Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mierzenie funkcjonalnych wyników w leczeniu dystrofii mięśniowej jest istotnym aspektem badań przedklinicznych. Ocena dobrowolnego poruszania się w modelach mysich jest nieinwazyjnym i powtarzalnym testem aktywności, który jest bezpośrednio analogiczny do pomiarów poruszania się pacjenta, takich jak test 6-minutowego marszu i powiązane wyniki mobilności. Wiele popularnych metod testowania prędkości i odległości poruszania się myszy opiera się na teście na otwartym polu, w którym mierzy się swobodny ruch zwierzęcia na arenie w czasie. Jedną z głównych wad tego podejścia jest to, że komercyjne oprogramowanie i sprzęt do śledzenia ruchu w wysokiej rozdzielczości jest drogi i może wymagać przeniesienia myszy do wyspecjalizowanych ośrodków w celu przetestowania. W tym miejscu opisujemy tani, oparty na wideo system pomiaru ruchu myszy, który wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że dobrowolne poruszanie się w mysim modelu dystrofiny mdx z dystrofiną zerową dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) jest zmniejszone w stosunku do aktywności myszy typu dzikiego. U myszy mdx wykazujących ekspresję transgenu utrofiny te deficyty aktywności nie są obserwowane, a całkowita przebyta odległość jest nie do odróżnienia od myszy typu dzikiego. Metoda ta jest skuteczna w mierzeniu zmian w dobrowolnym chodzeniu związanym z patologią dystroficzną i zapewnia wszechstronną platformę, którą można łatwo dostosować do różnych warunków badawczych.
Wprowadzenie
Wiarygodne i powtarzalne pomiary funkcji mięśni są kluczowe dla oceny skuteczności potencjalnych terapii DMD. DMD jest zaburzeniem genetycznym spowodowanym mutacjami w genie dystrofiny, prowadzącymi do postępującego osłabienia mięśni, utraty ruchu i ostatecznie niewydolności krążeniowo-oddechowej. Najczęściej stosowanym zwierzęcym modelem DMD jest mysz mdx z dystrofiną zerową. Zestaw testów funkcjonalnych pojawił się jako rutynowe testy do oceny postępu choroby u myszy mdx, a także w podobnych modelach zwierzęcych innych dystrofii i miopatii. Powszechnie stosowane testy in vivo obejmują pomiary siły chwytu kończyn przednich, czasu zwisania drutu, maksimum rotarod, czasu do wyczerpania podczas biegania na bieżni oraz śledzenie aktywności motorycznej. W tej dziedzinie podjęto znaczne wysiłki w celu standaryzacji tych testów, mając na celu zmniejszenie zmienności między badaniami przedklinicznymi i zwiększenie potencjału translacyjnego terapii testowanych na myszach1,2.
Jedną z ważnych kategorii badań przedklinicznych jest pomiar dobrowolnego ruchu, parametru, który jest często zmieniany w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Jest to zwykle testowane za pomocą testów opartych na monitorowaniu aktywności w otwartym terenie i może oceniać ruchy poziome (chodzenie) lub pionowe (wychowawcze) w ciągu minut lub godzin2,3,4. Wiele badań wykazało, że dobrowolny ruch jest zmieniony u myszy mdx, szczególnie po ćwiczeniach, a pomiary te okazały się wrażliwe na leczenie farmakologiczne i postęp choroby. Jednym z głównych ograniczeń w wykonywaniu tych testów jest potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu. W tym miejscu przedstawiono tanią metodę, która śledzi ruch myszy przy użyciu łatwo dostępnych zasobów.
Dystans 6-minutowego spaceru jest wskaźnikiem powszechnie używanym jako narzędzie oceny klinicznej u osób z dystrofią mięśniową Duchenne'a5,6. Modyfikacje tej miary zostały wykorzystane do oceny wyników w modelach zwierzęcych Duchenne'a, w tym myszy mdx7 i psy z dystrofią mięśniową golden retriever (GRMD)8. W tym badaniu rejestrujemy dobrowolne ruchy w otwartym polu w ciągu 6 minut bezpośrednio po łagodnym wyzwaniu ćwiczeń. Odległość ambulacji została następnie obliczona przy użyciu bezpłatnego oprogramowania typu open source do pomiaru ruchu poziomego w czasie.
