Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.
Artykuł metodologiczny
Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Retinopatia cukrzycowa jest główną przyczyną ślepoty wśród dorosłych w średnim wieku. Rosnąca częstość występowania cukrzycy na całym świecie sprawi, że zapobieganie cukrzycowym powikłaniom mikronaczyniowym stanie się jednym z kluczowych kierunków badań w nadchodzących dziesięcioleciach. Specjalistyczna, celowana terapia i nowatorskie leki terapeutyczne są potrzebne, aby poradzić sobie z rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku. Danio pręgowany jest uznanym modelem zwierzęcym dla badań rozwojowych o rosnącym znaczeniu dla modelowania metabolicznych wieloczynnikowych procesów chorobowych. Zalety tego gatunku pozwalają na optymalną wizualizację i wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, w połączeniu z silną zdolnością do eliminowania interesujących genów. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego danio pręgowanego tg (fli: EGFP) jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą lub uszkodzeniem naczyń. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie siatkówki danio pręgowanego i całkowite zamontowanie tkanki. Wizualizację odsłoniętych naczyń uzyskuje się następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej zielonego reportera EGFP wyrażonego w unaczynieniu siatkówki dorosłego. Prawidłowe obchodzenie się z tkanką doprowadzi do lepszych wyników i mniejszego pękania naczyń wewnętrznych, aby zapewnić wizualizację niezmienionej struktury naczyniowej. Metoda ta może być stosowana w modelach waskulopatii siatkówki danio pręgowanego związanych ze zmianami w architekturze naczyń krwionośnych, a także neoangiogenezą.
Wprowadzenie
Cukrzyca jest chorobą metaboliczną definiowaną przez hiperglikemię, która wynika z dysfunkcyjnej sekrecji insuliny lub niewłaściwej odpowiedzi tkanek na wydzielaną insulinę. WHO szacuje, że w 2014 roku 42 miliony dorosłych żyło z cukrzycą1, a przewiduje się, że do 2035 roku zapadalność na cukrzycę na całym świecie wzrośnie do 8–10% populacji2, co sprawia, że cukrzyca stanie się jedną z kluczowych dziedzin badawczych w nadchodzących dziesięcioleciach. Życie z chronicznie wysokim poziomem cukru we krwi prowadzi do długoterminowych powikłań mikronaczyniowych, w tym do retinopatii, nefropatii i polineuropatii cukrzycowej. Zarządzanie tymi powikłaniami i ich zapobieganie są trudne; w rzeczywistości cukrzyca staje się najczęstszą przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), prowadzącej do dializ2, oraz jest główną przyczyną ślepoty wśród osób w średnim wieku3.
Pierwotnymi przyczynami uszkodzeń mikronaczyniowych w oku pacjenta z cukrzycą są przewlekła hiperglikemia, zmiany metaboliczne oraz określone czynniki ryzyka (np. nadciśnienie tętnicze, dyslipidemia), prowadzące do dysfunkcji śródbłonka naczyniowego, zaniku perycytów i regresji kapilarnej, co skutkuje powstaniem bezkomórkowych rękawów naczyniowych. Wynikająca z tego niedokrwienność siatkówki jest przyczyną neowaskularyzacji i zwiększonej przepuszczalności naczyniowej, co sprzyja rozwojowi proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)4. Retinopatia cukrzycowa była ogólnie wykrywana u 37% pacjentów z cukrzycą, natomiast retinopatia cukrzycowa zagrażająca wzrokowi stwierdzona została u 12% przebadanej białej kohorty europejskiej w badaniu UKADS5. Obecne leczenie pozwala jedynie zapobiegać dalszym powikłaniom i nie jest w stanie w pełni odwrócić już powstałych uszkodzeń. Fotokoagulacja panretinalna, poza kontrolą glikemii, jest standardową terapią w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR), lecz oddziałuje ona również na sąsiednie zdrowe tkanki. Interwencje z użyciem przeciwciał anty-VEGF wykazują obiecujące wyniki jako alternatywa dla leczenia laserowego6,7, jednak w ostateczności niezbędna jest specjalistyczna, celowana terapia oraz nowe leki, aby zarządzać rosnącą liczbą pacjentów zagrożonych utratą wzroku.
Ustanowione modele badań zwierzęcych nad retinopatią cukrzycową nie odzwierciedlają każdego aspektu ludzkiej patofizjologii. Dobór odpowiedniego gatunku, aby sprostać konkretnym wymaganiom naukowego pytania badawczego, jest jednym z najważniejszych elementów projektu eksperymentalnego. Zarodek rybki zebrafish (Danio rerio) jest już szeroko stosowany w badaniach nad rozwojem i zapewnia optymalne praktyczne tło do wyciszania (knockdown) lub usuwania (knockout) specyficznych genów za pomocą morfolino lub techniki CRISPR/Cas98. Metody te mogą być łatwo wykorzystane u rybek zebrafish do badania genów zidentyfikowanych w szeroko zakrojonych badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS), co pozwala uzyskać wgląd w konkretne mechanizmy progresji choroby i podatności na nią9. Krótki czas generacji, duża liczba potomstwa, łatwa i niedroga obsługa oraz rosnące wsparcie dla testów diagnostycznych zwiększyły znaczenie modelu zebrafish, zwłaszcza biorąc pod uwagę jego ogromny potencjał w modelowaniu chorób metabolicznych. Wykazano, że zachowanie mechanizmów biologicznych u rybek zebrafish stanowi podstawę dla rozwoju terapii farmakologicznych. Na przykład wykazano, że lek przeciwcukrzycowy metformina i obniżająca poziom cholesterolu simwastatyna „leczą” stany w modelach wysokiej ekspresji PEPCK indukowanej cAMP/deksametazonem oraz hipercholesterolemii indukowanej dietą wysokocholesterolemową10,1,12. To rosnące zrozumienie nadrzędnych, zachowanych mechanizmów metabolicznych jest dodatkowo wspierane przez zwiększającą się liczbę modeli cukrzycy u rybek zebrafish, obejmujących eksperymenty takie jak: naprzemienna inkubacja w roztworach glukozy, ablacja komórek beta indukowana streptozotocyną, ablacja komórek beta za pośrednictwem nitroreduktazy z użyciem proleku metronidazolu, cukrzyca monogeniczna indukowana przez knockdown lub knockout genu pdx1, a także modele zwiększonej insulinooporności w mięśniach szkieletowych12. Te już ustanowione protokoły, wspomniana specyfika gatunkowa oraz możliwość efektywnej manipulacji genomem w dużej liczbie próbek demonstrują zalety rybek zebrafish w badaniu mechanizmów napędzających złożone procesy chorobowe, a także możliwość przesiewania interwencji farmakologicznych.
