Artykuł metodologiczny

Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej

DOI:

10.3791/56772

⸱

29 grudnia 2017

 , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, 2Center for Duchenne Muscular Dystrophy, University of California, 3Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, 4Molecular Biology Institute, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mierzenie funkcjonalnych wyników w leczeniu dystrofii mięśniowej jest istotnym aspektem badań przedklinicznych. Ocena dobrowolnego poruszania się w modelach mysich jest nieinwazyjnym i powtarzalnym testem aktywności, który jest bezpośrednio analogiczny do pomiarów poruszania się pacjenta, takich jak test 6-minutowego marszu i powiązane wyniki mobilności. Wiele popularnych metod testowania prędkości i odległości poruszania się myszy opiera się na teście na otwartym polu, w którym mierzy się swobodny ruch zwierzęcia na arenie w czasie. Jedną z głównych wad tego podejścia jest to, że komercyjne oprogramowanie i sprzęt do śledzenia ruchu w wysokiej rozdzielczości jest drogi i może wymagać przeniesienia myszy do wyspecjalizowanych ośrodków w celu przetestowania. W tym miejscu opisujemy tani, oparty na wideo system pomiaru ruchu myszy, który wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym. Korzystając z tego protokołu, wykazaliśmy, że dobrowolne poruszanie się w mysim modelu dystrofiny mdx z dystrofiną zerową dla dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD) jest zmniejszone w stosunku do aktywności myszy typu dzikiego. U myszy mdx wykazujących ekspresję transgenu utrofiny te deficyty aktywności nie są obserwowane, a całkowita przebyta odległość jest nie do odróżnienia od myszy typu dzikiego. Metoda ta jest skuteczna w mierzeniu zmian w dobrowolnym chodzeniu związanym z patologią dystroficzną i zapewnia wszechstronną platformę, którą można łatwo dostosować do różnych warunków badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiarygodne i powtarzalne pomiary funkcji mięśni są kluczowe dla oceny skuteczności potencjalnych terapii DMD. DMD jest zaburzeniem genetycznym spowodowanym mutacjami w genie dystrofiny, prowadzącymi do postępującego osłabienia mięśni, utraty ruchu i ostatecznie niewydolności krążeniowo-oddechowej. Najczęściej stosowanym zwierzęcym modelem DMD jest mysz mdx z dystrofiną zerową. Zestaw testów funkcjonalnych pojawił się jako rutynowe testy do oceny postępu choroby u myszy mdx, a także w podobnych modelach zwierzęcych innych dystrofii i miopatii. Powszechnie stosowane testy in vivo obejmują pomiary siły chwytu kończyn przednich, czasu zwisania drutu, maksimum rotarod, czasu do wyczerpania podczas biegania na bieżni oraz śledzenie aktywności motorycznej. W tej dziedzinie podjęto znaczne wysiłki w celu standaryzacji tych testów, mając na celu zmniejszenie zmienności między badaniami przedklinicznymi i zwiększenie potencjału translacyjnego terapii testowanych na myszach1,2.

Jedną z ważnych kategorii badań przedklinicznych jest pomiar dobrowolnego ruchu, parametru, który jest często zmieniany w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Jest to zwykle testowane za pomocą testów opartych na monitorowaniu aktywności w otwartym terenie i może oceniać ruchy poziome (chodzenie) lub pionowe (wychowawcze) w ciągu minut lub godzin2,3,4. Wiele badań wykazało, że dobrowolny ruch jest zmieniony u myszy mdx, szczególnie po ćwiczeniach, a pomiary te okazały się wrażliwe na leczenie farmakologiczne i postęp choroby. Jednym z głównych ograniczeń w wykonywaniu tych testów jest potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu. W tym miejscu przedstawiono tanią metodę, która śledzi ruch myszy przy użyciu łatwo dostępnych zasobów.

Dystans 6-minutowego spaceru jest wskaźnikiem powszechnie używanym jako narzędzie oceny klinicznej u osób z dystrofią mięśniową Duchenne'a5,6. Modyfikacje tej miary zostały wykorzystane do oceny wyników w modelach zwierzęcych Duchenne'a, w tym myszy mdx7 i psy z dystrofią mięśniową golden retriever (GRMD)8. W tym badaniu rejestrujemy dobrowolne ruchy w otwartym polu w ciągu 6 minut bezpośrednio po łagodnym wyzwaniu ćwiczeń. Odległość ambulacji została następnie obliczona przy użyciu bezpłatnego oprogramowania typu open source do pomiaru ruchu poziomego w czasie.

