Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Summary

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Abstract

Zastosowanie matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej, obrazowania spektrometrią mas (MALDI MSI) szybko się rozszerzyło, ponieważ technika ta analizuje wiele biomolekuł, od leków i lipidów po N-glikany. Chociaż istnieją różne techniki przygotowania próbek, wykrywanie peptydów z tkanek zakonserwowanych formaldehydem pozostaje jednym z najtrudniejszych wyzwań dla tego typu analizy spektrometrii mas. Z tego powodu stworzyliśmy i zoptymalizowaliśmy solidną metodologię, która zachowuje informacje przestrzenne zawarte w próbce, jednocześnie pozyskując największą liczbę peptydów jonizowalnych. Naszym celem było również osiągnięcie tego w opłacalny i prosty sposób, eliminując w ten sposób potencjalne błędy systematyczne lub błędy przygotowania, które mogą wystąpić w przypadku korzystania z automatycznego oprzyrządowania. Efektem końcowym jest powtarzalny i niedrogi protokół.

Introduction

Obrazowanie metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI MSI) jest stosowane jako technika oparta na obrazie od dwóch dekad^1,2, analizując szereg biomolekuł, w tym: lipids³, peptydy^2,4, białka^2,5, metabolity^6,7, N-glikany⁸, oraz syntetyczne cząsteczki, takie jak leki terapeutyczne9^,10. W ciągu ostatniej dekady znacznie wzrosła liczba publikacji demonstrujących użyteczność tej techniki^6,11,12,13. Niektóre cząsteczki, takie jak lipidy, są stosunkowo łatwe do analizy za pomocą MALDI MSI, ponieważ łatwo jonizują ze względu na swoją naturę chemiczną, a zatem wymagają niewielkiego wcześniejszego przygotowania³. Jednak w przypadku trudniejszych celów, takich jak peptydy, kroki wymagane do skutecznej jonizacji tych cząsteczek są rozległe i ogólnie skomplikowane¹⁴. Obecnie istnieje bardzo niewiele publikacji, które mają na celu odniesienie się lub wykazanie odtwarzalności w metodologiach stosowanych do przygotowania tkanek do tej unikalnej techniki wizualnej¹⁵. Z tego powodu zebraliśmy obserwacje i wdrożyliśmy optymalizacje w jedną, łatwą do wdrożenia metodologię, która powinna wymagać niewielkiej lub żadnej modyfikacji, do analizy peptydów z usieciowanego źródła tkanek formaldehydu¹⁴.

W tym manuskrypcie opisaliśmy sprawdzoną, tanią powtarzalną metodologię wykrywania i mapowania przestrzennego peptydów, generowanych z utrwalonych w formalinie zamrożonych (FFF) i utrwalonych w formalinie fragmentów tkanek zatopionych w parafinie (FFPE). Ta metodologia nie wymaga ani nie opiera się na żadnym specjalistycznym oprzyrządowaniu³. W szczególności zajmujemy się wieloma aspektami specjalistycznego przygotowywania próbek niezbędnych do analizy peptydów; Kroki, takie jak pobieranie antygenu < klasa sup = "xref">16 i powlekanie matrycy. Nasz protokół wykorzystuje również niedrogi sprzęt i odczynniki, dzięki czemu ta metodologia jest dostępna dla szerszej społeczności, która w przeciwnym razie nie byłaby w stanie pozwolić sobie na alternatywną aparaturę robotyczną¹⁷.

Powód opracowania metody ręcznego przygotowania próbki był dwojaki: Po pierwsze, użycie sublimatora tworzy spójną i jednorodną powłokę kryształów matrycy o długości ~1 μm¹⁸, co jest nieosiągalne przy użyciu bardziej powszechnych technik natryskiwania. Po drugie, stosunkowo niewielkie koszty instalacji: całkowity koszt niestandardowej aparatury wyniósł <1500 AUD. Zauważamy, że jeśli chodzi o opłacalność, cena za próbkę jest znacznie niższa, gdy nie ma maszyn zrobotyzowanych. Stosowanie sublimacji było już wcześniej zgłaszane, jednak zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, metodologie krok po kroku, które opisują ten proces i przygotowanie próbki, nie zostały zgłoszone ani opisane w literaturze.

