Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Summary

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Abstract

Retinopatia cukrzycowa jest główną przyczyną ślepoty wśród dorosłych w średnim wieku. Rosnąca częstość występowania cukrzycy na całym świecie sprawi, że zapobieganie cukrzycowym powikłaniom mikronaczyniowym stanie się jednym z kluczowych kierunków badań w nadchodzących dziesięcioleciach. Specjalistyczna, celowana terapia i nowatorskie leki terapeutyczne są potrzebne, aby poradzić sobie z rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku. Danio pręgowany jest uznanym modelem zwierzęcym dla badań rozwojowych o rosnącym znaczeniu dla modelowania metabolicznych wieloczynnikowych procesów chorobowych. Zalety tego gatunku pozwalają na optymalną wizualizację i wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, w połączeniu z silną zdolnością do eliminowania interesujących genów. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego danio pręgowanego tg (fli: EGFP) jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą lub uszkodzeniem naczyń. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie siatkówki danio pręgowanego i całkowite zamontowanie tkanki. Wizualizację odsłoniętych naczyń uzyskuje się następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej zielonego reportera EGFP wyrażonego w unaczynieniu siatkówki dorosłego. Prawidłowe obchodzenie się z tkanką doprowadzi do lepszych wyników i mniejszego pękania naczyń wewnętrznych, aby zapewnić wizualizację niezmienionej struktury naczyniowej. Metoda ta może być stosowana w modelach waskulopatii siatkówki danio pręgowanego związanych ze zmianami w architekturze naczyń krwionośnych, a także neoangiogenezą.

Introduction

Cukrzyca to choroba metaboliczna definiowana przez hiperglikemię wynikającą z dysfunkcyjnego wydzielania insuliny lub nieodpowiedniej odpowiedzi tkanek na wydzielaną insulinę. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) szacuje, że w 2014 roku 422 miliony dorosłych żyło z cukrzycą¹, a częstość występowania cukrzycy na całym świecie ma wzrosnąć do 8-10% populacji do 2035 roku², co sprawi, że cukrzyca stanie się jedną z kluczowych dziedzin badań w nadchodzących dziesięcioleciach. Życie z przewlekłym wysokim poziomem cukru we krwi prowadzi do długotrwałych powikłań mikronaczyniowych, w tym retinopatii cukrzycowej, nefropatii i polineuropatii. Leczenie i zapobieganie tym powikłaniom jest trudne; w rzeczywistości cukrzyca staje się najczęstszą przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), która prowadzi do dializy², a cukrzyca jest główną przyczyną ślepoty wśród dorosłych w średnim wieku³.

Początkowymi przyczynami uszkodzeń mikrokrążenia w oku cukrzycowym są przewlekła hiperglikemia, zmiany metaboliczne, a także pewne czynniki ryzyka (np. nadciśnienie, dyslipidemia), prowadzące do dysfunkcji śródbłonka naczyń krwionośnych, wypadania perycytów i regresji naczyń włosowatych, która prowadzi do powstania bezkomórkowych rękawów naczyniowych. Wynikające z tego niedokrwienie siatkówki jest przyczyną neowaskularyzacji i zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych, co sprzyja rozwojowi proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)⁴. Retinopatia cukrzycowa była ogólnie wykrywana u 37% pacjentów z cukrzycą, podczas gdy zagrażająca wzrokowi retinopatia cukrzycowa została stwierdzona u 12% przesiewanej białej kohorty europejskiej w badaniu UKADS⁵. Obecne leczenie może jedynie zapobiec dalszym powikłaniom i nie jest w stanie w pełni przywrócić już wywołanych uszkodzeń. Fotokoagulacja panretinalna, oprócz kontroli glikemii, jest standardową terapią proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR), ale wpływa również na sąsiednią zdrową tkankę. Interwencje anty-VEGF wykazują obiecujące wyniki jako alternatywa dla leczenia laserowego^6,7, ale ostatecznie potrzebna jest specjalistyczna, celowana terapia i nowe leki, aby poradzić sobie z rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku.

Sprawdzone modele badań nad retinopatią cukrzycową nie dzielą wszystkich aspektów ludzkiej patofizjologii. Wykorzystanie odpowiednich gatunków w celu zaspokojenia specyficznych wymagań pytania naukowego jest jedną z najważniejszych części zestawu eksperymentalnego. Zarodek danio pręgowanego (Danio rerio) jest już szeroko stosowany w badaniach rozwojowych i stanowi optymalne praktyczne tło do obalania lub nokautowania określonych genów za pomocą morpholinos lub techniki CRISPR/Cas9⁸. Metody te mogą być łatwo wykorzystane u danio pręgowanego do badania genów, które zostały zidentyfikowane w badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS) na dużą skalę, generując wgląd w poszczególne mechanizmy progresji choroby i podatności⁹. Krótki czas pokoleniowy, duża liczba potomstwa, łatwa i tania obsługa oraz rosnące wsparcie dla testów zwiększyły znaczenie modelu danio pręgowanego, zwłaszcza biorąc pod uwagę jego ogromny potencjał w modelowaniu chorób metabolicznych. Wykazano, że zachowanie mechanizmów biologicznych u danio pręgowanego stanowi podstawę do opracowania terapii farmakologicznej. Na przykład wykazano, że lek przeciwcukrzycowy metformina i obniżająca poziom cholesterolu symwastatyna "leczą" stany w modelach wysokiej ekspresji PEPCK wywołanej przez cAMP/deksametazon i hipercholesterolemii wywołanej dietą wysokocholesterolową^10,11,12. Ten postępowy wgląd w nadrzędne konserwatywne mechanizmy metaboliczne jest dodatkowo wspierany przez rosnącą liczbę modeli cukrzycy danio pręgowanego, poprzez eksperymenty takie jak: naprzemienna inkubacja w roztworach glukozy, indukowana streptozotocyną ablacja komórek beta, ablacja komórek beta za pośrednictwem nitroreduktazy przy użyciu proleku metronidazolu, cukrzyca monogenowa, w której pośredniczy knockdown lub knockout genu PDX1, a także modele zwiększonej insulinooporności w mięśniach szkieletowych¹². Te już ustalone protokoły, wspomniana wyżej specyfika gatunku oraz zdolność do skutecznego manipulowania genomem w dużej liczbie próbek pokazują zalety danio pręgowanego w badaniu mechanizmów kierujących złożonymi procesami chorobowymi, a także zdolność do badań przesiewowych pod kątem interwencji farmakologicznych.

