Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Streszczenie

Wykazano, że mutacje w bogatej w leucynę kinazie powtórzeniowej 2 (LRRK2) są związane z rodzinną chorobą Parkinsona (FPD). Ponieważ nieprawidłowa aktywacja aktywności kinazy LRRK2 jest związana z patogenezą PD, konieczne jest ustalenie metody oceny fizjologicznych poziomów aktywności kinazy LRRK2. Ostatnie badania wykazały, że LRRK2 fosforyluje członków rodziny GTPazy Rab, w tym Rab10, w warunkach fizjologicznych. Chociaż fosforylację endogennego Rab10 przez LRRK2 w hodowanych komórkach można było wykryć za pomocą spektrometrii mas, trudno było ją wykryć za pomocą immunoblottingu ze względu na słabą czułość obecnie dostępnych przeciwciał specyficznych dla fosforylacji dla Rab10. W tym miejscu opisujemy prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez LRRK2 w oparciu o immunoblotting z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w połączeniu ze znacznikiem wiążącym fosforan (znacznik P), którym jest N-(5-(2-aminoetylokarbamoilo)pirydyno-2-ylmetylo)-N,N',N'-tris(pirydyno-2-yl-metylo)-1,3-diaminopropan-2-ol. Niniejszy protokół nie tylko stanowi przykład metodologii wykorzystującej znacznik P, ale także umożliwia ocenę, w jaki sposób mutacje, a także leczenie/podawanie inhibitorów lub jakiekolwiek inne czynniki zmieniają dalszą sygnalizację LRRK2 w komórkach i tkankach.

Wprowadzenie

PD jest jedną z najczęstszych chorób neurodegeneracyjnych, głównie dotykającą neuronów dopaminergicznych w śródmózgowiu, powodując dysfunkcję układu motorycznego u osób starszych¹. Podczas gdy większość pacjentów rozwija chorobę Parkinsona w sposób sporadyczny, istnieją rodziny, które dziedziczą tę chorobę. Stwierdzono, że mutacje w kilku genach są powiązane z FPD². Jednym z genów wywołujących FPD jest LRRK2, w którym do tej pory zgłoszono osiem mutacji missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S i I2020T) związanych z dominująco dziedziczonym FPD o nazwie PARK8^3,4,5. Kilka badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS) sporadycznych pacjentów z chorobą Parkinsona zidentyfikowało również zmiany genomowe w locus LRRK2 jako czynnik ryzyka PD, co sugeruje, że nieprawidłowość w funkcji LRRK2 jest częstą przyczyną neurodegeneracji zarówno w przypadku sporadycznym, jak i PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 to duże białko (2,527 aminokwasów) składające się z domeny powtórzeń bogatej w leucynę, domeny wiążącej GTP Ras białek złożonych (ROC), C-końcówki domeny ROC (COR), domeny kinazy białkowej seryny/treoniny i domeny powtórzeń WD40⁹. Osiem mutacji FPD znajduje się w tych domenach funkcjonalnych; N1437H i R1441C/G/H/S w domenie ROC, Y1699C w domenie COR, G2019S i I2020T w domenie kinazy. Ponieważ mutacja G2019S, która jest najczęściej spotykaną mutacją u pacjentów z PD^10,11,12, zwiększa aktywność kinazy LRRK2 2-3 razy in vitro¹³, przypuszcza się, że nieprawidłowy wzrost fosforylacji substratu (substratów) LRRK2 jest toksyczny dla neuronów. Jednak niemożliwe było zbadanie, czy fosforylacja fizjologicznie istotnych substratów LRRK2 jest zmieniona u rodzinnych/sporadycznych pacjentów z chorobą Parkinsona z powodu braku metod oceny jej w próbkach pobranych od pacjentów.

Fosforylacja białek jest zazwyczaj wykrywana za pomocą immunoblottingu lub testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu przeciwciał rozpoznających stan fosforylacji białek lub przez analizę spektrometryczną mas. Jednak pierwsza strategia czasami nie może być zastosowana ze względu na trudności w tworzeniu przeciwciał specyficznych dla fosforylacji. Znakowanie metaboliczne komórek radioaktywnym fosforanem jest kolejną opcją badania fizjologicznych poziomów fosforylacji, gdy przeciwciała specyficzne dla fosforylacji nie są łatwo dostępne. Wymaga to jednak dużej ilości materiałów radioaktywnych i dlatego wymaga specjalistycznego sprzętu do ochrony przed promieniowaniem¹⁴. Analiza spektrometrii mas jest bardziej czuła w porównaniu z tymi metodami immunochemicznymi i stała się popularna w analizie fosforylacji białek. Jednak przygotowanie próbki jest czasochłonne, a do analizy potrzebne są drogie instrumenty.

