Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka^1,2. Komórki nowotworowe pochodzące z tkanek pierwotnych wchodzą do krążenia w zawiesinie i przeżywają różne wyzwania hematogenne, np. anoikis, ataki immunologiczne i uszkodzenia spowodowane stresem ścinającym spowodowanym ciśnieniem krwi lub ograniczeniami geometrycznymi, zanim będą w stanie skolonizować odległe narządy, co jest kluczowym krokiem decydującym o powodzeniu przerzutów^3,4,5,6. W związku z tym obecnie podjęto energiczne wysiłki w celu scharakteryzowania krążących komórek nowotworowych (CTC) i skorelowania tych cech z nowotworem złośliwym, przerzutami i wskaźnikami przeżycia pacjentów z rakiem^7,8,9. Ponieważ proces przerzutów nowotworowych wyraźnie przedstawia zdarzenie in vivo, modele zwierzęce są jedynym podejściem, które ujmuje pełny ogólnoustrojowy proces przerzutów^10,11,12.

CTC stają się przerzutowymi tkankami nowotworowymi w wyniku wielu zdarzeń komórkowych, w tym kolonizacji odległych narządów^1,2. Jednak najczęściej stosowane testy przerzutów^13,14,15 nie zapewniają sposobu na obserwację kolonizacji CTC odległych narządów. Dlatego pilnie potrzebny jest projekt testu in vivo do wizualizacji kolonizacji CTC. Chociaż zaprojektowano kilka krótkoterminowych testów kolonizacji płuc in vivo i ex vivo, problemy i wady pozostają. Na przykład, podczas gdy komórki nowotworowe z nadekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) zostały użyte w tych testach^22,23, stabilna transfekcja i klonowanie komórek nowotworowych o wystarczającej intensywności fluorescencji GFP pod mikroskopem wymaga czasu. Podobnie, chociaż przejściowe barwienie komórek nowotworowych za pomocą długoterminowego znacznika komórek CFSE zostało zastosowane w celu zastąpienia komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP, nadal trudno jest ocenić, czy komórki nowotworowe znakowane CFSE są przyczepione, czy tylko obecne w unaczynieniu wyciętych odległych narządów^16,17.

Polimeryczna fibronektyna (polyFN) złożona na powierzchni CTC w decydujący sposób przyczynia się do ostatecznego powstania przerzutowych tkanek nowotworowych^{18,19,20,21,22}. Tutaj przeprowadziliśmy krótkoterminowe testy kolonizacji płuc, w których zawieszone komórki raka płuc Lewisa (LLC) stabilnie eksprymujące FN-shRNA (shFN) lub scramble-shRNA (shScr) i wstępnie znakowane CFSE zostały dożylnie zaszczepione myszom C57BL / 6. Po 2-3 dniach płuca myszy zostały najpierw perfundowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu całkowitego usunięcia nieprzyłączonych CTC w obrębie układu krwionośnego, a następnie poddane mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacji LLC kolonizujących płuca. Wyraźnie wykazaliśmy, że liczba kolonizujących płuca shFN LLC i guzków nowotworowych została znacznie zmniejszona w porównaniu z shScr LLC, co znacznie potwierdza rolę składania poliFN na CTC w ułatwianiu kolonizacji i wzrostu CTC w płucach. Nasze badanie uzasadnia dalsze badania nad rolą poliFN w przerzutach raka.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi naszego instytutu (Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, NCKU Medical College).

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

1. Przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych należy zaopatrzyć się w sterylne szwy chirurgiczne, strzykawki 1 ml z igłą 26G/0,5 cm (do wstrzykiwania żyły ogonowej), strzykawki 3 ml z igłą 24G/3 cm (do perfuzji płuc), zmodyfikowane podłoże Eagle Media firmy Dulbecco (DMEM), roztwór trypsyna-EDTA (5 g/L trypsyny i 0,53 mM), płodowa surowica bydlęca (FBS), 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂PHO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄) oraz 6 cm szalki hodowlane.