Ogólne zrozumienie podstawowej anatomii oka danio pręgowanego (Rysunek 1) jest niezbędne do przeprowadzenia sekcji, aby wykorzystać danio pręgowanego jako model angiopatii siatkówki. Oko danio pręgowanego ma sześć mięśni zewnątrzgałkowych, cztery mięśnie proste i dwa mięśnie skośne, które wstawiają się na zewnątrz kuli ziemskiej w twardówce¹³. Rogówka jest przezroczystą tkanką pokrywającą soczewkę i biegnie bezpośrednio do twardówki, która tworzy zewnętrzną powłokę oka. Twardówka jest nieprzezroczysta, ma częściowo odbijającą światło powierzchnię i jest mocno napigmentowana. Sama soczewka ma bardziej kształt kuli niż ludzki odpowiednik. Siatkówka składa się z trzech warstw jądrowych komórek neuronalnych, podczas gdy unaczynienie siatkówki dostarczające tlen jest ściśle związane z wewnętrzną warstwą komórek zwojowych, ale nie tworzy sieci podsiatkówkowej. Z kolei naczynia naczyniówkowe leżą między twardówką a siatkówką i są związane z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Ta sieć kapilarna dostarcza tlen do zewnętrznych części siatkówki¹⁴.

Ryc. 1: Schematyczne przedstawienie oka dorosłego osobnika danio pręgowanego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Prostą wizualizację unaczynienia siatkówki można osiągnąć dzięki wykorzystaniu transgenicznej linii dg(fli:EGFP) danio pręgowanego¹⁵. Zielone białko fluorescencyjne ulegające ekspresji pod kontrolą promotora fli w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych stanowi podstawę do wizualizacji za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego w późniejszych etapach. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie siatkówki danio pręgowanego i całkowite zamontowanie tkanki. Ten transgeniczny model zapewnia szybki odczyt naczyń krwionośnych bez stosowania znakowania wewnątrznaczyniowego lub immunohistochemii całościowej. Aby przeanalizować retinopatię cukrzycową u danio pręgowanego, każda dyssektorium powinna stosować krok po kroku i standaryzowaną rutynę przygotowania. Poniższy protokół przygotowania daje innym grupom badawczym możliwość łatwej oceny zmian naczyniowych w odsłoniętych naczyniach oka dorosłego danio pręgowanego i udziela wskazówek w celu ustalenia zoptymalizowanej rutyny preparacji siatkówki danio pręgowanego.

Protocol

Wszystkie procedury, w tym kroki związane z tematami związanymi ze zwierzętami, zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt (Regierungspräsidium Karlsruhe) i są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu w Heidelbergu dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie utrwalacza (4% PFA/PBS)

1. Utrwalacz należy przygotowywać codziennie na świeżo, aby zapewnić optymalne zachowanie integralności histologicznej tkanki.
2. Rozpuścić 0,2 g wodorotlenku sodu (NaOH) w 90 ml podwójnie destylowanej wody (_ddH2O), ciągle mieszając w temperaturze pokojowej.
3. Dodać 4 g paraformaldehydu (PFA) i mieszać, aż roztwór będzie całkowicie klarowny przez co najmniej 5-10 minut, aby zapewnić depolimeryzację makrocząsteczek.
   Uwaga: PFA jest toksyczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie.
4. Rozpuścić 0,84 g diwodorofosforanu sodu (_NaH2PO₄) w roztworze i kontrolować pH na poziomie 7,2 za pomocą pomiaru.
5. Dostosować objętość do 100 ml za pomocą ddH₂O i przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną stopnia 3.
6. Przechowywać 4% PFA/PBS na lodzie.

2. Przygotowanie roztworu do eutanazji

UWAGA: Następujące kroki zostały wykonane z dzikim szczepem ABTL w wieku 6-8 miesięcy.

1. Użyj 3-aminobenzoesanu etylu, sulfonianu metanu, zwanego również "trikainą" lub MS-222, w stężeniu 0,31 mg/ml do eutanazji danio pręgowanego¹⁶. Wykorzystaj 1x wodę jajeczną, używaną do hodowli zarodków danio pręgowanego, jako rozpuszczalnik do roztworu do eutanazji. Ogólnie rzecz biorąc, kontroluj prawidłową głębokość znieczulenia przed rozpoczęciem pracy z rybami w stanie uspokojenia, wykazując utratę równowagi i utratę reakcji na dotyk.
   1. Aby uzyskać 1,000 ml 10x wody jajecznej, dodaj te sole do 1,000 ml podwójnie destylowanej wody (ddH₂O), ciągle mieszając w następującej kolejności: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,4 g CaCl_2*6H₂O, 1,32 g MgSO_4*6H₂O.

