciwciałami anty-króliczym, AF488-anty-kozimi i biotynylowanymi przeciwciałami mysimi i przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych, jak opisano w Tabeli Uzupełniającej 2.
    4. Myć szkiełka w TBST przez 5 minut. Wysuszyć szkiełka.
    5. Inkubować szkiełka ze 100 μl przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut w wilgotnej komorze.
    6. Przygotować mieszaninę przeciwciał trzeciorzędowych zawierających Cy3-streptawidynę, jak opisano w Tabeli Uzupełniającej 2.
    7. Myj szkiełka w TBS przez 10 minut. Wysusz szkiełka.
    8. Inkubować szkiełka ze 100 μl mieszaniny przeciwciał trzeciorzędowych przez 30 minut.
    9. Myj szkiełka w TBS przez 10 minut. Wysusz szkiełka.
  5. Montaż ogniwa
    1. Zamontuj szkiełka w pożywce montażowej zawierającej 4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI) (1,5 μg/ml DAPI) z szkiełkiem nakrywkowym kompatybilnym z mikroskopią fluorescencyjną (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Jako kontrolę ujemną dla każdego eksperymentu użyto jednego szkiełka z przeciwciałami dopasowanymi do izotypu w tym samym stężeniu, co odpowiadające im przeciwciała. Do tego barwienia użyliśmy mysich przeciwciał kontrolnych IgG1, króliczych IgG i kozich IgG (patrz tabela materiałów). Jako kontrolę pozytywną użyliśmy ludzkiego przerostu migdałków, o którym wiadomo, że jest dodatni dla badanych markerów, dla każdego eksperymentu. Typowe barwienie jest opisane w wynikach (Rysunek 1). Barwienie mono-CD8, PD-1 i Tim-3 powinno być wykonywane indywidualnie (jedno barwienie na szkiełko) z tą samą obróbką wstępną i bez DAPI. Należy również wykonać preparat w tych samych warunkach doświadczalnych bez żadnego przeciwciała, a jedynie z podłożem montażowym DAPI. Szkiełko powinno być zobrazowane w identycznych warunkach eksperymentalnych bez przeciwciał i bez DAPI.

