Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Streszczenie

Ludzka kora mózgowa jest bardzo rozbudowana i wykazuje złożoną strukturę z określonymi obszarami funkcjonalnymi, zapewniając wyższe funkcje mózgu, takie jak funkcje poznawcze. Wysiłki mające na celu zbadanie rozwoju ludzkiej kory mózgowej były ograniczone przez dostępność systemów modelowych. Przełożenie wyników badań na gryzoniach na organizm ludzki jest ograniczone przez różnice gatunkowe, a badania nad pierwotnymi tkankami ludzkimi są utrudnione ze względu na brak dostępności tkanek, a także obawy etyczne. Ostatnie osiągnięcia w technologii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) obejmują generowanie trójwymiarowych (3D) samoorganizujących się systemów hodowli organotypowych, które do pewnego stopnia naśladują specyficzny dla człowieka rozwój mózgu in vitro. Obecnie dostępne są różne protokoły generowania organoidów specyficznych dla całego mózgu lub regionu mózgu. Metoda generowania jednorodnych i powtarzalnych organoidów typu przodomózgowia z indukowanego PSC (iPSC), którą wcześniej ustaliliśmy i opisaliśmy tutaj, łączy wewnętrzną zdolność PSC do samoorganizacji z kierowanym różnicowaniem w kierunku przedniej linii neuroektodermalnej i osadzaniem macierzy w celu wspierania tworzenia ciągłego nabłonka nerwowego. Dokładniej rzecz ujmując, protokół ten obejmuje: (1) generowanie agregatów iPSC, w tym konwersję kolonii iPSC do konfluencyjnej kultury jednowarstwowej; (2) indukcja neuroektodermy przedniej; (3) osadzanie agregatów neuroektodermalnych w rusztowaniu matrycy; (4) wytwarzanie organoidów typu przodomózgowia z agregatów neuroektodermalnych; oraz (5) utrwalanie i walidacja organoidów typu przodomózgowia. W związku z tym protokół ten zapewnia łatwy do zastosowania system do generowania standaryzowanych i odtwarzalnych struktur tkanki korowej pochodzących z iPSC in vitro.

Wprowadzenie

Ludzki mózg jest zdecydowanie jednym z najbardziej złożonych organów i odpowiada za wszystkie ludzkie zdolności intelektualne. W związku z tym głębsze zrozumienie rozwoju mózgu specyficznego dla człowieka jest krytycznym warunkiem wstępnym dla zrozumienia ludzkich zdolności poznawczych. Tradycyjnie, transgeniczne zwierzęta służyły jako organizmy modelowe do badania rozwoju mózgu. Modele te dostarczyły fundamentalnych informacji na temat zasad rozwoju mózgu. Obecnie wiemy, że wspólną cechą rozwoju mózgu u wszystkich ssaków jest precyzyjna choreografia proliferacji progenitorów, neurogenezy i migracji neuronów. Istnieją jednak znaczące różnice strukturalne między mózgami organizmów modelowych, takich jak gryzonie i ludzie, zwłaszcza w korze nowej. Podstawowe mechanizmy, które zostały zaproponowane, aby przyczynić się do ewolucji kory naczelnych, to zwiększona proliferacja komórek macierzystych i progenitorowych, a także wytwarzanie zewnętrznych promienistych komórek glejowych (oRGC), które są bardzo rzadko spotykane u gryzoni^1,2,3.

Metody modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej obejmują generowanie komórek progenitorowych kresomózgowia pochodzących z PSC oraz neuronów projekcyjnych kory mózgowej jako kultur jednowarstwowych. Te ustandaryzowane protokoły różnicowania odtwarzają pewne aspekty rozwoju kory mózgowej człowieka, takie jak stereotypowy porządek czasowy neurogenezy korowej⁴. Nie są one jednak wystarczające, jeśli chodzi o rekapitulację procesów rozwojowych organogenezy, takich jak wzorce przestrzenne i morfogeneza. Nowsze osiągnięcia w biologii komórek macierzystych doprowadziły do powstania trójwymiarowych kultur organoidowych z PSC, które rewolucjonizują badania nad organogenezą człowieka in vitro. Wykorzystując zdolność PSC do samoorganizacji w struktury organotypowe, ustalono różne organoidy, które odzwierciedlają kluczowe właściwości strukturalne i funkcjonalne narządów, w tym nerek, jelit, oka i mózgu⁵. Takie organoidy zawierają wiele podtypów komórkowych specyficznych dla narządów, które grupują się i organizują przestrzennie bardzo podobnie do rozwijających się narządów in vivo^5,6. Ponadto skład komórkowy, pokrewieństwo i badania sieci genów z wykorzystaniem sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki ujawniły, że ludzkie organoidy mózgowe wiernie odwzorowują główne aspekty rozwoju ludzkiej kory nowej płodu, takie jak programy ekspresji genów^7,8. Jedną z głównych wad, która do tej pory uniemożliwiała ich szerokie zastosowanie, były jednak duże różnice między partiami i niejednorodność między organoidami⁹.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół dla prostego i ustandaryzowanego systemu hodowli organoidów typu przodomózgowia. Kluczową cechą tego systemu jest to, że wydajnie i powtarzalnie generuje organoidy pochodzące z PSC o niemal wyłącznej tożsamości grzbietowej kresomózgowia. Protokół jest oparty na metodach użytych w naszym ostatnim artykule Cell Reports¹⁰. Łączy w sobie zdolność iPSC do samoorganizacji z selektywną indukcją nabłonka nerwowego kory mózgowej i może solidnie generować jednorodne kultury wczesnej tkanki kresomózgowia grzbietowego w ciągu 3 tygodni. Protokół opiera się na wcześniej opisanej strategii sygnalizacji SMAD i hamowania Wnt, która kieruje różnicowaniem PSC w kierunku przedniej linii neuroektodermalnej^11,12 w połączeniu z osadzaniem w matrycy, co sprzyja tworzeniu dużych i ciągłych struktur neuroepitelialnych¹³. Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną metodę na różnych liniach iPSC, z kilkoma klonami na osobę. Wykazaliśmy, że system ten nadaje się do dalszych zastosowań, w których odtwarzalność i jednorodność mają kluczowe znaczenie, takich jak modelowanie chorób. Stosując protokół do iPSC pochodzących od pacjentów cierpiących na ciężką wadę rozwojową kory mózgowej, byliśmy w stanie podsumować patologiczne cechy choroby in vitro i zidentyfikować nowe mechanizmy molekularne prowadzące do zmian fenotypowych¹⁰. Sugerujemy, że opisany protokół organoidowy może być wykorzystany do wypełnienia luki między redukcjonistycznymi kulturami monowarstwowymi kory mózgowej pochodzącymi z PSC a badaniami in vivo, oraz że reprezentuje niezawodny i stabilny system modelowy oparty na komórkach do symulacji wczesnego rozwoju kory mózgowej człowieka w zdrowiu i chorobie poza ciałem ludzkim.