3. Utrwalenie tkanki danio pręgowanego

1. Przenieś wcześniej 6 ml 4% roztworu PFA/PBS na próbkę do dołków na płytkach sześciodołkowych.
2. Dorosłe rybo pręgowane należy poddać eutanazji (wcześniej utrzymywanej w standardowym cyklu dnia świetlnego, np. 12 godzin: 12 godzin) 2 godziny po zapaleniu świateł rano, umieszczając je w roztworze tricainy i czekając, aż osiągną eutanazję. Po ustaniu ruchu wiecznego, który może trwać do 10 minut.
3. Wyjmij ryby z roztworu do eutanazji tricaine i połóż je na świeżych ręcznikach papierowych. Osusz rybę i użyj skalpela, aby odciąć głowy za wieczkiem (patrz Rysunek 2A). Przenieś głowice bezpośrednio do przygotowanych płytek dołkowych, które zawierają świeżo przygotowany utrwalacz
.
4. Płytki studzienkowe zawierające głowy ryb należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc przez co najmniej 24 godziny, aby upewnić się, że utrwalacz przenika do głębszych warstw siatkówki.
   UWAGA: Głowy danio pręgowanego mogą być przechowywane maksymalnie przez 48 godzin w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przed przygotowaniem bez istotnej utraty siły sygnału fluorescencji. Zwiększone opóźnienie może prowadzić do utraty integralności tkanek i obniżenia jakości obrazu, dlatego należy tego unikać.

4. Przygotowanie układu krwionośnego siatkówki danio pręgowanego

1. Napełnij szalkę Petriego do jednej trzeciej podgrzaną 2% agarozą i poczekaj, aż agar będzie twardy. Przykryj płytkę agarową 1x PBS, aby stworzyć przestrzeń roboczą do preparowania oczu.
   UWAGA: Pozwoli to zarówno na zachowanie pęsety preparacyjnej, jak i niewielki nacisk na tkankę podczas preparacji, zmniejszając prawdopodobieństwo uszkodzenia struktury. Wszystkie dalsze kroki przygotowawcze należy wykonać w tym miejscu roboczym przy użyciu prostych kleszczy #5 z cienkimi końcówkami pod mikroskopem preparacyjnym z dodatkowym epi-oświetleniem.
   1. Podczas preparacji używaj powiększenia od 4,0x do 6,0x, aby umożliwić zarówno przegląd, jak i szczegółową ocenę tkanki.
2. Przenieść utrwaloną próbkę na szalkę Petriego i, przytrzymując głowę przy powierzchni cięcia za pomocą jednej pęsety, włożyć kolejną spiętą pęsetę poniżej gałki ocznej w jamie oczodołu. Powoli otwórz pęsetę pod okiem i chwyć nerw wzrokowy, a następnie ostrożnie rozerwij i odłącz oczy (Rysunek 2B).

Ryc. 2: Usunięcie oka dorosłego osobnika danio pręgowanego. Widok z boku rogówki z okiem nadal w jamie oczodołu i nienaruszonym nerwem wzrokowym (A). Widok z boku rogówki z oderwanym okiem (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Usuń dowolny z czterech mięśni prostych i dwóch skośnych mięśni zewnątrzgałkowych, które są nadal połączone z okiem, a także pozostałą tkankę zewnątrzgałkową łączącą oko z jamą oczodołu (porównaj Rysunek 3 i Rysunek 4).
   1. Osiągnij to, przytrzymując oko przez półprzymkniętą pęsetę i chwytając konstrukcję drugą pęsetą, delikatnie oderwij ją diametralnym ruchem. Ponieważ chwytanie gałki ocznej bezpośrednio prowadzi do pęknięcia naczynia wewnętrznego, technika ta jest odpowiednio delikatna, aby zachować unaczynienie.

Ryc. 3: Oko dorosłego danio pręgowanego z zaznaczonymi mięśniami zewnątrzgałkowymi. Widok boczny z przyczepieniem mięśnia zewnątrzgałkowego do lewej zewnętrznej krawędzi gałki ocznej w ostrości (A). Widok z boku nerwu wzrokowego z mięśniami zewnątrzgałkowymi symetrycznie flankującymi nerw wzrokowy (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Użyj jednorazowej igły 27G (0,4 x 19 mm), aby nakłuć rogówkę (Rysunek 4C, czerwona strzałka) w zewnętrznym zakresie. Przez ten otwór przytrzymaj rogówkę obiema pęsetami i lekko ją rozerwij. Następnie ostrożnie pracuj, aby utworzyć wyśrodkowane rozdarcie o wielkości mniej więcej odpowiedniej źrenicy.

