Method Article

Protokół do śledzenia pojedynczych cząstek 3D w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/56711

⸱

January 3rd, 2018

 , 
1Department of Chemistry, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje budowę i działanie mikroskopu 3D do śledzenia pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym, zdolnego do śledzenia nanoskalowych sond fluorescencyjnych przy wysokich prędkościach dyfuzyjnych i niskich szybkościach zliczania fotonów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe śledzenie pojedynczych cząstek w czasie rzeczywistym (RT-3D-SPT) ma potencjał, aby rzucić światło na szybkie procesy 3D w systemach komórkowych. Chociaż w ostatnich latach zaproponowano różne metody RT-3D-SPT, śledzenie cząstek dyfuzujących 3D z dużą prędkością przy niskiej liczbie fotonów pozostaje wyzwaniem. Co więcej, konfiguracje RT-3D-SPT są na ogół złożone i trudne do wdrożenia, co ogranicza ich powszechne zastosowanie do problemów biologicznych. Protokół ten przedstawia system RT-3D-SPT o nazwie 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), który może śledzić cząstki z dużą prędkością dyfuzyjną (do 20 μm2/s) przy niskich szybkościach zliczania fotonów (do 10 kHz). 3D-DyPLoT wykorzystuje deflektor elektrooptyczny 2D (2D-EOD) i soczewkę z przestrajalnym gradientem akustycznym (TAG) do dynamicznego sterowania pojedynczą skupioną plamką lasera w 3D. W połączeniu ze zoptymalizowanym algorytmem szacowania położenia, 3D-DyPLoT może blokować pojedyncze cząstki z dużą prędkością śledzenia i wysoką precyzją lokalizacji. Dzięki pojedynczemu wzbudzeniu i układowi pojedynczej ścieżki detekcji, 3D-DyPLoT jest solidny i łatwy w konfiguracji. W tym protokole omówiono krok po kroku, jak zbudować 3D-DyPLoT. Po pierwsze, opisany jest układ optyczny. Następnie system jest kalibrowany i optymalizowany poprzez skanowanie rastrowe koralika fluorescencyjnego o długości fali 190 nm za pomocą nanopozycjonera piezoelektrycznego. Wreszcie, aby zademonstrować zdolność śledzenia 3D w czasie rzeczywistym, kulki fluorescencyjne 110 nm są śledzone w wodzie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się zaawansowanych technik obrazowania otworzyło okno do zobaczenia coraz bardziej szczegółowej struktury zjawisk komórkowych, aż do poziomu molekularnego. Metody takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcyjna (STORM)1,2,3, mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotografią (PALM)4,5,6,7, mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)8,9, 10,11, oraz mikroskopia zubożenia emisji stymulowanej (STED)12,13,14 znacznie przekroczyły granicę dyfrakcji, aby dostarczyć bezprecedensowe szczegóły w strukturze i funkcji żywych komórek. Jednak pełne zrozumienie tego, jak zachowują się te systemy, wymaga zarówno informacji dynamicznych, jak i strukturalnych. Wymienione powyżej metody superrozdzielczości wiążą się z kompromisem między rozdzielczością przestrzenną a rozdzielczością czasową, co ogranicza czasową precyzję, z jaką można badać procesy dynamiczne. Metodą, która zapewnia zarówno wysoką precyzję przestrzenną, jak i rozdzielczość czasową, jest RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. W tym miejscu dokonujemy rozróżnienia między tradycyjnym 3D-SPT30 i RT-3D-SPT. Tradycyjny 3D-SPT wymaga po prostu szeregu czasowego trójwymiarowych danych obrazowych (które można uzyskać za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu epifluorescencyjnego przy odpowiedniej konfiguracji). W tradycyjnym 3D-SPT współrzędne cząstki są określane po zebraniu danych poprzez zlokalizowanie cząstki w każdym stosie obrazów i połączenie tych lokalizacji w kolejnych objętościach w celu utworzenia trajektorii. W przypadku tych metod ostateczna rozdzielczość czasowa jest określana przez szybkość obrazowania wolumetrycznego. W przypadku mikroskopów konfokalnych jest to z łatwością w skali od sekund do kilkudziesięciu sekund. W przypadku metod epifluorescencyjnych, w których ścieżka optyczna jest manipulowana w taki sposób, aby można było uzyskać informacje o położeniu osiowym, rozdzielczość czasowa jest ograniczona ekspozycją kamery lub czasem odczytu. Te metody epifluorescencyjne są ograniczone w zakresie, w którym można zbierać informacje osiowe, chociaż niedawny postęp w projektowaniu masek fazowych w płaszczyźnie Fouriera i optyce adaptatywnej rozszerza te zakresy do 10 μm lub więcej31,32,33,34.