Podzbiór rodziny GTPazy Rab, w tym Rab10 i Rab8, został niedawno zgłoszony jako bezpośrednie fizjologiczne substraty dla LRRK2 na podstawie wyniku zakrojonej na szeroką skalę analizy fosfoproteomicznej¹⁵. Następnie wykazaliśmy, że fosforylacja Rab10 była zwiększona przez mutacje FPD w mysich fibroblastach embrionalnych i w płucach myszy knockin¹⁶. W tym raporcie zdecydowaliśmy się zastosować metodę opartą na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), w której cząsteczka P-tag jest kopolimeryzowana w żele SDS-PAGE (P-tag SDS-PAGE) w celu wykrycia endogennych poziomów fosforylacji Rab10, ponieważ nadal brakowało wysoce czułego przeciwciała specyficznego dla fosforylowanego Rab10. Nie udało nam się wykryć fosforylacji endogennego Rab8 ze względu na słabą selektywność obecnie dostępnych przeciwciał dla całkowitego Rab8. Dlatego postanowiliśmy skupić się na fosforylacji Rab10. LRRK2 fosforyluje Rab10 w Thr73, lokalizując się w środku wysoce konserwatywnego regionu "przełącznika II". Wysoka ochrona miejsc fosforylacji wśród białek Rab może być jednym z powodów, dla których przeciwciała fosfospecyficzne rozpoznające odrębne białka Rab są trudne do wytworzenia.

Fosforylacja Rab8A przez LRRK2 hamuje wiązanie Rabin8, czynnika wymiany nukleotydów guaninowych (GEF), który aktywuje Rab8A poprzez wymianę związanego GDP z GTP¹⁵. Fosforylacja Rab10 i Rab8A przez LRRK2 hamuje również wiązanie inhibitorów dysocjacji GDP (GDI), które są niezbędne do aktywacji białek Rab poprzez ekstrakcję białek Rab związanych z GDP z błon¹⁵. Podsumowując, przypuszcza się, że fosforylacja białek Rab przez LRRK2 uniemożliwia ich aktywację, chociaż dokładny mechanizm molekularny i fizjologiczne konsekwencje fosforylacji pozostają niejasne.

P-tag SDS-PAGE został wynaleziony przez Kinoshita et al. w 2006 roku: W tej metodzie, akrylamid został kowalencyjnie sprzężony z P-tag, cząsteczką wychwytującą fosforany o wysokim powinowactwie, które kopolimeryzowały w żele SDS-PAGE¹⁷. Ponieważ cząsteczki znacznika P w żelu SDS-PAGE selektywnie opóźniają ruchliwość elektroforetyczną fosforylowanych białek, SDS-PAGE ze znacznikiem P może oddzielać białka fosforylowane od niefosforylowanych (Rysunek 1). Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest fosforylowane na wielu resztach, zaobserwuje się drabinę prążków odpowiadających formom różnie fosforylowanym. W przypadku Rab10 obserwujemy tylko jedno przesunięte pasmo, co wskazuje, że Rab10 jest fosforylowany tylko w Thr73. Główną zaletą SDS-PAGE ze znacznikiem P w porównaniu z immunoblottingiem z przeciwciałami specyficznymi dla fosforylacji jest to, że fosforylowany Rab10 można wykryć przez immunoblotting z przeciwciałami niespecyficznymi dla fosforylacji (tj. Rozpoznającymi całkowity Rab10) po przeniesieniu na błony, które są na ogół bardziej specyficzne, wrażliwe i dostępne ze źródeł komercyjnych / akademickich. Kolejną zaletą stosowania P-tag SDS-PAGE jest to, że można uzyskać przybliżone oszacowanie stechiometrii fosforylacji, co jest niemożliwe przez immunoblotting za pomocą przeciwciał specyficznych dla fosforylacji lub przez metaboliczne znakowanie komórek radioaktywnymi fosforanami.

Oprócz zastosowania taniego akrylamidu P-tag i kilku drobnych modyfikacji z nim związanych, obecna metoda wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 jest zgodna z ogólnym protokołem immunoblottingu. Dlatego powinien być prosty i łatwy do wykonania we wszystkich laboratoriach, w których immunoblotting jest powszechną praktyką, z dowolnymi rodzajami próbek, w tym oczyszczonymi białkami, lizatami komórkowymi i homogenatami tkankowymi.