Ogólna znajomość podstawowej anatomii oka zebrafish (Rycina 1) jest niezbędna dla osoby wykonującej preparację, aby móc wykorzystać zebrafish jako model angiopatii siatkówki. Oko zebrafish posiada sześć mięśni pozagałkowych: cztery mięśnie proste i dwa mięśnie skośne, które przyczepiają się do zewnętrznej strony gałki ocznej na poziomie twardówki13. Rogówka to przezroczysta tkanka pokrywająca soczewkę, która przechodzi bezpośrednio w twardówkę tworzącą zewnętrzną powłokę oka. Twardówka jest nieprzezroczysta, posiada częściowo odbijającą światło powierzchnię i jest silnie pigmentowana. Sama soczewka ma bardziej kulisty kształt niż jej ludzki odpowiednik. Siatkówka składa się z trzech warstw jądrowych komórek neuronalnych, natomiast doprowadzające tlen naczynia siatkówki są ściśle powiązane z wewnętrzną warstwą komórek zwojowych, ale nie tworzą sieci podsiatkówkowej. Naczynia naczyniówkowe natomiast znajdują się pomiędzy twardówką a siatkówką i są powiązane z nabłonkiem pigmentowym siatkówki (RPE). Ta sieć kapilarna dostarcza tlen do zewnętrznych części siatkówki14.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie oka dorosłego danio pręgowanego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Prostą wizualizację naczyń krwionośnych siatkówki można osiągnąć dzięki zastosowaniu transgenicznej linii danio-ostrobłotników tg(fli:EGFP)15. Zielone białko fluorescencyjne, ekspresowane pod kontrolą promotora fli w komórkach śródbłonka naczyń, stanowi podstawę wizualizacji za pomocą skaningowego mikroskopu laserowego w kolejnych etapach. Osiąga się to poprzez wypreparowanie siatkówki danio-ostrobłotnika i przygotowanie preparatu całego tkankowego (whole-mount). Ten model transgeniczny zapewnia szybki odczyt naczyniowy bez konieczności stosowania znakowania wewnątrznaczyniowego lub immunohistochemii całych tkanek. Aby analizować retinopatię cukrzycową u danio-ostrobłotników, każdy operator powinien stosować ustandaryzowaną procedurę preparowania krok po kroku. Poniższy protokół preparowania umożliwia innym grupom badawczym łatwą ocenę zmian naczyniowych w odsłoniętych naczyniach oka dorosłego danio-ostrobłotnika oraz służy jako wytyczna do ustanowienia zoptymalizowanej rutyny preparowania siatkówki danio-ostrobłotnika.
Protokół
Wszystkie procedury, w tym kroki dotyczące zwierząt doświadczalnych, zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt (Regierungspräsidium Karlsruhe) i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Heidelbergu.
1. Przygotowanie utrwalacza (4% PFA/PBS)
- Przygotowywać utrwalacz codziennie, aby zapewnić optymalne zachowanie integralności histologicznej tkanki.
- Rozpuścić 0,2 g wodorotlenku sodu (NaOH) w 90 mL wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O), stale mieszając w temperaturze pokojowej.
- Dodać 4 g paraformaldehydu (PFA) i mieszać przez co najmniej 5-10 min, aż roztwór stanie się całkowicie przejrzysty, aby zapewnić depolimeryzację makrocząsteczek.
Ostrzeżenie: PFA jest toksyczny, należy z nim obchodzić się ostrożnie. - Rozpuścić 0,84 g wodorodiwodorofosforanu sodu (NaH2PO4) w roztworze i skontrolować pH, aby wynosiło 7,2.
- Dopełnić objętość do 10 mL wodą ddH2O i przefiltrować roztwór przez papier filtracyjny stopnia 3.
- Przechowywać 4% PFA/PBS w lodzie.
2. Przygotowanie roztworu do eutanazji
UWAGA: Poniższe kroki zostały wykonane z użyciem szczepu dzikiego typu rybek zebrafish ABTL w wieku od 6 do 8 miesięcy.
- Do eutanazji rybek zebrafish należy użyć metanosulfonianu etylowego 3-aminobenzoesanu, znanego również jako „tricaina” lub MS-2, w stężeniu 0,31 mg/mL16. Jako rozpuszczalnik do roztworu eutanazyjnego należy wykorzystać 1x wodę do jaj (egg water), stosowaną do hodowli embrionów zebrafish. Przed przystąpieniem do pracy z uspokojonymi rybami należy zazwyczaj sprawdzić prawidłową głębokość znieczulenia, stwierdzając utratę równowagi oraz brak reakcji na dotyk.
