Artykuł metodologiczny

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56780

⸱

20 lutego 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Streszczenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) mają ogromne znaczenie dla przemysłu farmaceutycznego, ponieważ są zaangażowane w wiele chorób ludzkich i zawierają dobrze zweryfikowane cele interwencji terapeutycznej. Odkrycie związków ołowiowych, w tym małych cząsteczek syntetycznych, które specyficznie hamują funkcję receptora, jest ważnym początkowym krokiem w rozwoju leków i opiera się na czułych, specyficznych i solidnych testach komórkowych. Tutaj opisujemy kinetyczny test komórkowy z odczytem fluorescencyjnym zaprojektowanym przede wszystkim w celu identyfikacji specyficznych dla receptora antagonistów, którzy hamują wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2 + wywołane aktywacją receptora chemokiny CXC 4 (CXCR4) przez jego endogenny ligand, ligand chemokiny CXC 12 (CXCL12). Kluczową zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona również badania przesiewowe związków obdarzonych wewnętrznymi właściwościami agonistycznymi (tj. związków wywołujących wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ przy braku CXCL12) lub związków modulujących funkcję receptora poprzez interakcję z allosterycznymi miejscami wiązania (tj., dodatnie i ujemne modulatory allosteryczne (odpowiednio PAM i NAM)). Z drugiej strony, związki autofluorescencyjne mogą zakłócać odczyt testu, utrudniając w ten sposób wiarygodną interpretację danych. Najprawdopodobniej test ten może zostać wdrożony, przy minimalnych adaptacjach, jako ogólny test odkrywania leków dla wielu innych GPCR, których aktywacja prowadzi do uwolnienia wewnątrzkomórkowego Ca2 +.

Wprowadzenie

GPCR to ważna nadrodzina białek powierzchniowych komórek, które aktywują kaskady transdukcji sygnału po związaniu ligandu zewnątrzkomórkowego. Mogą być aktywowane przez wiele różnych bodźców, w tym peptydy, hormony białkowe, aminy biogenne i lipidy, co powoduje inicjację różnych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i ostatecznie odpowiedzi biologicznych1,2. Co więcej, GPCR biorą udział w wielu, jeśli nie we wszystkich, procesach rozwojowych i fizjologicznych, a wiele chorób u ludzi jest związanych z dysfunkcyjną sygnalizacją GPCR lub nadekspresją receptorów. GPCR są zatem jednymi z najbardziej zatwierdzonych celów farmakologicznych w medycynie1,3.

Zazwyczaj, proces odkrywania leków GPCR zaczyna się od komórkowych testów przesiewowych, które umożliwiają identyfikację związków, takich jak małe cząsteczki, przeciwciała monoklonalne i peptydy, które mogą modulować aktywność konkretnego GPCR. W odkrywaniu leków GPCR istnieje wiele różnych rodzajów testów do poszukiwania takich związków, z których większość jest kompatybilna ze średnio- i wysokoprzepustowymi kampaniami przesiewowymi. Do najczęściej stosowanych testów należą eksperymenty z wiązaniem receptorów, testy oparte na fluorescencji lub luminescencji wykrywające wahania poziomu tak zwanych wtórnych przekaźników (np. Ca2+, cykliczny monofosforan adenozyny (AMP)), fenotypowe testy przesiewowe i testy rekrutacji β-aresztiny4. Wybór konkretnego rodzaju testu może zależeć od wielu czynników, ale jest również determinowany wcześniejszą wiedzą na temat właściwości sygnalizacyjnych danego GPCR. Wiązanie agonisty z GPCR indukuje zmianę konformacyjną katalizującą wymianę difosforanu guanidyny (GDP) na trifosforan guanidyny (GTP) na podjednostce α heterotrimerycznych białek G. Następnie podjednostka Gα-GTP dysocjuje od podjednostki Gβγ i obie podjednostki zainicjują dalsze szlaki sygnałowe. Hydroliza cząsteczki GTP, a następnie ponowne asocjowanie podjednostek Gα-GDP i Gβγ przywróci białko G do jego nieaktywnej konformacji5,6. Na podstawie podobieństwa sekwencji podjednostki Gα definiuje się różne typy białek G (Gs, Gi, Gq, G12/13)7. Sygnalizacja za pośrednictwem podjednostki Gα powoduje kilka typowych reakcji, takich jak wzrost (poprzez Gs) lub spadek (przez Gi) cyklicznej produkcji AMP i wewnątrzkomórkowa mobilizacja Ca2 + (przez Gq) 5,7. Podjednostki Gβγ są również zdolne do indukowania wewnątrzkomórkowych szlaków efektorowych. Na przykład, po aktywacji GPCR sprzężonych z Gi, Gβγ może bezpośrednio stymulować fosfolipazę C (PLC-β) do produkcji trifosforanu inozytolu (IP3), który wyzwala uwalnianie Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów7. Po aktywacji receptora GPCR są fosforylowane przez kinazy GPCR (GRK), co sprzyja interakcji z β-aresztinami. Proces ten kończy sygnalizację białka G i prowadzi do odczulania receptora i ostatecznie internalizacji. β-aresztiny są również zdolne do tworzenia kompleksów wielocząsteczkowych, które mogą wyzwalać inne szlaki sygnałowe niezależne od sygnalizacji białka G8.