Protokół

1. Przygotowanie próbki do strony SDS z tagiem P

1. Wyjmij i wyrzuć pożywkę z 10-centymetrowych szalek, w których hoduje się komórki za pomocą ssania, a następnie umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, najpierw dodając DPBS z boku szalek, aby uniknąć naruszenia warstwy komórkowej, a następnie kilkakrotnie ręcznie kołysz naczyniami w przód iw tył.
2. Wyjmij i wyrzuć DPBS za pomocą odsysania i dodaj 2 ml 0,25% (w/v) trypsyny rozcieńczonej w DPBS i delikatnie kołysz szalkami, aby przykryć warstwę komórkową. Naczynia umieścić w inkubatorze CO₂ (37 °C, nawilżone powietrze, 5% CO_{2 )} na 5 min.
3. Po pipetowaniu w górę i w dół za pomocą jednorazowej pipety w celu rozdrobnienia oderwanych komórek, zbierz zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i zmierz gęstość komórek za pomocą hematocytometru pod mikroskopem¹⁸.
4. Rozcieńczyć komórki do 2,5 × 10⁵ komórek/ml zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Dodać 2 ml (5 × 10⁵ komórek) rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego dołka z płytkami 6-dołkowymi.
5. Hoduj komórki przez noc w inkubatorze CO₂ (37 °C, wilgotne powietrze, 5% CO_{2 ).}
6. Transfekcja do komórek HEK293
   UWAGA: Jeśli ma być badana fosforylacja endogennego Rab10, przejdź do kroku 1.7. Plazmidy użyte w tym protokole można uzyskać od autorów na życzenie. Patrz Spis materiałów w celu uzyskania krótkich informacji i Rysunek S1 dla ich sekwencji DNA.
   1. Porcjować 200 μl DMEM do probówek o pojemności 1,5 ml.
   2. Do każdej probówki dodaj zarówno 0,266 μg (końcowe stężenie 1,33 μg/ml) plazmidu kodującego HA-Rab10, jak i 1,066 μg (końcowe stężenie 5,33 μg/ml) plazmidu kodującego 3×FLAG-LRRK2 z 500 μg/ml zapasów plazmidu. Następnie dodać 4 μl 1 mg/ml roztworu polietylenoinoiminy (rozpuszczonego w 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) i natychmiast wymieszać roztwór, wirując przez 5 s.
   3. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 10 minut i dodaj zawartość jednej probówki kroplami do jednego dołka za pomocą mikropipety. Delikatnie i ręcznie kilkakrotnie kołysz płytkami hodowlanymi w przód iw tył, aby mieszanina transfekcji równomiernie rozproszyła się po całej studzience.
7. Pozwól komórkom rosnąć przez kolejne 24-36 godzin w inkubatorze CO₂ (37 °C, nawilżone powietrze, 5% CO_{2 ).}
8. Jeśli ma być badana fosforylacja endogennego Rab10, należy traktować komórki z inhibitorami LRRK2 i bez nich przez 1 godzinę przed lizą komórek.
   1. Przygotować roztwory podstawowe inhibitorów LRRK2, rozpuszczając inhibitory w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 10 mM. Zalecamy stosowanie MLi-2 i GSK2578215A, które są wysoce specyficznymi i silnymi inhibitorami LRRK2. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze -80 °C.
   2. Przygotować zapasy robocze inhibitorów, rozcieńczając roztwory podstawowe DMSO: Dla MLi-2 przygotować odpowiednio 10 μM i 30 μM dla endogennego i nadeksprymowanego LRRK2. Dla GSK2578215A należy przygotować odpowiednio 1 mM i 3 mM dla endogennego i nadeksprymowanego LRRK2.
   3. Dodać 2 μl zapasów roboczych MLi-2 lub GSK2578215A do środka jednego studzienki za pomocą mikropipety i delikatnie obrócić płytkę ręcznie w przód i w tył kilka razy, aby inhibitory równomiernie rozprowadziły się po studzience.
   4. Dodać 2 μl DMSO do innego dołka oraz kontroli ujemnej w podobny sposób jak inhibitor w kroku 1.8.3.
   5. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i hodować komórki przez 1 godzinę.
9. Lizuj komórki.
   1. Połóż płytki hodowlane na lodzie. Wyjmij i wyrzuć nośnik. Umyj komórki, najpierw dodając 2 ml DPBS z boku naczyń, aby uniknąć naruszenia warstwy komórek i ręcznie kołysz naczyniami w przód iw tył kilka razy.
   2. Wyjąć i wyrzucić DPBS i dodać do komórek 100 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) eter polioksyetylenofenylowy(10) oktylofenylowy, 1 mM EGTA (glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy), 1 mM ortowananian sodu, 50 mM fluorek sodu, 10 mM β-glicerofosforan, 5 mM pirofosforan sodu, 0,1 μg/ml mikrocystyny-LR, 270 mM sacharozy, koktajl inhibitorów proteazy).
   3. Przechyl płytki na lodzie i zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek, aby zebrać jak najwięcej lizatu komórkowego. Zebrać lizaty za pomocą mikropipety do probówek o pojemności 1,5 ml (wstępnie schłodzonych na lodzie).
      Uwaga: Microcystin-LR może być śmiertelny w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą.
10. Pozostaw probówki na lodzie na 10 minut, aby uzyskać całkowitą lizę. Klarować lizaty komórkowe przez odwirowanie (20 000 × g, 10 minut w temperaturze 4 °C) i przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml wstępnie schłodzonych na lodzie.
11. Zmierzyć stężenie białka (μg/μl) oczyszczonych lizatów za pomocą testu Bradforda.
    1. Przygotować wzorce albumin surowicy bydlęcej (BSA) (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1 mg/ml) przez rozcieńczenie roztworu podstawowego wodą destylowaną. Rozcieńczyć oczyszczone lizaty komórkowe 20-krotnie wodą destylowaną.
    2. Umieścić 5 μl/studzienkę wzorców BSA, ślepą próbę (woda destylowana) i każdy rozcieńczony lizat komórkowy na 96-dołkowej płytce w trzech egzemplarzach.
    3. Dodać 150 μl/basenik odczynnika do testu Bradforda za pomocą 12-kanałowej mikropipety i odstawić płytkę w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    4. Zmierz absorbancję przy 595 nm na czytniku płytek i porównaj z wzorcami BSA.
12. Przygotuj 100 μl próbek do SDS-PAGE. Stężenie białka w próbkach wynosi 1 μg/μl dla nadekspresji HA-Rab10 i 2 μg/μL dla endogennego Rab10.
    1. Korzystając z ilościowo określonych stężeń z kroku 1.11.4, obliczyć objętość (μl) lizatów komórkowych równoważną 100 μg (nadekspresja HA-Rab10) lub 200 μg (endogenny Rab10), dzieląc ilość białka (100 μg lub 200 μg) przez stężenie białka w lizatach (μg/μl).
    2. Dodać 25 μl 4× buforu do próbek SDS-PAGE firmy Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8% (w/v) SDS, 40% (v/v) glicerolu, 0,02% (w/v) błękitu bromofenolowego, 4% (v/v) β-merkaptoetanolu) do nowych probówek o pojemności 1,5 ml przechowywanych w temperaturze pokojowej.
    3. Dodaj obliczoną objętość lizatów komórkowych do każdej probówki i mieszaj przez wirowanie przez 5 s w temperaturze pokojowej.
    4. Doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl za pomocą buforu do lizy i mieszać przez wirowanie przez 5 s w temperaturze pokojowej.
13. Uzupełnić 10 mM MnCl₂ w celu stłumienia czynnika chelatującego. Dodać 1 μl z 500 mM MnCl₂. Mieszać przez wirowanie przez 5 s w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Próbki zawierające MnCl₂ mogą nie być odpowiednie dla normalnej SDS-PAGE. Ten etap jest wymagany ze względu na obecność czynnika chelatującego (takiego jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), EGTA itp.) w buforze do lizy. W przeciwnym razie jony Mn²⁺ sprzężone z akrylamidem P-tag zostaną zdysocjowane przez czynniki chelatujące, a P-tag SDS-PAGE nie będzie działać prawidłowo.
14. Gotować wszystkie próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut i przechowywać próbki w temperaturze poniżej -20 °C do czasu użycia. Ugotowane próbki można przechowywać do co najmniej 6 miesięcy.

2. Żele do odlewania dla SDS TAG P-PAGE

UWAGA: Żele powinny być przygotowywane tego samego dnia, w którym są uruchamiane. Żele można wytwarzać w warunkach oświetlenia otoczenia.

1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy akrylamidu ze znacznikiem P, najpierw całkowicie rozpuszczając 10 mg akryloamidu w proszku/stałym znaczniku P w 100 μl metanolu, a następnie doprowadzając do 3,3 ml przez dodanie podwójnie destylowanej wody.
   UWAGA: Akrylamid P-tag jest wrażliwy na światło. Przygotowany roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
2. Wyczyść zarówno zwykłe, jak i karbowane talerze, rozpylając 70% etanolu i wycierając ręcznikiem papierowym. Zmontuj płytki żelowe. Wymiary płytek żelowych stosowanych w tym konkretnym protokole to 80 lub 100 mm długości i 100 mm szerokości. Czyste silikonowe przekładki umieszcza się między płytami gładkimi i karbowanymi, a zmontowane płyty zaciska się za pomocą spinaczy do segregatorów.
   UWAGA: Można stosować każdy rodzaj płytek żelowych, które działają na zwykłą SDS-PAGE.
3. Umieść grzebień, który ma być używany (17-dołkowy plastikowy grzebień) w zmontowanych płytkach żelowych i zaznacz na płytce żelowej położenie dna studzienek trwałym markerem.
4. Przygotuj 10 ml mieszaniny 10% żelu akrylowoamidowego (10% (w/v) akrylamidu (akrylamid: bis-akryloamid = 29:1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (w/v) SDS) w probówce o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Optymalne stężenie akrylamidu może się różnić w zależności od zastosowanych odczynników. W tym momencie nie należy dodawać tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i nadsiarczanu amonu (APS).
5. Dodać 100 μl 5 mM akrylamidu P-tag i 10 μl 1 M roztworów MnCl₂ w końcowych stężeniach odpowiednio 50 μM i 100 μM.
   UWAGA: Optymalne stężenia akrylamidu P-tag i MnCl₂ mogą się również różnić w zależności od użytych odczynników.
6. Dodać 15 μl TEMED do mieszaniny żelu w końcowym stężeniu 0,15% (v/v), a następnie 50 μl 10% (w/v) APS w końcowym stężeniu 0,05% (w/v). Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając probówkę przez 5 sekund i natychmiast wlej do zmontowanych płytek do wysokości 2 mm poniżej pozycji zaznaczonej w kroku 2.3.
7. Delikatnie nałóż 2-propanol na roztwór żelu, aby spłaszczyć wierzch żeli separujących.
8. Pozostaw żele na 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby zabezpieczania żeli przed światłem.
   UWAGA: Związanie żeli w niskiej temperaturze pokojowej może potrwać dłużej. Odgazowanie mieszaniny żelu przed dodaniem TEMED i APS pomaga przyspieszyć ten etap. W tym celu mieszaninę żelu można przygotować w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100-200 ml podłączonej do ssania. Odgazuj roztwór przez 10 minut.
9. Usuń warstwowy 2-propanol, wchłaniając go ręcznikiem papierowym.
10. Umyj górną przestrzeń żeli, wypełniając ją wodą destylowaną z butelki do mycia i wylej wodę, wylewając ją do miski. Powtórz pranie 3 razy.
11. Usuń resztki wody pozostające w górnej przestrzeni żeli, wchłaniając je ręcznikiem papierowym.
12. Przygotuj 3 ml mieszaniny 4% żelu akrylowoamidowego (4% (w/v) akrylamidu (a: krylamid: bis-akryloamid = 29:1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (w/v) SDS) w probówce o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Nie dodawaj akryloamidu P-tag ani roztworu MnCl₂ do mieszaniny żelu do układania w stosy.
13. Dodać 7,5 μl TEMED i 24 μl 10% (w/v) APS w końcowych stężeniach odpowiednio 0,25% (v/v) i 0,08% (w/v). Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając probówkę przez 5 sekund i wylej mieszaninę na żel separacyjny. Natychmiast umieść odpowiednie grzebienie (17-dołkowe grzebienie z tworzywa sztucznego, które mieszczą do 25 μl próbek, na przykładample).
14. Pozostaw żele na 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby ochrony żeli przed światłem. Po ustawieniu żeli do układania w stosy uruchom je bez dalszego przechowywania.

