Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że mutacje w bogatej w leucynę kinazie powtórzeniowej 2 (LRRK2) są związane z rodzinną chorobą Parkinsona (FPD). Ponieważ nieprawidłowa aktywacja aktywności kinazy LRRK2 jest związana z patogenezą PD, konieczne jest ustalenie metody oceny fizjologicznych poziomów aktywności kinazy LRRK2. Ostatnie badania wykazały, że LRRK2 fosforyluje członków rodziny GTPazy Rab, w tym Rab10, w warunkach fizjologicznych. Chociaż fosforylację endogennego Rab10 przez LRRK2 w hodowanych komórkach można było wykryć za pomocą spektrometrii mas, trudno było ją wykryć za pomocą immunoblottingu ze względu na słabą czułość obecnie dostępnych przeciwciał specyficznych dla fosforylacji dla Rab10. W tym miejscu opisujemy prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez LRRK2 w oparciu o immunoblotting z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w połączeniu ze znacznikiem wiążącym fosforan (znacznik P), którym jest N-(5-(2-aminoetylokarbamoilo)pirydyno-2-ylmetylo)-N,N',N'-tris(pirydyno-2-yl-metylo)-1,3-diaminopropan-2-ol. Niniejszy protokół nie tylko stanowi przykład metodologii wykorzystującej znacznik P, ale także umożliwia ocenę, w jaki sposób mutacje, a także leczenie/podawanie inhibitorów lub jakiekolwiek inne czynniki zmieniają dalszą sygnalizację LRRK2 w komórkach i tkankach.
Wprowadzenie
PD jest jedną z najczęstszych chorób neurodegeneracyjnych, głównie dotykającą neuronów dopaminergicznych w śródmózgowiu, powodując dysfunkcję układu motorycznego u osób starszych1. Podczas gdy większość pacjentów rozwija chorobę Parkinsona w sposób sporadyczny, istnieją rodziny, które dziedziczą tę chorobę. Stwierdzono, że mutacje w kilku genach są powiązane z FPD2. Jednym z genów wywołujących FPD jest LRRK2, w którym do tej pory zgłoszono osiem mutacji missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S i I2020T) związanych z dominująco dziedziczonym FPD o nazwie PARK83,4<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbki do strony SDS z tagiem P
- Wyjmij i wyrzuć pożywkę z 10-centymetrowych szalek, w których hoduje się komórki za pomocą ssania, a następnie umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, najpierw dodając DPBS z boku szalek, aby uniknąć naruszenia warstwy komórkowej, a następnie kilkakrotnie ręcznie kołysz naczyniami w przód iw tył.
- Wyjmij i wyrzuć DPBS za pomocą odsysania i dodaj 2 ml 0,25% (w/v) trypsyny rozcieńczonej w DPBS i delikatnie kołysz szalkami, aby przykryć warstwę komórkową. Naczynia umieścić w inkubatorze CO2 (37 °C, nawilżone powietrze, 5% CO2 ) na 5 min....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
System nadekspresji: Fosforylacja HA-Rab10 przez 3×FLAG-LRRK2 w komórkach HEK293:
Komórki HEK293 przetransfekowano 0,266 µg HA-Rab10 typu dzikiego oraz 1,066 µg 3×FLAG-LRRK2 (typu dzikiego, mutanta nieaktywnego kinazowo (K1906M) lub mutantów FPD). Fosforylację Rab10 badano za pomocą elektroforezy P-tag SDS-PAGE, a następnie immunoblottingu z użyciem przeciwciała anty-HA (Rycina 2). 10 µg białek naniesi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy łatwą i solidną metodę wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 na poziomach endogennych w oparciu o metodologię znacznika P. Ponieważ obecnie dostępne przeciwciało przeciwko fosforylowanemu Rab10 działa tylko z nadekspresjami białek15, obecna metoda wykorzystująca SDS-PAGE ze znacznikiem P jest jedynym sposobem oceny endogennych poziomów fosforylacji Rab10. Ponadto obecna metoda pozwala na oszacowanie stechiometrii fosforylacji Rab10 w komórkach. Ponieważ metodologia P-ta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski, Japonia) za uprzejme dostarczenie plazmidów kodujących 3xFLAG-LRRK2 WT i mutantów. Dziękujemy również dr Dario Alessi (University of Dundee, Wielka Brytania) za uprzejme dostarczenie MLi-2 i plazmidu kodującego HA-Rab10. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Number JP17K08265 (G.I.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| odczynniki | |||
| domowej roboty | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ i sterylizowane przez autoklawowanie | ||
| Chlorek sodu | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Wodorofosforan disodowy sodu 12-wodny | Wako | 196-02835 | |
| Chlorek potasu | Wako | 163-03545 | |