2. Przygotowanie i odzyskiwanie komórek nowotworowych w zawiesinie

1. Przygotuj sterylne zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) zawierające 10% lub 20% FBS i świeżo dodaj 2 mM L-glutaminy, 1x PBS i 0,05% Trypsyny-EDTA.
2. Hodować komórki w DMEM uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 °C i hodować je do momentu uzyskania 70-80% konfluencji w naczyniu hodowlanym.
3. Usunąć pożywkę hodowlaną (DMEM) z naczyń, a następnie dwukrotnie przemyć 2 ml sterylnego 1x PBS.
4. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczyń, aby dokładnie pokryć wszystkie komórki. Natychmiast usuń 800 μl roztworu i pozostaw tylko 200 μl w naczyniach. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 30 s do 1 minuty (w zależności od typu komórek) i poczekać, aż większość komórek znajdzie się w stanie zawieszenia.
5. Dodaj 1 ml świeżego DMEM zawierającego 10% FBS bezpośrednio do szalek, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny i energicznie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety 1000 μl, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki.
6. Przenieś komórki z naczynia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj w temperaturze pokojowej o sile 162 x g przez 3 minuty.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki nowotworowe w 1,5 ml DMEM zawierającym 20% FBS i obracać komórki w zawiesinie w temperaturze 37 °C od końca do końca przez 2 godziny
   UWAGA: Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty podczas odzyskiwania, wymień stare podłoże na świeże zawierające 20% FBS.

3. Barwienie fluorescencyjne i analiza komórek nowotworowych w zawiesinie estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)

1. Po odzyskaniu komórek w zawiesinie, należy policzyć odpowiednią liczbę żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera w celu miareczkowania dawek barwienia fluorescencyjnego i wstrzyknięcia żyły ogonowej.
2. Odwirować komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml wysterylizowanego 1x PBS, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 162 x g przez 3 minuty.
3. Zawiesić granulowane komórki w 500 μl 1X PBS zawierającego 10% FBS i 0, 5, 10, 20 lub 40 μM CFSE w celu miareczkowania dawki i inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 ^oC przez 10 minut w ciemności.
4. Odwiruj komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawieś granulowane komórki za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 1% FBS. Powtórz ten krok prania jeszcze trzy razy. Ponownie zawiesić granulowane komórki za pomocą 4 ml samego DMEM w celu końcowego przepłukania.
5. Poddaj komórki znakowane CFSE analizie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu ilościowego określenia intensywności fluorescencji pojedynczej komórki lub wstrzyknięcia żyły ogonowej.
   UWAGA: Trzymaj komórki na lodzie przed wykonaniem analizy FACS lub wstrzyknięć do żył ogonowych.