W przeciwieństwie do tego, RT-3D-SPT nie polega na pozyskiwaniu stosu obrazów 3D i znajdowaniu cząstek po fakcie. Zamiast tego informacje o lokalizacji w czasie rzeczywistym są pozyskiwane za pomocą detektorów jednopunktowych, a sprzężenie zwrotne jest stosowane w celu skutecznego "zablokowania" cząstki w ogniskowej soczewki obiektywu za pomocą szybkiego stolika piezoelektrycznego. Pozwala to na ciągły pomiar położenia cząstki ograniczony jedynie liczbą fotonów, które można zebrać. Co więcej, metoda ta umożliwia badanie spektralne cząstki poruszającej się na długich dystansach. RT-3D-SPT w efekcie działa podobnie jak pułapka optyczna bez użycia siły dla obiektów w skali nano, w której cząstka jest stale badana i mierzona w czasie rzeczywistym bez potrzeby stosowania dużych mocy lasera lub sił optycznych. Biorąc pod uwagę, że RT-3D-SPT zapewnia środki do ciągłego odpytywania szybkich obiektów dyfuzyjnych (do 20 μm2/s)25,29 w trzech wymiarach przy niskich szybkościach zliczania fotonów20,29,35, powinien zapewnić wgląd w szybkie lub przejściowe procesy biologiczne, takie jak wewnątrzkomórkowy transport ładunku, wiązanie ligand-receptor i zewnątrzkomórkowy Dynamika pojedynczych wirionów. Jednak do tej pory zastosowanie RT-3D-SPT było ograniczone do garstki grup pracujących nad rozwojem tej technologii.

Jedną z barier jest złożoność układu optycznego wymaganego przez metody RT-3D-SPT, które są zróżnicowane. W przypadku większości metod optyczne sprzężenie zwrotne jest zapewniane przez stopień piezoelektryczny. Gdy cząstka wykonuje niewielkie ruchy w X, Y lub Z, odczyty z detektorów jednopunktowych są przekształcane w funkcje błędów i podawane z dużą prędkością do piezoelektrycznego nanopozycjonera, który z kolei porusza próbką, aby przeciwdziałać ruchowi cząstki, skutecznie blokując ją w miejscu względem soczewki obiektywu. Aby zmierzyć małe ruchy pozycyjne w X, Y i Z, użyj wielu detektorów (4 lub 5 w zależności od implementacji)15,18,21 lub wiele punktów wzbudzenia (2 - 4, z których dolna może być zastosowana, jeśli wzmacniacz blokujący jest używany do wyodrębniania pozycji X i Y za pomocą obracającej się plamki laserowej)25,28 są stosowane. Nakładanie się na siebie tych wielu punktów detekcji i emisji sprawia, że systemy są trudne do dostosowania i konserwacji.