Ten protokół ma na celu pomoc badaczom, którzy mają dostęp do spektrometru masowego MALDI i którzy są zainteresowani generowaniem informacji przestrzennych w odniesieniu do interesującej nas biocząsteczki¹⁹. W istocie, MALDI MSI jest formą histologicznego badania przesiewowego, które nie opiera się na przeciwciałach ani stains².

Protocol

UWAGA: Podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać wszystkich obowiązujących środków ostrożności, w tym stosowania odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (PPE) (np. fartuchów laboratoryjnych, rękawic nitrylowych, okularów ochronnych, itp.)

1. Przygotowanie odczynników i sprzętu

1. Przygotowanie roztworów
   1. Aby przygotować 500 ml płynu Carnoya, wymieszaj 100% etanol (EtOH), chloroform i lodowaty kwas octowy w stosunku 6:3:1 v/v/v w czystej szklanej butelce Schotta.
   2. Aby uzyskać ciekłą nitrocelulozę (NC), rozpuść membranę NC (powszechnie stosowaną w western blotting) w czystym acetonie, delikatnie mieszając, do końcowego stężenia 40 mg / ml.
2. Przygotowanie prowadnic z powłoką NC
   1. Do przygotowania preparatów z powłoką NC należy użyć techniki podobnej do tej, która jest używana do przygotowania rozmazów krwi do badania histologicznego²⁰.
   2. Odpipetować 40 μl cieczy NC na jedną krawędź szkiełka mikroskopowego z przewodzącego tlenku indu i cyny (ITO). Używając zwykłego szkiełka mikroskopowego, przeciągnij NC pod napięciem powierzchniowym po szkiełku, aby uzyskać równą cienką powłokę.
   3. Pozostaw NC do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 20 s, a następnie przechowuj, aż będzie potrzebny, w temperaturze pokojowej. Przechowywanie próbek w tych warunkach może być nieograniczone, pod warunkiem że tkanki są konserwowane i wolne od pyłu.
      UWAGA: Ta metoda przygotowania jest lepiej znana jako "cienka folia" i zapewnia jednolitą powłokę, która opiera się na lepkości NC, a także na braku napięcia powierzchniowego do samopoziomowania na szkiełku. Jedyną ostrożnością, jaką należy zachować podczas przygotowywania szkiełek, jest to, aby nie poruszać się zbyt szybko, co spowoduje powstanie smug NC, a nie pełnego pokrycia.
      UWAGA: Ponieważ płyn NC wysycha bardzo szybko, ważne jest, aby pracować szybko, aby uniknąć wysuszenia roztworu przed jego odpowiednim rozprowadzeniem. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z NC w stanie ciekłym, ponieważ jest to związek wysokoenergetyczny i nie powinien stykać się ze źródłem zapłonu, aby zapobiec wybuchowi zapalającemu. NC ulega również przemianom endotermicznym podczas suszenia i może powodować oparzenia zimnem, jeśli pozwoli się mu na długotrwały kontakt ze skórą lub dłońmi w rękawiczkach. Aby zminimalizować wszelkie związane z tym ryzyko, za każdym razem należy przygotowywać tylko niewielkie ilości (zaleca się <1 ml). Po wyschnięciu jest stabilny w temperaturze pokojowej. Jednak NC może pozostać wybuchowy, gdy występuje w dużych ilościach.
3. Tworzenie niestandardowych komór parowych
   1. Wytnij kawałek grubej bibuły nożyczkami wystarczająco dużymi, aby zmieścił się w dolnej połowie standardowej plastikowej szalki Petriego (94 mm średnicy i 3 mm grubości).
   2. Przeciąć papier, pozostawiając prostokątny pasek pośrodku, tego samego rozmiaru co szkiełko mikroskopowe, pozostawiając wystarczająco dużo nadmiaru, aby papier zachował swoją pozycję na szalce Petriego (rysunek uzupełniający 1).