4. Test kolonizacji płuc

1. Przygotuj komórki oznaczone 20 μM CFSE (patrz kroki od 3.1 do 3.4).
   UWAGA: Zdecyduj o dawce roboczej CFSE do znakowania komórek nowotworowych, na podstawie wyników miareczkowania z analizy FACS (patrz Krok 3.3).
2. Rozgrzej ogony 4-6 tygodniowych samców myszy C57BL/6 (6 myszy) lampą halogenkową przez 5-10 minut na zasadzie mysz po myszy, aby rozszerzyć żyły ogona myszy.
3. Dokładnie wymieszaj i odessaj komórki nowotworowe znakowane CFSE za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (26Gx1/2), unikając pęcherzyków w zawiesinie komórek (przy końcowej gęstości komórek 5 x 10⁶ komórek/ml).
4. Ostrożnie wstrzyknąć 1 x10⁶ komórek nowotworowych znakowanych CFSE w 200 μl DMEM do żyły ogonowej myszy, która powinna być umieszczona w ograniczniku dla myszy.
   UWAGA: Podczas wstrzyknięcia, jeśli igła jest umieszczona bezpośrednio w świetle żyły ogonowej, komórki nowotworowe powinny być łatwo dostarczone do krążenia bez konieczności mocnego naciskania na strzykawkę. Jeśli trudno jest przepchnąć komórki nowotworowe, najprawdopodobniej zostały one wstrzyknięte poza żyłę ogonową, do przestrzeni podskórnej.
5. Podziel myszy, które otrzymały dożylnie komórki nowotworowe znakowane CFSE, na dwie grupy: jedna grupa przejdzie perfuzję płuc, a następnie mikroskopię konfokalną i kwantyfikację ImageJ w teście kolonizacji płuc, a druga zostanie pozostawiona sama na 4-5 tygodni w długoterminowym teście kolonizacji płuc.
6. Po 20, 38 lub 45 godzinach i z 1x 10⁶ komórkami nowotworowymi wstrzykniętymi dożylnie podczas miareczkowania zależnego od czasu i dawki, znieczulij myszy z guzem za pomocą 50-75 mg / kg zoletil 50, który jest dobrze akceptowanym i właściwym środkiem znieczulającym23.
   UWAGA: Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
7. Przeciąć podłużnie skórę i tkanki podskórne od brzucha do klatki piersiowej nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz jamę opłucnową nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami, aby całkowicie odsłonić serce i płuca.
   UWAGA: Uważaj, aby nie odciąć naczyń krwionośnych.
8. Zawiązać żyłę główną górną (SVC) i żyłę główną dolną (IVC) sterylnymi szwami chirurgicznymi, aby zapobiec cofaniu się roztworu perfuzyjnego podczas perfuzji płuc.
9. Przeciąć ścianę lewej komory nożyczkami chirurgicznymi, aby otworzyć szczelinę (około 2-4 mm) w celu odprowadzenia roztworu perfuzyjnego z płuc.
10. Wstrzyknąć 1x PBS do prawej komory za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i usunąć odsączony roztwór ze stałym ssaniem podczas perfuzji płuc, aż płuca zmienią kolor z czerwonawego na całkowicie blady.

5. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe i analiza komórek nowotworowych skolonizowanych przez płuca

1. Usuń blade płuca z jamy opłucnej i oddziel pięć płatów, odcinając tchawicę i więzadła tkanki łącznej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy²⁴.
2. Przygotuj uchwyt na płuca przypominający nosze, jak pokazano w Rysunek 3B, owijając nylonowy szew wokół dwóch metalowych prętów, aby uzyskać siatkową teksturę z przestrzenią między dwoma prętami do umieszczenia płatów płuc. Umieść uchwyt na płuca w naczyniu o średnicy 6 cm.
   UWAGA: Uchwyt płuc będzie używany do stabilizacji płatów płuc pod soczewką obiektywu mikroskopu konfokalnego.
3. Umieść i przymocuj płaty płuc do siateczkowatej tekstury uchwytu płuca. Przykryj i zwilż płaty płuc 1x PBS.
4. Poddaj 6-centymetrową naczynie hodowlane, w której znajdują się płaty płuc na uchwycie płuc, mikroskopii konfokalnej w celu uchwycenia obrazów fluorescencyjnych rejestrujących komórki nowotworowe kolonizujące płuca.
5. Do obrazowania należy używać soczewek obiektywowych (5X, MPLN, NA: 0,1, WD: 20, Air).
6. Obróć koło filtra do NIBA (wzbudzenie/emisja; 470-495 nm/510-550 nm) i użyj lasera 488 nm do wzbudzenia CFSE, aby wyraźnie uwidocznić obrazy punktów fluorescencyjnych w płatach płuc.
7. Obróć koło filtrów na R690 (dla lasera MaiTai HP DeepSee), aby skanować z prędkością skanowania 2,0 μs/piksel i zoptymalizować poziomy HV, wzmocnienia i przesunięcia.
8. Rejestruj obrazy fluorescencyjne (512 x 512 pikseli) za pomocą oprogramowania mikroskopowego z prędkością skanowania 10 μs/piksel.
9. Określ ilościowo i analizuj statystycznie obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ i GraphPad, jak opisano wcześniej²¹.