Tutaj prezentujemy metodę 3D-SPT z uproszczonym projektem optycznym o nazwie 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT używa soczewki 2D-EOD i TAG36,37,38 do dynamicznego przesuwania skupionej plamki lasera przez ogniskową obiektywu z dużą szybkością (50 kHz XY, 70 kHz Z). Połączenie pozycji ogniska lasera i czasu nadejścia fotonu umożliwia szybkie uzyskanie pozycji 3D cząstki nawet przy niskich prędkościach zliczania fotonów. 2D-EOD steruje ogniskowaniem lasera w rycerskim wzorze wycieczkowym39 o rozmiarze kwadratu 1 x 1 μm w płaszczyźnie X-Y, a soczewka TAG przesuwa ognisko lasera w kierunku osiowym w zakresie 2 - 4 μm. Pozycja cząstki 3D jest uzyskiwana za pomocą zoptymalizowanego algorytmu szacowania położenia29,40 w 3D. Sterowanie dynamicznie poruszającą się plamką lasera 3D, zliczanie fotonów z fotodiody lawinowej (APD), obliczanie pozycji cząstek w czasie rzeczywistym, sprzężenie zwrotne stopnia piezoelektrycznego i rejestracja danych są wykonywane na programowalnej matrycy bramek (FPGA). W tym protokole opisujemy, jak krok po kroku zbudować mikroskop 3D-DyPLoT, w tym wyrównanie optyczne, kalibrację z cząstkami stałymi i wreszcie śledzenie cząstek swobodnych. W ramach demonstracji kulki fluorescencyjne o długości fali 110 nm były śledzone w wodzie w sposób ciągły przez kilka minut.

Metoda opisana tutaj jest idealnym wyborem dla każdego zastosowania, gdzie pożądane jest ciągłe monitorowanie szybko poruszającej się sondy fluorescencyjnej przy słabym oświetleniu, w tym wirusów, nanocząsteczek i pęcherzyków, takich jak endosomy. W przeciwieństwie do poprzednich metod, istnieje tylko jedna ścieżka wzbudzenia i detekcji, co ułatwia wyrównanie i konserwację. Co więcej, duży obszar detekcji umożliwia temu mikroskopowi łatwe wychwytywanie szybko dyfuzyjnych cząstek, a możliwość śledzenia przy niskich poziomach sygnału (do 10 kHz) sprawia, że metoda ta jest idealna do zastosowań przy słabym oświetleniu29.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja układu i wyrównania