3. Analiza fluorescencyjna i automatyczne zliczanie komórek

  1. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopu automatycznego
    1. Utwórz protokół.
      1. Włącz oprogramowanie mikroskopu automatycznego i oświetlacz fluorescencyjny.
      2. Na pasku menu kliknij "Plik", "utwórz protokół", wybierz "DAPI", "FITC" i "TRITC".
      3. Kliknij "Dalej", "Sekcja tkanki" i kliknij "Dalej", "Nazwa protokołu". Wybierz nazwę, na przykład "CD8-PD-1-Tim-3", kliknij "Dalej" i "zapisz".
      4. Ręczne umieszczanie slajdu na stole montażowym.
      5. Na pasku menu kliknij "ustawienia", "ustawienia". Kliknij "ustaw dom Z" w nowym oknie.
      6. Dostosuj czas ekspozycji za pomocą szkiełka kontroli dodatniej, tj. CD8, PD-1 i Tim-3 potrójnie wybarwionych próbką DAPI.
      7. Na pasku narzędzi kliknij w "ustaw ekspozycję".
      8. Dostosuj czas ekspozycji dla każdego filtra, aż do uzyskania wystarczającego, ale nienasyconego sygnału.
      9. W przypadku obrazowania monochromatycznego wykonaj następujące czynności:
      10. Wybierz akwizycję i w sekcji "autofokus" wybierz filtr DAPI.
      11. W polu "Limit obszaru skanowania" przesuń górny róg obiektywu do lewego górnego rogu szkiełka. Kliknij "Zaznacz". Zrób to samo dla prawego dolnego rogu.
        UWAGA: Ten krok wyznacza obszar obrazowania o niskiej mocy (obrazowanie LP) przy 4X; Należy pamiętać, aby dobrze umieścić znak w taki sposób, aby otaczał wszystkie próbki z serii.
      12. W przypadku obrazowania o dużej mocy (HP) należy wykonać następujące czynności:
      13. W sekcji "Autofokus" wybierz "DAPI".
      14. W paśmie "Akwizycja" wybierz "DAPI", "FITC", "Cy3" i "Cy5". Kliknij "OK". Na pasku menu kliknij "Plik", "Zapisz protokół".
    2. Zeskanuj slajdy.
      1. Załaduj protokół, klikając "Plik", "załaduj protokół" na pasku menu. Kliknij "Start".
      2. Wprowadź "Lab ID" (lokalizacja folderu do przechowywania obrazu). Wprowadź identyfikator slajdu, aby zidentyfikować slajd. Kliknij "Dalej".
      3. Kliknij "Obrazowanie monochromatyczne" (aby zeskanować cały slajd w jasnym świetle pola i uzyskać sekwencyjne obrazy za pomocą obiektywu 4x).
        UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie przeglądu slajdu w skali szarości.
      4. Kliknij "Znajdź okaz". Wybierz obszar tkanki, który ma zostać zeskanowany w niskiej rozdzielczości (4x): przytrzymaj "Ctrl" i kliknij pole za pomocą kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć pola (Rysunek 2A).
      5. Kliknij "LP Imaging" (obrazowanie 4x), aby uzyskać fluorescencyjny obraz z czerwonego niebieskiego i zielonego każdego pola.
      6. Aby wybrać pole HP, przytrzymaj "Ctrl" i kliknij pole za pomocą kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć pola odpowiadające obszarowi tkanek, które będą skanowane w wysokiej rozdzielczości (20x). Wybierz 5 pól (Rysunek 2B).
      7. Kliknij "HP Imaging" (obrazowanie 20x), aby uzyskać wielospektralny obraz akwizycji każdego pola (Rysunek 2C).
      8. Kliknij "Przechowywanie danych", aby zapisać obrazy w folderze, który został wybrany na początku w LabID.
        UWAGA: Proces jest podsumowany i zilustrowany w Rysunek 2. Dla każdego kroku (wykrywanie tkanek, wybór pola) algorytm może być inkrementowany i trenowany przez użytkownika w celu uzyskania całkowicie zautomatyzowanego procesu skanowania.
  2. Analiza obrazu fluorescencyjnego i automatyczne zliczanie komórek za pomocą sprzężonego oprogramowania analitycznego
    1. Zbuduj bibliotekę spektralną.
      1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu.
      2. W lewym panelu otwórz "Buduj biblioteki". W sekcji "Załaduj obraz" kliknij "Przeglądaj" i wybierz jeden monochromatyczny obraz (np. CD8/Cyjanina 5).
      3. Wybierz fluorofor (np. cyjanina 5). Kliknij "wyodrębnij". Kliknij "Zapisz", aby zapisać w bibliotece. Kliknij "Zapisz".
      4. Powtórz ten sam proces dla szkiełek barwionych mono PD-1, Tim-3 i DAPI, aby zintegrować widmo każdego interesującego nas fluoroforu.
        UWAGA: Budowanie biblioteki spektralnej integruje widmo dla każdego fluoroforu używanego dla określonej tkanki (w tym przypadku nerki), ale można użyć "syntetycznych" bibliotek, które już istnieją. Ponieważ widmo autofluorescencji jest ściśle zależne od tkanki, ważne jest, aby wykonać jedną bibliotekę autofluorescencji i spektralnej na projekt.
    2. Utwórz nowy projekt.
      1. Na pasku menu kliknij "Plik", "Nowy projekt". W zakładce "Znajdź funkcję" wybierz "segmentacja komórek". W zakładce "Fenotypowanie" wybierz "fenotypowanie". Kliknij "Utwórz".
      2. Zintegruj reprezentatywne obrazy w projekcie.
        1. W zakładce "Plik" kliknij "otwórz obraz". Wybierz od 10 do 30 reprezentatywnych obrazów z całej serii. Dodaj niepoplamione szkiełko, aby usunąć autofluorescencję. Na prawym panelu: wybierz źródło biblioteki. Wybierz fluorofor i wybierz te, które odpowiadają wcześniej zbudowanej bibliotece spektralnej.
      3. Aby usunąć autofluorescencję tkankową, kliknij przycisk "AF", a następnie wybierz obszar autofluorescencji na pustym szkiełku.
      4. Obróbka obrazu i generowanie obrazu kompozytowego.
        1. Kliknij "Przygotuj wszystko", aby zintegrować bibliotekę fluorescencji i widma autofluorescencji w celu wygenerowania obrazu kompozytowego (Rysunek 3). Kliknij ikonę "oka", aby otworzyć panel "edytor widoku" i wybierz wyświetlane dane: wybierz znaczniki CD8, PD-1, Tim-3 i DAPI. Usuń autofluorescencję. Postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi przez oprogramowanie.