2. Przygotowanie skrawków tkanek

1. FFPE Tissue²¹.
   1. Wybierz żądany blok tkanki i przekrój go o grubości 12 μm w standardowym mikrotomie montowanym na stole i mocowaniu pływakowym na wstępnie powlekanych szkiełkach ITO NC.
   2. Zanurz szkiełka w świeżym ksylenie, aby usunąć resztki parafiny na 2 minuty i powtórz operację po raz drugi.
      UWAGA: Jeśli blok parafinowy jest szczególnie rozpowszechniony lub tkanka jest stosunkowo mała w porównaniu z blokiem parafinowym, próbki można podgrzać w temperaturze 60 °C, aby stopić większość przed myciem w ksylenie.
   3. Umyj odparafinowane próbki, zanurzając szkiełka w stopniowanej serii rozpuszczalników: 70% v/v EtOH/woda, 100% EtOH, płyn Carnoya, 100% EtOH, ultraczysta woda i 100% EtOH. Czas trwania każdego zanurzenia powinien wynosić 30 s, z wyjątkiem płynu Carnoya, który musi trwać 2 min.
      UWAGA: Płyn Carnoya i ksylen muszą być przechowywane i używane w dygestorium, ponieważ są wysoce toksyczne w przypadku wdychania.
2. Tkanka mrożona utrwalona formaliną (FFF)
   UWAGA: Próbki powinny być już zamrożone, odpowiednio do typu próbki.
   1. Równoważ blok tkankowy w temperaturze roboczej mikrotomu przez 20 min²².
      UWAGA: Temperatura równowagi zależy od rodzaju tkanki.
   2. Tkankę należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu o wielkości 12 μm i rozmrozić na wstępnie przygotowanym szkiełku podstawowym ITO pokrytym NC.
   3. Przechowywać szkiełka w eksykatorze próżniowym na stole w ciemności.
      UWAGA: W takich warunkach próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni.
   4. Przemyć próbki w serii rozpuszczalników o stopniowanej czystości, jak podano dla tkanek FFPE (2.1.3).
      UWAGA: Nie ma potrzeby przeprowadzania etapu odparafinowania ksylenu, ponieważ próbka nie jest osadzona.

3. Hydroliza usieciowania metylenowego

1. Załaduj szkiełka podstawowe (FFF lub FFPE) do plastikowego pudełka na szkiełka, które jest wypełnione do góry 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Zamknij pudełko i umieść je w łaźni wodnej zawierającej 500 ml wody, tak aby pudełko dotykało dna. Następnie podgrzewaj go przez 15 minut w temperaturze 120 °C w szybkowarze, który może osiągnąć ciśnienie robocze 70 kPa.
2. Wyjmij szkiełka, pozwól im ostygnąć i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze otoczenia przez 15 minut.

4. Trawienie tkankowe

1. Po hydrolizie próbki należy pokryć 10 μl roztworu trypsyny (1 mg/ml) w ultraczystej wodzie, pipetując 10 μl roztworu na krawędź sekcji tkanki, a następnie, używając tej samej końcówki pipety, przeciągnąć kroplę po całej powierzchni tkanki pod napięciem powierzchniowym.
   UWAGA: Unikaj drapania powierzchni tkanki końcówką pipety i nadmiernego rozprowadzania enzymu poza granice krawędzi tkanki.
2. Pozostawić próbki do wyschnięcia w temperaturze otoczenia.
3. Po wyschnięciu zamontuj próbki w górnej części wcześniej skonstruowanej komory parowej (tkanka skierowana w dół) za pomocą taśmy autoklawu na obu krawędziach szkiełka (rysunek uzupełniający 2).
4. Ostrożnie odmierzyć pipetą 600 μl roztworu zawierającego mieszaninę 100% acetonitrylu i wodorowęglanu amonu w proporcji 1:1 v/v na palec bibuły w dolnej części szalki Petriego, aż palec będzie wyglądał na równomiernie mokry.
5. Umieść górną połowę komory parowej na dolnej połowie, upewniając się, że palec papierowy i szkiełko próbki są idealnie wyrównane, a następnie uszczelnij komorę wokół równika folią parafinową.
6. Pozostawić próbkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić całkowite roztrawienie.