W podrodzinie receptorów chemokin, CXCR4 sprzężony z Gi jest GPCR, który wzbudził duże zainteresowanie jako obiecujący cel do odkrycia leków. Biorąc pod uwagę jego ugruntowaną rolę jako głównego koreceptora dla wnikania i zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 (HIV-1), związki ukierunkowane na CXCR4 zostały początkowo opracowane jako kandydaci na leki anty-HIV9. Ostatnio coraz więcej dowodów wskazuje na ważną rolę CXCR4 w nowotworzeniu i przerzutach do raka, co czyni go dobrze zweryfikowanym celem terapeutycznym również w onkologii10. CXCR4 ulega silnej ekspresji w ponad dwudziestu typach nowotworów u ludzi i kontroluje przeżycie, proliferację i migrację komórek nowotworowych, a także angiogenezę związaną z nowotworem10. Antagoniści CXCR4 różnych klas chemicznych zostali już wcześniej opisani11,12, ale tylko AMD3100 małocząsteczkowy jest obecnie dopuszczony do użytku klinicznego jako środek mobilizujący komórki macierzyste stosowany podczas leczenia pacjentów z chłoniakiem i szpiczakiem13,14. Trwają badania kliniczne mające na celu ocenę bezpieczeństwa i skuteczności kilku innych antagonistów CXCR4 w różnych chorobach człowieka, ale z silnym naciskiem na onkologię12. Biorąc pod uwagę wiele potencjalnych zastosowań antagonistów CXCR4, uzasadnione jest poszukiwanie nowych związków o ulepszonych właściwościach farmakokinetycznych, lepszej biodostępności lub potencjalnie mniejszych skutkach ubocznych.

Tutaj opisany jest test komórkowy oparty na fluorescencji kinetycznej, używany głównie do wykrywania związków zdolnych do hamowania CXCR4. Pomiar fluorescencyjny tej metody opiera się na przejściowym wzroście wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + wywołanego aktywacją CXCR4 przez jego endogennego agonistę, ligand chemokiny CXCL12 (wcześniej znany jako czynnik 1α pochodzący z komórek zrębu (SDF1-α)) oraz potencjalnym hamowaniu tego indukowanego przez CXCL12 Ca2 + odpowiedź poszczególnych związków. W tym teście wykorzystywane są ludzkie komórki glejaka U87 stabilnie eksprymujące ludzki receptor CXCR4. Jednocześnie komórki te nie mają endogennej ekspresji CXCR7, pokrewnego receptora chemokiny, który również wiąże CXCL1215,16,17. Wcześniej wykazano również, że CXCR7 jest zdolny do tworzenia heterodimerów z CXCR4, modulując w ten sposób właściwości sygnalizacyjne tego ostatniego receptora18. Wahania poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2 + za pośrednictwem CXCR4 są monitorowane poprzez obciążenie komórek CXCR4 + estrem fluo-2 acetoksymetylowym (AM), przepuszczalnym dla komórek fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym Ca2 + o wysokim powinowactwie. Fluo-2 AM to cząsteczka fluorescencyjna o pojedynczej długości fali, która może być wzbudzona przy 490 nm, podczas gdy jej fluorescencja emisyjna jest mierzona przy 520 nm. Ta fluorescencja emisyjna nasila się po związaniu Ca2+, z dużym zakresem dynamiki między stanem związanym Ca2+ a stanem niezwiązanym. Wzrost sygnału fluorescencyjnego jest przejściowy, występuje w odstępie czasu kilku minut, a następnie zanika. Szczytowa wysokość emisji fluorescencji dodatkowo koreluje z poziomem aktywacji receptora. Sam test jest wykonywany przy użyciu czytnika mikropłytek fluorescencyjnych wyposażonego w kamerę ze zintensyfikowanym przetwornikiem CCD (ICCD), która posiada zintegrowany system pipetowania, który umożliwia standaryzację etapów pipetowania w teście (patrz tabela materiałów). Ponadto jednoczesny pomiar sygnału fluorescencyjnego we wszystkich studzienkach mikropłytki jest kolejną kluczową zaletą zastosowanego czytnika fluorescencji. Podczas pierwszej części testu badane związki (np. panel małych cząsteczek o ustalonym stężeniu lub w serii rozcieńczeń) są dodawane do komórek CXCR4 + U87 załadowanych fluo-2 AM, a następnie następuje ~ 10-minutowy okres inkubacji, podczas którego potencjalny efekt agonistyczny związków jest stale mierzony w czasie rzeczywistym. Następnie endogenny agonista (tj. CXCL12) jest dodawany do komórek, aby wywołać przejściowy wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego Ca2 + za pośrednictwem CXCR4. Podczas tej części testu można ocenić potencjalną aktywność antagonistyczną badanych związków. Schematyczny przegląd ogólnego przebiegu testu jest przedstawiony w Rysunek 1.