Protokół

1. Generowanie agregatów iPSC

1. Wytwarzanie jednokomórkowych kultur jednowarstwowych z kolonii iPSC
   1. Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą ekstraktem z błony podstawnej (BME). Rozmrozić BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny, rozcieńczyć zimnym zmodyfikowanym podłożem Eagle F12 firmy Dulbecco (DMEM-F12; rozcieńczenie 1:50), przykryć płytkę 1 ml/studzienkę rozcieńczonego roztworu BME i przechowywać płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Odessać pożywkę i przemyć nienaruszone kolonie iPSC z co najmniej 2 dołków 6-dołkowej płytki 0,5 mM EDTA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dwa razy przed inkubacją kolonii z 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Odessać roztwór EDTA i delikatnie odłączyć kolonie, zmywając je z dna naczynia 5 ml pożywki DMEM-F12. Zbierz je do probówki o pojemności 15 ml i zagnieźdź przez odwirowanie (4 min przy 1,200 x g przy RT).
      Uwaga: Z powodzeniem zastosowano iPSC przeprogramowane z dostępnych na rynku fibroblastów¹⁰.
   3. Odessać supernatant i inkubować kolonie iPSC z 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek przez 6 minut w temperaturze 37 °C.
   4. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby rozbić pozostałe skupiska komórek na pojedyncze komórki.
   5. Dodać 4 ml DMEM-F12 do zawiesiny komórek, aby rozcieńczyć odczynnik do dysocjacji komórek.
   6. Wiruj komórki w dół przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
   7. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 i komórkach nasiennych do jednego dołka na 6-dołkowej płytce pokrytej BME.
      nuta: Użyć pożywki iPSC określonej w Tabeli materiałów dla jednokomórkowych monowarstwowych kultur iPSC.
   8. Następnego dnia zastąp pożywkę nową pożywką iPSC, na której brakuje Y-27632. Od tego momentu kontynuuj hodowlę komórek, zmieniając pożywkę każdego dnia, aż iPSC będą w 100% zlewne. W zależności od linii komórkowej i zbiegu studzienek początkowych zajmie to od 2 do 4 dni.
   9. Po zlaniu się przejdź przez iPSC. Odessać pożywkę i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.
   10. Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.
   11. Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 5 ml.
   12. Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
   13. Wysiewać komórki w pożywce iPSC uzupełnionej 5 μM Y-27632 w stosunku 1:2 do 1:4 na 6-dołkowej płytce pokrytej BME (2 ml / dołek pożywki).
   14. Kontynuuj hodowlę komórek przez 2-5 dni i codziennie zmieniaj pożywkę iPSC, w której brakuje Y-27632. Po zlewaniu się przechodzą iPSC (kroki 1.1.4-1.1.8).
       nuta: Hodowla iPSC przez co najmniej 2 pasaże jako monowarstwa w pożywce iPSC określonej w tabeli materiałów przed użyciem ich do wytworzenia agregatów iPSC, aby umożliwić komórkom przystosowanie się do warunków hodowli.
2. Do wytwarzania agregatów iPSC należy stosować jednowarstwowe kultury iPSC, gdy zlewają się one w 70-90%.
   Uwaga: iPSC dostosował się do warunków hodowli, ponieważ pojedyncze komórki są mniej podatne na stres, który prowadzi do śmierci komórki podczas procedury dysocjacji i agregacji. Jednowarstwowe kultury iPSC muszą wykazywać typową morfologię pluripotencjalną bez dowodów na różnicowanie. Regularnie testuj kultury pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Pracuj tylko z kulturami iPSC wolnymi od mykoplazmy.
   1. Odessać pożywkę hodowlaną z jednego dołka na płytce 6-dołkowej i nałożyć 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na komórki.
   2. Inkubować komórki przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie kołysać płytką, aby oderwać komórki.
   3. Umyj komórki ze studzienki za pomocą 2 ml DMEM-F12 i zbierz je do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj DMEM-F12 do całkowitej objętości 10 ml.
   4. Do zliczania komórek należy pobrać 25 μl z zawiesiny komórek i wymieszać je z 25 μl błękitu trypanowego, aby oznaczyć martwe komórki. Policz żywe komórki za pomocą komory liczącej.
   5. Zbierz wystarczającą ilość komórek (4,500 komórek na agregat iPSC) z zawiesiny komórek w probówce o pojemności 15 ml.
   6. Wirować komórki przy 1,200 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
   7. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki iPSC uzupełnionej 50 μM Y-27632, aby uzyskać 4 500 żywych komórek na 150 μL.
      nuta: Stosowanie wysokiego stężenia Y-27632 (50 μM) ma kluczowe znaczenie dla przetrwania iPSC.
   8. Umieścić 150 μl w każdym dołku 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery U o niskiej przyczepności i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
      nuta: Generując agregaty iPSC, należy wziąć pod uwagę, że do kontroli jakości w 20. dniu potrzebnych jest co najmniej 6 organoidów (zob. sekcja 5).

