Artykuł metodologiczny

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

DOI:

10.3791/56761

⸱

16 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Rola krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu przerzutów nowotworowych, w których kolonizacja płuc przez CTC krytycznie przyczynia się do wczesnych procesów przerzutowych do płuc, była intensywnie badana. W związku z tym modele zwierzęce są jedynym podejściem, które pozwala uchwycić pełny ogólnoustrojowy proces przerzutów. Biorąc pod uwagę, że w poprzednich projektach eksperymentalnych występują problemy dotyczące badania udziału CTC w wynaczynieniu naczyń krwionośnych, ustaliliśmy test kolonizacji płuc in vivo, w którym długotrwały znacznik komórek fluorescencyjnych, ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), został użyty do znakowania zawieszonych komórek nowotworowych, a perfuzję płuc przeprowadzono w celu usunięcia niespecyficznie uwięzionych CTC przed usunięciem płuc, obrazowanie konfokalne i kwantyfikacja. Stwierdzono, że polimeryczna fibronektyna (polyFN) złożona na powierzchni CTC pośredniczy w kolonizacji płuc w ostatecznym ustaleniu przerzutowych tkanek nowotworowych. Tutaj, aby w szczególności przetestować wymóg składania poliFN na CTC do kolonizacji i wynaczynienia płuc, przeprowadziliśmy krótkoterminowe testy kolonizacji płuc, w których zawieszone komórki raka płuc Lewisa (LLC) stabilnie eksprymujące FN-shRNA (shFN) lub scramble-shRNA (shScr) i wstępnie znakowane 20 μM CFSE zostały dożylnie zaszczepione myszom C57BL / 6. Z powodzeniem wykazaliśmy, że zdolności komórek shFN LLC do kolonizacji płuc myszy były znacznie zmniejszone w porównaniu z komórkami shScr LLC. Dlatego ta krótkoterminowa metodologia może być szeroko stosowana w celu specyficznego wykazania zdolności CTC w krążeniu do kolonizacji płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka1,2. Komórki nowotworowe pochodzące z tkanek pierwotnych wchodzą do krążenia w zawiesinie i przeżywają różne wyzwania hematogenne, np. anoikis, ataki immunologiczne i uszkodzenia spowodowane stresem ścinającym spowodowanym ciśnieniem krwi lub ograniczeniami geometrycznymi, zanim będą w stanie skolonizować odległe narządy, co jest kluczowym krokiem decydującym o powodzeniu przerzutów3,4,5,6. W związku z tym obecnie podjęto energiczne wysiłki w celu scharakteryzowania krążących komórek nowotworowych (CTC) i skorelowania tych cech z nowotworem złośliwym, przerzutami i wskaźnikami przeżycia pacjentów z rakiem7,8,9. Ponieważ proces przerzutów nowotworowych wyraźnie przedstawia zdarzenie in vivo, modele zwierzęce są jedynym podejściem, które ujmuje pełny ogólnoustrojowy proces przerzutów10,11,12.

CTC stają się przerzutowymi tkankami nowotworowymi w wyniku wielu zdarzeń komórkowych, w tym kolonizacji odległych narządów1,2. Jednak najczęściej stosowane testy przerzutów13,14,15 nie zapewniają sposobu na obserwację kolonizacji CTC odległych narządów. Dlatego pilnie potrzebny jest projekt testu in vivo do wizualizacji kolonizacji CTC. Chociaż zaprojektowano kilka krótkoterminowych testów kolonizacji płuc in vivo i ex vivo, problemy i wady pozostają. Na przykład, podczas gdy komórki nowotworowe z nadekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) zostały użyte w tych testach22,23, stabilna transfekcja i klonowanie komórek nowotworowych o wystarczającej intensywności fluorescencji GFP pod mikroskopem wymaga czasu. Podobnie, chociaż przejściowe barwienie komórek nowotworowych za pomocą długoterminowego znacznika komórek CFSE zostało zastosowane w celu zastąpienia komórek nowotworowych wykazujących ekspresję GFP, nadal trudno jest ocenić, czy komórki nowotworowe znakowane CFSE są przyczepione, czy tylko obecne w unaczynieniu wyciętych odległych narządów16,17.