- Aby przygotować 1 0 mL 10x wody do jaj, należy dodać następujące sole do 1 0 mL wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O>), stale mieszając w podanej kolejności: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,4 g CaCl2*6H2O, 1,32 g MgSO4*6H2O.
3. Fixacja tkanek ryby danio
- Przenieś wcześniej do dołków płytek sześciodołkowych po 6 ml 4% roztworu PFA/PBS na każdą próbkę.
- Uśmierć dorosłe rybki danio-ostrobramkowe (uproszczone wcześniej w standardnym cyklu dobowym oświetlenia, np., 12 h: 12 h) 2 h po zapaleniu świateł rano, umieszczając je w roztworze trikainy i czekając do momentu uśmiercenia. Następuje po ustaniu ruchu opercularnego, co może potrwać do 10 min.
- Wyjmij ryby z roztworu do eutanazji z użyciem trikainy i umieść je na świeżych ręcznikach papierowych. Osusz ryby i za pomocą skalpela odetnij głowy za operculum (patrz Rycina 2A). Przenieść głowy bezpośrednio do przygotowanych płytek wielodołkowych zawierających świeżo przygotowany utrwalacz.
- Przechowywać płytki z głowami ryb w temperaturze 4 °C przez noc, przez co najmniej 24 h, aby zapewnić przenikanie utrwalacza do głębszych warstw siatkówki.
UWAGA: Głowy ryb zebrafish można przechowywać maksymalnie przez 48 h w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze 4 °C przed przygotowaniem, bez istotnej utraty siły sygnału fluorescencji. Zwiększone opóźnienie może prowadzić do utraty integralności tkanki i pogorszenia jakości obrazu, dlatego należy go unikać.
4. Przygotowanie unaczynienia siatkówki rybki zebra
- Wypełnij szalkę Petriego do jednej trzeciej podgrzaną 2% agarozą i odczekaj, aż agar stężeje. Przykryj płytkę z agarem 1x PBS, aby stworzyć przestrzeń roboczą do sekcji oczu.
UWAGA: Pozwoli to na stabilizację pęset preparacyjnych oraz zapewni niski nacisk na tkankę podczas sekcji, co zmniejszy prawdopodobieństwo uszkodzeń strukturalnych. Wszystkie kolejne etapy przygotowania należy przeprowadzać w tej przestrzeni roboczej, używając prostej pęsety nr 5 z cienkimi końcówkami pod mikroskopem stereoskopowym z dodatkowym oświetleniem episkopowym.- Podczas sekcji stosuj powiększenie od 4,0x do 6,0x, aby umożliwić zarówno ogólny przegląd, jak i szczegółową ocenę tkanki.
- Przenieś utrwaloną próbkę do szalki Petriego i, trzymając głowę jedną pęsetą za powierzchnią cięcia, wprowadź drugą pęsetę (złączoną spinką) pod gałką oczną w jamie oczodołu. Powoli otwórz pęsetę pod okiem i chwyć nerw wzrokowy, a następnie ostrożnie rozerwij i odseparuj oczy (Rycina 2B).
Rysunek 2: Usunięcie oka dorosłego danio pręgowanego. Widok boczny rogówki z okiem wciąż znajdującym się w jamie oczodołowej i nienaruszonym nerwie wzrokowym (A)Widok z boku rogówki z odseparowanym okiem (B)Schematyczne przedstawienie oka danio pręgowanego na tym etapie (C). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
- Usuń pozostałe cztery mięśnie proste oraz dwa mięśnie skośne oka, które są nadal przytwierdzone do gałki ocznej, a także resztki tkanki pozagałkowej łączącej oko z jamą oczną (porównaj Rysunek 3 i Rysunek 4).
- Aby to osiągnąć, podtrzymaj oko za pomocą częściowo zamkniętej pęsety, a następnie, chwyćając strukturę drugą pęsetą, delikatnie oderwij ją ruchem diametralnym. Ponieważ bezpośrednie chwytanie gałki ocznej prowadzi do przerwania naczyń wewnętrznych, technika ta jest odpowiednio łagodna, aby zachować układ naczyniowy.
Rycina 3: Oko dorosłego danio pręgowanego z widocznymi mięśniami pozagałkowymi. Widok boczny z przyczepem mięśnia pozagałkowego do lewej zewnętrznej krawędzi gałki ocznej w obszarze ostrości (A)Widok boczny nerwu wzrokowego z mięśniami gałkoruchowymi symetrycznie flankującymi nerw wzrokowy (B)Schematyczne przedstawienie oka zebrafish na tym etapie (C). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Używając jednorazowej igły 27G (0,4 x 19 mm), należy przebić rogówkę (Rysunek 4C, czerwona strzałka) w jej zewnętrznym obszarze. Przez powstały otwór należy uchwycić rogówkę oboma pęsetami i lekko ją rozciąć. Następnie należy ostrożnie wykonać centralne nacięcie o wielkości odpowiadającej średnicy danej źrenicy.
Rysunek 4: Oko dorosłego danio pręgowanego po usunięciu wszystkich mięśni pozagałkowych. Widok z boku z widocznym prześwitującym zewnętrznym brzegiem gałki ocznej (A)Widok boczny nerwu wzrokowego z nerwem wzrokowym w centrum. Odbijająca światło twardówka nie pokrywa całego obszaru wokół nerwu (czerwona przerywana linia). (B)Schematyczne przedstawienie oka danio-ostrobramkowego na tym etapie (C). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Wywarciaj nacisk na stronę rogówkową gałki ocznej (bulbus oculi) na zewnętrznej krawędzi rogówki powyżej tęczówki. Spowoduje to powstanie niewielkiego wgłębienia i przesunięcie soczewki na wysokość pęknięcia rogówki. Wsuń pęsetę pod soczewkę i usuń ją (Rysunek 5A).