  1. Instalacja i kolimacja śledzącego lasera wzbudzającego
    1. Przymocuj laser do stołu optycznego za pomocą domowego uchwytu. Montaż to prosta aluminiowa płytka z otworami montażowymi na głowicę lasera i stół optyczny. Laser powinien być mocno przymocowany do metalowego uchwytu, aby zapewnić stabilność i odprowadzanie ciepła. Do tej pracy użyj lasera półprzewodnikowego o długości fali 488 nm do oświetlenia (Rysunek 1), chociaż długość fali można wybrać tak, aby pasowała do konkretnego fluoroforu lub eksperymentu. Krytycznym czynnikiem jest to, czy długość fali lasera pasuje do zakresu roboczego 2D-EOD, który jest określany przede wszystkim przez płytkę falową między dwoma deflektorami (Rysunek 1: W2). Laser o długości fali 488 nm może skutecznie wzbudzać zielone lub żółte białko fluorescencyjne (GFP/YFP), które są powszechnymi znacznikami fluorescencyjnymi w eksperymentach na żywych komórkach.
    2. Dostosuj wysokość i kierunek wiązki laserowej za pomocą pary luster dielektrycznych (Rysunek 1: M). Upewnij się, że wiązka laserowa jest równoległa do stołu optycznego i ustaw ją na odpowiednią wysokość.
      UWAGA: Wysokość należy dobrać na podstawie platformy mikroskopu. Wysokość ta powinna być zachowana dla wszystkich kolejnych lusterek używanych w tym protokole, choć nie zostanie to wyraźnie określone.
    3. Skolimuj wiązkę za pomocą pary soczewek (Rysunek 1: L1 i L2). Ogniskowe soczewek powinny być starannie dobrane, aby uniknąć przycięcia plamki lasera przez aperturę 2D-EOD. Przycinanie jest widoczne po zmianie kształtu wiązki laserowej po przejściu przez 2D-EOD. Jakość kolimacji jest tutaj bardzo ważna, ponieważ aberracje będą wzmacniane przez kolejne soczewki, a każda rozbieżność pogorszy wydajność ugięcia 2D-EOD. Najlepiej skolimować wiązkę, skupiając wiązkę w punkcie oddalonym o co najmniej 20 m.
  2. Umieść otwór otworkowy (Rysunek 1: PH) o odpowiednim rozmiarze w ognisku pierwszej soczewki kolimacyjnej (Rysunek 1: L1).
    1. Wybierz otwór otworkowy o odpowiednim rozmiarze. Rozmiar otworka można wybrać na podstawie następujących obliczeń:
      figure-protocol-1
      Gdzie λ to długość fali lasera, f to ogniskowa pierwszej soczewki, a D to średnica wiązki wejściowej.
    2. Zamontuj otworek na stoliku do translacji 3D, aby można go było umieścić precyzyjnie w ognisku pierwszej soczewki kolimacyjnej.
    3. Dostosuj położenie otworu. Umieść miernik mocy lasera za otworkiem i wyreguluj pozycję otworka w XYZ, aby zmaksymalizować odczyt miernika mocy. W przypadku zaobserwowania pierścienia dyfrakcyjnego należy go zablokować przysłoną umieszczoną przed 2D-EOD.
  3. Montaż polaryzatora Glan-Thompson
    1. Umieść polaryzator Glan-Thompson (Rysunek 1: GP) za drugą soczewką kolimacyjną (Rysunek 1: L2), aby oczyścić polaryzację wiązki laserowej. Obróć polaryzator, aby znaleźć maksymalną transmisję za pomocą miernika mocy.
  4. Instalacja saperów
    1. Użyj 2 czujników EOD (Rysunek 1: EOD1 i EOD2), aby odchylić laser w kierunku X i Y. Zmaksymalizuj transmisję lasera, dostosowując odchylenie, nachylenie i wysokość każdego EOD.
    2. Wyrównaj dwa EOD względem siebie za pomocą znacznika wyrównania dostarczonego przez producenta z boku każdego deflektora.