Stwierdzono, że

Polimeryczna fibronektyna (polyFN) złożona na powierzchni CTC w decydujący sposób przyczynia się do ostatecznego powstania przerzutowych tkanek nowotworowych18,19,20,21,22. Tutaj przeprowadziliśmy krótkoterminowe testy kolonizacji płuc, w których zawieszone komórki raka płuc Lewisa (LLC) stabilnie eksprymujące FN-shRNA (shFN) lub scramble-shRNA (shScr) i wstępnie znakowane CFSE zostały dożylnie zaszczepione myszom C57BL / 6. Po 2-3 dniach płuca myszy zostały najpierw perfundowane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu całkowitego usunięcia nieprzyłączonych CTC w obrębie układu krwionośnego, a następnie poddane mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacji LLC kolonizujących płuca. Wyraźnie wykazaliśmy, że liczba kolonizujących płuca shFN LLC i guzków nowotworowych została znacznie zmniejszona w porównaniu z shScr LLC, co znacznie potwierdza rolę składania poliFN na CTC w ułatwianiu kolonizacji i wzrostu CTC w płucach. Nasze badanie uzasadnia dalsze badania nad rolą poliFN w przerzutach raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi naszego instytutu (Przewodnik po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, NCKU Medical College).

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

  1. Przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych należy zaopatrzyć się w sterylne szwy chirurgiczne, strzykawki 1 ml z igłą 26G/0,5 cm (do wstrzykiwania żyły ogonowej), strzykawki 3 ml z igłą 24G/3 cm (do perfuzji płuc), zmodyfikowane podłoże Eagle Media firmy Dulbecco (DMEM), roztwór trypsyna-EDTA (5 g/L trypsyny i 0,53 mM), płodowa surowica bydlęca (FBS), 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4 i 1,8 mM KH2PO4) oraz 6 cm szalki hodowlane.

2. Przygotowanie i odzyskiwanie komórek nowotworowych w zawiesinie

  1. Przygotuj sterylne zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) zawierające 10% lub 20% FBS i świeżo dodaj 2 mM L-glutaminy, 1x PBS i 0,05% Trypsyny-EDTA.
  2. Hodować komórki w DMEM uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 °C i hodować je do momentu uzyskania 70-80% konfluencji w naczyniu hodowlanym.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną (DMEM) z naczyń, a następnie dwukrotnie przemyć 2 ml sterylnego 1x PBS.
  4. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczyń, aby dokładnie pokryć wszystkie komórki. Natychmiast usuń 800 μl roztworu i pozostaw tylko 200 μl w naczyniach. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 30 s do 1 minuty (w zależności od typu komórek) i poczekać, aż większość komórek znajdzie się w stanie zawieszenia.
  5. Dodaj 1 ml świeżego DMEM zawierającego 10% FBS bezpośrednio do szalek, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny i energicznie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety 1000 μl, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki.
  6. Przenieś komórki z naczynia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj w temperaturze pokojowej o sile 162 x g przez 3 minuty.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki nowotworowe w 1,5 ml DMEM zawierającym 20% FBS i obracać komórki w zawiesinie w temperaturze 37 °C od końca do końca przez 2 godziny
    UWAGA: Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty podczas odzyskiwania, wymień stare podłoże na świeże zawierające 20% FBS.

3. Barwienie fluorescencyjne i analiza komórek nowotworowych w zawiesinie estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE)

  1. Po odzyskaniu komórek w zawiesinie, należy policzyć odpowiednią liczbę żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego w komorze liczącej Neubauera w celu miareczkowania dawek barwienia fluorescencyjnego i wstrzyknięcia żyły ogonowej.
  2. Odwirować komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml wysterylizowanego 1x PBS, a następnie odwirować w temperaturze pokojowej przy 162 x g przez 3 minuty.
  3. Zawiesić granulowane komórki w 500 μl 1X PBS zawierającego 10% FBS i 0, 5, 10, 20 lub 40 μM CFSE w celu miareczkowania dawki i inkubować zawiesinę komórek w temperaturze 37 oC przez 10 minut w ciemności.
  4. Odwiruj komórki w temperaturze 162 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i ponownie zawieś granulowane komórki za pomocą 4 ml DMEM zawierającego 1% FBS. Powtórz ten krok prania jeszcze trzy razy. Ponownie zawiesić granulowane komórki za pomocą 4 ml samego DMEM w celu końcowego przepłukania.
  5. Poddaj komórki znakowane CFSE analizie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu ilościowego określenia intensywności fluorescencji pojedynczej komórki lub wstrzyknięcia żyły ogonowej.
    UWAGA: Trzymaj komórki na lodzie przed wykonaniem analizy FACS lub wstrzyknięć do żył ogonowych.