Rysunek 5: Oko dorosłej ryby danio prążkowanej w trakcie procesu usuwania soczewki. Widok boczny rogówki z soczewką przesuniętą przez rozdarcia rogówki (A)Widok boczny rogówki z soczewką obok gałki ocznej (B)Schematyczny rysunek oka rybki zebrafish na tym etapie (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Odwróć oko do góry nogami tak, aby nerw wzrokowy był skierowany w stronę badacza. Zauważ, że twardówka i rogówka są połączone i tworzą włóknistą tunikę gałki ocznej, która chroni miseczkowatą siatkówkę (Rysunek 6).
- Ta powłoka, składająca się z rogówki i twardówki, nazywana jest również „corneosclera” i pozostawia wolną przestrzeń wokół nerwu wzrokowego (Rysunek 4B, czerwona przerywana linia). Wprowadź igłę w to miejsce, aby stworzyć otwór między twardówką a siatkówką.
Rysunek 6: rogówka i twardówka złożone z twardówki i rogówki, oddzielone od pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej. Widok boczny rogówki przedstawiający przejście przezroczystej rogówki w pigmentowaną twardówkę (A)Widok boczny skupiony na części twardówkowej rogówkowo-twardówki (B)Schematyczny rysunek usuniętej rogówki i twardówki (C). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
- Wykorzystując ten dostęp, ostrożnie rozdar pęsetami twardówkę wzdłuż osi na pasy, aby powiększyć otwór wokół nerwu wzrokowego. Należy uważać, aby nie uszkodzić rogówkówki i twardówki w miejscu przejścia do obwodu strony rogówkowej (patrz Rysunek 6A).
- Przytrzymaj twardówkę jedną pęsetą, a następnie, chwytając drugą pęsetą nerw wzrokowy i odciągając go, całkowicie usuń rogówkówkę i twardówkę z oka i ją odrzuć (Rysunek 6). Przed oddzieleniem rogówkówki i twardówki od pozostałej tkanki wewnątrzgałkowej staraj się przeciąć wszelkie połączenia, ponieważ przytwierdzenie do innych struktur będzie punktem krytycznym; ten etap pozwoli uzyskać strukturę w kształcie czary składającą się z tęczówki i siatkówki zawierającej naczynia krwionośne siatkówki (Rysunek 7).
- Utwórz przerwanie w warstwie naczyniówki/RPE, trzymając igłę 27G bokiem do pozostałej czary i zdrapując zewnętrzną powierzchnię krawędzią końcówki igły. Wykorzystaj to przerwanie jako punkt dostępu, aby uchwycić warstwę naczyniówki/RPE i rozdarć ją obiema pęsetami na pasy, zachowując jednak połączenie z tęczówką.
- Następnie prześunij jedną pęsetą pod tęczówką, prowadząc ją okrężnie od zewnątrz, jednocześnie wytwarzając napięcie poprzez pociąganie za przerwany poziom naczyniówki/RPE, aby doprowadzić do odłączenia połączonej struktury.
UWAGA: Tęczówka musi zostać odłączona, aby nie blokowała fluorescencji podczas wizualizacji naczyń (Rysunek 8B). Bezpośrednie chwytanie tęczówki w celu jej usunięcia może prowadzić do rozległych uszkodzeń naczyń, szczególnie w obrębie wewnętrznego kręgu nerwu wzrokowego (IOC), ponieważ tęczówka jest nadal połączona z otaczającą tkanką. Warstwa naczyniówki i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) mogą zostać oddzielone i często zachowują połączenie z tęczówką, co umożliwia łatwe wtórne usunięcie. - Jeśli części tęczówki nie można usunąć, wykorzystaj naturalny punkt pęknięcia, który występuje w oku dorosłego danio-pręgowanego wewnątrz warstwy fotoreceptorów (PL), w sposób podobny do kroku 4.9, aby usunąć tęczówkę.
- Zdrap zewnętrzną stronę pozostałej siatkówki w kształcie czary, aby wywołać przerwy w warstwie PL powyżej punktu pęknięcia (Rysunek 1C, czarna strzałka). Wykorzystaj utworzony dostęp, aby usunąć górną część warstwy, zachowując ewentualne połączenie z tęczówką. Następnie prześunij pęsetą pod tęczówką i prowadź ją okrężnie, jak wspomniano wcześniej, aby odłączyć połączoną strukturę.
UWAGA: Należy zachować cierpliwość, ponieważ cały krok 4.9 może być trudny, ale taka staranność pozwoli uzyskać lepszy efekt w zakresie naczyń niż bezpośrednie chwytanie tęczówki na krawędzi źrenicy lub wymuszanie otwarcia poprzez niszczenie połączeń z warstwą naczyniówki/RPE lub warstwą fotoreceptorów bez ich wcześniejszego usunięcia. Wykonanie tego kroku pozwoli zatem zachować integralność naczyń siatkówki, ale doprowadzi do uszkodzenia zewnętrznych warstw siatkówki.
- Następnie prześunij jedną pęsetą pod tęczówką, prowadząc ją okrężnie od zewnątrz, jednocześnie wytwarzając napięcie poprzez pociąganie za przerwany poziom naczyniówki/RPE, aby doprowadzić do odłączenia połączonej struktury.
Rysunek 7: Oko dorosłego danio pręgowanego po usunięciu rogówki i twardówki. Widok boczny przedstawia pozostałą tkankę wewnątrzgałkową z nienaruszonymą tęczówką i nerwem wzrokowym (A)Widok boczny rogówki z tęczówką w ogniskowej (B)Schematyczne przedstawienie oka rybki zebrafish na tym etapie (C). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Użyj nożyczek mikrodissekcyjnych z prostą krawędzią tnącą o długości 2,5 mm, aby odciąć nerw wzrokowy jak najbliżej siatkówki; pozwoli to na lepsze płaskie zamocowanie tkanki.