Główną zaletą tej metody jest to, że zwierzęta mogą być testowane w różnych warunkach bez potrzeby specjalistycznego sprzętu czy drogiego komercyjnego oprogramowania do analizy. Jednym z ważnych aspektów tej analizy jest to, że można ją przeprowadzić w podstawowych warunkach laboratoryjnych bez konieczności przenoszenia lub przenoszenia myszy z wiwarium do specjalistycznej placówki podstawowej. Opisany tutaj protokół śledzenia wideo dobrze nadaje się do oceny poruszania się w stosunkowo krótkich okresach czasu i może wykryć różnice w aktywności między myszami typu dzikiego i mdx, a także ujawnić poprawę funkcjonalną w ratunkowym modelu DMD.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Myszy typu dzikiego (C57BL/6J) oraz myszy mdx (tło C57Bl/10ScSn) zostały zakupione z komercyjnego źródła. Myszy mdx:utrophin-Tg były darem od Jamesa Ervasti, za zgodą Kay Davies, i były utrzymywane na tle mdx. Testy chodu przeprowadzono na samcach myszy w wieku 6 miesięcy. Myszy były utrzymywane w Terasaki Life Sciences Vivarium zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (zatwierdzenie nr 20-029-43), a zgodę na te badania przyznał UCLA Animal Welfare Assurance (zatwierdzenie nr A3196-01).
1. Przygotowanie komory
- Przeprowadź zbieranie danych w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze o stałej porze dnia9. Testy należy przeprowadzić w sposób zaślepiony pod kątem genotypu i zastosowanej terapii badanej myszy.
- Dostosuj dowolny system komory otwartego pola do tej analizy.
UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano niedrogą i łatwo transportowalną komorę rejestracyjną wykonaną z dużego kosza na śmieci. Areną otwartego pola jest taca ustawiona na klatce lub podobnej podwyższonej platformie. - Umieść kamerę na siatce nad komorą, aby rejestrować obraz całej areny.
- Przed każdą próbą oczyść komorę rejestracyjną środkiem dezynfekującym.
2. Protokół przedwysiłkowy i gromadzenie danych
- Opcjonalnie, bezpośrednio przed rejestracją aktywności, poddaj każdą mysz protokołowi aktywacji mięśni.
UWAGA: Krok ten jest opcjonalny, ale zalecany w eksperymentach z udziałem myszy mdx.- Pozwól myszy chwycić uchwyt cyfrowego miernika siły i delikatnie pociągnij do tyłu, aż zwierzę puści uchwyt. Powtórz tę procedurę pięć razy w ramach jednej próby.
- Zarejestruj maksymalne napięcie (N) dla każdej próby.
UWAGA: Poza pełnieniem funkcji wyzwania wysiłkowego dla testu ambulacyjnego, siła wywarta przez zwierzę podczas tego testu siły chwytu może służyć jako dodatkowy funkcjonalny miernik wyniku2,10. - Wykonaj łącznie pięć prób dla każdej myszy, z 1 min przerwą między kolejnymi próbami.
- Bezpośrednio po teście siły chwytu lub innym protokole wysiłkowym, umieść mysz w komorze aktywności.
- Rozpocznij nagrywanie wideo ruchów myszy w arenie komory. Pozwól myszy swobodnie eksplorować otoczenie przez 6 min.
- Zatrzymaj nagrywanie po 6 min i przenieś mysz z powrotem do klatki domowej.
3. Analiza wideo
- Opcjonalnie przygotuj wideo do analizy poprzez zmniejszenie częstotliwości odświeżania klatek. Aby zmniejszyć częstotliwość klatek na potrzeby analizy śledzenia, zastosuj poniższy protokół w programie do edycji wideo (np. iMovie lub podobnym programie), aby zredukować liczbę klatek wideo dwukrotnie.
UWAGA: W zależności od długości i częstotliwości klatek wideo, przed analizą może być przydatne zmniejszenie częstotliwości odświeżania. W niniejszym badaniu wideo nagrywano przy 30 frames/s (nagranie trwało 6 min, co daje łącznie około 10 80 klatek).- Załaduj wideo do programu.
- W menu „Speed” wybierz opcję „Speed: Fast” i ustaw prędkość na 2x.
- Wyeksportuj zredukowane wideo w formacie pliku .mp4 do analizy śledzenia.
- Otwórz wideo do analizy w programie komputerowym. Wykonaj kalibrację nagrania wideo za pomocą narzędzia linii. Narysuj linię wzdłuż jednej krawędzi komory. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii i wybierz „Calibrate measure…”. Wprowadź rzeczywisty wymiar boku komory w centymetrach.
- Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij kursor „move”.
Zaczynając od pierwszej klatki w wideo, kliknij prawym przyciskiem myszy w punkt, który ma być śledzony; punkt śledzenia jest oznaczony niebieskim kółkiem.
UWAGA: W niniejszym badaniu pozycję każdego zwierzęcia śledzono, wyznaczając podstawę ogona. - Przesuń klatkę, klikając prawą strzałkę na klawiaturze; punkt śledzenia powinien automatycznie przesuwać się zgodnie z pozycją podstawy ogona.
- Jeśli pozycja śledzenia nie pokrywa się z punktem zainteresowania w danej klatce, ręcznie dopasuj niebieskie kółko do podstawy ogona.
UWAGA: W zależności od jakości wideo i prędkości myszy, śledzenie może wymagać różnego stopnia interwencji użytkownika w celu utrzymania zgodności z punktem zainteresowania. Ścieżka myszy powinna przesuwać się w miarę trwania nagrania.
- Jeśli pozycja śledzenia nie pokrywa się z punktem zainteresowania w danej klatce, ręcznie dopasuj niebieskie kółko do podstawy ogona.
- Po zakończeniu śledzenia całego wideo zapisz film oraz nałożoną na niego ścieżkę. Wyeksportuj dane pozycyjne ścieżki, wybierając opcję „Export to Spreadsheet”.
4. Analiza danych
- Otwórz dane pozycyjne w programie arkusza kalkulacyjnego. Oprogramowanie do analizy ruchu raportuje współrzędne X,Y pozycji myszy w każdej klatce obrazu.
- Aby obliczyć dystans przebyty w jednej klatce, należy zastosować następujące równanie (gdzie pozycja w pierwszej klatce to x1,y1 a druga ramka to x2,y2):
UWAGA: Skumulowany dystans w czasie można obliczyć, sumując odległości pokonane pomiędzy kolejnymi klatkami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazano, że warianty testu otwartej przestrzeni (open field assay) stanowią skuteczną metodę badania progresji choroby w modelach dystrofii mięśniowej. W niniejszej pracy prezentujemy wszechstronną metodę śledzenia wideo do analizy dwuwymiarowego ruchu myszy z wykorzystaniem łatwo dostępnego sprzętu rejestrującego oraz oprogramowania open source (Rysunek 1A-B). Zgodnie z wynikami zgłaszanymi w podobnych testach, wykazujemy, ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test otwartego pola zapewnia skuteczny i nieinwazyjny sposób testowania funkcji motorycznych w mysich modelach chorób mięśni, a odmiany tego testu mogą służyć jako cenna miara punktu końcowego w badaniach przedklinicznych. Jednym z głównych ograniczeń związanych z tego typu testami są wysokie koszty i ograniczona dostępność systemów monitorowania aktywności. W tym badaniu demonstrujemy tani system do analizy aktywności w terenie otwartym, który może generować wyniki podobne do istniejącego komercyjnego oprogramowania i s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health [R01 AR048179 i R01 HL126204 dla R.C.W, T32 AR059033 i F32 AR069469 dla E.M.G] oraz Muscular Dystrophy Association USA [274143 i 416364 dla R.C.W.].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kamera wideo | Apple Inc. | ME553LL/A | Do nagrywania wideo z jazdy, iPhone 5S Plus (lub odpowiednik) |
| Oprogramowanie Kinovea (wersja 0.8.15) | Kinovea Association | Oprogramowanie do analizy wideo o otwartym kodzie źródłowym. Bezpłatne pobieranie, kompatybilne z komputerem PC (wersja 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (wersja 10.0.6) | Apple Inc. | Każde podobne oprogramowanie może być użyte do zmniejszenia liczby klatek na sekundę wideo (opcjonalnie) | |
| Okrągły kosz na śmieci o pojemności 32 galonów (komora na otwartym polu) | Rubbermaid | # | 1778013 Każdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci. |
| Avant Biała plastikowa taca 15 "szer. x 10" gł. x 1,45 "wys. (otwarta komora polowa) | US Acrylic, LLC | Każdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Samiec 6-miesięcznych myszy |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Samiec 6-miesięcznych myszy |
| mdx: utropin-Tg (fiona) | Prezent od od Jamesa Ervastiego, za zgodą Kay Davies | Męskie myszy 6-miesięczne |
Bibliografia
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