Chociaż ten test mobilizacji Ca2+ był głównie używany do identyfikacji i określenia siły hamującej konkurencyjnych antagonistów CXCR4 (tj. związków, które uniemożliwiają endogennemu agoniście wiązanie i stymulowanie receptora), może on również identyfikować agonistów receptorów i dodatkowo związki, które pełnią swoją funkcję poprzez wiązanie się w miejscach allosterycznych (tj., miejsca, które topograficznie różnią się od ortosterycznego miejsca wiązania zajmowanego przez endogennego agonistę). Przykładami tej drugiej kategorii związków są agoniści allosteryczni oraz PAM i NAMs19,20. Podczas gdy antagoniści specyficzni dla receptorów, a także NAM hamowaliby indukowaną przez CXCL12 odpowiedź Ca2 +, PAM wzmacniałyby tę odpowiedź (patrz również sekcja Dyskusja). Chociaż test opisany w niniejszym dokumencie jest ukierunkowany konkretnie na CXCR4, przewiduje się, że metoda ta może być zastosowana do innych GPCR przy minimalnym wysiłku optymalizacyjnym, przynajmniej jeśli sygnalizują one poprzez uwalnianie wewnątrzkomórkowego Ca2 +.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w sekcjach 1 i 2 są wykonywane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej.

1. Konserwacja U87. Komórki CD4.hCXCR4

  1. Hodować komórki w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    UWAGA: Linia komórkowa in vitro użyta w tym protokole to linia komórkowa glejaka U87 stabilnie eksprymująca klaster różnicowania 4 (CD4) i ludzki CXCR4 i została wcześniej opisana17. Ekspresja CD4 i CXCR4 na powierzchni komórki jest stale monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej, a poziomy ekspresji pozostają stałe w czasie (~ 100% komórek CD4 + i ~ 100% CXCR4 +). Szczegółowy opis wytwarzania wykorzystanej linii komórkowej i procedury cytometrii przepływowej w celu zbadania poziomów ekspresji receptorów nie wchodzi w zakres niniejszego protokołu.
    1. Subkulturuj komórki przy zbiegu 80-85%. Pozwól, aby wszystkie odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (RT) przed hodowlą komórek.
    2. Usunąć kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć monowarstwę komórek jednorazowo 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Dodaj 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i rozprowadź ją równomiernie na monowarstwie komórki. Następnie usunąć nadmiar trypsyny-EDTA i inkubować do 5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki zaczną się odłączać.
    4. Dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% Płodowej Surowicy Bydlęcej (FBS) + 0,01 M HEPES + odpowiednie środki selekcyjne). Zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
    5. Policz liczbę żywotnych komórek przy użyciu wybranej metody. W przypadku komórek glejaka wielopostaciowego U87 żywotność na ogół osiąga ~ 100%.
      UWAGA: Numery komórek można określić na kilka sposobów. Rutynowo korzystamy ze zautomatyzowanego systemu analizy komórek opartego na barwieniu błękitem trypanowym (patrz Tabela Materiałów) zgodnie ze standardowymi procedurami obsługi, ale inne sposoby powinny działać równie dobrze.
    6. Dodać 2 x 106 lub 3 x 106 (żywotnych) komórek do końcowej objętości 25 ml świeżej pożywki wzrostowej w kolbie hodowlanej T75 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Jeśli użyjesz 3 x 106 komórek, komórki osiągną 80-90% konfluencji po 2 dniach. Jeśli użyjesz komórek 2 x 106, osiągną one tę samą konfluencję po 3 dniach. Szybkość wzrostu komórek należy najpierw określić empirycznie, jeśli używane są inne linie komórkowe.