2. Indukcja neuroektodermy przedniej

1. Uważnie monitoruj zmiany morfologii agregatów iPSC każdego dnia pod mikroskopem hodowli tkankowych za pomocą soczewki o dużej mocy 4X lub 10X. Obserwuj w dniu 1, agregaty komórek z wyraźnymi granicami. Kontynuować hodowlę agregatów iPSC w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   nuta: Pewna liczba martwych komórek/studzienki jest normalna i nie wpływa na wytwarzanie organoidów.
2. Podawaj agregaty iPSC począwszy od 2 dnia i kontynuuj co drugi dzień, delikatnie zasysając około 2/3 pożywki bez naruszania agregatów komórkowych na dole. Dodać dodatkowe 100 μl pożywki iPSC bez Y-27632.
   nuta: W ciągu 4-6 dni agregaty komórkowe będą miały średnicę 350-450 μm i gładkie krawędzie.
3. Na tym etapie zebrać agregaty komórek za pomocą wyciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl w naczyniu o średnicy 6 cm o niskim stopniu mocowania (maksymalnie 20 agregatów/szalkę) w pożywce do indukcji kory zawierającej DMEM-F12 z dodatkiem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP; 0,15 μg/ml), 0,5% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% L-alanylo-L-glutamina, heparyna (10 μg/ml) oraz związki LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) i inhibitor odpowiedzi Wnt-1 (IWR-1) (10 μg/ml). Nakarm agregaty komórkowe, zmieniając pożywkę indukcyjną kory mózgowej 3 dni po przeniesieniu ich do 6-centymetrowej płytki.
4. Ściśle monitoruj zmiany morfologiczne podczas indukcji kory mózgowej pod mikroskopem hodowli tkankowej za pomocą soczewki o mocy 4X.
   nuta: Po 4-5 dniach w pożywce indukcyjnej korowej krawędzie agregatów komórkowych powinny zacząć rozjaśniać się na powierzchni, wskazując na różnicowanie neuroektodermalne. Na tym etapie pojawia się promienista organizacja pseudowarstwowego nabłonka. Przejdź do sekcji 3, aby osadzić agregaty komórek w matrycy BME.

3. Osadzanie agregatów neuroektodermalnych w rusztowaniu matrycowym

1. Rozmrażać BME na lodzie w temperaturze 4 °C przez 2-3 godziny. Podwielokrotność nierozcieńczonego BME w wystarczających ilościach.
2. Przygotuj arkusz folii parafinowej z tworzywa sztucznego do procedury zatapiania. Przetnij plastikową folię parafinową za pomocą sterylnych nożyczek na kawałki o wymiarach 4 cm x 4 cm, połóż kawałek plastikowej folii parafinowej na pustej tacce na końcówki o pojemności 100 μl na końcówki o pojemności 100 μl i dociśnij palcem w rękawiczce, aby powstały małe wgłębienia w plastikowym arkuszu folii parafinowej (potrzebny 1 wgłębienie/agregat komórek). Oczyść plastikową folię parafinową z 70% etanolem i naświetl ją światłem UV (moc: 15 watów, długość fali: 435 nm) pod zamkniętą sterylną ławą przez 30 minut.
3. Przenieś każdą agregację komórek do jednego wgłębienia w arkuszu folii parafinowej z tworzywa sztucznego za pomocą końcówki o pojemności 100 μl z otworem o średnicy 1,5-2 mm. W przypadku, gdy dwa agregaty komórek są połączone, nie rozdzielaj ich, ale przenieś je razem do jednego wgłębienia.
4. Delikatnie zassać pożywkę otaczającą agregaty komórek za pomocą nieoszlifowanej końcówki do pipety o pojemności 100 μl.
   nuta: Uważaj, aby nie zassać agregatów komórek do końcówki, ponieważ spowoduje to uszkodzenie agregatów.
5. Dodać 40 μl nierozcieńczonego BME do każdego agregatu komórek.
6. Umieść każdą grupę komórek w środku kropli BME za pomocą nieobciętej końcówki pipety o pojemności 100 μl.
   nuta: Bądź bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić rozwijającego się nabłonka nerwowego końcówką pipety.
7. Ostrożnie przenieś plastikowy arkusz folii parafinowej za pomocą sterylnych kleszczy na 10-centymetrową szalkę Petriego (lub inną wystarczającą ilość naczyń do hodowli komórkowych) i umieść naczynie w inkubatorze na 15-20 minut, aby umożliwić zestalenie się BME.
8. W międzyczasie przygotuj 6-centymetrowe naczynie o niskim stopniu przystawki, zawierające 5 ml pożywki do indukcji korowej.
9. Po polimeryzacji BME należy usunąć kropelki zawierające agregaty komórkowe z arkusza folii parafinowej z tworzywa sztucznego. Odwróć plastikową folię parafinową za pomocą sterylnych kleszczy i delikatnie ściśnij agregaty komórek do lekko pochylonego (około 30 °) nisko przylegającego naczynia o średnicy 6 cm, aż kropelki spadną z plastikowego arkusza folii parafinowej. Przenieść maksymalnie 16 agregatów komórek do jednego naczynia o średnicy 6 cm.
10. Kontynuować inkubację agregatów komórkowych w temperaturze 37 °C.