Ryc. 4: Oko dorosłego osobnika danio pręgowanego po usunięciu wszystkich mięśni zewnątrzgałkowych. Widok boczny z widoczną oczyszczoną zewnętrzną krawędzią gałki ocznej (A). Widok z boku nerwu wzrokowego z nerwem wzrokowym pośrodku. Twardówka odbijająca światło nie pokrywa całego obszaru wokół nerwu (czerwona przerywana linia) (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Wywieraj nacisk na stronę rogówki gałki ocznej (bulbus oculi) na zewnętrznej krawędzi rogówki nad tęczówką. Spowoduje to powstanie małego wgniecenia i popchnie soczewkę na wysokość rozdarcia rogówki. Uruchom pęsetę pod soczewką i wyjmij ją (Rysunek 5A).

Ryc. 5: Oko dorosłego ryba pręgowanego w trakcie usuwania soczewki. Widok z boku rogówki z soczewką przepchniętą przez rozdarcie rogówki (A). Widok z boku rogówki z soczewką obok gałki ocznej (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Odwróć oko do góry nogami do nerwu wzrokowego skierowanego w stronę badacza. Należy pamiętać, że twardówka i rogówka są połączone i tworzą włóknistą tunikę bańki oka, aby chronić siatkówkę w kształcie miseczki. (Rysunek 6).
   1. Ta powłoka, składająca się z rogówki i twardówki, nazywana jest również "corneosclera" i oszczędza obszar wokół nerwu wzrokowego (Ryc. 4B, czerwona przerywana linia). Wbij igłę w tym przerwaniu raz, aby utworzyć otwór między twardówką a siatkówką.

Ryc. 6: Twardówka rogówki składająca się z twardówki i rogówki, która jest odłączona od pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej. Widok z boku rogówki pokazujący kontynuację półprzezroczystej rogówki do pigmentowanej twardówki (A). Widok boczny skoncentrowany na twardówkowej części rogówki (B). Schematyczne przedstawienie usuniętej koroponki (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Korzystając z tego dostępu za pomocą obu pęset, ostrożnie rozerwij twardówkę osiowo na paski, aby zwiększyć otwór wokół nerwu wzrokowego. Uważaj, aby twardówka rogówki pozostała nienaruszona w miejscu przejścia do obwodu strony rogówki (patrz Ryc. 6A).
8. Przytrzymaj twardówkę jedną pęsetą, a drugą chwytając nerw wzrokowy i odciągając, całkowicie usuń rogówkę z oka i wyrzuć ją (Ryc. 6). Spróbuj przeciąć wszelkie połączenia przed oddzieleniem twardówki rogówki od pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej, ponieważ przyczepienie się do innych struktur będzie punktem krytycznym; ten krok zapewni strukturę w kształcie miseczki składającą się z błony naczyniowej oka i siatkówki zawierającej unaczynienie siatkówki (Rysunek 7).
9. Stworzyć pęknięcie w warstwie naczyniówki/RPE, przytrzymując igłę 27G bokiem do pozostałej miseczki, jednocześnie zeskrobując zewnętrzną powierzchnię krawędzią końcówki igły. Użyj pęknięcia jako punktu dostępu, aby chwycić warstwę naczyniówki/RPE i rozerwać ją obiema pęsetami w paski, ale zachowaj nienaruszone połączenie z tęczówką.
   1. Następnie uruchom jedną pęsetę pod tęczówką i obejdź obwód od zewnątrz, tworząc napięcie, ciągnąc za przerwaną warstwę naczyniówkową/RPE, aby uzyskać oderwanie połączonej struktury.
      UWAGA: Tęczówka musi być odłączona, aby nie blokować fluorescencji podczas wizualizacji naczyń ( Rysunek 8B). Chwytanie tęczówki bezpośrednio w celu jej usunięcia może prowadzić do rozległego uszkodzenia naczyń, zwłaszcza w wewnętrznym okręgu wzrokowym (IOC), ponieważ tęczówka jest nadal połączona z otaczającą tkanką. Warstwa naczyniówki i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) mogą być oddzielone i często zachowują połączenie z tęczówką, co pozwala na łatwe wtórne usunięcie.
   2. Jeśli części tęczówki nie mogą zostać usunięte, wykorzystaj naturalny punkt złamania, który oko dorosłego danio pręgowanego wykazuje wewnątrz warstwy fotoreceptorów (PL), w podobny sposób jak w kroku 4.9, aby usunąć tęczówkę.
   3. Zeskrobać zewnętrzną stronę pozostałej siatkówki w kształcie miseczki, aby wywołać przerwanie ciągłości w PL powyżej punktu krytycznego (Rysunek 11C, strzałka). Użyj utworzonego dostępu, aby usunąć górną część warstwy, zachowując możliwe połączenie z tęczówką w stanie nienaruszonym. Następnie uruchom pęsetę pod tęczówką i obejdź dookoła, jak wspomniano wcześniej, aby odłączyć połączoną strukturę.
      UWAGA: Należy uzbroić się w cierpliwość, ponieważ cały krok 4.9 może być trudny, ale ta opieka pozwoli osiągnąć lepszy wynik naczyniowy niż proste złapanie tęczówki na krawędzi źrenicy lub wymuszenie otwarcia poprzez zniszczenie połączeń z warstwą naczyniówki/RPE lub fotoreceptora bez ich odpowiedniego usunięcia. Wykonanie tego kroku pozwoli zachować integralność naczyniową siatkówki, ale doprowadzi do uszkodzenia zewnętrznych warstw siatkówki.