3. SDS–PAGE i immunoblotting

1. Usuń grzebienie z żeli. Następnie usuń silikonowe przekładki, a następnie klipsy z żeli.
2. Włóż odlane żele do zbiorników żelu i przymocuj żel do zbiornika, zaciskając za pomocą zacisków do segregatora.
3. Wlej bufor do biegania (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% (w/v) SDS) na dno i górę żeli. Oczyść studzienki, przepłukując działający bufor za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły 21G w celu usunięcia kawałków żelu.
4. Usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej przestrzeni żeli za pomocą wygiętej igły przymocowanej do strzykawki. Aby wykonać wygiętą igłę, ręcznie zegnij igłę 21G na środku igły tak, aby kąt między końcówką a podstawą igły wynosił 30-45 °.
5. Odwirować osady spowodowane dodaniem MnCl₂ w ilości 20 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu uzyskania klarownych próbek.
6. Załaduj białka 10 μg do wykrywania fosforylacji nadekspresji białek Rab10 i 30 μg dla endogennego Rab10,
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby załadować równą objętość próbek do WSZYSTKICH studzienek. Puste pasy powinny być załadowane za pomocą 1× bufora próbki SDS-PAGE firmy Laemmli. Jeżeli próbki zawierają MnCl₂, należy dodać to samo stężenie MnCl₂ do próbek pozorowanych.
7. Studzienka załadowana markerem masy cząsteczkowej (MWM) powinna być również uzupełniona o 1× bufor próbek SDS-PAGE firmy Laemmli, tak aby objętość załadowanych próbek była taka sama we wszystkich studzienkach.
   UWAGA: Ponownie, jeśli próbki zawierają MnCl₂, dodaj to samo stężenie MnCl₂ do MWM. Alternatywnie można zastosować MWM wolny od EDTA.
8. Uruchom żele pod napięciem 50 V w celu układania w stosy (około 30 min), aż czoło barwnika przejdzie w żel separacyjny.
9. Po ułożeniu próbek zmień napięcie na 120 V w celu rozdzielenia, aż czoło barwnika dotrze do dna żeli (około 50 i 80 minut odpowiednio dla żeli o długości 80 i 100 mm).
   UWAGA: Oczekuje się, że wzorzec migracji MWM będzie inny niż w normalnych żelach SDS-PAGE. Nie powinien być używany do szacowania masy cząsteczkowej białek na żelach P-tag SDS-PAGE, ale może być używany do sprawdzania odtwarzalności żeli P-tag. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Dyskusja.
10. Umyj żele, aby usunąć MnCl₂ z żeli.
    1. Wlać bufor transferowy (48 mM Tris, 39 mM glicyny, 20% (v/v) metanolu) zawierający 10 mM EDTA i 0,05% (w/v) SDS do pojemnika (np. dużych łódek wagowych). Objętość buforu powinna być wystarczająca do pokrycia żelu.
    2. Usuń żele separacyjne z płytek żelowych i umieść jeden żel w jednym pojemniku. Wyrzuć żel do układania w stosy.
    3. Pozostaw żele na bujanym shakerze (~60 obr./min) na 10 min w temperaturze pokojowej.
    4. Powtórz kroki prania w sumie 3 razy.
       UWAGA: Używaj świeżego bufora do każdego prania.
    5. Umyj żele raz przez 10 minut buforem transferowym zawierającym 0,05% (w/v) SDS w celu usunięcia EDTA. Objętość buforu powinna być wystarczająca do pokrycia żelu.
11. Elektrotransfer do membran nitrocelulozowych lub polifluorku winylidenu (PVDF) przy użyciu mokrych zbiorników.
    1. Umieść bibułę filtracyjną (10 x 7 cm) na gąbce w celu przeniesienia. Umieść żel na bibule filtracyjnej. Upewnij się, że między bibułą filtracyjną a żelem nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Nałóż membranę (10 x 7 cm) na żel i upewnij się, że między żelem a membraną nie ma pęcherzyków powietrza.
    3. Połóż kolejną bibułę filtracyjną (10 x 7 cm) na membranie i ponownie upewnij się, że między membraną a bibułą filtracyjną nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Połóż kolejną gąbkę na bibule filtracyjnej. Umieść stos bibuły membranowej/filtracyjnej w kasecie w celu przeniesienia.
    5. Włóż kasetę do zbiornika transferowego, upewniając się, że membrana znajduje się między żelem a dodatnio naładowaną anodą.
    6. Podłącz zbiornik do zasilania i umieść zbiornik w pudełku z pianki styrenowej wypełnionym lodowatą wodą. Rozpocznij zasilanie przy napięciu 100 V przez 180 min.
       UWAGA: Przedłużony transfer jest konieczny, ponieważ transfer białek z żeli SDS-PAGE ze znacznikiem P nie jest tak wydajny, jak w przypadku normalnych żeli SDS-PAGE. Wydajne chłodzenie jest niezbędne, aby uniknąć topnienia żeli podczas przenoszenia.
12. Sprawdź przelew
    1. Usuń błony z żeli za pomocą pęsety i namocz błony w roztworze Pąsek S (0,1% (w/v) Ponceau S, 5% (v/v) kwas octowy) w celu zabarwienia przeniesionych białek na błonach w plastikowym pojemniku. Objętość roztworu powinna być wystarczająca do pokrycia membrany.
    2. Inkubować błony przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, kołysząc ręcznie.
       UWAGA: Drabina z taśmami powinna stać się widoczna w każdej alei.
    3. Wyjmij membranę z roztworu barwiącego za pomocą pęsety i sprawdź, czy drabina taśm ma jednolity wzór i intensywność na każdym pasie, na którym załadowano próbki.
    4. Po sprawdzeniu barwienia usunąć roztwór barwiący i dodać bufor TBST (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) monolaurynian polioksyetylenosorbitanu). Objętość buforu powinna być wystarczająca do pokrycia membrany.
       UWAGA: Roztwór Ponceau S można zbierać i ponownie używać kilka razy.
    5. Kołysz membranami w TBST na kołyszącej się wytrząsarce (~60 obr./min) w temperaturze pokojowej, aż na membranach nie pozostaną żadne widoczne pasma.
    6. Powtórz etap mycia ze świeżym TBST przez 5 minut.
13. Usuń i wyrzuć TBST. Blok poprzez dodanie 5% (w/v) odtłuszczonego mleka rozpuszczonego w TBST i kołysanie na shakerze (~60 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Objętość roztworu blokującego powinna być wystarczająca do pokrycia membrany.
14. Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczając przeciwciała pierwszorzędowe (przeciwciało anty-Rab10 dla endogennego Rab10 i przeciwciało anty-HA dla nadekspresji HA-Rab10) w 10 ml na błonę roztworu blokującego (patrz tabela materiałów dla stężeń).
15. Usunąć i wyrzucić roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Inkubować błony na kołyszącej się wytrząsarce (~60 obr./min) przez noc w temperaturze 4 °C.
16. Usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i dodaj TBST, aby przemyć błony. Objętość bufora powinna być wystarczająca do pokrycia membrany.
17. Inkubować błony przez 5 minut na kołyszącym się wytrząsarce (~60 obr./min) w temperaturze pokojowej. Powtórz pranie (krok 3.16) w sumie 3 razy, za każdym razem używając świeżego TBST.
18. Przygotować roztwory przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczając przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową (HRP) w 10 ml na błonę roztworu blokującego. Stosować przeciwciało anty-królicze IgG znakowane HRP dla błon sondowanych przeciwciałem anty-Rab10 oraz przeciwciało anty-mysie IgG znakowane HRP dla tych, u których badano przeciwciałem anty-HA (patrz Tabela materiałów dla stężenia).
19. Po trzecim przemyciu należy usunąć i wyrzucić TBST i dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubować membrany na wytrząsarce kołyszącej (~60 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
20. Umyj membrany w TBST przez 10 minut. Powtórz etap prania w sumie 3 razy, podobnie jak w kroku 3.17.
21. Rozwijaj membrany przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (ECL).
    UWAGA: Czas ekspozycji może się różnić w zależności od roztworu ECL i systemu używanego do wykrywania chemiluminescencji.
    1. Włącz imager wyposażony w kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) i komputer podłączony do imagera. Uruchom oprogramowanie sterujące imagera. Poczekaj, aż temperatura kamery CCD osiągnie -25 °C.
    2. Umieścić 1 ml roztworu ECL na jedną membranę na folii foliowej rozłożonej na stole.
    3. Nałóż żelową stronę do góry na roztwór ECL, a następnie szybko odwróć go tak, aby obie strony membrany były pokryte roztworem.
    4. Podnieś membranę i opróżnij ją, pozwalając jednej stronie membrany dotknąć ręcznika papierowego przez 5 sekund.
    5. Umieść membranę między przezroczystymi foliami (np. przezroczystymi kieszeniami papierowymi).
       UWAGA: Folia plastikowa nie jest zalecana do owijania membran. Przezroczyste folie używane do owijania membrany muszą być jak najbardziej płaskie, bez widocznych zmarszczek, aby uniknąć nierównego tła.
    6. Umieść membranę na czarnej tacy. Włóż tacę do wywoływarki i zamknij drzwiczki.
    7. Kliknij przycisk "Ustawianie ostrości" w oknie oprogramowania sterującego. Sprawdź, czy membrana jest prawidłowo umieszczona. Kliknij przycisk "Powrót".
    8. Wybierz "Precyzja" dla "Typ ekspozycji". Wybierz "Ręcznie" dla "Czas ekspozycji" i ustaw czas ekspozycji na 1 s.
    9. Wybierz "Wysoka" dla "Czułość/Rozdzielczość". Pozostaw opcję "Dodaj obraz digitalizacji" niezaznaczoną. Kliknij przycisk "Start", aby zrobić zdjęcie.
    10. Zapisz obraz, który pojawił się na wyświetlaczu w komputerze, jako plik TIFF.
    11. Powtórz robienie zdjęć z czasem naświetlania od 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s do 180 s. Podczas wykonywania ostatniego zdjęcia zaznacz opcję "Dodaj obraz digitalizacji", aby można było jednocześnie wykonać obraz cyfrowy, a nie chemiluminescencję membrany.
    12. Wybierz najlepszy obraz o największym zakresie dynamiki i bez żadnych nasyconych pikseli (pokazanych na czerwono) w interesujących Cię pasmach.
        UWAGA: Konwencjonalne filmy rentgenowskie mogą być również używane do wykrywania¹⁹.