4. Generowanie organoidów typu przodomózgowia z agregatów neuroektodermalnych

1. Jednego dnia po umieszczeniu w matrycy BME umieścić szalki z kulturami organoidowymi na kołyszącym się wytrząsarce do kultur komórkowych o kącie nachylenia 5 ° i 14 obr./min, zainstalowanej w inkubatorze do hodowli komórkowych.
2. Monitoruj organoidy każdego dnia. Jednorodne struktury przypominające pętlę neuroepitelialną rozwijają się stopniowo po osadzeniu w matrycy BME.
3. Gdy widoczne są struktury pętli neuroepitelialnej, należy zmienić pożywkę na pożywkę różnicującą organoidy zawierającą DMEM-F12 z suplementem N2 (1:200), suplementem B27 (1:100), glukozą (0,2 mg/ml), cAMP (0,15 μg/ml), 0,5% NEAA, 1% L-alanylo-L-glutaminą, insuliną (2,5 μg/ml)
4. Pożywkę do różnicowania organoidów należy wymieniać co 3-4 dni, aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego różnicowania. Następnie zamocuj organoidy (patrz sekcja 5).
   nuta: Czasami w tkance mogą pojawiać się zawiązki optycznie przezroczystej tkanki bez struktur pętelkowych. Chociaż nie jest to rozwiązanie idealne, nie wpływa to na rozwój struktur korowych. Organoidy można hodować w pożywce do różnicowania organoidów przez okres do 40 dni. Przez dłuższe okresy hodowli (40-100 dni) pożywkę różnicującą organoidy można uzupełnić 1:50 BME w celu zwiększenia złożoności tkanki oraz BDNF i GDNF, aby umożliwić przeżycie i dojrzewanie neuronów^14,15.

5. Utrwalenie i walidacja organoidów typu przodomózgowia

1. W celu walidacji zbierz 6 organoidów w 20 dniu. Użyj 3 organoidów do izolacji mRNA i analiz PCR. Przenieść dodatkowe 3 organoidy na 24-dołkową płytkę zawierającą PBS za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml z otworem 3-3,5 mm w celu utrwalenia i sekwencyjnych analiz immunocytochemicznych.
2. Umyj organoidy dwukrotnie, ostrożnie odsysając PBS i zastępując go świeżym PBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Utrwal organoidy przez 15 minut w zimnym 4% paraformaldehydzie (PFA) (pH 7,4).
   ostrożność: Należy pamiętać, że PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi. Wszystkie prace należy wykonywać w okapie oparów chemicznych w rękawicach nitrylowych. Zaleca się noszenie okularów ochronnych. Formaldehyd może powodować nieodwracalne uszkodzenie rogówki.
3. Ostrożnie zassać PFA i umyć trzykrotnie przy użyciu PBS o temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Zastąp PBS 30% roztworem sacharozy (wag./obj., na bazie PBS) i przechowuj próbki w temperaturze 4 °C, aby umożliwić odwodnienie organoidów. Organoidy można przechowywać do 7 dni do czasu dalszego przetwarzania.
5. Jednego dnia po utrwaleniu należy wstępnie wybarwić odwodnione organoidy, dodając błękit trypanowy w stosunku około 1:50 przez 10 minut, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas procedury kriosekcji.
6. Przygotować pożywkę zawierającą 10% sacharozy, 7,5% żelatyny wag./obj. w PBS i ogrzać ją do temperatury 75 °C do uzyskania płynu.
7. Zastąp 30% roztwór sacharozy pożywką do zatapiania i przenieś płytkę 24-dołkową na płytkę grzewczą (60 °C) na 15 minut w celu zrównoważenia organoidów.
8. Przykryj spód form do zatapiania warstwą podłoża do zatapiania i umieść je na lodzie w celu polimeryzacji.
9. Przenieść organoidy z płytki 24-dołkowej do form do zatapiania zawierających spolimeryzowane podłoże do zatapiania, dodać dodatkowe podłoże do zatapiania na wierzchu, tak aby organoidy były przykryte, i szybko umieścić formę w kąpieli zamrażającej 100% etanolu/suchego lodu (temperatura powinna wynosić od -30 do -50 °C) na co najmniej 1 minutę w celu szokowego zamrożenia.
10. Umieść tymczasowo formę z kleszkami na suchym lodzie i przechowuj ją w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąp do kriosekcji.
11. Organoidy kriosekcji o grubości 20 μm i zebrać skrawki na szkiełkach mikroskopowych, śledząc kolejność skrawków na szkiełkach (sekwencyjny wychwyt). Pozostawić skrawki do wyschnięcia na szkiełkach przez kilka godzin, przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C lub bezpośrednim wykonaniem barwienia immunocytochemicznego.

Wyniki

Opisany tutaj standaryzowany protokół organoidów typu przodomózgowia zazwyczaj generuje wysoce jednorodne kultury organoidów o prawie wyłącznie grzbietowej tożsamości korowej z ludzkich iPSC w ciągu 20 dni od uprawy (protokół opisany w Rysunek 1A). Zaleca się wykonanie kilku etapów kontroli jakości w czasie trwania protokołu, zdefiniowanych tutaj jako: "go" (kontynuuj proces różnicowania) i "no-go" (nieoptymalne hodowle, zaleca się zakończenie partii) (Rysunek 1). Wskazane jest również dobre udokumentowanie każdego etapu kontroli jakości, robiąc zdjęcia i notatki.

Pierwszym krytycznym krokiem w generowaniu organoidów typu przodomózgowia jest rozpoczęcie od wysokiej jakości kultur iPSC. Ważne jest, aby iPSC nie zawierały większych frakcji zróżnicowanych komórek. Należy używać wyłącznie kultur iPSC, które prezentują się jako jednorodna monowarstwa niezróżnicowanych komórek w populacji wyjściowej (ryc. 1B, C). Ponadto ważne jest, aby zacząć od podanego numeru komórki do agregacji iPSC. Pierwsza szczegółowa kontrola agregatów iPSC powinna zostać przeprowadzona w dniu 2. Na tym etapie agregaty powinny uformować zwarte pąki komórkowe o gładkich krawędziach ("go"), podczas gdy nieregularnie pojawiające się agregaty lub agregaty z ubytkami powinny zostać odrzucone ("no-go") (ryc. 1D, E). Kolejny etap kontroli jakości powinien zostać przeprowadzony w 10 dniu protokołu. W tym momencie agregaty komórkowe powinny wykazywać gładką i optycznie przezroczystą tkankę na zewnętrznej powierzchni, reprezentującą indukcję neuroektodermy ("go"), podczas gdy brak takiej tkanki wskazuje na nieoptymalną indukcję neuronalną ("no-go") (ryc. 1F, G). Tylko te agregaty, które wykazują półprzezroczystą powierzchnię (Rysunek 1F) powinny być osadzone w matrycy BME. Po osadzeniu organoidy korowe rozwiną ciągłe struktury przypominające pętlę neuroepitelialną, które szybko się rozszerzają. Przeanalizuj skuteczność indukcji korowej w dniu 15 i dniu 20, badając, czy organoidy rozwinęły spolaryzowaną ektodermę neuronalną, jak pokazano na Rysunek 1H, J ('go'). W przypadku, gdy organoidy nie rozwinęły takich zawiązków neuroepitelialnych ("no-go", jak pokazano na Rysunek 1I, K), krytycznie zrewiduj wykonane kroki kontroli jakości w celu rozwiązania problemu. Przy ścisłym przestrzeganiu protokołu zostaną wygenerowane wysoce znormalizowane partie organoidów (ryc. 2A, B), które wykażą ≥ 90% jednorodność w tworzeniu spolaryzowanej ektodermy neuronalnej w obrębie i między partiami ( Rysunek 2C). Częstym błędem prowadzącym do zmiennej wydajności tworzenia spolaryzowanej ektodermy neuronalnej jest zwiększanie początkowej liczby komórek do agregacji iPSC lub rozpoczynanie od kultur iPSC o niskiej jakości, takich jak kultury zanieczyszczone mykoplazmą lub kultury zawierające zróżnicowane komórki.

Szczegółowa walidacja tożsamości grzbietowej kresomózgowia wygenerowanych organoidów powinna zostać przeprowadzona w 20 dniu. W tym celu należy utrwalić 3 organoidy i użyć ich do analiz immunofluorescencyjnych. Warstwowe pętle neuroepitelialne (Ryc. 3A) wyrażają marker nerwowych komórek macierzystych Sox2 (Ryc. 3B, D), markery przodomózgowia Pax6 i Otx2 (ryc. 3C, E) oraz grzbietowy marker korowy Emx1 ( Ryc. 3F). Te pętle korowe są ponadto charakteryzowane przez wierzchołkową lokalizację N-kadheryny i ZO-1 (ryc. 3G, H), mikrotubulę pochodzącą z promieniowej komórki glejowej strefy komorowej (vRGC), która rozciąga się od wierzchołkowej do podstawowej strony struktur (Figura 3I) oraz wierzchołkowe dzielące się komórki, które barwią się dodatnio na fosforylowaną wimentynę (p-Vimentin, Rysunek 3J). Śmierć komórki może być obecna w strukturach organoidowych. Centralna apoptoza jest normalna i nie wpływa na rozwój tkanki korowej. Dodatkowo należy użyć 3 organoidów do oceny jednorodności protokołu za pomocą analiz ekspresji genów. Organoidy typu przodomózgowia wykazują ekspresję markerów grzbietowej części przodomózgowia (FoxG1, Otx2, Emx1), podczas gdy ekspresja markerów śródmózgowia (FoxA2, Pax5) i tyłomózgowia (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) nie jest wykrywalna (Ryc. 3K).

Partie organoidów o kontrolowanej jakości mogą być używane do różnych zastosowań, takich jak analiza płaszczyzny podziału wierzchołkowych promienistych komórek glejowych. W tym celu sugerujemy wykonanie podwójnego barwienia przy użyciu przeciwciał przeciwko p-wimentynie i Tpx2 (Rysunek 3J). P-wimentyna jest fosforylowana przez CDK1 podczas mitozy i znajduje się w jądrze, oznaczając w ten sposób wszystkie jądra w fazie mitotycznej¹⁶. Tpx2 jest białkiem związanym z mikrotubulami, które może wizualizować wrzeciono mitotyczne i procesy wierzchołkowe podczas międzykinetycznej migracji jądrowej^17,18. Za pomocą tych markerów można w zasadzie przeanalizować trzy aspekty podziału vRGC: (I) czy podział komórki odbywa się po stronie wierzchołkowej, (II) czy płaszczyzna podziału jest wyrównana pionowo (co wskazuje na symetryczny podział komórki), poziomo lub ukośnie (wskazując na asymetryczny podział komórki) do powierzchni wierzchołkowej oraz (III) czy centra organizujące mikrotubule są tworzone normalnie.

Organoidy mogą być również dalej różnicowane w bardziej złożone, zorganizowane i uwarstwione struktury tkanki korowej. Struktury korowe w ciągu 35 ± 2 dni organoidy składają się ze strefy komorowej (VZ), wewnętrznej i zewnętrznej strefy podkomorowej (SVZ), a także obszaru przypominającego płytkę korową (CP). W obrębie VZ oraz wewnętrznego i zewnętrznego SVZ można zidentyfikować vRGC, pośrednie progenitory (IP) i komórki przypominające oRGC. Ponadto początkowe tworzenie się warstwy kory można zaobserwować w obszarze podobnym do CP z głębokimi neuronami korowymi wyrażającymi Tbr1 i Ctip2 wewnątrz i górnymi neuronami korowymi wyrażającymi Satb2, a także komórkami eksprymującymi reelinę w zewnętrznych regionach¹⁰.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu organoidowego oraz ilustracja kryteriów 'go' i 'no-go'. (A) Schematyczny przegląd protokołu. Medium CI: ośrodek indukcji korowej; CD: ośrodek różnicowania kory mózgowej. (B-C) Obraz optymalnej 90% zlewającej się kultury jednowarstwowej iPSC (B) i nieodpowiedniej kultury iPSC wykazującej zróżnicowanie (C). (D-E) Agregacja iPSC optymalna pod względem wielkości, gęstości komórek i wyglądu powierzchni (D) oraz dwa agregaty komórkowe "no-go" wykazujące albo ubytki w komórce zapasowej (E, górne agregaty), albo nieregularne krawędzie (E, dolne zagregowanie) dwa dni po agregacji komórek. (F-G) Agregaty komórkowe wykazujące półprzezroczyste i gładkie krawędzie (F) oraz agregaty komórkowe pozbawione prześwitywania optycznego (G). Żółta linia wizualizuje obszar zainteresowania. (H-K) Optymalny organoid z ciągłymi pętlami neuronabłonkowymi (H, J) i organoid, który nie rozwinął promieniście zorganizowanej neuroektodermy (I, K) zobrazowano odpowiednio w 15 i 20 dniu. Podziałka liniowa, B-C 500 μm; D-K 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Jednorodność i odtwarzalność protokołu organoidów typu przodomózgowia. (A-B) Reprezentatywne obrazy organoidów w jasnym polu z jednej partii w dniu 15 (A) i dniu 26 (B). (C) Analizy ilościowe organoidów w dniu 20. Organoidy, które wykazują na zewnętrznej powierzchni nabłonek nerwowy, rozpoznawalny w jasnym polu jako optycznie przezroczysta powierzchowna tkanka z wyraźną obwódką i dowodami na radialną architekturę komórkową (n = 3 na linię iPSC z co najmniej 16 organoidami na eksperyment). Podziałka liniowa, A-B: 500 μm. Słupki błędów ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Walidacja organoidów typu przodomózgowia w 20 dniu. (A-J) Charakterystyka immunocytochemiczna organoidów. Organoidy organizują się w wiele pętli neuroepitelialnych (A, barwione przeciwstawnie DAPI). Warstwifikowane, zorganizowane komórki w pętlach neuronabłonkowych wyrażają marker nerwowych komórek macierzystych Sox2 (B, D), markery przodomózgowia Pax6 (C, D) i Otx2 (E), a także marker grzbietowej przodomózgowia Emx1 (F). Struktury pętli korowej wykazywały drobno przylegający pas połączeniowy po najbardziej wierzchołkowej stronie z akumulacją N-kadheryny (G) i białka zona occludens 1 (ZO-1; H). Sieci mikrotubul komorowych RGC (barwione acetylowaną α-tubuliną, Ac-Tub) rozciągają się od wierzchołka do podstawy struktur pętlowych (I). Komórki proliferujące eksprymującą p-wimentynę (p-Vim) znajdują się na powierzchni wierzchołkowej. Wrzeciona mitotyczne są barwione przez Tpx2. Reprezentatywny obraz w większym powiększeniu płaszczyzny podziału pionowego i poziomego pokazano po prawej stronie (J). (K) Analiza RT-PCR pod kątem specyficznych dla regionu czynników transkrypcyjnych w 20. dniu dwóch niezależnych zestawów organoidów pochodzących z 2 różnych linii iPSC. FB: kontrola mózgu płodu; AB: kontrola mózgu dorosłego. Podziałka liniowa, A-D 200 μm; E-I 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Epitop Rozcieńczeniu Sox2 powiedział: od 1 do 300 Pax6 powiedział: od 1 do 500 Otx2 powiedział: od 1 do 500 Emx1 powiedział: od 1 do 50 N-kadheryna od 1 do 500 ZO-1 od 1 do 100 P-wimentyna od 1 do 1000 szt. Tpx2 powiedział: od 1 do 500 Acetylowana α-tubulina od 1 do 500 Alexa488 anty ms od 1 do 1000 szt. Alexa488 anty rb od 1 do 1000 szt. Alexa555 anty ms od 1 do 1000 szt. Alexa555 anty rb od 1 do 1000 szt.