6. Długoterminowe testy kolonizacji płuc

UWAGA: Powtórz kroki od 4.1 do 4.5.

1. Poświęć myszy po inokulacji komórek nowotworowych przez 4-5 tygodni i napraw ich płuca za pomocą Bouin's Fluid²⁵ przez 1 do 2 dni.
2. Określ ilościowo i przeanalizuj statystycznie guzki guza z płuc myszy za pomocą software²¹.

Przed przeprowadzeniem testu kolonizacji płuc in vivo, jak pokazano w Rysunek 1A, aby sprawdzić, czy poliFN na zawieszonych komórkach nowotworowych pośredniczy w kolonizacji płuc i/lub wynaczynieniu ułatwiając przerzuty, najpierw miareczkowaliśmy różne stężenia CFSE, związku fluorescencyjnego, który jest przepuszczalny dla komórek i kowalencyjnie koniuguje wewnątrzkomórkowe cząsteczki zawierające aminy26, 27 w zawieszonych komórkach nowotworowych i pozostaje w komórkach przez dość długi okres czasu. Odkryliśmy, że komórki nowotworowe były skutecznie znakowane CFSE w sposób zależny od dawki, jak pokazano w Rysunek 1B. Znakowanie CFSE w 6 x105 komórkach LLC / ml prawie osiągnęło plateau przy 20 μM, jak pokazano w Rysunek 1C.

Ze względu na obfity zwężony system naczyń włosowatych, który może fizycznie utrudniać przepływ CTC w obrębie układu naczyniowego płuc, przeprowadziliśmy perfuzję płuc u myszy z dożylnie wstrzykniętymi komórkami LLC znakowanymi CFSE, aby usunąć niespecyficznie uwięzione CTC, jak pokazano w Rysunek 1A przed usunięciem płuc w każdym punkcie czasowym, jak pokazano w Rysunek 4. Przed perfuzją płuca były wyraźnie zaczerwienione z powodu obecności krwi, jak pokazano na lewym panelu Rysunek 2. Płuca stały się blade po perfuzji z 10-15 ml 1x PBS, jak pokazano w prawym panelu Rycina 2.

Natychmiast po usunięciu perfundowanych płuc myszy z przestrzeni opłucnej, płaty płuc zostały oddzielone i zamontowane na uchwycie płuca umieszczonym w naczyniach, jak pokazano w Rysunek 3A z 1x PBS dokładnie pokrywającym płaty płuc. Płaty płuc zamontowane na uchwycie płuca, jak pokazano na rysunku Rysunek 3B, poddano konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano na rysunku Rysunek 3A. Komórki nowotworowe znakowane CFSE kolonizujące płuca zostały zobrazowane, jak pokazano w górnym panelu Rysunek 3C, i przekształcone w czarno-białe obrazy, jak pokazano w dolnym panelu Rysunek 3C, aby ułatwić ilościowe określenie kolonizacji płuc za pomocą oprogramowania Image J.