Wyniki

System nadekspresji: Fosforylacja HA-Rab10 przez 3×FLAG-LRRK2 w komórkach HEK293:

Komórki HEK293 zostały transfekowane 0,266 μg HA-Rab10 typu dzikiego i 1,066 μg 3×FLAG-LRRK2 (mutant typu dzikiego, nieaktywny kinaza (K1906M) lub mutanty FPD). Fosforylację Rab10 badano za pomocą znacznika P SDS-PAGE, a następnie immunoblottingu przy użyciu przeciwciała anty-HA (Ryc. 2). 10 μg białek przeprowadzono na 10% żelu (80...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy łatwą i solidną metodę wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 na poziomach endogennych w oparciu o metodologię znacznika P. Ponieważ obecnie dostępne przeciwciało przeciwko fosforylowanemu Rab10 działa tylko z nadekspresjami białek¹⁵, obecna metoda wykorzystująca SDS-PAGE ze znacznikiem P jest jedynym sposobem oceny endogennych poziomów fosforylacji Rab10. Ponadto obecna metoda pozwala na oszacowanie stechiometrii fosforylacji Rab10 w komórkach. Ponieważ metodologia P-ta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynniki
	domowej roboty		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ i sterylizowane przez autoklawowanie
Chlorek sodu	Nacalai Tesque	31320-34
Wodorofosforan disodowy sodu 12-wodny	Wako	196-02835
Chlorek potasu	Wako	163-03545
Diwodorofosforan potasu	Wako	169-04245
2,5% Trypsyna (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Rozcieńczyć 10-krotnie sterylnym DPBS do przygotowania roztworu roboczego
Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)	Wako	044-29765
Płodowa surowica bydlęca	BioWest	S1560	Inaktywowana termicznie w temperaturze 56 & stopni; C przez 30 min
Penicylina-Streptomycyna (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Wodorotlenek sodu	Wako	198-13765
Polietylenina HCl MAX, liniowy, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	Roztwór podstawowy przygotowano w 20 mM HEPES-NaOH pH 7,0 przy 1 mg/ml, a następnie pH dostosowano do 7,0 za pomocą NaOH
Dimetylosulfotlenku	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Kwas solny	Wako	080-01066
Eter polioksyetyleno(10) oktylofenylowy	Wako	160-24751	Odpowiednik Triton X-100
Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy (EGTA)	Wako	346-01312
Ortowanad(V)	Wako	198-09752
Fluorek sodu	Kanto Chemical	37174-20
β-glicerofosforowy Kwas disodowy Sól disodowa Pentahydrat	Nacalai Tesque	17103-82
Sód dekahydrat pirofosforanu	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
Sacharoza	Wako	196-00015
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche	11873580001	Rozpuść jedną tabletkę w 1 ml wody, która może być przechowywana w temperaturze -20 stopni; C przez miesiąc. Użyj go w rozcieńczeniu 1:50 do lizy komórek
Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białek	Thermo Fisher Scientific	23200
Dodecylosiarczan sodu	Nacalai Tesque	31607-65
Glicerol	Wako	075-00616
Błękit bromofenolowy	Wako	021-02911
β-merkaptoetanol	Kanto Chemical	25099-00
Etanol	Wako	056-06967
Metanol	Wako	136-01837
Znacznik wiążący fosforany akryloamid	Wako	AAL-107	Znacznik P akryloamid
40% (w/v) roztwór akrylamidu	Nacalai Tesque	06119-45	Akrylamid:Bis = 29:1
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
Nadsiarczan amonu (APS)	Wako	016-08021	10% (w/v) roztwór przygotowano przez rozpuszczenie proszku nadsiarczanu amonu w wodzie MilliQ
2-propanol	Wako	166-04831
Czterowodny chlorek manganu	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Marker masy cząsteczkowej zastosowany w protokole
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0,45	GE Healthcare	10600007	Membrana nitrocelulozowa
Filtr membranowy Durapore	EMD Millipore	GVHP00010	Membrana PVDF
Bibuły filtracyjne nr 1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Kwas octowy	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	monolaurynian polioksyetylenoesorbitanu
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Wako	345-01865
Odtłuszczone mleko w proszku	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	Roztwór ECL (normalna czułość)
Immunostar LD	Wako	290-69904	Roztwór ECL (wysoka czułość)
CBB roztwór barwiący	domowej roboty		1 g CBB R-250, 50% (v/v) metanol, 10% (v/v) kwas octowy w 1 l wody MilliQ
CBB R-250	Wako	031-17922
Odbarwienie CBB roztwór	domowej roboty		12% (v/v) metanolu, 7% (v/v) kwasu octowego w 1 l wody MilliQ
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	>Komentarze
Przeciwciała
przeciwciało anty-HA	Sigma-Aldrich	11583816001	Używany przy 0,2 μ g/ml do immunoblottingu.