5. Powlekanie matrycy metodą sublimacji

1. Po strawieniu zważyć szkiełko z próbką na 5-cyfrowej wadze mikroanalitycznej.
2. Zamontuj szkiełko na palcu chłodzącym aparatu sublimacyjnego i zabezpiecz go taśmą miedzianą, w taki sam sposób, jak opisano dla komory parowej (rysunek uzupełniający 3).
   UWAGA: Aby zapewnić równomierny kontakt ze szkiełkiem przez palec chłodzący, na spodzie palca chłodzącego umieszcza się warstwę taśmy miedzianej w celu wyrównania powierzchni. Zapewnia to równomierne chłodzenie szkiełka, co prowadzi do równomiernego osadzania się matrycy.
3. Umieścić 300 mg matrycy kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) na szklanej szalce Petriego na dnie komory i równomiernie rozprowadzić, aby utworzyć cienką warstwę kryształów matrycy.
4. Zmontuj sublimator i zabezpiecz dwie połówki za pomocą zacisku podkowiastego. Zmontowaną jednostkę zawiesić na wysokości 15-20 cm nad łaźnią piaskową podgrzaną do temperatury 220 °C, umieszczając ją w metalowym pierścieniu połączonym ze stojakiem na retortę.
5. Podłącz komorę do źródła podciśnienia, włącz podciśnienie i pozwól mu ustabilizować się do ~25 mTorr przez 5 minut.
6. Zapakuj palec chłodzący do góry lodem i dodaj 50 ml wody. Pozwól urządzeniu osiąść przez kolejne 5 minut przed kontynuowaniem.
7. Opuść komorę na powierzchnię piasku, upewniając się, że piasek całkowicie styka się z dnem komory, i pozostaw ją na 45 minut, aby uzyskać idealną powłokę 0,22 mg/cm²
   UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze szklanymi naczyniami w wysokiej próżni, ponieważ jakiekolwiek uszkodzenie urządzenia podczas ewakuacji może spowodować katastrofalną awarię szklanej komory.
8. Po 45 minutach wyjmij komorę z kąpieli piaskowej, podnosząc metalowy pierścień i odpowietrz komorę.
   UWAGA: Po odpowietrzeniu komory szkiełko należy bardzo szybko zdjąć, ponieważ woda w powietrzu zacznie skraplać się na palcu zamrażającym i szkiełku do próbek.
9. Zdejmij szkiełko i zważ je, aby upewnić się, że uzyskano pożądaną powłokę.
   UWAGA: Jeśli uzyskano niewystarczającą powłokę, po prostu powtórz proces sublimacji dla szkiełka, aż do uzyskania żądanej grubości powłoki.

6. Rekrystalizacja

1. Po sublimacji zamontuj szkiełko z próbką w górnej części wcześniej skonstruowanej komory parowej, jak opisano wcześniej (tkanka skierowana w dół).
2. Odmierzyć pipetą 600 μl roztworu zawierającego mieszaninę 100% acetonitrylu i 0,1% v/v kwasu trifluorooctowego w wodzie w stosunku 1:1 (v/v), ostrożnie na bibułę w dolnej części płytki Petriego, aby zapewnić równomierne pokrycie.
3. Zmontuj komorę, upewniając się, że zakładka papieru i szkiełko mikroskopu są idealnie wyrównane, i pozostaw w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę
   Uwaga: NIE uszczelniaj komory.
   UWAGA: Po rekrystalizacji normalnie żółty odcień matrycy powinien zmienić się na biały, wyglądać mniej błyszcząco i wydawać się bardzo równomierny. Oznacza to, że rekrystalizacja została przeprowadzona prawidłowo.
4. Próbka jest teraz gotowa do analizy.

7. Oprzyrządowanie

1. Zeskanuj slajd w skanerze płaskim, aby utworzyć obraz cyfrowy.
2. Załaduj próbkę do spektrometru mas, a następnie przeanalizuj ją za pomocą odpowiedniej platformy oprogramowania.
3. Analizuj próbki w trybie reflektronu jonów dodatnich o zakresie masowym 750-3,500 Da, z rozdzielczością punktową, która ma zastosowanie do pożądanego wyniku. W większości przypadków wystarczająca jest szerokość rastra 20-50 μm, jednak można użyć zaledwie 10 μm¹⁵.
   UWAGA: Lasery UV MALDI są źródłem promieniowania jonizującego i nie należy ich oglądać bezpośrednio. Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że laser jest umieszczony w osłonie przyrządu.