Wstrzyknęliśmy dożylnie komórki shScr lub shFN LLC, które były oznaczone 20 μM CFSE i czekaliśmy na czas od 24 do 72 godzin przed wykonaniem perfuzji płuc i konfokalnego obrazowania mikroskopowego. Kwantyfikacja komórek nowotworowych kolonizujących płuca u 6 myszy, jak pokazano na Rysunek 4A za pomocą oprogramowania ImageJ, ujawniła, że znacznie mniej komórek shFN LLC niż komórek shScr LLC zostało policzonych w punktach czasowych 38 h i 45 h, jak pokazano w Rysunek 4B. Powodem, dla którego liczba zarówno skolonizowanych przez płuca komórek shScr, jak i shFN LLC stopniowo się zmniejszała, była najprawdopodobniej ciągła cytotoksyczność wywierana przez odporność krążenia nawet przeciwko już skolonizowanym komórkom LLC. Podsumowując, wyniki te sugerują, że poliFN złożony na CTC jest rzeczywiście wymagany w pośredniczeniu w kolonizacji płuc przez komórki LLC, prowadząc do całkowitych przerzutów do płuc, jak ujawniono w wynikach, w których niektóre myszy dożylnie otrzymywały podwielokrotności komórek shScr i shFN LLC znakowanych CFSE do testów kolonizacji płuc, jak pokazano w Figura 4 pozostawiono w spokoju, dopóki nie rozwinęły się guzki guza płuc w eksperymentalnym teście przerzutów nowotworowych, jak pokazano w Rysunek 5A i 5B.

Rycina 1: Miareczkowanie stężeń CFSE do znakowania komórek nowotworowych w teście kolonizacji płuc. (A) Schematyczne ilustracje procedur oznaczania kolonizacji płuc i eksperymentalnego testu przerzutów, jak wyszczególniono w sekcji Protokoły. (B) Analiza FACS dla intensywności fluorescencji CFSE komórek LLC, które zostały wybarwione różnymi stężeniami CFSE. (C) Intensywności fluorescencji wykreślono jako funkcje różnych stężeń CFSE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Płuca przed i po perfuzji. Reprezentatywne obrazy płuc przed (nieperfundowane; Niewykonalny.) i po (perfuzji; Wyk.) wykonywanie perfuzji płuc. Złota gwiazda: serce. Biała strzałka: krawat, który zamknął IVC/SVC. Czerwone strzałki: płuca tej samej myszy przed i po perfuzji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Montaż perfundowanych płatów płuc na uchwycie płuca do fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. (A) Schemat mocowania płuc na uchwycie płuca do mikroskopii konfokalnej. (B) Reprezentatywny obraz 3 perfundowanych płatów płuc na uchwycie płuca. (C) Reprezentatywne obrazy kolonizujących płuca komórek LLC z fluorescencją CFSE do kwantyfikacji za pomocą oprogramowania Image J. Górny panel: regularne obrazowanie. Dolny panel: odwrócone obrazowanie czarno-białe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Obrazowanie, kwantyfikacja i analiza statystyczna przebiegu czasu dla skolonizowanych przez płuca komórek shScr i shFN LLC po perfuzji płuc w teście kolonizacji płuc. (A) Reprezentatywne czarno-białe obrazy (przekształcone z obrazów fluorescencyjnych) komórek shScr i shFN LLC, które zostały skolonizowane w unaczynieniu płuc w różnych punktach czasowych, jak pokazano po rozległej perfuzji płuc. Linie przerywane oznaczają krawędź ostrych konfokalnych obszarów tkanki płucnej. (B) Kwantyfikacja i analiza statystyczna dla komórek LLC kolonizujących płuca, jak zwizualizowano w (A) poprzez uśrednienie 5 bezwzględnych reprezentatywnych obrazów / płat płuc / mysz. Uwaga: Każdy słupek wskazuje uśrednioną intensywność fluorescencji każdego obszaru konfokalnego ostrości. Dane zostały przeanalizowane statystycznie z 6 myszy i podane jako średnia ± SD; n.s. oznacza nieistotne; * oznacza P<0,05; a ** oznacza p<0,01; Dwukierunkowa ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Wyciszenie ekspresji FN w komórkach LLC znakowanych CFSE zmniejsza guzki nowotworowe w płucach w długoterminowym teście kolonizacji CTC in vivo. (A) Płuca myszy Bouina z płynem z guzkami nowotworowymi pochodzącymi z komórek shScr lub shFN LLC znakowanych CFSE. (B) Kwantyfikacja i analiza statystyczna guzków nowotworowych w płucach. Dane są podawane jako średnia ± SD; : p<0,001; n=6 na grupę; Niesparowany test t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.