2. Wysiewanie komórek do testu mobilizacyjnego Ca2+

  1. W dniu pasażowania komórek (dzień 0) pokryj 96-dołkowe płytki z czarnego polistyrenu o przezroczystym dnie (patrz Tabela materiałów) 0,1% roztworem żelatyny, aby ułatwić łączenie komórek.
    UWAGA: Powlekanie płytek 96-dołkowych żelatyną można pominąć, jeśli stosuje się wstępnie powlekane płytki, które są dostępne w handlu (patrz Tabela materiałów). Zaleca się ocenę użycia wstępnie powlekanych płytek zamiast ręcznego powlekania dla każdej badanej linii komórkowej przed kontynuowaniem protokołu.
    1. Przygotować roztwór żelatyny, dodając 1 g żelatyny do 100 ml PBS w celu uzyskania 1% roztworu. Rozcieńczyć 10x PBS przed dalszym użyciem. Aby poprawić rozpuszczalność żelatyny, podgrzać roztwór do 37 °C.
    2. Dodać 100 μl 0,1% roztworu żelatyny do dołka 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  2. W międzyczasie przygotuj komórki do wysiewu na powlekanej płytce 96-dołkowej.
    1. Oderwać komórki od kolby hodowlanej, zawiesić je ponownie w świeżej pożywce wzrostowej i policzyć metodą barwienia błękitem trypanowym.
    2. Wirować komórki w probówce o pojemności 50 ml przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
    3. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, bez antybiotyków), aby uzyskać gęstość komórek 0,1 x 106 (żywotnych) komórek/ml.
  3. Usuń roztwór żelatyny z płytek o czarnych ściankach z przezroczystym dnem, odwracając płytkę i susząc ją na chusteczce. Dodać 200 μl/basenik PBS, aby usunąć nadmiar żelatyny i ponownie odwrócić płytkę.
  4. Dozować 200 μl zawiesiny komórek (co odpowiada 0,2 x 105 komórek) na studzienkę na 96-dołkową płytkę pokrytą żelatyną (od teraz jedna z nich będzie dalej nazywana "płytką pomiarową").
  5. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Ładowanie komórek barwnikiem fluorescencyjnym Ca2+ -sensitive

  1. W dniu 1 wykonaj rzeczywisty test mobilizacji Ca2 +, zaczynając od obciążenia wysianych komórek fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym Ca2 + fluo-2 AM.
    1. Przygotować bufor testowy, dodając 40 ml HEPES (1 M) do 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS, 10x, bez czerwieni fenolowej, bez wodorowęglanu sodu). Dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 2 l i dodać 4 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Rozpuścić BSA przez mieszanie magnetyczne. Doprowadzić pH do 7,4 (z NaOH) i przefiltrować roztwór.
      UWAGA: Podczas wszystkich kolejnych kroków używany jest ten sam bufor, określany jako "bufor testowy".
    2. Przygotować roztwór podstawowy (4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)) fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na Ca2+ fluo-2 AM. Unikaj nadmiernej ekspozycji na światło. Rozpuścić 1 mg fluo-2 AM (masa cząsteczkowa: 1,061 g/mol) w 235,6 μl DMSO.
    3. Przygotuj roztwór roboczy fluo-2 AM. Dla jednej 96-dołkowej płytki testowej wymieszać 12,5 μl roztworu podstawowego fluo-2 AM (4 mM) i 12,5 μl roztworu poliolu niejonowego środka powierzchniowo czynnego (np. pluronu f-127) (20% wagowo-objętościowo w DMSO, patrz Tabela materiałów). Dodać 22 μl tej mieszaniny do 11 ml buforu testowego w probówce o pojemności 15 ml. Końcowe stężenie fluo-2 AM wynosi 4 μM.
      UWAGA: Niejonowy środek powierzchniowo czynny jest stosowany jako środek dyspersyjny w celu poprawy rozpuszczalności fluo-2 AM w wodzie i w konsekwencji zwiększenia obciążenia komórek. Aby rozpuścić środek powierzchniowo czynny w DMSO, należy podgrzać próbkę w temperaturze 37 °C i regularnie mieszać w celu uzyskania jednorodnego roztworu.
    4. Usuń pożywkę wzrostową z wcześniej zasianych komórek na 96-dołkowej płytce pomiarowej, odwracając płytkę i osuszając ją na ręczniku papierowym.
    5. Dodać 100 μl roztworu barwnika do dołka za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