Tabela 1: Przeciwciała do kontroli jakości organoidów w dniu 20.

podkład kolejność Otx2 do przodu tgcaggggttcttctgtgat Otx2 rewers agggtcagagcaattgacca powiedział: FoxG1 do przodu ccctcccatttctgtacgttttt powiedział: FoxG1 rewers ctggcggctcttagagat powiedział: Emx1 do przodu agacgcaggtgaaggtgtgg powiedział: Emx1 rewers caggcaggcaggctctcc powiedział: FoxA2 naprzód ccaccaccaaccacacaaaatg FoxA2 bieg wsteczny tgcaacaccgtctccccaaagt tgcaacaccgtctccccaaagt Pax5 do przodu aggatgccgctgatggagtac powiedział: Pax5 rewers tggaggagtgaatcagcttgg powiedział: HoxB2 do przodu tttagccgttcgcttagagg powiedział: HoxB2 bieg wsteczny cggatagctggagacaggag powiedział: HoxA4 do przodu ttcagcaaaatgccctctctct powiedział: HoxA4 bieg wsteczny taggccagctccacagttct powiedział: HoxB4 do przodu acacccgctaacaaatgagg powiedział: HoxB4 bieg wsteczny gcacgaaagatgagggagag powiedział: HoxB6 do przodu gaactgaggagcggactcac powiedział: HoxB6 bieg wsteczny ctgggatcagggagtcttca powiedział: 18s do przodu ttccttggaccggcgcaag powiedział: 18s wsteczny gccgcatcgccggtcgg powiedział:

Tabela 2: Sekwencje starterów i starterów dla profilu ekspresji genów.

Dyskusja

Organoidy mózgowe stanowią potężne narzędzie do badania rozwoju ludzkiego mózgu in vitro , ponieważ dostarczają odpowiedniego tła gatunkowego i złożonego układu 3D komórek w kontekście tkankowym. W ten sposób wypełnili lukę między modelami zwierzęcymi innymi niż ludzie a redukcjonistycznymi technikami dwuwymiarowej hodowli komórek jednowarstwowych u ludzi. Ich stosowanie jest jednak utrudnione ze względu na brak odtwarzalności⁹. Opracowaliśmy protokół organoidowy typu przodomózgowia, który przezwycięża dużą zmienność między próbkami, łącząc zdolność do samoorganizacji iPSC z ich podatnością na czynniki wzorcowe. W szczególności iPSC zostały zagregowane w celu promowania samoorganizacji, a następnie hamowania sygnalizacji TGF-ß / SMAD w celu promowania różnicowania kory grzbietowej poprzez wystawienie kultur na działanie BMP (LDN-193189) i inhibitora receptora TGF-β typu I (A83-01). Dodatkowo zastosowano związek hamujący szlak Wnt (IWR) w celu zapobiegania posterioryzacji. W przeciwieństwie do "wewnętrznych" protokołów organoidów mózgowych¹⁹, które opierają się na samoorganizacji bez zewnętrznej kontroli, co prowadzi do powstania raczej niejednorodnych organoidów mózgowych i wykazuje duże różnice w partiach (mierzone wydajnością tworzenia spolaryzowanej ektodermy neuronalnej¹⁵), opisany tutaj protokół w sposób powtarzalny generuje jednorodne organoidy specyficzne dla przodomózgowia z ludzkich iPSC.