Rysunek 8: Oko dorosłego danio-pręgowanego po usunięciu RPE/nabłonka naczyniówkowego oraz uciętym nerwie wzrokowym. Widok boczny nerwu wzrokowego przedstawia siatkówkę z uciętym nerwem wzrokowym (A)Widok boczny rogówki z bezpośrednim wglądem w najgłębszą warstwę siatkówki (B)Schematyczne przedstawienie oka rybki zebrafish na tym etapie (C). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
5. Montowanie naczyń krwionośnych siatkówki
- Przemyj wypreparowaną siatkówkę dwukrotnie przez 5 minut w 1x PBS. Do przenoszenia siatkówki po odcięciu nerwu wzrokowego użyj szpatułki laboratoryjnej z mikrołyżeczką, aby uniknąć bezpośredniego dotykania odsłoniętej tkanki.
- Umieść kroplę PBS na szkiełku przedmiotowym i przenieś do niej siatkówkę. Używając pęsety, przytrzymaj tkankę w miejscu, a następnie przetnij skalpelem strukturę w kształcie kielicha, aby uzyskać płaski kształt czteropłatowy lub pięciopłatowy, w zależności od rozmiaru siatkówki (patrz Rycina 9).
- Odsącz pozostały PBS za pomocą kawałka cienkiego papieru. Należy uważać, aby nie dotknąć siatkówki.
- Zatop płasko zamontowaną siatkówkę w medium montażowym i przykryj szkiełkiem nakrywką. Należy uważać, aby nie wytworzyć piany, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zniekształcić obraz naczyń siatkówki.
- Zminimalizuj przemieszczanie się szkiełka nakrywki i zabezpiecz brzegi bezbarwnym lakierem do paznokci.
6. Wizualizacja naczyń krwionośnych siatkówki
- Należy maksymalnie skrócić odstęp czasu między przygotowaniem a wizualizacją, aby ograniczyć utratę szczegółów obrazu wynikającą ze spadku sygnału fluorescencyjnego. Jeśli bezpośrednia wizualizacja nie jest możliwa, przygotowane preparaty naczyń krwionośnych siatkówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w celu zmniejszenia utraty sygnału, ponieważ degradacja jakości obrazu staje się powoli widoczna 48 h po przygotowaniu.
- Wizualizację preparatów naczyń krwionośnych siatkówki należy przeprowadzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub laserowej mikroskopii konfokalnej.
UWAGA: Wizualizacja naczyń w mikroskopii fluorescencyjnej została osiągnięta przy powiększeniu 2,5x, czasie ekspozycji 2,0 s, wzmocnieniu 6,0x i ustawieniach gamma 1,67. W przypadku mikroskopii konfokalnej wykorzystano laser Ar (48 nm/20 mW) przy mocy 20% w połączeniu z filtrem wzbudzenia TD 48/543/63, obiektywem multi-immersion 20x/0,7 NA z ddH2O jako medium imersyjnym oraz ustawieniami filtra emisji 505-560 nm. Obrazy konfokalne składają się z 4x4, 4x5 lub 5x5 pojedynczych obrazów połączonych za pomocą skanowania mozaikowego (tile scan) w zależności od rozmiaru siatkówki.
7. Przekroje HE siatkówki danio przebrózgowanego
UWAGA: W przypadku preparowania skrawków siatkówki rybki danio barwionych metodą HE, należy przygotować tkankę zgodnie z opisem w protokole do kroku 4.5, a następnie przejść bezpośrednio do kroku 7.1.
- Wymyć enukleowane oczy (po kroku 4.5) dwukrotnie przez 5 minut w 1x PBS. Następnie przenieść tkankę do 70% etanolu (EtOH). Na tym etapie przygotowane oczy można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu zatopienia w parafinie.
- Odtalić tkankę w następujący sposób przed zatopieniem w parafinie: 2x15 min w 80% etanolu, 2x15 min w 90% etanolu, 3x15 min w 96% etanolu, 3x15 min w 99% etanolu, 2x15 min w mieszaninie aceton/9% etanol (1:2), 3x15 min w acetonie. Przechowywać tkankę w parafinie w temperaturze 62 °C przez noc.
- Podgrzać świeżą parafinię do 62 °C i wlać ją do form do zatapiania. Przenieść tkankę bezpośrednio do form i szybko skontrolować prawidłową orientację oczu dla pożądanego przekroju. Następnie nałożyć kasetkę do zatapiania na formę i przykryć dodatkową podgrzaną parafinią.
- Zdjąć formy do zatapiania po ostygnięciu bloków parafinowych. Wyciąć z bloków parafinowych skrawki o grubości 10 µm za pomocą mikrotomu i umieścić je na powierzchni kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C na czas wystarczający do ich całkowitego rozpłaszczenia.
- Przenieść skrawki na szkiełko przedmiotowe i odprowadzić wodę pionowo, aby usunąć nadmiar cieczy, a następnie suszyć przez noc w piecu w temperaturze 45 °C.
- Dalszą obróbkę skrawków w celu deparafinizacji i barwienia HE przeprowadzić według następującego schematu: 4x1 min w ksylolu, 1x1 min w 9% etanolu, 1x1 min w 96% etanolu, 1x1 min w 80% etanolu, 1x1 min w 70% etanolu, 1x1 min w ddH2O, 1x4 min w hematoksylinie Mayera, 1x10 min w ddH2O, 1x2min w 0,5% eozynie, 1x30 s w ddH2O, 1x30 s w 80% etanolu, 2x30 s w 96% etanolu, 3x1 min w 9% etanolu oraz 1x1 min w ksylolu.