4. Przygotowanie 96-dołkowych płytek polipropylenowych zawierających ligand chemokinowy CXCL12 lub badane związki

  1. Zaopatrzyć się w 96-dołkowe płytki z polipropylenu (PP) z okrągłym dnem (patrz Tabela Materiałów).
    1. Pozwolić, aby roztwór podstawowy CXCL12 (1 mg/ml) i roztwór podstawowy badanych związków osiągnęły równowagę w temperaturze RT.
      UWAGA: Roztwór podstawowy CXCL12 przygotowuje się w ultraczystej wodzie uzupełnionej 0,01% Tween20 i przechowuje w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności jednorazowego użytku.
    2. Przygotować 5x stężony roztwór CXCL12 w buforze do oznaczania (250 ng/ml, co odpowiada 31,25 nM) i 5x stężone rozcieńczenie każdego związku (w buforze do testu).
    3. Dozować roztwory podstawowe do odpowiedniej płytki 96-dołkowej zgodnie z predefiniowanym układem płytek. Dozować 75 μl/basenik do płytki zawierającej CXCL12 ("płytka chemokina"), dozować 50 μl/basenik do płytki zawierającej związki ("płytka złożona").
      UWAGA: Zarówno związki, jak i CXCL12 zostaną ostatecznie rozcieńczone 5x po dozowaniu na płytce pomiarowej. Ważne jest również, aby uwzględnić studzienki kontroli ujemnej zawierające tylko bufor do oznaczania zarówno w płytce złożonej, jak i na płytce chemokiny. Należy również uwzględnić studzienki kontroli dodatniej (tj. studzienki z CXCL12 w płytce chemokiny, ale z buforem testowym w odpowiednich studzienkach płytki złożonej).

5. Ustawienia protokołu w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych

UWAGA: Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych używany w tym protokole jest wymieniony w Tabeli Materiałów.

  1. Najpierw włącz chłodnicę czytnika płytek fluorescencyjnych, a następnie włącz sam czytnik fluorescencji. Pozwól na zainicjowanie na kilka minut i otwórz oprogramowanie systemu.
  2. Utwórz protokół testu za pomocą menu przeciągnij i upuść, które zawiera następujące kroki:
    1. W polu "Ustawienia" wybierz "Read_Mode" z długością fali wzbudzenia: 470-495 nM; długość fali emisji: 515-575 nM.
      UWAGA: Wybrane długości fal są odpowiednie do stosowania z barwnikiem fluo2 wrażliwym na Ca2+.
    2. Dołącz pudełko "Wymieszaj z TF" (płyn transferowy) do automatycznego mieszania związków w płytce złożonej, która zostanie umieszczona w pozycji źródła 2 urządzenia (patrz krok 6.4). Wybrać 15 μl roztworu w każdym dołku, który ma być automatycznie zasysany i trzykrotnie mieszany. Wyreguluj wysokość końcówek pipet na poziomie 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania i dozowania na 50 μl/s.
      UWAGA: Wysokość końcówek pipet odnosi się do objętości pozostałej pod końcówkami pipet. Na przykład, jeśli studzienki płytki złożonej zawierają 50 μl, wysokość 30 μl odpowiada 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Za pomocą oprogramowania można regulować objętość roztworu złożonego pobranego do wymieszania, prędkość mieszania, położenie końcówek pipet podczas mieszania oraz liczbę cykli mieszania.
    3. W polu "Płyn transferowy" określ, że 20 μl każdego dołka z płytki złożonej zostanie przeniesione na płytkę pomiarową. Umieścić końcówki pipet na wysokości 20 μl poniżej powierzchni cieczy, tj. na wysokości 30 μl podczas zasysania związków i na wysokości 60 μl podczas dozowania na płytce pomiarowej. Ustaw prędkość zasysania na 50 μL/s, a prędkość dozowania na 25 μL/s.
      UWAGA: Płytka złożona zawiera 50 μl roztworu na studzienkę (patrz krok 4.1.3), a zatem wysokość 30 μl odpowiada położeniu 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Płytka pomiarowa będzie zawierała 80 μl buforu testowego na studzienkę (patrz krok 6.3), a zatem wysokość 60 μl odpowiada podobnemu położeniu końcówek.
    4. Wybierz przycisk "Czytaj za pomocą TF". W pierwszym interwale wybierz 60 odczytów (pomiary fluorescencyjne) z interwałem odczytu wynoszącym 1 s. Zdefiniuj, że 10 odczytów jest rejestrowanych przed dozowaniem związków na płytkę pomiarową, a 50 odczytów później. Zdefiniuj drugi interwał z czasem interwału odczytu wynoszącym 30 s i 18 odczytów.
      UWAGA: Na tym etapie fluorescencja będzie mierzona kinetycznie (w zdefiniowanych odstępach czasu) łącznie przez ~ 10 minut.
    5. Trzykrotnie umieść przycisk "Wskazówki dotyczące prania" w protokole. Na każdym etapie prania wybierz rodzaj płynu: płyn A (woda ultraczysta) lub płyn B (70% etanolu), liczbę cykli prania (1), prędkość pompy (szybko) i liczbę uderzeń (5) podczas każdego kroku prania.
      UWAGA: Podczas pierwszego i ostatniego etapu prania stosuje się płyn A, podczas drugiego etapu prania stosuje się płyn B.
    6. Dołącz funkcję "Pause Pipettor". Ustaw pipetor na pauzę na 300 s.
      UWAGA: Po uwzględnieniu tego kroku w protokole, głowica pipetora, która jest zintegrowana z czytnikiem płytek fluorescencyjnych, zatrzyma się na 5 minut przed kontynuowaniem protokołu.
    7. Dołącz pudełko "Wymieszaj z TF", aby umożliwić automatyczne mieszanie roztworu CXCL12 w płytce chemokiny, która zostanie umieszczona w pozycji źródła 3 urządzenia (patrz krok 6.4). Wybrać 15 μl roztworu w każdym dołku, który ma być automatycznie zasysany i trzykrotnie mieszany. Podczas zasysania i mieszania należy umieścić końcówki pipet 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Prędkość zasysania i dozowania jest ustawiona na 50 μL/s.
      UWAGA: Podobnie jak w kroku 5.2.2, parametry te można dostosować.
    8. W kolejnym polu "Płyn transferowy" określ, że 25 μl z każdej studzienki płytki chemokinowej zostanie przeniesione na płytkę pomiarową. Umieścić końcówki 20 μl poniżej powierzchni cieczy, tj. na wysokości 55 μl podczas zasysania z płytki chemokiny, która zawiera 75 μl/studzienkę (patrz krok 4.1.3) i na wysokości 80 μl podczas dozowania na płytce pomiarowej. Ustaw prędkość zasysania na 50 μL/s, a prędkość dozowania na 25 μL/s.
    9. Dołącz przycisk "Czytaj za pomocą TF". W pierwszym interwale wybierz 145 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym 1 s. Zdefiniuj, że 5 odczytów jest rejestrowanych przed dozowaniem CXCL12 do płytki pomiarowej, a 140 odczytów później. Zdefiniuj drugi interwał z czasem interwału odczytu wynoszącym 6 s i wybierz 20 odczytów.
      UWAGA: Łącznie, w całym protokole zarejestrowano 243 odczyty (pomiary fluorescencyjne): 78 w kroku 5.2.4 i 165 w kroku 5.2.9.
    10. Podobnie jak w kroku 5.2.5, dołącz trzykrotnie przycisk "Końcówki do prania" w protokole.
      UWAGA: Uwzględnienie tego kroku na końcu protokołu pozwala na ponowne użycie końcówek do wykonania innego testu bez konieczności wymiany końcówek.
  3. Ustaw temperaturę urządzenia na 37 °C, klikając przycisk "Set stage temperature" i wybierając 37 °C.

6. Przeprowadzanie testu fluorescencji

  1. Po inkubacji płytki pomiarowej z buforem ładującym przez 45 minut (patrz krok 3.1.5), usunąć bufor, odwracając płytkę i wysuszyć ją na chusteczce.
  2. Przemyć wysiane komórki, dodając 150 μl/studzienkę buforu do oznaczania i inkubować przez 2 minuty.
  3. Ponownie wyjmij bufor, odwracając płytkę. Dodać 80 μl/basenik buforu do oznaczania za pomocą pipety wielokanałowej.
  4. Umieść wszystkie płytki w urządzeniu w odpowiedniej pozycji: płytkę złożoną w pozycji źródła 2, płytkę chemokinową w pozycji źródła 3 i płytkę pomiarową w pozycji odczytu. Umieść pudełko z czarnymi końcówkami w pozycji wskazówek źródła 1. Zamknij drzwi urządzenia i inkubuj przez 5 minut przed kontynuowaniem protokołu.
  5. Wybierz przycisk "Test sygnału protokołu", aby określić względne jednostki światła tła (RLU) i wariancję fluorescencji na płycie. Pojawi się nowe okno. Wybierz "Sygnał testowy".
    UWAGA: Na tym etapie RLU tła są określane przez kamerę ICCD, która jest zintegrowana z komorą optyczną czytnika fluorescencji. Te RLU powstają w wyniku wzbudzenia barwnika wrażliwego na Ca2+ (fluo-2) przez diody elektroluminescencyjne (LED) (długość fali wyjściowej LED 470-495 nm). Wartości 8 000-10 000 RLU dobrze nadają się do tego zastosowania. W razie potrzeby RLU można dostosować, zmieniając intensywność wzbudzenia (Select Exc. Intensity) lub bramkę kamery (Select Gate Open). Wariancja w stosunku do płytki powinna być idealnie mniejsza niż 7,5%.
  6. Wybierz opcję "Aktualizuj", jeśli uzyskane są wartości tła od 8 000 do 10 000 RLU. Zapisz główny protokół, klikając przycisk Zapisz.
    UWAGA: W ten sposób ustawienia z testu sygnału protokołu zostaną przeniesione do protokołu głównego.
  7. Uruchom test, naciskając przycisk "RUN".