Results

Jeśli jest przestrzegany poprawnie, ten protokół tworzy obrazy, które wyraźnie reprezentują ogólną morfologię tkanki bez żadnych zadrapań czy innych deformacji (Rysunek 1). Idealną walidacją dla prawidłowo przeprowadzonego przygotowania próbki jest zdolność do rozróżniania różnych struktur fizycznych poprzez zmianę oglądanej cząsteczki (Rysunek 2).

Dobrym przewodnikiem do...

Discussion

Protokół ten został zaprojektowany w celu maksymalizacji generowania jonizowalnych form molekularnych przy jednoczesnym wyeliminowaniu delokalizacji analitów. Kluczowe czynniki obejmują stosowanie tej samej nadrzędnej zasady podczas nakładania matrycy, trawienia próbki lub rekrystalizacji po sublimacji²⁴; Mianowicie, że należy stworzyć i utrzymać równomierne osadzanie pary, matrycy lub w inny sposób. Pipetowanie rozpuszczalników do płukania w celu rekrystalizacji i mineralizacji, równomiernie pod ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryo Microtome	Leica	CM3050	Do przygotowania i przekroju tkanki.
Szkiełka mikroskopowe z tlenkiem indu i cyny	Bruker	8237001	Do przygotowania i przekroju tkanki.
Coplin Jars	Sigma Aldrich	S5516	Do przygotowania i przekroju tkanki.
Szybkowar	Kambrook	KPR620BSS	Do przygotowania i przekroju tkanki.
Sublimator	Chem Glass	NA	Do zabiegu sublimacji. Podobny w konstrukcji do CG-3038, jednak został wykonany na zamówienie
Kąpiel piaskowa	NA	NA Do	zabiegu sublimacji. Drobnej jakości piasek rzeczny trzymany w złożonej folii aluminiowej pochodzącej z zewnątrz, nie od żadnej konkretnej firmy
Szklana szalka Petriego	Sigma Aldrich	CLS70165100	Do procedury sublimacji.
Pompa próżniowa	NA	NA Do	procedury sublimacji. Pozyskiwany jako część zamienna ze starego spektrometru masowego
Zimna wymrażarka	Chem Glass	CG-4510-02	Do procedury sublimacji.
Płyta grzejna	John Morris	EW-15956-32.	Do zabiegu sublimacji.
Plastikowa szalka Petriego	Sigma Aldrich	Z717223	Do zabiegu sublimacji.
37 &stopnie; C inkubator	NA	NIE DOTYCZY	Do procedury sublimacji. Nie dotyczy, inkubator jest niesterylny i ma ponad 30 lat
Bibuła	Sigma Aldrich	P7796	Do procedury sublimacji.
Nitroceluloza	Sigma Aldrich	N8395	Do mycia szkiełek.
Aceton	Sigma Aldrich	650501	Do mycia szkiełek.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	Do mycia szkiełek.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Do mycia szkiełek.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Do mycia szkiełek. Wyprodukowano w laboratorium z 95% etanolu magazynowego
Chloroform	Sigma Aldrich	C2432	Do mycia szkiełek.
Lodowaty kwas octowy	Sigma Aldrich	ARK2183	Do mycia szkiełek.
Tris HCL pH 8,8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Do rozszczepienia proteolitycznego. Proszek wykonany do 1M, a następnie zrównoważenie z 32% HCl do PH 8,8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	Do rozszczepienia proteolitycznego. Oczyszczanie wykonywane w domu przez oryginalny system oczyszczania wody
Birwęglan amonu	Sigma Aldrich	A6141	Do rozszczepienia proteolitycznego.
Trypsyna	Sigma Aldrich	T0303	Do rozszczepienia proteolitycznego.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Do rekrystalizacji.
Acetonitryl	Sigma Aldrich	1.00029	Do rekrystalizacji.
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Do rekrystalizacji.