Przeciwciało anty-Rab10	Cell Signaling Technology	#8127	Używane w 1:1000 do immunoblottingu. Specyficzność została potwierdzona przez CRISPR KO w Ito et al., Biochem J, 2016.
przeciwciało anty-pSer935	Abcam	ab133450	Stosowane w 1 μ g/ml do immunoblottingu.
przeciwciało anty-LRRK2	Abcam	ab133518	Stosowane w 1 μ g/ml do immunoblottingu.
przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe	Sigma-Aldrich	T9026	Stosowane przy 1 μ g/ml do immunoblottingu.
anty-GAPDH	Santa-Cruz	sc-32233	Stosowane przy 0,02 μ g/ml do immunoblottingu.
Peroksydaza AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Stosowany przy 0,16 μ g/ml do immunoblottingu.
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Stosowany przy 0,16 μ g/ml do immunoblottingu.
Nazwa	Firma	>Numer katalogowy	>Komentarze
Inhibitors
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 ° stopni; C
MLi-2	Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee)		Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 ° C
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee)		Ten plazmid wykazuje ekspresję amino-końcowego znakowanego HA ludzkiego Rab10.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Ito et al., Biochemia, 46: 1380– 1388 (2007). Ten plazmid wyraża amino-końcowy 3xFLAGA znakowany ludzki LRRK2 typu dzikiego.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Ito et al., Biochemia, 46: 1380– 1388 (2007). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy nieaktywny mutant kinazy K1906M znakowany 3xFLAG, ludzkiego LRRK2.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant N1437H FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441C FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441G FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441H FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441S FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowego mutanta Y1699C FPD oznaczonego 3xFLAG ludzkiego LRRK2.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant G2019S FPD G2019S ludzkiego LRRK2 znakowany amino-końcowym.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)		Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963– 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant I2020T FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Equipments
2 inkubator	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Automatyczna
	Drummond	Mikropipeta Pipet-Aid PA-400
P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0,5– 10 μ L
Mikropipeta P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20– 200 μ L
Mikropipeta P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100– 1000 μ L
Końcówki do mikropipet P10	STAR	RST-481LCRST	Sterylne
końcówki do mikropipet P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Sterylne
końcówki do mikropipet P1000	STAR	RST-4810BRST	Sterylna
pipeta jednorazowa 5 ml	Greiner	606180	Sterylna
pipeta jednorazowa 10 ml	Greiner	607180	Sterylna
pipeta jednorazowa 25 ml	Falcon	357535	Sterylny
hematocytometr	Szkło ołowiowe	A126	Ulepszony mikroskop Neubeuer
	Naczynia Olympus	CKX53
10 cm	Falcon	353003	Do hodowli tkankowych
Płytki 6-dołkowe	AGC Techno Glass	3810-006	Do hodowli
tkankowychMieszalnik wirowy	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
Skrobaki do komórek	Sumitomo Bakelit	MS-93100
Probówki 1,5 ml	STAR	RSV-MTT1,5
Probówki 15 ml AGC	Techno Glass	2323-015
Probówki 50 ml	AGC Techno Glass	2343-050
Wirówki	TOMY	MX-307
Płytki 96-dołkowe	Greiner	655061	Nie do hodowli tkankowych
Czytnik płytek	Urządzenia molekularne	SpectraMax M2e
SDS– Zbiorniki PAGE	Nihon Eido	NA-1010
Zbiorniki transferowe	Nihon Eido	NA-1510B
Płytki żelowe (zębate)	Nihon Eido	NA-1000-1
Płytki żelowe (gładkie)	Nihon Eido	NA-1000-2
Dystanse silikonowe	Nihon Eido	NA-1000-16
Grzebienie 17-dołkowe	Nihon Eido	Wykonane
Spinki do segregatorów	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL strzykawka	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Elektrownia 1000 VC	ATTO	AE-8450	Zasilacz do SDS– STRONA i transfer
Duże łodzie wagowe	Ina Optika	AS-DL
Pojemniki plastikowe	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
Wytrząsarka bujana	Titech	NR-10
Pudełko z pianki styrenowej	ogólne		Wymiary wewnętrzne powinny pasować do jednego zbiornika transferowego (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		Imager wyposażony w chłodzoną kamerę CCD do wykrywania ECL