Ryc. 7: Oko dorosłego osobnika danio pręgowanego po usunięciu twardówki szkieletowej. Widok boczny pokazuje pozostałą tkankę wewnątrzgałkową z nienaruszoną tęczówką i nerwem wzrokowym (A). Widok z boku rogówki z ostrością tęczówki (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Użyj nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji z prostą krawędzią tnącą 2,5 mm, aby przeciąć nerw wzrokowy jak najbliżej siatkówki; pozwoli to na lepsze płaskie mocowanie tkanki.

Rycina 8: Oko dorosłego ryba pręgowanego po usunięciu RPE/naczyniówki i ściętego nerwu wzrokowego. Widok z boku nerwu wzrokowego pokazuje siatkówkę ze ściętym nerwem wzrokowym (A). Widok z boku rogówki z bezpośrednim spojrzeniem na najbardziej wewnętrzną warstwę siatkówki (B). Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Montaż układu naczyniowego siatkówki

1. Przemyj wypreparowaną siatkówkę dwa razy przez 5 minut w 1x PBS. Aby przenieść siatkówkę po obcięciu nerwu wzrokowego, użyj szpatułki laboratoryjnej z końcówką mikro łyżki, aby uniknąć bezpośredniego dotykania odsłoniętej tkanki.
2. Umieść kroplę PBS na szkiełku podstawowym i przenieś siatkówkę do kropli. Użyj pęsety, aby utrzymać tkankę na miejscu, jednocześnie przecinając strukturę w kształcie miseczki skalpelem, aby uzyskać płaski kształt cztero- lub pięciopłatkowy w zależności od rozmiaru siatkówki (patrz Rysunek 9).
3. Zassaj resztki PBS drobnym kawałkiem papieru. Uważaj, aby nie dotknąć siatkówki.
4. Pokryj płaską siatkówkę w nośniku montażowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj, aby nie tworzyć piany, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zniekształcać wizualizację naczyń siatkówki.
5. Zminimalizuj ruchy szkiełka nakrywkowego i uszczelnij okładkę przezroczystym lakierem do paznokci.

6. Wizualizacja unaczynienia siatkówki

1. Utrzymuj jak najkrótszą przerwę czasową między przygotowaniem a wizualizacją, aby zmniejszyć utratę szczegółów obrazu w wyniku utraty sygnału fluorescencji. Przygotowane mocowania naczyniowe siatkówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zmniejszyć straty sygnału, jeśli nie można uzyskać bezpośredniej wizualizacji, ponieważ pogorszenie jakości obrazu staje się powoli widoczne po 48 godzinach od przygotowania.
2. Wizualizacja naczyń krwionośnych siatkówki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.
   UWAGA: Wizualizację naczyń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej uzyskano przy 2,5-krotnym powiększeniu z czasem naświetlania 2,0 s, wzmocnieniem 6,0x i ustawieniami gamma 1,67. Do mikroskopii konfokalnej wykorzystano laser AR (488 nm/20 mW) o mocy 20% w połączeniu z filtrem wzbudzenia TD 488/543/633, obiektywem multi-immersyjnym 20x/0,7 NA z ddH₂O jako medium zanurzeniowym oraz ustawieniami filtra emisyjnego 505-560 nm. Obrazy konfokalne składają się z pojedynczych obrazów 4x4, 4x5 lub 5x5 połączonych za pomocą skanu kafelkowego w zależności od rozmiaru siatkówki.

7. Sekcje HE siatkówki danio pręgowanego

UWAGA: Dla sekcji HE siatkówki danio pręgowanego, przygotuj tkankę zgodnie z opisem w protokole do kroku 4.5, a następnie przejdź bezpośrednio do kroku 7.1.

1. Przemyć wyłuszczone oczy (po kroku 4.5) dwa razy przez 5 minut w 1x PBS. Następnie przenieś tkankę do 70% etanolu (EtOH). Na tym etapie przygotowane oczka można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia się w parafinie.
2. Umyj chusteczkę w następujący sposób, aby ją odwodnić przed zatopieniem w parafinie: 2x15 min w 80% etanolu, 2x15 min w 90% etanolu, 3x15 min w 96% etanolu, 3x15 min w 99% etanolu, 2x15 min w acetonie/99% etanolu (1:2), 3x15 min w acetonie. Przechowywać tkankę w parafinie w temperaturze 62 °C przez noc.
3. Świeżą parafinę podgrzać do temperatury 62 °C i wlać do foremek do zatapiania. Przenieś tkankę bezpośrednio do form i w szybkim tempie kontroluj prawidłową orientację oczu dla żądanego przekroju. Następnie nałóż kasetę do zatapiania na formę i przykryj dodatkową podgrzaną parafiną.
4. Usuń formy do zatapiania po ostygnięciu bloków parafiny. Pokrój bloki parafiny w mikrotomie na odcinki o wielkości 10 μm i wypuść je na kąpiel wodną o temperaturze 45 °C na powierzchni wody wystarczająco długo, aby całkowicie się spłaszczyły.
5. Złap sekcje na szkiełku podstawowym i osusz je pionowo, aby usunąć nadmiar wody, a następnie wysusz je przez noc w piekarniku w temperaturze 45 °C.
6. Dalsze przetwarzanie skrawków zgodnie z następującym harmonogramem deparafinowania i barwienia HE: 4x1 min w ksylolu, 1x1 min w 99% etanolu, 1x1 min w 96% etanolu, 1x1 min w 80% etanolu, 1x1 min w 70% etanolu, 1x1 min w ddH₂O, 1x4 min w hematoksynie Mayera, 1x10 min w ddH₂O, 1x2min w 0,5% eozynie, 1x30 s w ddH₂O, 1x30 s w 80% etanolu, 2x30 s w 96% etanolu, 3x1 min w 99% etanolu i 1x1 min w ksylolu.
7. Wyjmij szkiełko z ksylolu i szybko przykryj chusteczkę pożywką montażową. Unikaj całkowitego wyschnięcia chusteczki, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij poplamioną chusteczkę.