4. Test kolonizacji płuc

  1. Przygotuj komórki oznaczone 20 μM CFSE (patrz kroki od 3.1 do 3.4).
    UWAGA: Zdecyduj o dawce roboczej CFSE do znakowania komórek nowotworowych, na podstawie wyników miareczkowania z analizy FACS (patrz Krok 3.3).
  2. Rozgrzej ogony 4-6 tygodniowych samców myszy C57BL/6 (6 myszy) lampą halogenkową przez 5-10 minut na zasadzie mysz po myszy, aby rozszerzyć żyły ogona myszy.
  3. Dokładnie wymieszaj i odessaj komórki nowotworowe znakowane CFSE za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (26Gx1/2), unikając pęcherzyków w zawiesinie komórek (przy końcowej gęstości komórek 5 x 106 komórek/ml).
  4. Ostrożnie wstrzyknąć 1 x106 komórek nowotworowych znakowanych CFSE w 200 μl DMEM do żyły ogonowej myszy, która powinna być umieszczona w ograniczniku dla myszy.
    UWAGA: Podczas wstrzyknięcia, jeśli igła jest umieszczona bezpośrednio w świetle żyły ogonowej, komórki nowotworowe powinny być łatwo dostarczone do krążenia bez konieczności mocnego naciskania na strzykawkę. Jeśli trudno jest przepchnąć komórki nowotworowe, najprawdopodobniej zostały one wstrzyknięte poza żyłę ogonową, do przestrzeni podskórnej.
  5. Podziel myszy, które otrzymały dożylnie komórki nowotworowe znakowane CFSE, na dwie grupy: jedna grupa przejdzie perfuzję płuc, a następnie mikroskopię konfokalną i kwantyfikację ImageJ w teście kolonizacji płuc, a druga zostanie pozostawiona sama na 4-5 tygodni w długoterminowym teście kolonizacji płuc.
  6. Po 20, 38 lub 45 godzinach i z 1x 106 komórkami nowotworowymi wstrzykniętymi dożylnie podczas miareczkowania zależnego od czasu i dawki, znieczulij myszy z guzem za pomocą 50-75 mg / kg zoletil 50, który jest dobrze akceptowanym i właściwym środkiem znieczulającym23.
    UWAGA: Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  7. Przeciąć podłużnie skórę i tkanki podskórne od brzucha do klatki piersiowej nożyczkami chirurgicznymi. Otwórz jamę opłucnową nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami, aby całkowicie odsłonić serce i płuca.
    UWAGA: Uważaj, aby nie odciąć naczyń krwionośnych.
  8. Zawiązać żyłę główną górną (SVC) i żyłę główną dolną (IVC) sterylnymi szwami chirurgicznymi, aby zapobiec cofaniu się roztworu perfuzyjnego podczas perfuzji płuc.
  9. Przeciąć ścianę lewej komory nożyczkami chirurgicznymi, aby otworzyć szczelinę (około 2-4 mm) w celu odprowadzenia roztworu perfuzyjnego z płuc.
  10. Wstrzyknąć 1x PBS do prawej komory za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i usunąć odsączony roztwór ze stałym ssaniem podczas perfuzji płuc, aż płuca zmienią kolor z czerwonawego na całkowicie blady.

5. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe i analiza komórek nowotworowych skolonizowanych przez płuca

  1. Usuń blade płuca z jamy opłucnej i oddziel pięć płatów, odcinając tchawicę i więzadła tkanki łącznej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy24.
  2. Przygotuj uchwyt na płuca przypominający nosze, jak pokazano w Rysunek 3B, owijając nylonowy szew wokół dwóch metalowych prętów, aby uzyskać siatkową teksturę z przestrzenią między dwoma prętami do umieszczenia płatów płuc. Umieść uchwyt na płuca w naczyniu o średnicy 6 cm.
    UWAGA: Uchwyt płuc będzie używany do stabilizacji płatów płuc pod soczewką obiektywu mikroskopu konfokalnego.
  3. Umieść i przymocuj płaty płuc do siateczkowatej tekstury uchwytu płuca. Przykryj i zwilż płaty płuc 1x PBS.
  4. Poddaj 6-centymetrową naczynie hodowlane, w której znajdują się płaty płuc na uchwycie płuc, mikroskopii konfokalnej w celu uchwycenia obrazów fluorescencyjnych rejestrujących komórki nowotworowe kolonizujące płuca.
  5. Do obrazowania należy używać soczewek obiektywowych (5X, MPLN, NA: 0,1, WD: 20, Air).
  6. Obróć koło filtra do NIBA (wzbudzenie/emisja; 470-495 nm/510-550 nm) i użyj lasera 488 nm do wzbudzenia CFSE, aby wyraźnie uwidocznić obrazy punktów fluorescencyjnych w płatach płuc.
  7. Obróć koło filtrów na R690 (dla lasera MaiTai HP DeepSee), aby skanować z prędkością skanowania 2,0 μs/piksel i zoptymalizować poziomy HV, wzmocnienia i przesunięcia.
  8. Rejestruj obrazy fluorescencyjne (512 x 512 pikseli) za pomocą oprogramowania mikroskopowego z prędkością skanowania 10 μs/piksel.
  9. Określ ilościowo i analizuj statystycznie obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ i GraphPad, jak opisano wcześniej21.