Główną zaletą tej metody jest to, że zwierzęta mogą być testowane w różnych warunkach bez potrzeby specjalistycznego sprzętu czy drogiego komercyjnego oprogramowania do analizy. Jednym z ważnych aspektów tej analizy jest to, że można ją przeprowadzić w podstawowych warunkach laboratoryjnych bez konieczności przenoszenia lub przenoszenia myszy z wiwarium do specjalistycznej placówki podstawowej. Opisany tutaj protokół śledzenia wideo dobrze nadaje się do oceny poruszania się w stosunkowo krótkich okresach czasu i może wykryć różnice w aktywności między myszami typu dzikiego i mdx, a także ujawnić poprawę funkcjonalną w ratunkowym modelu DMD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Myszy typu dzikiego (C57BL/6J) i mdx (tło C57Bl/10ScSn) zostały zakupione ze źródła komercyjnego. Myszy mdx:utropin-Tg były prezentem od Jamesa Ervastiego, za zgodą Kay Davies, i były utrzymywane na tle mdx. Testy ambulatoryjne przeprowadzono na samcach myszy w wieku 6 miesięcy. Myszy utrzymywano w wiwarium Terasaki Life Sciences zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (zatwierdzenie #2000-029-43), a zgoda na te badania została udzielona przez UCLA Animal Welfare Assurance (zgoda #A3196-01).

1. Przygotowanie komory

  1. Zbieraj dane w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze o stałej porze dnia9. Wykonaj testy ślepo na genotyp i leczenie badanej myszy.
  2. Do tej analizy można dostosować dowolny system studzienek do pracy w polu otwartym.
    UWAGA: W tym badaniu używamy niedrogiej i łatwej w transporcie komory nagraniowej zbudowanej z dużego kosza na śmieci. Arena na otwartym polu to taca ustawiona na klatce lub podobnej podwyższonej platformie.
  3. Umieść kamerę na drucianej siatce nad komorą, aby nagrywać na całej arenie.
  4. Przed każdą próbą należy oczyścić komorę nagraniową środkiem dezynfekującym.

2. Protokół przedtreningowy i zbieranie danych

  1. Opcjonalnie, bezpośrednio przed rejestracją aktywności, rzuć wyzwanie każdej myszy za pomocą protokołu aktywacji mięśni.
    UWAGA: Jest to opcjonalne, ale zalecane w eksperymentach z udziałem myszy mdx.
    1. Pozwól myszy chwycić drążek do ciągnięcia cyfrowego miernika siły i delikatnie pociągnij do tyłu, aż drążek pociągowy zostanie zwolniony. Powtórz tę procedurę pięć razy na próbę.
    2. Zapis napięcia szczytowego (N) dla każdej próby.
      UWAGA: Oprócz tego, że służy jako wyzwanie ćwiczeniowe dla testu ambulacji, siła wywierana przez zwierzę podczas tego testu siły chwytu może być wykorzystana jako dodatkowa funkcjonalna miara wyniku2,10.
    3. Wykonaj łącznie pięć prób dla każdej myszy z 1 minutą odpoczynku między każdą próbą.
  2. Natychmiast po teście siły chwytu lub innym protokole ćwiczeń umieść mysz w komorze aktywności.
  3. Rozpocznij nagrywanie wideo ruchu myszy na arenie kameralnej. Pozwól myszy na swobodną eksplorację przez 6 minut.
  4. Zatrzymaj nagrywanie po 6 minutach i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