Te organoidy typu przodomózgowia mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, takich jak badania neurorozwojowe, badania ewolucyjne, w tym badania funkcji genów, modelowanie chorób oraz, potencjalnie, testowanie leków i cele terapeutyczne. Protokół jest jednak najbardziej odpowiedni do badania wczesnych aspektów rozwoju kory mózgowej człowieka. Na przykład wykorzystaliśmy organoidy typu przodomózgowia do zbadania specyficznych dla człowieka aspektów zachowania vRGC. Dokładniej rzecz ujmując, zajęto się zmianami patofizjologicznymi związanymi z ciężką postacią lizencefalii, malformacją kory mózgowej człowieka charakteryzującą się prawie brakiem fałdowania kory mózgowej. Tylko niektóre aspekty tej choroby można modelować u myszy, ponieważ mózg myszy jest naturalnie lizopenfaliczny. Stosując system organoidowy do iPSC pochodzących od pacjentów z lizencefalią, mogliśmy wiarygodnie podsumować specyficzne dla człowieka aspekty choroby i zidentyfikować mechanizmy leżące u jej podstaw. Mówiąc dokładniej, mogliśmy wykazać, że organoidy pochodzące od pacjentów wykazują znaczne zmniejszenie rozmiaru spowodowane przejściem z symetrycznego do asymetrycznego podziału komórek vRGC. Przełącznik ten był związany ze zmianami w organizacji sieci mikrotubul vRGC, zakłóceniem architektury niszy VZ i zmienioną ekspresją cząsteczek adhezyjnych komórek, co prowadziło do upośledzonej aktywacji osi sygnalizacyjnej N-kadheryna / β-katenina¹⁰. Warto zauważyć, że β-katenina zależna od regulacji sposobów podziału vRGC jest specyficzna dla człowieka, ponieważ nadekspresja β-kateniny u myszy prowadzi do ekspansji kory stowej, a następnie fałdowania kory²⁰. W związku z tym nasze dane podkreślają, że system organoidów typu przodomózgowia stanowi obiecujące narzędzie do badania w wymierny sposób specyficznych dla człowieka aspektów wczesnego rozwoju kory mózgowej in vitro.

Głównym wyzwaniem na przyszłość jest utrzymanie jednorodności organoidów w dłuższych okresach czasu w celu uzyskania bardziej dojrzałych fenotypów neuronów. Można to osiągnąć poprzez jeden lub więcej z następujących działań: hodowlę organoidów w systemie bioreaktora¹⁴, zastosowanie pływających rusztowań¹⁵, uzupełnienie pożywki różnicującej wzrostem neuronów lub czynnikami przeżycia neuronów. Wreszcie, kontrolowany wzrost złożoności mózgu można osiągnąć poprzez połączenie organoidów typu przodomózgowia z organoidami mózgowymi o różnej tożsamości regionalnej^21,22.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół organoidowy typu przodomózgowia oferuje łatwe do zastosowania i niezawodne narzędzie do generowania wczesnych struktur korowych in vitro. Protokół prowadzi do powstania wysoce jednorodnej wczesnej tkanki korowej w wielu liniach iPSC i może być wykorzystany do niezawodnego generowania indywidualnie specyficznej tkanki korowej. Dzięki temu system nadaje się szczególnie do zastosowań wymagających wysokiego stopnia jednorodności i odtwarzalności, takich jak modelowanie chorób.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A83-01	StemGent	130-106-274	500 nM
B27 Suplement	Gibco	17504-044	1 do 100
Ekstrakt z błony podstawnej (np. Geltrex)	Gibco	A14132-02
Cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP)	Sigma-Aldrich	A9501	0,15 &mikro; g / ml
Odczynnik do dysocjacji komórek (TrypLE Express)	Gibco	12605028
Komora licząca, np. Fuchs-Rosenthal	Karl Hecht	40449001
D-Glukoza	Carl Roth	HN06.3	0,2 mg / ml
DMEM-F12 L-glutamina	Gibco	11320033
Formy do zatapiania (Tissue-Tek Cryomold)	Sakura Finetek	4565
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	E6511	0,5 mM
Gelantin	Sigma-Aldrich	G1890
Heparyna	Sigma-Aldrich	H3149-25KU	10 ug/ml
Inhibitor odpowiedzi WNT (IWR-1)	Enzo Life Science	BML-WN103-0005	10 ug/ml
Insulina	Sigma-Aldrich	91077C	2,5 i mikro; g/mL
Pożywka IPSC do hodowli jednowarstwowych (Pluripro)	Systemy naprowadzania komórek	MK01
L-alanylo-L-glutamina (GlutaMax)	Gibco	35050038	1%
Płytki o niskiej przyczepności 6 cm	Labomedic	2081646L
Płytki o niskiej przyczepności 10 cm	Labomedic	2081646O
LDN-193189	Miltenyi Biotec	130-104-171	180 nM
N2 Suplement	Gibco	17502-048	1 do 200
Aminokwasy endogenne	Gibco	11140035	0,50%
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	4,00%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Gibco	14190144
Plastikowa folia parafinowa (Parafilm)	MARKA GMBH + CO KG	701606
Inhibitor ROCK Y-27632	Systemy naprowadzania komórek	SM02-100	5 &mikro; M lub 50 &mikro; M
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S7903
Probówki 15 ml	Corning Life Sciences	734-0451
Szkiełka mikroskopowe, np. Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe	Thermo Scientific	4951PLUS4
Kultura tkankowa 6-dołkowa Falcon		734-0019
Płytka 24-dołkowa do hodowli tkankowych	Falcon	734-0949
Niebieska plama trypanowa	Gibco	15250-061
Ultra-niskowiążąca 96-dołkowa płytka lipidurowa A-U96	Amsbio	AMS.51011610
Przeciwciała
Sox2	R& D Systems	MAB2018
Pax6	Covance	PRB-278P-100
Otx2	R& D Systems	ab9566
Emx1	Sigma HPA006421
N-kadheryna	BD	610921
ZO-1	Life Tech	61-7300
P-Vimentin	Biozol	D076-3
Tpx2	Novus Biologicals	NB500-179
Acetylowana &alfa;-tubulina	NEB/CS	5335
Alexa488 anty ms	Invitrogen	A11001
Alexa488 anty rb	Invitrogen	A11008
Alexa555 anty ms	Invitrogen	A21424
Alexa555 anty rb	Invitrogen	A21429