Results

Tutaj pokazujemy dwa typowe przykłady morfologiczne unaczynienia siatkówki u dorosłego danio pręgowanego tg(fli:EGFP): raz wizualizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 9A) i raz za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (Rysunek 9B). Odsłonięta struktura siatkówki wykazuje wysoce zorganizowany wzór. Silna autofluorescencja jest widoczna w siatkówce danio pręgowanego, gdy jest wizualizowana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Dlatego zaleca się wizualizację tylko warstwy naczyniowej za pomocą skanu konfokalnego w celu zmniejszenia fluorescencji tła i zwiększenia kontrastu. W przypadku szybszej akwizycji obrazu lub sytuacji, w których wystarczą dane jakościowe, mikroskop fluorescencyjny jest atrakcyjną alternatywą.

Rycina 9: Reprezentatywne zdjęcia unaczynienia siatkówki dorosłego dg (fli: EGFP) danio pręgowanego. Przedstawiono dwa typowe przykłady morfologiczne unaczynienia siatkówki: Centralna tętnica wzrokowa rozgałęzia się na 5-7 głównych naczyń, które następnie rozgałęziają się w szereg arkad. Wszystkie dalsze naczynia spływają do żyły obwodowej (CV), ograniczając zewnętrzną część każdego płatka. Wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy 2,5-krotnym powiększeniu (A). Wizualizacja unaczynienia siatkówki za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej za pomocą połączonego skanu kafelkowego 5x5 z pojedynczym obrazem (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tętnica wzrokowa przenika przez siatkówkę w głowie nerwu wzrokowego i w większości próbek rozprzestrzenia się na 5-7 głównych naczyń (Rysunek 10A). Główne naczynia rozgałęziają się następnie w szereg arkad i łączą się z wewnętrznym okręgiem wzrokowym (IOC), zwanym również żyłą obwodową (CV), otaczającym tarczę nerwu wzrokowego na obrzeżach płasko zamontowanej siatkówki (patrz Rysunek 10B). IOC to naczynie żylne, które odprowadza krew tętniczą na wewnętrznej krawędzi gałki ocznej (bulbus oculi). Unaczynienie siatkówki danio pręgowanego wykazuje również obszary o wysokiej aktywności naczyniowej z rozgałęzieniami naczyń włosowatych i kiełkowaniem angiogennym (Rysunek 10C). Ta aktywność naczyniowa jest głównie zlokalizowana w pobliżu MKOl. Ważne jest, aby zauważyć, że to samo oko może wykazywać zarówno wysoką, jak i niską aktywność naczyniową w różnych obszarach siatkówki (porównaj Rysunek 10B i Rysunek 10C). Ogólnie rzecz biorąc, unaczynienie siatkówki danio pręgowanego wykazuje więcej przestrzeni jałowej i mniej naczyń włosowatych między głównymi gałęziami w porównaniu z, na przykład, siatkówką myszy¹⁷. Oba oczy każdej próbki powinny być analizowane, ponieważ układ naczyniowy może się różnić między nimi, a pojedyncze badanie może prowadzić do stronniczości.

Rycina 10: Powiększone obszary wizualizacji naczyń siatkówki dorosłego dg (fli: EGFP) danio pręgowanego. Tętnica wzrokowa rozgałęziająca się na naczynia główne (A). Naczynia włosowate siatkówki w obszarze o niskiej aktywności naczyniowej łączące się z wewnętrznym okręgiem wzrokowym (IOC) u dołu zdjęcia (B). Naczynia włosowate siatkówki w obszarze o wysokiej aktywności naczyniowej łączące się z IOC (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wysoce zachowana architektura warstw neuronalnych jest już obecna u danio pręgowanego od około 72 godzin po zapłodnieniu (hpf)¹⁸. Siatkówka dorosłego danio pręgowanego wykazuje następujące warstwy od wewnątrz na zewnątrz (Ryc. 11): warstwa komórek zwojowych (GCL), wewnętrzna warstwa splotowata (IPL), wewnętrzna warstwa jądrowa (INL), zewnętrzna warstwa splotowata (OPL), zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL), warstwa fotoreceptorów (PL) i pigmentowany nabłonek siatkówki (RPE). Oszacowanie parametrów naczyniowych na podstawie wizualizacji unaczynienia siatkówki przedstawiono w Rysunek 12. Wewnętrzne unaczynienie siatkówki znajduje się na warstwie komórek zwojowych (GCL) (Ryc. 13B, biała ramka), podczas gdy naczynia włosowate naczyniówki byłyby związane z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE).

Ryc. 11: Barwienie HE oka dorosłego ryba pręgowanego. Przegląd przekroju poprzecznego całego oka po zdjęciu soczewki (A). Warstwy siatkówki dorosłego danio pręgowanego eye¹⁹ (B). Wskazanie (strzałka) naturalnego punktu zerwania w PL (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Modele neoangiogenezy siatkówki wywołanej niedotlenieniem wykazują zwiększoną liczbę punktów rozgałęzień, pędów angiogennych, całkowitej powierzchni naczyń krwionośnych i zmniejszonej odległości międzykapilarnej u danio pręgowanego²⁰. Odkrycia te potwierdzają ideę, że danio pręgowany jest podatny na cukrzycowe powikłania mikronaczyniowe²¹, ponieważ kluczowe wyniki późniejszej retinopatii cukrzycowej obejmują neoangiogenezę za pośrednictwem niedotlenienia, która jest silnie związana z ekspresją VEGF. Wywołane hiperglikemią zmiany w siatkówce danio pręgowanego prowadzą do zwiększenia grubości naczyń, ale utrzymują ogólny wzór²². Naprzemienne zanurzanie w roztworach glukozy przez 30 dni również zmniejsza grubość IPL i INL²³. Wykazano już również bezpośredni wpływ metabolitów glukozy u danio pręgowanego jako metabolicznych orędowników waskulopatii. Dodatkowe rozgałęzienie naczyń zaobserwowano w unaczynieniu tułowia zarodków danio pręgowanego po inkubacji z methylglyoxalem²⁴. W chwili obecnej nie ma modelu zwierzęcego, który zapewniałby wszystkie kluczowe kryteria retinopatii cukrzycowej. Często stwierdza się wczesne zmiany, ale brakuje progresji do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej²⁵. Danio pręgowany również mieści się w tej definicji, ponieważ do tej pory widzieliśmy tylko neoangiogenezę za pośrednictwem hipoksji lub zmiany wywołane hiperglikemią. Obecne odkrycia potwierdzają tezę, że danio pręgowany jest podatny na zmiany naczyniowe wywołane hiperglikemią i jako model zwierzęcy może potencjalnie wykazywać progresję do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. W zależności od siły i ekspozycji na efekt zależny od hiperglikemii, właściwy model eksperymentalny może prowadzić do niedokrwienia w niektórych obszarach siatkówki danio pręgowanego i promować neoangiogenezę jako kluczowe kryteria proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. Ponieważ jednak danio pręgowany jest stosunkowo nowym graczem w dziedzinie modelowania długoterminowych patologii mikrokrążenia, nadchodzące modele cukrzycy u danio pręgowanego dostarczą dalszych informacji i wyjaśnią jego znaczenie w odniesieniu do innych modeli i ich patologii. Na przykład, krzyżówka danio pręgowanego tg(gata1a:DsRed) z erytrocytami znakowanymi na czerwono do linii tg(fli:EGFP) może być wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji potencjalnych krwawień wewnątrzgałkowych w przyszłych modelach danio pręgowanego pokazujących mikrotętniaki jako predyktor progresji do PDR.

Ponieważ unaczynienie siatkówki przechodzi w ciąg arkad, ocena odległości międzynaczyniowej, liczby punktów rozgałęzień i całkowitej powierzchni naczyniowej jest związana z odległością od centralnej tętnicy wzrokowej. Aby uniknąć błędu systematycznego w ocenianych parametrach naczyniowych, wymagany jest punkt orientacyjny. MKOl jest taką strukturą i jest bardzo istotny, ponieważ obszary aktywności naczyniowej leżą w bezpośredniej bliskości przestrzennej. Aby uzyskać spójną ocenę, skan siatkówki należy podzielić na wiele prostokątnych odcinków obrazu ze stałą odległością od IOC. Cała siatkówka powinna być analizowana, a obrazy numerycznie symetrycznie rozmieszczone. Siatkówka danio pręgowanego pokazuje obszary o dużej i niskiej gęstości naczyń włosowatych, a nierównomierny rozkład odcinków obrazu może prowadzić do dodatkowego odchylenia.

Rycina 12: Przykładowa prezentacja parametrów naczyniowych jako odczyt wizualizacji naczyń siatkówki. Pomiar odległości międzynaczyniowej (czerwona podwójna strzałka) w pobliżu wewnętrznego koła wzrokowego (IOC) (A). Trzy rozgałęzienia (czerwone kółka) w pobliżu MKOl (B). Wizualizacja unaczynienia siatkówki danio pręgowanego z powiększonym obszarem (czerwona ramka) przedstawiającym kiełkujące naczynie (C). Średnica naczynia mierzona w pewnej odległości (biała podwójna strzałka) od tętnicy centralnej (biały krzyż) (D). Gęstość naczyń to procent powierzchni siatkówki zajmowanej przez nakładające się naczynia (ukośne czerwone linie) (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zmierzyć odległość międzynaczyniową, należy standardowo ustawić pewną odległość do IOC (ryc. 12A, biała podwójna strzałka) i narysować wyimaginowaną linię poziomą (ryc. 12A, pozioma biała linia) równoległą do IOC. Odległość między naczyniami na tej linii zsumowana i uśredniona arytmetycznie równa się odległości międzynaczyniowej. Punkty rozgałęzień są zliczane wewnątrz każdego obrazu, gdy naczynie rozdziela się, a więcej niż jedno światło naczyniowe kontynuuje się od punktu początkowego. Obejmuje to również poziome połączenia między naczyniami włosowatymi. Ważne jest, aby zachować spójność w analizie i zdecydować, które punkty rozgałęzień należy policzyć, i zachować te zasady przez cały eksperyment, aby zmniejszyć niepotrzebną zmienność. Kiełkowanie naczyń krwionośnych, jak pokazano na rycinie 12C, jest kolejnym parametrem, który można policzyć na każdym obrazie w celu oceny wpływu na unaczynienie siatkówki. Pędy angiogenne nie podążają za arkadkowym następstwem między tętnicą centralną a IOC i skupiają się w pobliżu zewnętrznych części siatkówki. Aby ocenić niektóre średnice naczyń, zawsze potrzebny jest punkt orientacyjny, od którego ustalona odległość oznacza miejsce pomiaru. Początek tętnicy centralnej wewnątrz siatkówki zapewnia takie wskazówki dla głównych naczyń macierzystych (ryc. 12D, biały krzyż). Obszar zajmowany przez naczynia (ryc. 12E, ukośne czerwone linie) jako procent całego obszaru siatkówki jest gęstością naczyniową i pośrednio koreluje z obszarem jałowym.