    3. Zastosuj wzorzec testowy do kontrolera 2D-EOD, aby sprawdzić dane wyjściowe EOD. Może to być albo wycieczka skoczka (Rysunek 2) za pośrednictwem układu FPGA opisanego poniżej lub prosta fala sinusoidalna dostarczana przez generator funkcyjny. Aby uzyskać najlepszą wydajność, ugięcie przez każdy deflektor powinno być równoległe do kierunku X lub Y nanopozycjonera piezoelektrycznego. Kierunek ten jest podyktowany kierunkiem kątowym deflektorów względem osi przekładni. Aby obrócić kierunek ugięcia bez przesuwania 2D-EOD, umieść pryzmat gołębi za 2D-EOD, aby wyrównać osie odchylenia z osiami nanopozycjonera piezoelektrycznego.
  5. Montaż płyty półfalowej
    1. Umieść płytkę półfalową (Rysunek 1: W1) między polaryzatorem Glan-Thompson (Rysunek 1: GP) a 2D-EOD, aby wyrównać polaryzację przychodzącej wiązki laserowej z osiami odchylenia 2D-EOD. Umieść obiektyw o długiej ogniskowej (300 mm) za 2D-EOD i umieść kamerę sCMOS na ognisku lasera. Następnie włącz 2D-EOD, aby wygenerować trasę rycerską opisaną poniżej (Rysunek 2). Obracaj płytkę półfalową, aż w aparacie zaobserwuje się równomierny kwadratowy rozkład lasera.
  6. Montaż pary soczewek przedłużających wiązkę i pary soczewek przekaźnikowych
    1. Umieść parę soczewek (Rysunek 1: L3 i L4) za 2D-EOD, aby rozszerzyć wiązkę, aby wypełnić tylną aperturę soczewki obiektywu (Rysunek 1: OL) i inną parę soczewek (Rysunek 1: L5 i L6), aby przekazać płaszczyznę ogniskową do obiektywu mikroskopu. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca między tymi dwiema parami soczewek, ponieważ soczewka TAG zostanie zainstalowana między nimi w późniejszym kroku.
  7. Zainstaluj filtr dichroiczny, rozdzielacz wiązki 10/90, soczewkę skupiającą, APD, soczewkę obiektywu i filtr emisji fluorescencji, aby zakończyć ścieżkę wykrywania.
    1. Zainstaluj filtr dichroiczny (Rysunek 1: DC), aby odbijać laser w kierunku soczewki obiektywu. Ustaw laser tak, aby przechodził prosto przez środek soczewki obiektywu za pomocą dwóch tęczówek na górze i na dole długiego tubusu obiektywu.
    2. Zainstaluj rozdzielacz wiązki 10/90 (Rysunek 1: BS), za pomocą którego 10% światła jest odbijane do obrazowania przez kamerę sCMOS (opisaną poniżej), a 90% przechodzi do APD w celu śledzenia.
    3. Wyrównaj APD. Ustaw laser na szkiełku nakrywkowym przy soczewce obiektywu. Użyj odbicia od szkiełka nakrywkowego, aby wyrównać wszystkie dalsze elementy, umieszczając szkiełko nakrywkowe w ognisku obiektywu i sprawdzając intensywność odczytu APD. Po rozdzielaczu wiązki zainstaluj soczewkę skupiającą APD (Rysunek 1: L7), a następnie APD na etapie translacji 3D. Ustaw soczewkę tak, aby odbicie lasera od obiektywu przechodziło przez środek soczewki. Pozycję APD można zoptymalizować, dostosowując pozycję 3D, aby zmaksymalizować intensywność odbicia lasera na szkiełku nakrywkowym. Pozycja APD znajduje się w optymalnej pozycji, gdy ruch pozycji detektora w dowolnym kierunku zmniejsza intensywność.
    4. Zainstaluj długoprzepustowy filtr emisji fluorescencji (Rysunek 1: F) przed rozdzielaczem wiązki, aby usunąć światło odbite i rozproszone.
  8. Montaż soczewki TAG
    1. Umieść soczewkę TAG między dwiema parami soczewek (pomiędzy Rysunek 1: L4 i L5), jak wspomniano wcześniej i pokazano w Rysunek 1. Dostosuj odchylenie, nachylenie, wysokość i położenie boczne tak, aby wiązka przechodziła prostopadle przez środek soczewki TAG.