- Wyjąć szkiełko z ksylolu i szybko przykryć tkankę medium montażowym. Należy uniknąć całkowitego wyschnięcia tkanki, następnie nałożyć na wierzch szkiełko coverglass i zabezpieczyć zabarwioną tkankę.
Wyniki
Prezentujemy tutaj dwa typowe przykłady morfologiczne naczyń krwionośnych siatkówki u dorosłych rybek zebrafish tg(fli:EGFP): jeden obrazowany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 9A) oraz drugi za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (Rysunek 9B). Ujawniona struktura siatkówki wykazuje wysoce zorganizowany wzorzec. Przy obrazowaniu siatkówki zebrafish za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego widoczna jest silna autofluorescencja. W związku z tym, w celu zmniejszenia fluorescencji tła i zwiększenia kontrastu, zaleca się wizualizację wyłącznie warstwy naczyniowej za pomocą skanowania konfokalnego. W przypadku potrzeby szybszego pozyskania obrazów lub w sytuacjach, gdy dane jakościowe są wystarczające, mikroskop fluorescencyjny stanowi atrakcyjną alternatywę.
Rysunek 9: Reprezentatywne zdjęcia naczyń krwionośnych siatkówki dorosłych rybek zebrafish tg(fli:EGFP). Przedstawiono dwa typowe przykłady morfologiczne naczyń krwionośnych siatkówki: centralna tętnica oczna rozgałęzia się na 5–7 głównych naczyń, które następnie dzielą się na kolejne arkady. Wszystkie pozostałe naczynia odprowadzają krew do żyły obwodowej (CV), ograniczającej zewnętrzną część każdego płatka. Wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu 2,5x. (A)Wizualizacja unaczynienia siatkówki za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej z wykorzystaniem połączonego skanu kafelkowego pojedynczego obrazu 5x5 (B). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Tętnica oczna penetruje siatkówkę w obrębie głowy nerwu wzrokowego i w większości próbek rozdziela się na 5-7 głównych naczyń (Rysunek 10A). Główne naczynia rozgałęziają się następnie w serii arkad i łączą z wewnętrznym kręgiem naczyniowym (IOC), zwanym również żyłą obwodową (CV), która otacza tarczę nerwu wzrokowego na peryferiach siatkówki zamontowanej na płasko (patrz Rysunek 10B). IOC jest naczyniem żylnym, które odprowadza krew tętniczą z wewnętrznej krawędzi gałki ocznej (bulbus oculi). Układ naczyniowy siatkówki danio-ostrosejana wykazuje również obszary wysokiej aktywności naczyniowej z rozgałęzieniami kapilar i pęczkowaniem angiogennym (Rysunek 10C). Aktywność naczyniowa ta jest zlokalizowana głównie w bezpośrednim sąsiedztwie IOC. Należy zauważyć, że to samo oko może wykazywać zarówno wysoką, jak i niską aktywność naczyniową w różnych regionach siatkówki (porównać Rysunek 10B i Rysunek 10C). Ogólnie rzecz biorąc, układ naczyniowy siatkówki danio-ostrosejana wykazuje więcej przestrzeni anaczyniowej i mniej kapilar pomiędzy głównymi odgałęzieniami w porównaniu na przykład do siatkówki myszy17. Należy analizować oba oczy każdej próbki, ponieważ układ naczyniowy może się między nimi różnić, a badanie tylko jednego oka może prowadzić do błędów systematycznych.
Rysunek 10: Powiększone obszary wizualizacji naczyń krwionośnych siatkówki dorosłych danio pręgowanych tg(fli:EGFP). Tętnica oczna rozgałęziająca się na główne naczynia (A)Naczynia włosowate siatkówki w obszarze o niskiej aktywności naczyniowej, łączące się z wewnętrznym kręgiem nerwu wzrokowego (IOC) w dolnej części zdjęcia (B)Naczynia włosowate siatkówki w obszarze wysokiej aktywności naczyniowej łączące się z IOC (C). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Wysoce konserwatywna architektura warstw neuronalnych występuje u danio przeżebrowanego już od około 72 h po zapłodnieniu (hpf)18. Siatkówka dorosłego osobnika danio przeżebrowanego wykazuje następujące warstwy, licząc od wewnątrz na zewnątrz (Rycina 11): warstwę komórek zwojowych (GCL), wewnętrzną warstwę splotowatą (IPL), wewnętrzną warstwę jądrową (INL), zewnętrzną warstwę splotowatą (OPL), zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), warstwę fotoreceptorów (PL) oraz nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE). Szacowanie parametrów naczyniowych na podstawie wizualizacji naczyń siatkówki przedstawiono na Rycini 12. Wewnętrzne naczynia siatkówki znajdują się na warstwie komórek zwojowych (GCL) (Rycina 13B, biała ramka), natomiast kapilary chłonoidalne są powiązane z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE).
Rycina 1: Barwienie HE oka dorosłego danio pręgowanego. Przekrój poprzeczny całego oka po usunięciu soczewki (A)Warstwy siatkówki oka dorosłej danio pręgowanej19 (B)Wskazanie (czarna strzałka) naturalnego punktu pęknięcia w PL (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Modele neoangiogenezy siatkówkowej indukowanej hipoksją wykazują zwiększoną liczbę punktów rozgałęzień, pąków angiogennych, całkowitą powierzchnię naczyniową oraz zmniejszoną odległość międzykapilarną u ryb zebrafish20. Wyniki te wspierają tezę, że ryba zebrafish jest podatna na powikłania mikronaczyniowe związane z cukrzycą21, ponieważ kluczowe cechy zaawansowanej retinopatii cukrzycowej obejmują neoangiogenezę zależną od hipoksji, która jest silnie powiązana z ekspresją VEGF. Zmiany w siatkówce zebrafish indukowane hiperglikemią prowadzą do zwiększenia grubości naczyń, przy jednoczesnym zachowaniu ogólnego wzorca ich rozmieszczenia2. Naprzemienne zanurzanie w roztworach glukozy przez 30 dni zmniejsza również grubość IPL oraz INL23. Wykazano już również bezpośredni wpływ metabolitów glukozy u zebrafish jako metabolicznych czynników sprawczych waskulopatii. Dodatkowe nadmierne rozgałęzianie naczyń zaobserwowano w naczyniach tułowia embrionów zebrafish po inkubacji z metyloglioksalem24. Obecnie nie istnieje model zwierzęcy, który spełniałby wszystkie kluczowe kryteria retinopatii cukrzycowej. Często stwierdza się zmiany wczesne, jednak brakuje progresji do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej25. Ryba zebrafish również wpisuje się w tę definicję, ponieważ do tej pory obserwowano albo neoangiogenezę indukowaną hipoksją, albo zmiany indukowane hiperglikemią. Obecne wyniki wspierają tezę, że zebrafish jest podatny na zmiany naczyniowe indukowane hiperglikemią i jako model zwierzęcy może potencjalnie wykazywać progresję do proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. W zależności od siły i czasu ekspozycji na efekt indukowany hiperglikemią, odpowiedni model eksperymentalny mógłby doprowadzić do niedokrwienia w określonych obszarach siatkówki zebrafish i promować neoangiogenezę jako kluczowe kryterium proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. Jednakże, ponieważ zebrafish jest stosunkowo nowym obiektem w dziedzinie modelowania długoterminowych patologii mikronaczyniowych, nadchodzące modele cukrzycy u zebrafish dostarczą dalszych informacji i pozwolą ocenić jego znaczenie w odniesieniu do innych modeli i ich patologii. Na przykład, krzyżowanie ryb zebrafish tg(gata1a:DsRed) z erytrocytami znakowanymi na czerwono z linią tg(fli:EGFP) mogłoby posłużyć do jednoczesnej wizualizacji potencjalnych krwawień wewnątrzgałkowych w przyszłych modelach zebrafish wykazujących mikrotętniaki jako predyktor progresji do PDR.
Ponieważ układ naczyniowy siatkówki rozwija się w serii łuków, ocena odległości między naczyniami, liczby punktów rozgałęzień oraz całkowitego obszaru naczyniowego jest powiązana z odległością od centralnej tętnicy wzrokowej. Aby uniknąć błędów w ocenie parametrów naczyniowych, wymagany jest punkt orientacyjny. Taką strukturą jest IOC, która jest szczególnie istotna, ponieważ obszary aktywności naczyniowej znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie przestrzennym. Dla zapewnienia spójności oceny skan siatkówki należy podzielić na wiele prostokątnych sekcji obrazu o stałej odległości od IOC. Analizie powinna zostać poddana cała siatkówka, a obrazy powinny być rozłożone numerycznie i symetrycznie. Siatkówka rybki zebrafish wykazuje obszary o wysokiej i niskiej gęstości kapilar, a nierównomierny rozkład sekcji obrazu może prowadzić do dodatkowych błędów pomiarowych.
Rycina 12: Przykład prezentacji parametrów naczyniowych jako wyniku wizualizacji naczyń krwionośnych siatkówki. Pomiar odległości międynaczyniowej (czerwona podwójna strzałka) w pobliżu wewnętrznego kręgutocznego (IOC) (A)Trzy punkty rozgałęzień (czerwone okręgi) w pobliżu IOC (B). Wizualizacja unaczynienia siatkówki rybki zebrafish z powiększonym obszarem (czerwona ramka) przedstawiającym wypukające się naczynie (C)Średnica naczynia mierzona w określonej odległości (biała podwójna strzałka) od tętnicy centralnej (biały krzyżyk) (D)Gęstość naczyń to procent powierzchni siatkówki zajętej przez nakładające się naczynia (czerwone linie ukośne). (E). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Aby zmierzyć odległość między naczyniami, należy wyznaczyć określoną odległość od IOC jako standard (Rysunek 12A, biała podwójna strzałka) i narysować wyimaginowaną linię poziomą (Rysunek 12A, pozioma biała linia) równoległą do IOC. Odległość między naczyniami na tej linii, po zsumowaniu i wyciągnięciu średniej arytmetycznej, stanowi odległość między naczyniami. Punkty rozgałęzień są liczone na każdym zdjęciu wszędzie tam, gdzie naczynie dzieli się i z punktu wyjścia kontynuuje więcej niż jedno światło naczyniowe. Obejmuje to również połączenia poziome między kapilarami. Ważne jest zachowanie spójności analizy i ustalenie, które punkty rozgałęzień należy liczyć, oraz przestrzeganie tych zasad przez cały eksperyment, aby zredukować niepotrzebną zmienność. Kiełkowanie naczyń, przedstawione na Rysunku 12C, to kolejny parametr, który można zliczyć na każdym zdjęciu, aby ocenić wpływ na naczyńkówkę siatkówki. Pąki angiogenne nie podążają za łukowatą sekwencją między tętnicą centralną a IOC i koncentrują się w pobliżu zewnętrznych części siatkówki. Aby ocenić średnice określonych naczyń, zawsze potrzebny jest punkt orientacyjny, od którego określona odległość wyznacza miejsce pomiaru. Początek tętnicy centralnej wewnątrz siatkówki stanowi taki punkt odniesienia dla głównych pni naczyniowych (Rysunek 12D, biały krzyżyk). Obszar zajęty przez naczynia (Rysunek 12E, ukośne czerwone linie), wyrażony jako procent całkowitego obszaru siatkówki, to gęstość naczyniowa, która koreluje pośrednio z obszarem awaskularnym.
Pełny skan konfokalny jednej próbki powinien składać się z wielu obrazów o wysokiej szczegółowości, aby umożliwić wizualizację niewielkich nadpączkowań kapilarnych (hypersprouting). Aby zoptymalizować czas i zasoby poświęcone na ten etap, należy zastosować zautomatyzowaną procedurę kaflowania (tiling) z ogólną głębokością skanowania dla każdego kafelka. Nierówne zamocowanie siatkówki może znacznie wydłużyć czas skanowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopu konfokalnego. W podejściu optymalnym należałoby skanować jedynie warstwę naczyniową (Rycina 13B, biała ramka), jednak często konieczne jest częściowe włączenie GCL. Pozostawienie zbyt długiego odcinka nerwu wzrokowego po uciętym fragmencie, a także zbyt krótkie nacięcia wykonane w celu uzyskania preparatu typu flat-mount, mogą prowadzić do nierównego zamocowania próbki.
Rycina 13: Porównanie barwienia HE i autofluorescencji w siatkówce dorosłego danio pręgowanego. Układ naczyniowy siatkówki w ogniskowej płaszczyźnie powyżej GCL (A)Naczynia krwionośne siatkówki (biała ramka) wykazujące zielony sygnał EGFP oraz warstwy siatkówki wykazujące silną autofluorescencję (B). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ponieważ prawidłowe przygotowanie naczyń krwionośnych siatkówki danio-pręgowanego wymaga wcześniejszego przeszkolenia, głównym ograniczeniem tej techniki jest niewielka wielkość próby w przypadku niedoświadczonych operatorów oraz znaczne zróżnicowanie wyników preparacji. Mimo że przygotowanie oczu ryb zebrafish linii tg(fli:EGFP) pozwala na szybki wgląd w stan naczyń krwionośnych, technika ta wciąż wymaga około 20 min pracy nad jedną siatkówką w przypadku doświadczonego badacza. Wszystkie etapy preparacji naczyń siatkówki muszą być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym, a operator musi zachować pełną koncentrację przez cały czas, ponieważ jeden nieuwaga może doprowadzić do przerwania naczyń. Operator powinien regularnie ćwiczyć, gdyż długa przerwa w wykonywaniu preparacji zmniejsza prawdopodobieństwo zachowania integralności naczyń.
Ponadto dodatkowa analiza za pomocą immunohistochemii (IHC) jest wciąż ograniczona, ponieważ tylko niewielka liczba przeciwciał zwalidowanych na tkankach ludzkich i gryzoni działa u danio pręgowanego. Badaczom zainteresowanym IHC zaleca się poszukiwanie przeciwciał specyficznych dla danio pręgowanego, szczególnie w przypadku pracy z nowymi celami. Alternatywnie zaleca się stosowanie dodatkowych linii reporterowych danio pręgowanego, które są przydatne do badania komórek poza naczyniami krwionośnymi w oku. Strategia ta jest jednak czasochłonna, ponieważ wygenerowanie dorosłych linii danio pręgowanego przenoszących wiele reporterów transgenicznych zajmuje kilka miesięcy.
Niemniej jednak rybka danio oferuje szereg unikalnych zalet. Są one stosunkowo małe i łatwo się rozmnażają. Szybko osiągają stadia dorosłe, a ich embriony są optymalne do przesiewania leków. Dziedzina ta dynamicznie się rozwija i coraz więcej literatury staje się dostępnych. Dzięki możliwości szybkiego generowania nokautów genowych oraz obfitości linii z fluorescencyjnymi reporterami transgenicznymi, wybór rybki danio ogranicza jedynie obrany problem badawczy.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Katrin Bennewitz i Marlene Hausner za hodowlę danio pręgowanego i pomoc techniczną. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Core Facility Live Cell Imaging Mannheim w Centrum Biomedycyny i Technologii Medycznej w Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Badania te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Międzynarodowa Grupa Szkoleniowa 1874/1 "DIAMICOM", projekt SP5 i SP9; Centrum Badawcze Współpracy SFB1118, projekt B1 oraz Centrum Badawcze SFB/TR23 projekt Z5).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sód diwodorofosforan | Roth | 2370.1 | |
| Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS-222,Trikaina) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agaroza | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| szalka Petriego | Greiner Bio one | 633180 | |
| Płytka sześciodołkowa | StarLab | CC7682-7506 | |
| Igła | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Mikro pęseta | World Precision Instruments | 14095 | |
| Nożyczki do mikrodysekcji | World Precyzyjne instrumenty | 501778 | |
| Szkiełko szklane | Carl Roth | H872.1 | |
| Szkiełko nakrywkowe 22mmx22mm | neoLab | ||
| Skalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy MZ10 F | |||
| SP5 DS | Leica | NA | |
| M80 | Leica | NA | |
| Linia danio pręgowanego: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | patrz Odniesienie 15 |
| Mayer' s hematoksylina | Dr. K. Hollborn & Sö hne | 0088663 | |
| 0,5% eozyny | Dr. K. Hollborn & Sö hne | NA | |
| 99,9% etanol | Roth | 9065.2 | |
| Parafina | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Aceton | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Mikrotom RM 2165 | Leica | NA |
Bibliografia
- WHO. Global report on diabetes. , 88(2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172(2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705(2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095(2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748(2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594(2013).
Przedruki i uprawnienia