7. Analiza i jakość danych

  1. Po zakończeniu testu otwórz pole "Analiza" w oprogramowaniu systemu.
    1. Przejdź do "konfiguruj poprawki" i wybierz "odpowiedź ponad linię bazową". Zdefiniuj linię bazową 1 tak, aby zaczynała się od pomiaru 1 i kończyła na pomiarze 5; Średnia fluorescencja zostanie obliczona w każdym studzience między pomiarem 1 a 5,
      UWAGA: Wszystkie dalsze pomiary z danego odwiertu są dzielone przez tę specyficzną dla odwiertu linię bazową 1.
      1. Zdefiniować linię bazową 2, aby rozpocząć od pomiaru 78 do pomiaru 83 (CXCL12 dozuje się po pomiarze 83; ponownie oblicza się średnią fluorescencję w każdym studzience między pomiarem 78 a 83 i ten współczynnik korygujący stosuje się do wszystkich pomiarów następujących po pomiarze 83).
    2. Zaznacz pola wyboru "pokaż jako procent" i "odejmij tło".
    3. Przejdź do "Konfiguruj redukcję kinetyczną". Aby ocenić hamujący wpływ związków na indukowaną przez CXCL12 odpowiedź Ca2+, wybierz Max-Min, zaczynając od pomiaru 84 (tj. pierwszego pomiaru, po którym dozuje się CXCL12) do 243 (tj. pomiaru końcowego).
      UWAGA: Po wybraniu opcji Max-Min podawana jest różnica między minimalną a maksymalną odpowiedzią w stosunku do linii podstawowej między pomiarem 84 a pomiarem 243. W przypadku wybrania wartości Max-Min, począwszy od pomiaru 11 do pomiaru 78, podaje się różnicę między minimalną i maksymalną odpowiedzią na linii podstawowej w stosunku do wartości podstawowej 1. Wartość ta może być wykorzystana do analizy potencjalnej aktywności agonistycznej związków, patrz Dyskusja).
    4. Dane zostaną zobrazowane w oprogramowaniu systemu. W razie potrzeby wyeksportuj nieprzetworzone dane w celu dodatkowej analizy i wizualizacji w innych popularnych pakietach oprogramowania analitycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ stymulacji CXCL12 na wewnątrzkomórkową mobilizację Ca2+ w komórkach U87.CD4.CXCR4+ oraz U87.CD4 oceniono za pomocą testu mobilizacji Ca2+. Zamiast 20 µL związku testowego, który normalnie dodaje się podczas pierwszego etapu pipetowania zgodnie z protokołem (Rycina 1), do załadowanych fluo-2 AM komórek U87.CD4.CXCR4+ na płytce pomiarowej dodano bufor testowy. Podczas drugiego etapu dozowania na płytkę pomiarową...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie test mobilizacji Ca2 + okazał się wcześniej cennym narzędziem do identyfikacji i charakteryzowania antagonistów receptora ukierunkowanych na CXCR417. Przewiduje się jednak, że metoda ta może być bardziej ogólnie stosowana do dużej grupy innych GPCR, które wywołują uwalnianie cytozolowego Ca2 + po ich aktywacji, jak pokazano dla pokrewnego receptora chemokiny CCR5. Podczas gdy w przypadku CCR5 można zastosować dokładnie te same warunki eksperyme...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fonteynowi i Geertowi Schoofsowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte przez KU Leuven (grant nr 1). PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant nr G.485.08) oraz Fondation Dormeur Vaduz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fluo-2 AMAbcamab142775fluorescencyjny barwnik wrażliwy na Ca2 +
Pluronic F-127SigmaP2443-250GKwas pluronowy
ŻelatynaSigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 mgspecyficzny antagonista CXCR4
Marawirokrodzaj prezentu, antagonista CCR5
Ligand chemokiny CXCL12PeproTech300-28A
Ligand chemokiny CCL5PeproTech300-06
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA1933-25G
Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Trypsyna-EDTA (0,25 %), czerwień fenolowaGibco (Life Technologies)25200-056
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Probówki Falcon, 50 mlGreiner Bio-One227 261
Kolba do hodowli tkankowych (T75)Corning353024
płytka, 96-dołkowa, z przezroczystym dnem, z pokrywką10530753Costar/Fisher Scientific(96-dołkowa), do wysiewu komórek
Płytki polipropylenowe (PP)Thermo Scientific (VWR)732-2661używane do przygotowania płytek złożonych i chemokiny Talerze z okrągłym dnem
Wysokowydajny komórkowy system przesiewowy FLIPR TetraUrządzenia molekularneCzytnik płytek fluorescencyjnych ze zintegrowaną głowicą pipetora i kamerą ICCD
Moduł FLIPR Tetra LED 470 - 495 nmUrządzenia molekularne0200-6128Diody elektroluminescencyjne do wzbudzania barwnika wrażliwego na fluorescencyjny Ca2+
Filtr emisyjny FLIPR Tetra 515 - 575 nmUrządzenia molekularne0200-6203filtr emisyjny kompatybilny z barwnikiem fluorescencyjnym
FLIPR Tetra 96 HeadMolecular Devices0310-453696-dołkowa głowica pipetora, zintegrowana z czytnikiem płytek fluorescencyjnych
Pakiet oprogramowania ScreenWorksMolecular Devicessłużący do analizy i wizualizacji danych na FLIPR
Analizator
Corning CellBIND 96 Płaskie, przezroczyste i czarne mikropłytki polistyrenowe, z pokrywką, sterylneCorning3340Wstępnie powlekane 96-dołkowe płytki testowe, które mogą stanowić alternatywę dla ręcznego powlekania płytki testowej.
leku antyretrowirusowego AnorMed Płytka do próbnego żywotności komórek Beckman Coulter Tetra Vi-CELL

Bibliografia

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza GPCRmobilizacja wapniaanaliza oparta na fluorescencjiprzesiewowy screening antagonist w CXCR4odkrywanie lek w GPCRkinetyczna analiza fluorescencyjnawewn trzkom rkowe uwalnianie wapniawykrywanie modulator w allosterycznychidentyfikacja agonist w i antagonist wstymulacja CXCL12

Powiązane artykuły