6. Długoterminowe testy kolonizacji płuc

UWAGA: Powtórz kroki od 4.1 do 4.5.

  1. Poświęć myszy po inokulacji komórek nowotworowych przez 4-5 tygodni i napraw ich płuca za pomocą Bouin's Fluid25 przez 1 do 2 dni.
  2. Określ ilościowo i przeanalizuj statystycznie guzki guza z płuc myszy za pomocą software21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed przeprowadzeniem testu kolonizacji płuc in vivo, jak pokazano w Rysunek 1A, aby sprawdzić, czy poliFN na zawieszonych komórkach nowotworowych pośredniczy w kolonizacji płuc i/lub wynaczynieniu ułatwiając przerzuty, najpierw miareczkowaliśmy różne stężenia CFSE, związku fluorescencyjnego, który jest przepuszczalny dla komórek i kowalencyjnie koniuguje wewnątrzkomórkowe cząsteczki zawierające aminy26,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z długoterminowymi testami kolonizacji płuc, krótkoterminowa metodologia, którą zastosowaliśmy tutaj do oceny kolonizacji płuc in vivo przez CTC w odległych narządach, wyraźnie ujawniła i zróżnicowała specyficzną rolę polyFN zgromadzonego na CTC w kolonizacji płuc, co następnie doprowadziło do procesów wynaczynienia i przerzutów 18,19,20,21. Chociaż znakowanie komórek za pomocą dł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Dr. Ming-Min Chang i Pani Ya-Hsin Cheng za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez tajwańskie Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST-103-2325-B-006 -009, MOST- 104-2325-B-006-001, MOST-105-2325-B-006-001 i MOST-106-2320-B-006-068-MY3) oraz Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej (MOHW106-TDU-B-211-144004). Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie ze strony Głównego Laboratorium Badawczego College of Medicine, National Cheng Kung University, dla ich wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
Albumina surowicy bydlęcej ( BSA)Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)101-9048-46-8
Płyn BouinaMCC (korporacja chemii medycznej)/POISON456-A-1GL
Barwnik proliferacyjny CFSEebiosciences65-0850-85Pełna nazwa: Karboksyfluoresceina succinimidylowa ester
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)101-6381-92-6Do przygotowanego roztworu trypsyny-EDTA( Stężenie końcowe: 0,53mM ) 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Rak płuc Lewisa (LLC)ATCC, Manassas, VA, USA,CRL-1642
L-glutamina, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Chlorek potasu (KCl)Cyrusbioscience (Taipei, Tajwan)101-7447-40-7Do przygotowania 1X PBS ( Stężenie końcowe: 2,7mM )
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipei, Tajwan)101-7778-77-0Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 1,8mM )
Sód chlorek (NaCl)Cyrusbioscience (Tajpej, Tajwan)101-7647-14-5Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 137mM )
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Do przygotowanego 1X PBS ( Stężenie końcowe: 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g wymieszać ze 100 ml 1X PBS
TrypsynaSigma AldrichT4799Do przygotowanego roztworu trypsyna-EDTA ( Stężenie końcowe: 5g/L )
Zoletil 50VirbacDo rozcieńczenia 1X PBS 
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Compact Wirówka stołowa 2420KUBOTA Co.2420
Naczynie hodowlane (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
Jednorazowa strzykawka (z igłą)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm;3 ml & 26G/0,5 cm;1 ml
Mikser end over endC.T.I YOUNG CHENNTS-20Do odzyskiwania zawieszonych komórek 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
KleszczeDimeda10.102.14
Forma Direct Heat Inkubator CO2Thermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Ogranicznik myszy (Ogranicznik cylindryczny 15-30 g)Stoelting51338
Wielofotonowy mikroskop konfokalny BX61WIOlympusFV1000MPE
Komora licząca NeubauerMarienfeld-Superior640010
Nożyczki chirurgiczneDimeda08.370.11
Szwy chirurgiczne UNIK SZWY CHIRURGICZNE MFG. CO.NR 0034pleciony jedwab; niewchłanialny (25YD; U.S.P. 4/0)
1,5 ml probówka do mikrowirówekWuxi NEST Biotechnology Co.
15 ml rurki Greiner Greinerbio-one188271
705001615001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687(2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44(2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680(2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72(2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162(2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344(2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152(2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555(2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30(2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678(2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796(2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kr ce kom rki nowotworoweznakowanie CFSEperfuzja p ucmikroskopia konfokalnask adanie fibronektynyrak p uca linii Lewisinokulacja do ylnamyszy C57BL 6obrazowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły