Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56765

⸱

4 lipca 2018

 ,  , 
1PTN Joint Graduate Program, School of Life Sciences, Peking University, 2National Institute of Biological Sciences, Beijing

W tym artykule

Podsumowanie

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

Streszczenie

Ta technika łączy zapisy fluorescencji za pośrednictwem światłowodu z precyzyjnym dostarczaniem rekombinowanych reporterów genów opartych na adenowirusie. Ten nowy i łatwy w użyciu system monitorowania fluorescencji in vivo został opracowany w celu rejestrowania rytmu transkrypcyjnego genu zegarowego, Cry1, w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy. W tym celu zaprojektowano reporter fluorescencji transkrypcyjnej Cry1 i umieszczono go w wirusie związanym z adenowirusem. Oczyszczony, skoncentrowany wirus wstrzyknięto do mysiego SCN, a następnie wprowadzono światłowód, który następnie przymocowano do powierzchni mózgu. Zwierzęta zostały zwrócone do swoich domowych klatek i pozostawiono im 1-miesięczny okres rekonwalescencji po operacji, aby zapewnić wystarczającą ekspresję reportera. Fluorescencja została następnie zarejestrowana u swobodnie poruszających się myszy za pomocą systemu monitorowania in vivo, który został skonstruowany w naszej placówce. W przypadku systemu rejestracji in vivo laser o długości fali 488 nm został sprzężony z rozdzielaczem wiązki 1 × 4, który dzielił światło na cztery wyjścia wzbudzenia laserowego o równej mocy. Ta konfiguracja umożliwiła nam nagrywanie z czterech zwierząt jednocześnie. Każdy z wyemitowanych sygnałów fluorescencyjnych został zebrany za pomocą fotopowielacza i karty akwizycji danych. W przeciwieństwie do poprzedniej techniki rejestracji zegara okołodobowego in vivo, ten fluorescencyjny system zapisu in vivo pozwolił na rejestrację ekspresji genów zegara okołodobowego podczas cyklu światła.

Wprowadzenie

U ssaków jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) zarządza rytmem dobowym całego ciała, koordynując reakcję jednostki na egzogenne zmiany środowiskowe (np. światło, temperaturę, stres, itp.)1. Składniki zegara rdzeniowego składają się z Per1-3, Cry1-2, Clock i Bmal1 i odgrywają kluczową rolę w regulacji zegara okołodobowego każdej komórki. Każda komórka w SCN zawiera aktywator transkrypcji, CLOCK/BMAL1, który działa jak heterodimer indukujący ekspresję PER i CRY. Kompleks PER/CRY następnie hamuje funkcję CLOCK/BMAL1, tworząc pętlę sprzężenia zwrotnego transkrypcji-translacji, która trwa około 24 godzin2,3.

Poprzednie badania nad SCN głównie wykorzystywały metodę hodowli warstwowej SCN ex vivo4,5,6 i, chociaż to podejście dostarczyło cennych informacji, jego ograniczenia ograniczyły naszą zdolność do uzyskania danych dotyczących wpływu innych jąder mózgu na SCN, jak również wpływu bodźców egzogennych (np., światła) na komórkach znajdujących się w tym krytycznym regionie. W 2001 roku grupa Hitoshi Okamury była pierwszą, która użyła systemu bioluminescencji do monitorowania in vivo ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN u swobodnie poruszających się myszy7. Grupa Kena-ichi Honmy spędziła ostatnie kilka lat na dalszym rozwijaniu systemu rejestracji bioluminescencji in vivo w SCN8,9,10. Łącznie badania te dały naukowcom możliwość monitorowania zegara okołodobowego w ciągłej ciemności lub po impulsie świetlnym. Ponieważ jednak bioluminescencja jest zbyt słaba, aby umożliwić ciągłe monitorowanie podczas cyklu światło/ciemność, w połączeniu z faktem, że światło jest dominującym sygnałem wymaganym do porywania zegarów okołodobowych za pośrednictwem SCN11, rośnie zapotrzebowanie na rozwój metod eksperymentalnych, które przezwyciężą ograniczenia związane z rejestracją bioluminescencji. Niniejszy raport opisuje system oparty na fluorescencji, który został skonstruowany w celu monitorowania zegara okołodobowego SCN in vivo u swobodnie poruszających się myszy. Ta łatwa w użyciu metoda pozwala na ciągłe monitorowanie podczas cyklu światło/ciemność i pozwala na długoterminową obserwację transkrypcji genów zegara okołodobowego w SCN w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury w tym protokole zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Instytutu Nauk Biologicznych w Pekinie, zgodnie z regulacjami rządowymi Chin.

1. Budowa Reportera Fluorescencji Cry1

Uwaga: Poprzednie badania okołodobowe z użyciem systemu bioluminescencji2,12,13 łączą promotor okołodobowy ze zdestabilizowaną lucyferazy (dLuc) w celu wywołania rytmicznej ekspresji dLuc. Aby rozwinąć reporter fluorescencji, zdestabilizowaną lucyferazy zastąpiono zdestabilizowanym białkiem fluorescencyjnym (dVenus) w celu wywołania rytmicznej ekspresji dVenus. Generacja reportera P(Cry1)-dVenus jest opisana poniżej, której konstrukcja jest obecnie przesyłana do Addgene i wkrótce będzie dostępna do użytku akademickiego.

  1. Amplifikacja funkcjonalnego mysiego promotora Cry1 (region genu Cry1 od +328 do -1208 pz, miejsce rozpoczęcia transkrypcji oznaczone jako ''-1''). Do amplifikacji fragmentu DNA promotora Cry1 należy użyć enzymu PCR (KOD Plus Neo), starterów F1 i R1 (patrz Tabela 2), genomu myszy jako matrycy oraz protokołu PCR producenta.
  2. Amplifikacja intronu 336 genu Cry1, który jest ważny dla funkcji zegara okołodobowego Cry114. Użyj enzymu PCR, starterów F2 i R2, genomu myszy jako matrycy i protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA intronu 336.
  3. Wzmocnij Wenus. Użyj enzymu PCR, starterów F3 i R3, plazmidu pVENUS-N1 jako matrycy oraz protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA Wenus.
  4. Amplifikacja fragmentu DNA NLS-D2. Użyj enzymu PCR, starterów F4 i R4, plazmidu pcDNA3.3-d2eGFP jako matrycy oraz protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA NLS-D2.
  5. Zsyntetyzuj fragment DNA 1 jako ekson 1.
  6. Zsyntetyzuj fragment DNA 2 jako łącznik między intronem 336 a fragmentem DNA Wenus.
  7. Przeciąć plazmid wektorowy pAAV-EF1a-podwójnie floksowany-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA za pomocą enzymów MluI i EcoRI. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić większy fragment DNA. Korzystaj z protokołu producenta.
  8. Korzystając z mieszanki montażowej Gibsona i jej standardowego protokołu, złóż wszystkie fragmenty DNA razem, aby wytworzyć reporter pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA. Korzystaj z protokołu producenta.

2. Produkcja wirusa związanego z adenowirusem15

  1. Przygotuj następujące zapasy plazmidowego DNA: 31,25 μg pRV1, 31,25 μg pH21, 125 μg pFdelta6 i 62,5 μg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA.
  2. Przygotuj pięć 15 cm szalek z komórkami 293T i poczekaj, aż komórki staną się zlewające się w 90%.
  3. Transfekcja plazmidów do komórek 297T zgodnie z protokołem odczynnika do transfekcji. Do każdej potrawy użyj 6,25 μg pRV1, 6,25 μg pH21, 25 μg pFfdelta6, 12,5 μg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA i 120 μl odczynnika do transfekcji.
  4. 72 godziny po transfekcji odłączyć komórki od każdej płytki za pomocą pistoletu do pipetowania; zebrać komórki do dwóch probówek o pojemności 50 ml.
  5. Osadzać komórki w masie 800 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Przemyć komórki, umieszczając 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w każdej probówce; Osadzać komórki w masie 800 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
  6. Zawiesić osady w 150 mM NaCl i 20 mM roztworze Tris o pH 8,0; użyć 25 ml roztworu/probówki. Dodać 1,25 ml świeżo przygotowanego 10% deoksycholanu sodu (wdH2O) do każdej probówki. Dodaj nukleazę benzonazy do końcowego stężenia 50 jednostek na ml i dokładnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  7. Usuń resztki komórkowe, odwirowując przy 3000 x g przez 15 minut. Ponadto upewnij się, że wszystkie zanieczyszczenia zostały usunięte, przepychając mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 μm; Ten krok pomoże zapobiec blokowaniu kolumn heparyny.
  8. Ustawić kolumny z heparyną za pomocą pompy perystaltycznej; ustawić natężenie przepływu na 1 ml/min, upewniając się, że do kolumn nie są wprowadzane pęcherzyki powietrza.
  9. Zrównoważyć kolumny 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris o pH 8,0. Dodaj roztwór zawierający wirusa do każdej kolumny. Przemyć kolumny 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris o pH 8,0. Następnie, za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, przemyć kolumny 1 ml 200 mM roztworu NaCl i 20 mM Tris o pH 8,0, a następnie 1 ml 300 mM roztworu NaCl i 20 mM Tris o pH 8,0.
  10. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby wymyć wirusa za pomocą 3 ml 400 mM roztworu NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, następnie 4 ml 450 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris, pH 8,0, a na koniec 3 ml 500 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris, pH 8,0. Zbierz wydobyte materiały.
  11. Aby uzyskać stężenie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV), należy załadować wyekstrahowane materiały, po 4 ml na raz, do odśrodkowych jednostek filtrujących z granicą masy cząsteczkowej 100 000 mas cząsteczkowych. Odwirować każdą próbkę o objętości 4 ml o masie 2000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucając przepływ.
  12. Gdy wszystkie wyekstrahowane materiały zostaną przepuszczone przez odśrodkowe jednostki filtracyjne, dodać 4 ml PBS i odwirować mieszaninę do około 250 μl. Usunąć rAAV (miano wirusa powinno wynosić około 2 - 8 x 1012 cząstek wirusa na ml) z odśrodkowych jednostek filtrujących, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Na tym etapie wirus może być przechowywany przez kilka miesięcy.

3. Wstrzyknięcie rAAV i wstawienie światłowodu do SCN dorosłej myszy

  1. Wstrzyknięcie okołodobowych fluorescencyjnych reporterowych rAAV do SCN
    1. Załadować 5 μl rAAV (miano wirusa wynosi około 2 - 8 x 1012 cząstek wirusa na ml) do mikrostrzykawki.
    2. Znieczulić dorosłą mysz (w wieku od 2 do 5 miesięcy, tło C57BL/6) Nembutalem (80 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczająco głębokie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
    3. Użyj nożyczek, aby usunąć sierść z głowy myszy, a następnie zamontuj mysz w aparacie stereotaktycznym. Zapewnij źródło ciepła znieczulonym zwierzętom za pomocą cyrkulacyjnego koca z gorącą wodą lub innego urządzenia grzewczego.
      UWAGA: Alternatywnie użyj kremu do depilacji lub elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść.
    4. Oczyść miejsce operacyjne odpowiednimi środkami dezynfekującymi. Na przykład może to obejmować sterylną wodę lub alkohol i jod, betadynę lub rozcieńczoną chlorheksydynę w naprzemiennych peelingach. Powtórz co najmniej 3 razy. Ułóż miejsce operacji.
    5. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze głowy i odsłonić czaszkę.
    6. Ustaw aparat stereotaktyczny tak, aby bregma i lambda znajdowały się w tej samej płaszczyźnie poziomej; utwórz dwa symetryczne punkty bregmy w tej samej płaszczyźnie poziomej.
    7. Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego 4%H2O2/H2O, aby skorodować okostną mózgu. Następnie użyj czystego, sterylnego bawełnianego wacika, aby oczyścić i osuszyć powierzchnię czaszki.
    8. Za pomocą mikrowiertła wykonaj otwór o średnicy około 1 mm, 0,46 mm z tyłu i 0,25 mm z boku do bregmy.
    9. fiUżyj czystego, bawełnianego, sterylnego wacika z roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć fragmenty kości z odsłoniętej powierzchni mózgu.
    10. Wprowadzić mikrostrzykawkę do mózgu, upewniając się, że końcówka mikrostrzykawki znajduje się 0,46 mm z tyłu i 0,25 mm z boku do bregmy oraz na głębokość 5,7 mm od powierzchni czaszki.
    11. Wstrzyknąć 500 nL rAAV (50 nL min-1) do SCN, pozostawiając mikrostrzykawkę na miejscu na 10 minut po wstrzyknięciu, aby zapewnić całkowitą dyfuzję rAAV.
    12. Powoli wyjąć mikrostrzykawkę.
  2. Włóż światłowód do obszaru SCN.
    1. Za pomocą noża do światłowodów przytnij włókno o długości 17 mm, upewniając się, że każda strona światłowodu jest gładka.
    2. Włóż światłowód do tulejki ceramicznej i przymocuj światłowód do ceramicznej tulejki za pomocą nadtlenku ketonu metylowo-etylowego (klej AB), upewniając się, że powierzchnie światłowodu i tulejki ceramicznej są wyrównane.
    3. Oczyść włókno zimnym roztworem sterylizującym lub tlenkiem etylenu.
    4. Po wstrzyknięciu rAAV (krok 3.1.11) włóż ceramiczny światłowód zawierający tulejkę do SCN.
    5. Przymocuj ceramiczną skuwkę i światłowód do czaszki za pomocą żywicy dentystycznej i pozostaw do wyschnięcia.
    6. Posmaruj powierzchnię żywicy dentystycznej tylnym lakierem do paznokci. Powtórzyć procedury opisane w ppkt 3.1.2 do 3.2.5, pomijając faktyczne wstrzyknięcie rAAV w celu kontroli.
  3. Opieka pooperacyjna
    1. Podawaj myszom pooperacyjne leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina 2 mg/kg masy ciała, podskórnie, dwa razy dziennie.
    2. Umieść myszy w klatce regeneracyjnej, gdy wyjdą z narkozy.
    3. Myszy domowe pojedynczo w 12 godzinach światła/ciemności (natężenie światła ~100 luksów na dnie klatki) z jedzeniem/wodą dostępną ad libitum. Przed dalszymi eksperymentami należy przeznaczyć osiem dni, aby zapewnić wystarczający czas na regenerację i zapewnić optymalną ekspresję reportera fluorescencji.

4. Monitorowanie i gromadzenie danych fluorescencyjnych in vivo

  1. Osiem dni po zabiegu połącz światłowód na głowie myszy z monitorem sygnału fluorescencji (np. Gene Observer). Sprawdź sygnał fluorescencyjny w SCN myszy kontrolnych, aby ustalić sygnał tła. Przeprowadzić obserwację i pomiar tego sygnału za pomocą monitora sygnału fluorescencyjnego.
  2. Oceń sygnał fluorescencyjny myszy eksperymentalnej przy tej samej operacji myszy kontrolnej. Wyklucz myszy, które otrzymały wektor wirusowy, ale wyświetlają tylko sygnał tła z analizy, ponieważ prawdopodobnie oznacza to, że końcówka światłowodu przegapiła SCN. Po tych wstępnych środkach należy umieścić myszy w klatkach domowych na kolejne 3 tygodnie, aby sygnał fluorescencyjny mógł się ustabilizować.
  3. Po 3 tygodniach połącz myszy z monitorem sygnału fluorescencji. Mierzyć fluorescencję przez 15 s co 10 minut, z częstotliwością 100 Hz. Podczas tych pomiarów myszy swobodnie poruszają się w swoich klatkach z jedzeniem/wodą dostępną ad libitum. Użyj natężenia światła na dnie klatki ~100 luksów, a mocy lasera na końcówce światłowodu między 15 - 20 μW.
  4. Po zakończeniu wszystkich nagrań, przetapiaj myszy 4% paraformaldehydem, a następnie usuń i pokrój mózgi, aby sprawdzić położenie światłowodu. Wyklucz myszy z analizy, jeśli końcówka światłowodu nie jest prawidłowo wszczepiona do SCN.

5. Analiza i prezentacja danych

  1. Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut przez 15 s, z częstotliwością 100 Hz, aby uzyskać 1500 punktów danych. Średnia z tych 1500 punktów przekłada się na sygnał fluorescencyjny w dowolnym punkcie czasowym. Wykreślenie wielu średnich w czasie tworzy krzywą sygnału do czasu, która odpowiada rytmowi transkrypcji Cry1 w kontrolnych warunkach oświetleniowych w SCN swobodnie poruszających się myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Projekt fluorescencyjnego raportera Cry1 przedstawiono na Ryc. 1A. Stosując opisaną powyżej metodę, do jądra nadskrzyżowaniowego (SCN) dorosłej myszy pomyślnie wstrzyknięto 50 nL rAAV-P(Cry1)-intron36-Venus-NLS-D2, co zaowocowało silną ekspresją Venus (Ryc. 1B, 1C). Sygnały fluorescencji zarejestrowane w warunkach 12h/12h światło/ciemność (LD) oraz ciemność/ciemność (DD) (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przeciwieństwie do metod ex vivo, takich jak hodowla plastrów 4,5, RT-PCR16 i hybrydyzacja in situ 17, które wymagają zabicia zwierząt, metoda rejestracji in vivo pozwala badaczom badać okołodobową ekspresję genów u żywego zwierzęcia. W związku z tym technologia ta zapewnia możliwość oceny wpływu różnych zaburzeń fizycznych (np. braku snu, stresu, spożycia pokarmu itp.)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Zhang za prowadzenie stymulujących dyskusji, a członkom laboratorium Zhan za pomoc techniczną. Badania te były wspierane przez granty 31500860 (dla C.Z.) NSFC, 2012CB837700 (dla E.E.Z. i C.Z.) programu 973 z M.O.S.T. z Chin oraz przez finansowanie przez Samorząd Miejski Pekinu. E.E.Z. był wspierany przez chiński "Program Rekrutacyjny Globalnych Ekspertów ds. Młodzieży".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KOD PlusNeo TOYOBOKOD-401Odczynnik
pVENUS-N1addgene#61854Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP addgene#26821Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpAaddgene#20297Plasmid
MluIThermo ScientificFD0564Odczynnik
EcoRIThermo ScientificFD0274Odczynnik
Gibson Assembly MixNEBE2611sOdczynnik
Lipofectamine 2000Thermo Scientific12566014
Odczynnik Filtr strzykawkowyEMD MilliporeSLHV033RS0,45  &mikro; m 
Kolumny heparyny HiTrapgelifesciences17-0406-011 ml 
Filtr odśrodkowy Amicon ultra-4EMD Millipore  UFC810024100 000 MWCO
Nukleaza benzonazowaSigma-AldrichE1014Odczynnik
Deoksycholan soduSigma-AldrichD5670Przygotuj świeży roztwór dla każdej partii
myszy aparat stereotaktycznyB& E TEKSYSTEMS LTD#SR-5M/6MSprzęt
pentobarbitalSigmaAldrich#1507002Odczynnik
mysz stereotaktycznyB& E TEKSYSTEMS LTD#SR-5M/6MSprzęt
Roztwór nadtlenku wodoruSigmaAldrich#216763Odczynnik
ŚwiatłowódThorlabsFT200EMT0,39 NA, Ø 200 i mikro; m
pompa mikrostrzykawkowaWtryskiwacz Nanolitr 2000, okucie ceramiczne WPI
Shanghai Fiblaser230 i thinsp; μ m I.D., 2,5 mm OD
Obserwator genówBiolinkOpticsSprzęt
Equipment

Bibliografia

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
  2. Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
  3. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
  4. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
  6. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  7. Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
  8. Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310(2015).
  9. Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
  10. Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
  11. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  12. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).
  13. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
  14. Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  15. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).
  16. Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
  17. Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
  18. Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
  19. Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

światłowódrekombinowany AAViniekcja AAVaparat stereotaktycznyfotopowielaczkarta akwizycji danych
In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.