2. Przygotowanie próbki.

  1. Stałe przygotowanie cząstek
    1. Rozcieńczyć kulki fluorescencyjne o długości 190 nm do ~ 5 × 108 kulek/ml w PBS. Dodać 400 μl roztworu kulek na szkiełko nakrywkowe i zamontować na uchwycie próbki stopnia piezoelektrycznego (objętość kulek będzie zależeć od uchwytu próbki; średnica użytej tutaj komory uchwytu próbki wynosi 18 mm). W przypadku zastosowanych tutaj kulek PBS powoduje, że cząstki osadzają się na szkiełku nakrywkowym.
  2. Przygotowanie cząstek poruszających się
    1. Rozcieńczyć kulki fluorescencyjne o długości fali 110 nm do ~ 5 × 108 kulek/ml wodą DI. Dodać 400 μl roztworu kulek na szkiełko nakrywkowe i zamontować na uchwycie próbki stolika piezoelektrycznego.

3. Optymalizuj parametry śledzenia

  1. Skanowanie rastrowe stałych cząstek
    1. Umieść utrwaloną próbkę cząstek na mikroskopie.
    2. Włącz laser, kontroler mikropozycjonera, kontroler nanopozycjonera piezoelektrycznego, kontroler obiektywu TAG i kontroler EOD. Pamiętaj, że kolejność nie jest krytyczna. Uruchom nanopozycjoner piezoelektryczny w zamkniętej pętli.
    3. Skanuj rastrze próbkę w XYZ za pomocą niestandardowego oprogramowania do skanowania (Rysunek S3, oprogramowanie dostępne na żądanie od autorów), które steruje 2D-EOD w wycieczce rycerskiej (Rysunek 2), zbiera zliczenia z APD, steruje nanopozycjonerem piezoelektrycznym i wykonuje obliczenia pozycji (Rysunek S2). Rozmiar kroku wynosi 40 nm, a zakres skanowania wynosi 2 μm.
      1. Aby umieścić szkiełko nakrywkowe w ognisku obiektywu, wyjmij filtr emisji fluorescencji i wykorzystaj odbicie lasera od szkiełka nakrywkowego, aby zmaksymalizować intensywność sygnału w funkcji położenia Z mikropozycjonera. Po umieszczeniu próbki w płaszczyźnie ogniskowej należy ponownie umieścić filtr emisji fluorescencji.
      2. Otwórz program do skanowania. Ustaw zakres skanowania i rozmiar kroku, wpisując liczbę w polach "początek", "zakończenie" i "krok". Najpierw ustaw duży zakres skanowania i rozmiar kroku, aby zlokalizować cząstkę (np. zakres 10 x 10 μm z krokiem 200 nm). Po znalezieniu cząstki zmniejsz zakres skanowania i zmniejsz rozmiar kroku (np. zakres 2 x 2 μm z krokiem 100 nm). Kliknij przycisk "skanuj", aby wykonać skanowanie rastrowe 3D w celu znalezienia ogniskowej fluorescencji.
  2. Ustawienia obiektywu TAG (patrz również Rysunek 3)
    1. Kliknij oprogramowanie do sterowania obiektywem TAG. Kliknij kolejno "połącz", "włącz".
    2. Aby zmienić fazę wyjściową sygnałów wyzwalających, konieczna jest zmiana trybu wyzwalania wyjściowego. Najpierw zmień tryb z "RGB" na "Multiplane", a następnie zmień go z powrotem. Teraz fazę można zmienić (Rysunek 3b).
    3. Ustaw fazę wyjściową na 0 °, 90 ° i 270 °. Chociaż można użyć dowolnych trzech faz, które pokrywają przestrzeń fazową, okazuje się, że te trzy działają dobrze empirycznie (Rysunek 3c).
    4. Wybierz ustawienie częstotliwości 68 500 Hz.
    5. Aby znaleźć optymalną częstotliwość, często konieczna jest zmiana zakresu wyszukiwania częstotliwości. Kliknij "zaawansowane", "ustawienia". Zmień "Max. Freq(Hz)" w kolumnie 0 z 70 000 Hz na 71 500 Hz. Można to dostosować do dowolnego odpowiedniego zakresu częstotliwości. Kliknij 'Zapisz kalibrację', 'Wyjdź z kalibracji' (Rysunek 3d).
    6. Aby nowa kalibracja była skuteczna, przełącz rezonans na inną częstotliwość (na przykład 189 150 Hz), a następnie przełącz się z powrotem na ustawienie częstotliwości 68 500 Hz (Rysunek 3e).
    7. Zmieniaj amplitudę stopniowo na 35%. Kliknij "Zablokuj rezonans". Po zablokowaniu częstotliwości kliknij "Odblokuj rezonans" (Rysunek 3e). Obiektyw TAG jest już gotowy do użycia.
    8. Aby skalibrować, zmień parametry, które są używane w estymacji, aby szacowana pozycja była równa rzeczywistej pozycji, jak pokazano na Rysunek 4e, f. Wprowadź zakres skanowania x, y i z, a następnie kliknij przycisk "skanuj", aby zeskanować próbkę w XYZ, aby przesunąć cząstkę przez poruszającą się plamkę lasera. Pozycja cząstki skanowanej przez ognisko laserowe powinna zgadzać się z szacowaną pozycją cząstki określoną przez pętlę estymacji położenia (Rysunek S1). Zależność między szacowaną pozycją a rzeczywistą pozycją (Rysunek 4d) można wyodrębnić z obrazów szacowanej pozycji (Rysunek 4f). Jeśli pozycje się nie zgadzają, dostosuj wartości pozycji lasera (ck) używane w pętli szacowania pozycji (Rysunek S1).
    9. Wyrównaj soczewkę TAG
      1. Gdy kontroler obiektywu TAG jest wyłączony, zeskanowane rastrowe obrazy cząstek (opisane poniżej) wykonane przed zainstalowaniem obiektywu TAG i po zainstalowaniu obiektywu TAG powinny wyglądać identycznie. Następnie wykonaj skanowanie stosu cząstek fluorescencyjnych Z, przesuwając obiektyw za pomocą nanopozycjonera z, aby dostroić położenie i kąt soczewki TAG (Rysunek 4). Dostosuj położenie soczewki TAG do momentu, gdy nie będzie dryftu w obrazach cząstek w płaszczyźnie XY wzdłuż kierunku Z, co jest osiągane, gdy nie ma zmiany w pozycji XY cząstki w funkcji pozycji Z (Rysunek 4d). System śledzenia jest gotowy do użycia po wyrównaniu soczewki TAG.
  3. Instalacja kamery sCMOS do monitorowania cząstek
    1. Zainstaluj kamerę sCMOS, aby wizualizować cząstki podczas ich śledzenia. Zainstaluj sCMOS dopiero po zainstalowaniu i zoptymalizowaniu wszystkich komponentów systemu śledzenia. Załaduj stałą próbkę cząstek fluorescencyjnych do mikroskopu i uruchom program śledzący, aby zablokować jedną cząstkę w objętości ogniskowej obiektywu. Następnie zainstaluj obiektyw o ogniskowej 100 mm (Rysunek 1: L8) i sCMOS. Dostosuj położenie sCMOS tak, aby obraz cząstki był skupiony na najmniejszej i najjaśniejszej plamce.