Pełny skan konfokalny jednej próbki powinien składać się z wielu bardzo szczegółowych obrazów, aby umożliwić wizualizację nadmiernego kiełkowania małych naczyń włosowatych. Aby zoptymalizować czas i zasoby poświęcone na ten etap, należy zastosować zautomatyzowaną procedurę uprawy z ogólną głębokością skanowania dla każdej płytki. Nierównomierne zamontowanie siatkówki może znacznie wydłużyć czas poświęcony na skanowanie naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopu konfokalnego. W optymalnym podejściu chciałoby się zeskanować tylko warstwę naczyniową (ryc. 13B, biała ramka), ale często konieczne jest częściowe włączenie GCL. Pozostawienie nadmiernej długości nerwu wzrokowego po obcięciu, a także nacięcia mające na celu uzyskanie zbyt krótkiego płaskiego mocowania, może prowadzić do nierównomiernego montażu.

Rycina 13: Porównanie barwienia HE i autofluorescencji w siatkówce dorosłego danio pręgowanego. Unaczynienie siatkówki w centrum uwagi powyżej GCL (A). Unaczynienie siatkówki (biała ramka) z zielonym sygnałem EGFP i warstwami siatkówki wykazującymi silną autofluorescencję (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ponieważ prawidłowe przygotowanie unaczynienia siatkówki danio pręgowanego wymaga wcześniejszego treningu, głównym ograniczeniem tej techniki jest mała wielkość próbki z nieprzeszkolonymi dyssektorami i silnie zróżnicowanymi wynikami przygotowania. Podczas gdy przygotowanie oczu zebry tg(fli:EGFP) daje szybki wgląd w stan układu krwionośnego, technika ta nadal wykorzystuje około 20 minut czasu pracy na siatkówkę dla doświadczonego badacza. Wszystkie te etapy przygotowania do unaczynienia siatkówki muszą być wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym, a prosektory muszą pozostać skoncentrowane przez cały czas, ponieważ nieostrożny krok może potencjalnie spowodować pęknięcie naczynia. Sekcja powinna być praktykowana regularnie, ponieważ długotrwała nieobecność w przygotowaniu zmniejsza prawdopodobieństwo utrzymania integralności naczynia przez osobę przeprowadzającą seksektorium.

Co więcej, dodatkowy odczyt za pomocą immunohistochemii (IHC) jest nadal ograniczony, ponieważ tylko niewielka liczba przeciwciał zwalidowanych na tkankach ludzkich i gryzoni działa z danio pręgowanym. Eksperymentatorom zainteresowanym IHC zaleca się poszukiwanie przeciwciał specyficznych dla danio pręgowanego, zwłaszcza podczas pracy z nowymi celami. Alternatywnie zaleca się stosowanie dodatkowych linii reporterowych danio pręgowanego, które są przydatne do badania komórek poza układem naczyniowym oka. Strategia ta jest jednak czasochłonna, ponieważ potrzeba kilku miesięcy, aby wygenerować dorosłe linie zebry, które przenoszą wiele transgenicznych reporterów.

Niemniej jednak danio pręgowany ma wyjątkowy wachlarz zalet. Są stosunkowo małe i łatwo się rozmnażają. Mogą szybko dorosnąć do dorosłego stadium, a ich zarodki są optymalne do badań przesiewowych leków. Dziedzina ta szybko się rozwija i coraz więcej literatury staje się dostępne. Dzięki zdolności do generowania nokautów genów z dużą prędkością i obfitości linii reporterowych fluorescencji transgenowej, wybór danio pręgowanego jest ograniczony tylko przez wybrane pytanie badawcze.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl2*6H20	Roth	5239.2
MgSO4*7H20	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sód diwodorofosforan	Roth	2370.1
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS-222,Trikaina)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agaroza	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
szalka Petriego	Greiner Bio one	633180
Płytka sześciodołkowa	StarLab	CC7682-7506
Igła	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Mikro pęseta	World Precision Instruments	14095
Nożyczki do mikrodysekcji	World Precyzyjne instrumenty	501778
Szkiełko szklane	Carl Roth	H872.1
Szkiełko nakrywkowe 22mmx22mm	neoLab
Skalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy MZ10 F
SP5 DS	Leica	NA
M80	Leica	NA
Linia danio pręgowanego: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	patrz Odniesienie 15
Mayer' s hematoksylina	Dr. K. Hollborn & Sö hne	0088663
0,5% eozyny	Dr. K. Hollborn & Sö hne	NA
99,9% etanol	Roth	9065.2
Parafina	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Aceton	Emsure	606-001-00-8
Mikrotom RM 2165	Leica	NA