      5. Podziel komórki na segmenty.
        1. Aby podzielić komórki na segmenty, w polu "Przedział" wybierz "Jądra" i "Błona". W zakładce "Jądra" ustaw DAPI jako przeciwbarwienie jądrowe.
        2. W zakładce "Maksymalny i minimalny rozmiar (px)" wpisz odpowiednio "40" i "176" jako rozmiary minimalne i maksymalne. Dla sygnału "Minimum" ustaw wartość "0.13". W zakładce "Split" ustaw "2.60". W zakładce "Jądra" ustaw wartość "0,81". Wybierz "użyj sygnału membranowego do wspomagania segmentacji".
        3. Kliknij "Segmentuj komórki" w dolnej części ekranu. Sprawdź segmentację jąder i błon komórkowych i spróbuj ponownie z różnymi parametrami, jeśli nie pasuje do DAPI i fluorescencji błony komórkowej.
          UWAGA: Oprogramowanie rozpoznaje komórki za pomocą barwienia jądrowego DAPI i na podstawie rozmiaru komórki. Dostosuj parametry komórki (rozmiar, podział, piksele) zgodnie z projektem.
      6. Fenotyp komórek.
        1. W zakładce "Fenotyp" kliknij "dodaj". Utwórz kategorie fenotypów komórek: CD8 (niebieska kropka)/CD8-PD-1 (czerwona kropka)/CD8-PD-1-Tim-3 (zielona kropka)/inne (kropka) (Rysunek 4).
        2. Zaznacz więcej niż 5 przykładów komórek z każdej kategorii. Kliknij "Klasyfikator pociągów".
          UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie przez oprogramowanie algorytmu klasyfikacji statystycznej.
        3. Kliknij "Fenotyp wszystkie", aby uzyskać fenotyp każdej komórki.
          UWAGA: Oprogramowanie podaje fenotyp jednej komórki z przedziałem ufności (CI) dokładności.
        4. Ulepsz algorytm, trenując oprogramowanie do momentu, aż różnica między liczeniem oka a zliczaniem automatycznym będzie zgodna (błąd < 5%). Wybierz CI, który jest akceptowalny dla interesujących komórek.
          UWAGA: Zdecydowaliśmy, że szkolenie na podstawie 55% CI jest akceptowalne.
      7. Zapisz algorytm i projekt.
      8. W sekcji "Plik" wybierz "projekt". Nazwij go i kliknij "Zapisz".
    3. Wykonaj analizę wsadową serii.
      1. Wybierz opcję "Analiza wsadowa". Wybierz projekt. Dodaj obrazy do analizy. Wybierz folder przechowywania danych. Kliknij "Uruchom". Sprawdź jakość obrazu kompozytowego. Sprawdź fenotypowanie dla wszystkich obrazów z serii.
        UWAGA: Sprzężone oprogramowanie do analizy obrazu integruje wszystkie sygnały z przedziałów komórkowych (błona/cytoplazma/jądra). Etap fenotypowania ma kluczowe znaczenie, chociaż szkolenie algorytmu może być czasochłonne. Wszystkie dane każdego obrazu znajdują się w jednym pliku .txt. Wszystkie dane jednej komórki (w szczególności jej fenotyp podany wraz z CI) znajdują się w jednym wierszu. Dla każdego slajdu akwizycja obrazu i późniejsze zliczanie zostały przeprowadzone na 5 polach.
  3. Integracja surowych danych i generowanie automatycznego zliczania komórek
    1. Oblicz dane za pomocą programu statystycznego.
      1. Oblicz wszystkie dane z 5 obrazów odpowiadających 5 polom analizowanym dla 1 pacjenta. Skorzystaj z platformy statystycznej i zleć analizę doświadczonemu statystykowi, menedżerowi danych lub naukowcowi zajmującemu się danymi. Zbuduj skrypt, który automatycznie zlicza komórki w zależności od ich fenotypu, wybierając CI > 55%.
      2. Umieść wszystkie pliki .txt serii w tym samym folderze.
    2. Wyodrębnij dane.
      1. Umieść wszystkie .txt pliki w jednym folderze. Uruchom skrypt automatyczny wbudowany w krok 3.3.1. Otwórz plik .csv wyjściowej wygenerowany przez skrypt języka R. Zapisz w formacie .xl. Dane wyjściowe gromadzą liczbę komórek dla każdego fenotypu (tj. samego CD8, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) dla każdego pacjenta.
      2. Oblicz średnią liczbę komórek dla każdego pacjenta na pole: podziel liczbę komórek na liczbę pól (tj. 5), aby znormalizować liczbę komórek dla każdego pacjenta na pole.
      3. Oblicz procent komórek PD-1 + wśród wszystkich limfocytów T CD8 + i komórek PD-1 + Tim-3 + wśród wszystkich limfocytów T CD8 +. Zobacz Rysunek 5 dla podsumowania tego kroku.
        UWAGA: Język R (lub inne wybrane oprogramowanie programistyczne) jest wymagany do poprawnego tworzenia i wykonywania poleceń, dlatego niezbędny jest doświadczony użytkownik lub statystyk/analityk danych. Program R może obliczać dane tego samego pacjenta, ale nazwa 5 .txt plików jednego pacjenta powinna mieć identyczny początek, odpowiadający unikalnemu identyfikatorowi pacjenta.
  4. analiza statystyczna
    1. Do analizy statystycznej wyników należy używać oprogramowania statystycznego.
    2. Wykonywanie odpowiednich analiz statystycznych z pomocą statystyka.
      1. Użyj nieparametrycznych testów rang ze znakiem Wilcoxona do porównania PD-1 MFI między dwoma fenotypami komórek (Rysunek 6). Skoreluj współzmienne i cechy histologiczne z testem chi-kwadrat Pearsona.
      2. Użyj metody Kaplana-Meiera, aby oszacować czas przeżycia wolny od progresji, oraz modeli regresji Coxa, aby oszacować wpływ współzmiennych na wyniki czasu do zdarzenia, takie jak przeżycie całkowite i przeżycie wolne od choroby.
      3. Uznaj, że wartości p mniejsze niż 0,05 są znaczące.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z ogólnego protokołu opisanego powyżej, naszym celem było ilościowe określenie wewnątrznowotworowych limfocytów T CD8+ koeksprymujących receptory hamujące PD-1 i Tim-3 w zamrożonych tkankach od pacjentów z RCC, oraz skorelowanie wyników z wynikami klinicznymi25.

Optymalizacja barwienia CD8/PD-1/Tim-3:

Różn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Jakość tkanek jest ważnym parametrem; Można to łatwo sprawdzić za pomocą zabarwienia hematoksyliną i eozyną.

Jedną z zalet tej techniki jest możliwość barwienia multipleksowego, ale aby uniknąć rozlania się fluoroforu, zaleca się wybór długości fal emisyjnych z deltą minimum 10 nm. Tutaj, ponieważ mieliśmy 4 barwienia, w tym DAPI, zdecydowaliśmy się rozłożyć długości fal (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, cyjanina 3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-Oncology (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG został sfinansowany ze stypendium Fundacji ARC. EV i CD zostały sfinansowane przez stypendium APHP (bourse année recherche). ChB jest finansowany przez stypendium Université Sorbonne Paris Cité (contrat doctoral). Autorzy dziękują Bristol Myers Squibb za finansowanie tego projektu. Autorzy dziękują Zakładowi Patologii Hopital Européen, Georges'owi Pompidou i Netcherowi (Laurianne Chambolle, Elodie Michel i Gisèle Legall). Autorzy dziękują platformie histologicznej PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Zautomatyzowane Ilościowe Obrazowanie Patologii Perkin ElmerCLS142338
Analiza komórkowa inForm 2.1.Oprogramowanie Perkin ElmerCLS135781
Rhttps://www.r-project.org
długopisem rozdzielającym DakopenDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7,6 100 tabletek
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 tabletek
blokujący biotynęDakoX0590Avidin 0,1% i Biotyna 0,01%
normalna surowica osłaJackson Immunoresearch017-000-0015% stężenie obj./obj.
Fluoroshield z DAPISigma-aldrichF60571,5 &mikro; stężenie g/ml
Szkiełko nakrywkowe Knittel GlassKnittel Glä ser,10003924x60 mm 100 szkiełek nakrywkowych
Królik anty-CD8 Klon P17-VnovusNBP1-79055zastosowanie w 4µ g / mL
Mysz anty-PD-1 Clone NATabcamab52587do użytku przy 2 i mikro; g/mL
Kozia anty-Tim-3R& DAF2365zastosowanie przy 3 i mikro; g / ml
Królik anty-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001stosować przy 1 &mikro; g / ml
Mysz AF647 oznaczona pan- Keratynowy klon C11Sygnalizacja komórkowa4528zastosowanie przy 0,5 i mikro; g/mL
Kozia anty-ludzka gal9R& DAF2045używać przy 0,3 i mikro; g / mL
Cyjan 5 sprzężony osioł anty-królikJackson Immunoresearch711-175-152stosować w 5 &mikro; g/ml
Biotynylowane F(ab' 2) osło anty-mysie IgGJackson Immunoresearch715-066-150zastosowanie w 3 &mikro; g / mL
Alexa Fluor488 sprzężony osioł anty-kozi IgGabcamab150133stosować przy 5 &mikro; g / ml
Streptawidyny znakowanej Cy3AmershamPA43001stosowania w 3 &mikro; g / mL
mysz kontroli ujemnej IgG1DakoX0931stosować przy 2 i mikro; g/mL
IgG z surowicy koziejSigma-aldrichI5256stosować przy 3 &mikro; g/mL
IgG z surowicy królikaSigma-aldrichI5006stosować w 4&mikro; g/ml
System

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

Related Articles