| Diwodorofosforan potasu | Wako | 169-04245 | |
| 2,5% Trypsyna (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Rozcieńczyć 10-krotnie sterylnym DPBS do przygotowania roztworu roboczego |
| Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Płodowa surowica bydlęca | BioWest | S1560 | Inaktywowana termicznie w temperaturze 56 & stopni; C przez 30 min |
| Penicylina-Streptomycyna (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Wodorotlenek sodu | Wako | 198-13765 | |
| Polietylenina HCl MAX, liniowy, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Roztwór podstawowy przygotowano w 20 mM HEPES-NaOH pH 7,0 przy 1 mg/ml, a następnie pH dostosowano do 7,0 za pomocą NaOH |
| Dimetylosulfotlenku | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Kwas solny | Wako | 080-01066 | |
| Eter polioksyetyleno(10) oktylofenylowy | Wako | 160-24751 | Odpowiednik Triton X-100 |
| Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Ortowanad(V) | Wako | 198-09752 | |
| Fluorek sodu | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-glicerofosforowy Kwas disodowy Sól disodowa Pentahydrat | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sód dekahydrat pirofosforanu | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sacharoza | Wako | 196-00015 | |
| Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA | Roche | 11873580001 | Rozpuść jedną tabletkę w 1 ml wody, która może być przechowywana w temperaturze -20 stopni; C przez miesiąc. Użyj go w rozcieńczeniu 1:50 do lizy komórek |
| Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białek | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Dodecylosiarczan sodu | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glicerol | Wako | 075-00616 | |
| Błękit bromofenolowy | Wako | 021-02911 | |
| β-merkaptoetanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Etanol | Wako | 056-06967 | |
| Metanol | Wako | 136-01837 | |
| Znacznik wiążący fosforany akryloamid | Wako | AAL-107 | Znacznik P akryloamid |
| 40% (w/v) roztwór akrylamidu | Nacalai Tesque | 06119-45 | Akrylamid:Bis = 29:1 |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Nadsiarczan amonu (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) roztwór przygotowano przez rozpuszczenie proszku nadsiarczanu amonu w wodzie MilliQ |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Czterowodny chlorek manganu | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Marker masy cząsteczkowej zastosowany w protokole |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0,45 | GE Healthcare | 10600007 | Membrana nitrocelulozowa |
| Filtr membranowy Durapore | EMD Millipore | GVHP00010 | Membrana PVDF |
| Bibuły filtracyjne nr 1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Kwas octowy | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | monolaurynian polioksyetylenoesorbitanu |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Odtłuszczone mleko w proszku | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | Roztwór ECL (normalna czułość) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | Roztwór ECL (wysoka czułość) |
| CBB roztwór barwiący | domowej roboty | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) metanol, 10% (v/v) kwas octowy w 1 l wody MilliQ | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| Odbarwienie CBB roztwór | domowej roboty | 12% (v/v) metanolu, 7% (v/v) kwasu octowego w 1 l wody MilliQ | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | >Komentarze |
| Przeciwciała | |||
| przeciwciało anty-HA | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Używany przy 0,2 μ g/ml do immunoblottingu. |
| Przeciwciało anty-Rab10 | Cell Signaling Technology | #8127 | Używane w 1:1000 do immunoblottingu. Specyficzność została potwierdzona przez CRISPR KO w Ito et al., Biochem J, 2016. |
| przeciwciało anty-pSer935 | Abcam | ab133450 | Stosowane w 1 μ g/ml do immunoblottingu. |
| przeciwciało anty-LRRK2 | Abcam | ab133518 | Stosowane w 1 μ g/ml do immunoblottingu. |
| przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe | Sigma-Aldrich | T9026 | Stosowane przy 1 μ g/ml do immunoblottingu. |
| anty-GAPDH | Santa-Cruz | sc-32233 | Stosowane przy 0,02 μ g/ml do immunoblottingu. |
| Peroksydaza AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Stosowany przy 0,16 μ g/ml do immunoblottingu. |
| Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Stosowany przy 0,16 μ g/ml do immunoblottingu. |
| Nazwa | Firma | >Numer katalogowy | >Komentarze |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 ° stopni; C |
| MLi-2 | Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee) | Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 ° C | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee) | Ten plazmid wykazuje ekspresję amino-końcowego znakowanego HA ludzkiego Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Ito et al., Biochemia, 46: 1380– 1388 (2007). Ten plazmid wyraża amino-końcowy 3xFLAGA znakowany ludzki LRRK2 typu dzikiego. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Ito et al., Biochemia, 46: 1380– 1388 (2007). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy nieaktywny mutant kinazy K1906M znakowany 3xFLAG, ludzkiego LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant N1437H FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441C FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441G FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441H FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441S FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowego mutanta Y1699C FPD oznaczonego 3xFLAG ludzkiego LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant G2019S FPD G2019S ludzkiego LRRK2 znakowany amino-końcowym. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski) | Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant I2020T FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2. | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Equipments | |||
| 2 inkubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Automatyczna | |
| Drummond | Mikropipeta Pipet-Aid PA-400 | ||
| P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0,5– 10 μ L |
| Mikropipeta P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20– 200 μ L |
| Mikropipeta P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100– 1000 μ L |
| Końcówki do mikropipet P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterylne |
| końcówki do mikropipet P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterylne |
| końcówki do mikropipet P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterylna |
| pipeta jednorazowa 5 ml | Greiner | 606180 | Sterylna |
| pipeta jednorazowa 10 ml | Greiner | 607180 | Sterylna |
| pipeta jednorazowa 25 ml | Falcon | 357535 | Sterylny |
| hematocytometr | Szkło ołowiowe | A126 | Ulepszony mikroskop Neubeuer |
| Naczynia Olympus | CKX53 | ||
| 10 cm | Falcon | 353003 | Do hodowli tkankowych |
| Płytki 6-dołkowe | AGC Techno Glass | 3810-006 | Do hodowli |
| tkankowychMieszalnik wirowy | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Skrobaki do komórek | Sumitomo Bakelit | MS-93100 | |
| Probówki 1,5 ml | STAR | RSV-MTT1,5 | |
| Probówki 15 ml AGC | Techno Glass | 2323-015 | |
| Probówki 50 ml | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Wirówki | TOMY | MX-307 | |
| Płytki 96-dołkowe | Greiner | 655061 | Nie do hodowli tkankowych |
| Czytnik płytek | Urządzenia molekularne | SpectraMax M2e | |
| SDS– Zbiorniki PAGE | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Zbiorniki transferowe | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Płytki żelowe (zębate) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Płytki żelowe (gładkie) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Dystanse silikonowe | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| Grzebienie 17-dołkowe | Nihon Eido | Wykonane | |
| Spinki do segregatorów | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL strzykawka | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Elektrownia 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Zasilacz do SDS– STRONA i transfer |
| Duże łodzie wagowe | Ina Optika | AS-DL | |
| Pojemniki plastikowe | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Wytrząsarka bujana | Titech | NR-10 | |
| Pudełko z pianki styrenowej | ogólne | Wymiary wewnętrzne powinny pasować do jednego zbiornika transferowego (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | Imager wyposażony w chłodzoną kamerę CCD do wykrywania ECL |
Bibliografia
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