4. Śledzenie 3D w czasie rzeczywistym swobodnie dyfuzujących nanocząstek

  1. Umieść swobodnie poruszającą się próbkę cząstek o długości fali 110 nm pod mikroskopem.
  2. Włącz laser, kontroler mikropozycjonera, kontroler nanopozycjonera piezoelektrycznego, kontroler obiektywu TAG i kontroler EOD. Uruchom nanopozycjoner piezoelektryczny w otwartej pętli. Ustaw oprogramowanie obiektywu TAG zgodnie z krokiem 3.2.
  3. Otwórz i uruchom oprogramowanie śledzące (dostępne na żądanie od autorów). Ustaw parametry szacowania pozycji na ich zoptymalizowane wartości, które zostały znalezione w sekcji 3.
  4. Aby umieścić szkiełko nakrywkowe w ognisku obiektywu, wyjmij filtr emisji fluorescencji i wykorzystaj odbicie lasera od szkiełka nakrywkowego, aby zmaksymalizować intensywność sygnału w funkcji położenia Z mikropozycjonera. Po znalezieniu szkiełka nakrywkowego zwiększ pozycję ostrości o 15 μm, aby ustawić ostrość lasera z dala od szkiełka nakrywkowego i do roztworu. Umieść z powrotem filtr emisji fluorescencji.
  5. Ustawić stałe sterowania całkowego. Całkowe stałe sterujące można ustawić, zaczynając od niskiej wartości i powoli rosnąc, aż do momentu, gdy w odczytach położenia cząstki można zobaczyć oscylacje. Po zaobserwowaniu oscylacji należy ustawić całkowe stałe sterujące na 80% wartości powodującej oscylacje. Typowe wartości wynoszą około 0,012 dla "wzmocnienia całkowego" XY i 0,004 dla "wzmocnienia całkowego" Z.
  6. Ustaw progi śledzenia w polach "Próg śledzenia" i "Minimalna ścieżka" i rozpocznij eksperyment ze śledzeniem, klikając "Szukaj" i "Automatyczne śledzenie". Próg zakończenia śledzenia jest ustawiony nieco wyżej niż poziom tła, a próg uruchomienia śledzenia jest około dwa razy wyższy niż tło. W tym przypadku próg wyzwolenia śledzenia wynosi 3 kHz, a próg zakończenia trajektorii wynosi 1,5 kHz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stałe skanowanie cząstek (Rysunek 4) i swobodne rozpraszanie cząstek fluorescencyjnych 110 nm (Rysunek 5) zostały przeprowadzone zgodnie z powyższym protokołem. Skanowanie cząstek przeprowadzono poprzez przesunięcie nanopozycjonera piezoelektrycznego i fotonów bin, przy jednoczesnym obliczaniu szacowanej pozycji cząstki w każdym punkcie skanu. Skanowany obraz pokazuje kwadrat o równej intensywności (Rysunek 4a), a szacowane pozyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż w ostatnich latach pojawiło się wiele odmian metod śledzenia pojedynczych cząstek 3D, solidne śledzenie w czasie rzeczywistym szybkiej dyfuzji 3D przy niskich szybkościach zliczania fotonów przy prostej konfiguracji nadal stanowi wyzwanie, co ogranicza jego zastosowanie do ważnych problemów biologicznych. Metoda 3D-DyPLoT opisana w tym protokole odpowiada na te wyzwania na kilka sposobów. Po pierwsze, ścieżki wzbudzenia i detekcji są znacznie uproszczone w porównaniu z innymi implementacjami, dzięki czemu wyrówna...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R35GM124868 oraz przez Duke University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Deflektor elektrooptyczny 2D ConOpticsM310A2 wymagany
zasilacz dla EODConOptics412Konwertuje wyjście FPGA na wysokie napięcie dla EOD
TAG  SoczewkaTAG OptykaTAG 2.0Służy do odchylania lasera wzdłuż kierunku osiowego
Nanopozycjoner piezoelektrycznyXY MadCityLabs Nano-PDQ275HSSłuży do przesuwania próbki w celu zablokowania cząstki w ogniskowej obiektywu w 
Z nanopozycyjnik piezoelektrycznyMadCity LabsNano-OP65HSSłuży do przesuwania soczewki obiektywu w celu podążania za cząstką dyfuzyjną
MikropozycjonerMadCityLabs MicroDriveSłuży do zgrubnego pozycjonowania próbki i oceny
obiektywuZeissPlanApoWymagana wysoka apertura numeryczna dla najlepszej czułości. 100X, 1.49 NA, M27, kamera Zeiss
sCMOSPCOpco.edge 4.2Służy do monitorowania położenia cząstki
APDExcelitasSPCM-ARQH-15Niższe ciemne liczby korzystne
Programowalna w terenie tablica bramekNational InstrumentsNI-7852r
OprogramowanieNationalInstruments LabVIEW
Śledzenie lasera wzbudzeniaJDSUFCD488-30
ObiektywThorLabsAC254-150-A-MLL1
ObiektywThorLabsAC254-200-A-MLL2
OtworkowyThorLabsP75SPH
Glan-Thompson PolaryzatorThorLabsGTH5-AGT
Płytka półfalowaThorLabsWPH05M-488WP
ObiektywThorLabsAC254-75-A-MLL3
ObiektywThorLabsObiektyw AC254-250-A-MLL4
ThorLabsAC254-200-A-MLL5
ObiektywThorLabsAC254-200-A-MLL6
Dichroiczne lustroChromaZT405/488/561/640RPC
Filtr emisji fluorescencjiChromaD535/40mF
10/90 beamsplitterChroma21012BS
PBSSigmaD8537
190 nm fluorescencyjne nanocząstkiBangs laboratoriesFC02F/9942
110 nm fluorescencyjne nanocząstkiBangs laboratoriesFC02F/10617
Szkiełko nakrywkoweFisher Scientific12-545A
Miernik mocyThorlabsPM100D
CMOSThorlabsDCC1545M
SM1D12Dtęczówka
Mad City LabsRM21
DC Mikroskop

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
  6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).
  8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).
  9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).
  10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
  12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
  13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
  16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).
  17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
  18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
  19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).
  20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
  21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
  22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
  23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
  24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
  25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
  26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
  27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
  28. Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
  29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
  30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
  31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
  32. Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).
  33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
  35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606(2017).
  36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
  37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
  38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
  39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
  40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
  41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Real time 3D Single Particle Tracking3D Dynamic Photon Localization Tracking2D Electro optic DeflectorTunable Acoustic Gradient LensAvalanche Photo DiodeField Programmable Gate ArrayPiezoelectric NanopositionerFluorescent Bead TrackingPhoton Counting RatePosition Estimation Algorithm

Related Articles