3. Analiza wideo

  1. Opcjonalnie przygotuj wideo do analizy, zmniejszając liczbę klatek na sekundę. Aby zmniejszyć liczbę klatek na sekundę do analizy śledzenia, użyj następującego protokołu w oprogramowaniu do edycji wideo (np. iMovie lub podobnym programie), aby zdziesiątkować liczbę klatek na sekundę wideo o współczynnik 2.
    UWAGA: W zależności od długości i liczby klatek na sekundę filmu przydatne może być zmniejszenie liczby klatek na sekundę wideo przed analizą. W tym badaniu wideo zostało nagrane z prędkością 30 klatek/s (6 minut nagrywania, łącznie około 10 800 klatek).
    1. Załaduj wideo do oprogramowania.
    2. W menu "Prędkość" wybierz "Prędkość: Szybka" i ustaw prędkość na 2x.
    3. Wyeksportuj zdziesiątkowane wideo w .mp4 formacie pliku w celu analizy śledzenia.
  2. Otwórz wideo do analizy w oprogramowaniu. Ustaw kalibrację nagrania wideo za pomocą narzędzia linii. Narysuj linię wzdłuż jednej strony komory. Kliknij prawym przyciskiem myszy na linię i wybierz "Kalibruj miarę..." Wprowadź rzeczywisty rozmiar boku komory w centymetrach.
  3. Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij na kursor 'przenieś'.
    Zaczynając od początkowej klatki w filmie, kliknij prawym przyciskiem myszy punkt, który chcesz śledzić; Punkt śledzenia jest oznaczony niebieskim kółkiem.
    UWAGA: W niniejszym badaniu pozycja każdego zwierzęcia była śledzona poprzez śledzenie podstawy ogona.
  4. Przesuwaj ramkę do przodu, klikając strzałkę w prawo na klawiaturze; punkt śledzenia powinien automatycznie przesunąć się w zależności od położenia podstawy ogona.
    1. Jeśli pozycja śledzenia nie jest wyrównana z punktem zainteresowania w danej ramce, ręcznie wyrównaj niebieskie kółko do podstawy ogona.
      UWAGA: W zależności od jakości obrazu wideo i szybkości działania myszy, śledzenie może wymagać różnych poziomów danych wejściowych użytkownika, aby utrzymać wyrównanie z punktem zainteresowania. Ścieżka myszy powinna przesuwać się przez przebieg filmu.
  5. Po zakończeniu śledzenia całego filmu zapisz film i nakładkę śledzenia. Wyeksportuj dane pozycyjne śledzenia, wybierając opcję "Eksportuj do arkusza kalkulacyjnego".

4. Analiza danych

  1. Otwórz dane pozycyjne w arkuszu kalkulacyjnym. Oprogramowanie do analizy ruchu podaje współrzędne X,Y myszy w każdej klatce.
  2. Aby obliczyć odległość przebytą przez klatkę, użyj następującego równania (gdzie pozycja w pierwszej klatce to x1,y 1, a klatka druga to x2,y 2):
    figure-protocol-1
    UWAGA: Łączną odległość w czasie można obliczyć, dodając odległość przebytą między każdą klatką.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Warianty testu otwartego pola okazały się skuteczną metodą testowania postępu choroby w modelach dystrofii mięśniowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną metodę śledzenia wideo do analizy dwuwymiarowego ruchu myszy przy użyciu łatwo dostępnego sprzętu rejestrującego i oprogramowania open source (Rysunek 1A-B). Zgodnie z wynikami przedstawionymi z podobnych testów, pokazujemy, że myszy mdx, którym poddano protokół ćwicze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test otwartego pola zapewnia skuteczny i nieinwazyjny sposób testowania funkcji motorycznych w mysich modelach chorób mięśni, a odmiany tego testu mogą służyć jako cenna miara punktu końcowego w badaniach przedklinicznych. Jednym z głównych ograniczeń związanych z tego typu testami są wysokie koszty i ograniczona dostępność systemów monitorowania aktywności. W tym badaniu demonstrujemy tani system do analizy aktywności w terenie otwartym, który może generować wyniki podobne do istniejącego komercyjnego oprogramowania i s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health [R01 AR048179 i R01 HL126204 dla R.C.W, T32 AR059033 i F32 AR069469 dla E.M.G] oraz Muscular Dystrophy Association USA [274143 i 416364 dla R.C.W.].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera wideoApple Inc.ME553LL/ADo nagrywania wideo z jazdy, iPhone 5S Plus (lub odpowiednik)
Oprogramowanie Kinovea (wersja 0.8.15)Kinovea AssociationOprogramowanie do analizy wideo o otwartym kodzie źródłowym. Bezpłatne pobieranie, kompatybilne z komputerem PC (wersja 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (wersja 10.0.6)Apple Inc.Każde podobne oprogramowanie może być użyte do zmniejszenia liczby klatek na sekundę wideo (opcjonalnie)
Okrągły kosz na śmieci o pojemności 32 galonów (komora na otwartym polu)Rubbermaid#1778013 Każdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci.
Avant Biała plastikowa taca 15 "szer. x 10" gł. x 1,45 "wys. (otwarta komora polowa)US Acrylic, LLCKażdy system komór otwartego pola można dostosować do nagrywania. W tym badaniu wykorzystano komorę rejestracyjną zbudowaną z tacy umieszczonej na platformie, na dnie dużego kosza na śmieci.
C57BL/6JJackson Laboratory#000664Samiec 6-miesięcznych myszy
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)Jackson Laboratory#001801Samiec 6-miesięcznych myszy
mdx: utropin-Tg (fiona)Prezent od od Jamesa Ervastiego, za zgodą Kay DaviesMęskie myszy 6-miesięczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokomocja myszytest otwartego polaruchy dobrowolneledzenie wideopomiar si y chwytumodel myszy mdxtransgen utrofinydystrofia mi niowa Duchenne a

Powiązane artykuły