Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół masowej produkcji mysich komórek NK wyciszających geny za pomocą systemu różnicowania bez karmienia do mechanistycznych badań in vitro i in vivo.

Streszczenie

Komórki NK należą do wrodzonego układu odpornościowego i stanowią pierwszą linię obrony immunologicznej przeciwnowotworowej; jednak są one tłumione w mikrośrodowisku guza, a mechanizm leżący u ich podstaw jest nadal w dużej mierze nieznany. Brak spójnego i wiarygodnego źródła komórek NK ogranicza postęp badań nad odpornością komórek NK. W tym miejscu przedstawiamy system in vitro, który może zapewnić wysoką jakość i ilość mysich komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego w warunkach wolnych od karmienia. Co ważniejsze, wykazaliśmy również, że wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA skutecznie hamuje dojrzewanie komórek NK zależne od E4bp4 za pomocą tego systemu. W związku z tym ten nowatorski system różnicowania komórek NK in vitro jest rozwiązaniem biomateriałowym do badań nad odpornością.

Wprowadzenie

Postęp raka jest w dużej mierze zależny od mikrośrodowiska guza^1,2, w tym immunocyty pochodzące od gospodarza, np. komórki NK. Kilka badań wykazało, że wewnątrznowotworowe komórki NK są ujemnie skorelowane z progresją nowotworu^3,4. Ponadto badania kliniczne wykazały, że terapia adoptywna komórkami NK jest możliwą strategią leczenia raka^5,6,7,8,9. Immunoterapia nowotworów oparta na komórkach NK została niedawno zasugerowana jako opcja terapeutyczna dla guzów litych, ale istnieją wyzwania związane z wydzielaniem cytokin immunosupresyjnych i obniżeniem poziomu ligandów aktywujących w mikrośrodowisku guzów litych^10,11. Sugeruje się, że transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) odgrywa rolę supresyjną w kancerogenezie, ale paradoksalnie komórki nowotworowe wytwarzają również TGF-β1, aby wspierać rozwój nowotworu^12,13,14,15. Sygnalizacja TGF-β może hamować aktywność cytolityczną komórek NK poprzez regulację w dół reakcji interferonu i produkcję interferonu gamma za pośrednictwem CD16 (IFN-γ) in vitro^16,17,18.

Chociaż zakłócenie sygnalizacji TGF-β w mikrośrodowisku guza może być możliwym sposobem eliminacji nowotworów, całkowite zablokowanie sygnalizacji TGF-β spowoduje choroby autoimmunologiczne ze względu na jego funkcję przeciwzapalną, o czym świadczy rozwój niepożądanych skutków ubocznych, w tym ogólnoustrojowych stanów zapalnych, wad układu krążenia i autoimmunizacji w modelach mysich¹⁹. W związku z tym zrozumienie mechanizmu działania immunosupresji za pośrednictwem TGF-β doprowadzi do zidentyfikowania dostępnego celu terapeutycznego w leczeniu raka.

Aby wyjaśnić zdarzenia molekularne niezbędne do rozwoju komórek NK, Williams i in. stworzyli system in vitro do różnicowania krwiotwórczych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy w komórki NK²⁰. System ten w znacznym stopniu ułatwia mechanistyczne badania rozwoju komórek NK, w tym identyfikację nowych komórek progenitorowych komórek NK²¹. Jednak progenitorzy szpiku kostnego powinni być hodowani w systemie ze wspierającymi komórkami zrębu OP9 jako warstwą zasilającą^20,21, a ta heterogeniczna populacja komórek w znacznym stopniu ogranicza dalsze stosowanie narzędzi zaburzających geny (np. wyciszania genów za pośrednictwem siRNA) specjalnie stosowanych do różnicujących się komórek NK.

Tutaj opisujemy system bez feederów, który został opracowany przez dalszą modyfikację systemu in vitro Williams et al²⁰. W naszym systemie komórki zasilające zręb OP9 nie są wymagane, a zamiast tego stosuje się warunkowe podłoże OP9 bez wpływu na różnicowanie komórek NK in vitro, co niedawno doprowadziło nas do odkrycia, że TGF-β jest w stanie promować progresję raka poprzez hamowanie rozwoju komórek NK zależnych od E4bp4 w mikrośrodowisku guza²². Ten nowatorski system z powodzeniem zapewnia niewymagającą tła metodę wyjaśniania molekularnego mechanizmu rozwoju komórek NK w określonych warunkach (np. wysoki TGF-β1, wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA itp.) in vitro.

Protokół

Protokół uzyskiwania i różnicowania komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego (BM-NK) jest oparty na wcześniej opublikowanych metodach^20,21,22. Wszystkie procedury na myszach zostały zatwierdzone przez Eksperymentalny Komitet ds. Etyki Zwierząt (AEEC) na Chińskim Uniwersytecie w Hongkongu.

1. Przygotowanie pożywki warunkowej OP9

1. Hodowla mysiej linii komórkowej zrębu OP9 w alfa-MEM zawierającej 20% FBS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze powietrza/CO₂ (95%:5%).
   1. Policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie zasiaj 2 x 10⁶ komórek OP9 do każdej kolby hodowlanej^o długości 75 cm 2 z 15 ml pożywki. Kultura przez 48 godzin.
   2. Gdy kultura osiągnie 80% zbieżności, przemyć kolbę 10 ml PBS i dodać 20 ml zwykłej pożywki alfa-MEM (bez FBS i antybiotyków) na kolbę.
2. Zebrać pożywkę kondycjonującą OP9 z kolby hodowlanej po 24 godzinach, oczyścić resztki komórek za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o wielkości 0,25 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C (zużyć w ciągu 2 tygodni).

2. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy

1. Poddaj eutanazji 12-tygodniową mysz C57BL/6J z przedawkowaniem pentobarbitonu (100 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe). Potwierdź śmierć przez brak oddechu, a następnie zbierz kości udowe nożem chirurgicznym, nacinając połączenia między kośćmi i usuń pozostałe mięśnie ostrzem, delikatnie drapiąc.
2. Umieść kości w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej schłodzony sterylny alfa-MEM, a następnie wykonaj następujące czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Wyrzuć pożywkę alfa-MEM i płucz kości 70% etanolem przez 30 sekund.
4. Umyj kości dwukrotnie lodowatym sterylnym PBS, aby usunąć pozostały etanol.
5. Przenieś kości w moździerzu zawierającym 5 ml lodowatego PBS i delikatnie rozdrobnij kości tłuczkiem (nie sproszkowaj ich).
6. Delikatnie potrząśnij kośćmi, obracając tłuczkiem, aby uwolnić komórki szpiku kostnego do PBS. Zebrać PBS zawierające komórki szpiku kostnego do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
7. Powtórz krok 2.6 cztery razy, aż fragmenty kości staną się jednolicie białe.
8. Odwirować probówkę o sile 465 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
9. Zawiesić osad w 18 ml sterylnej wody destylowanej i odstawić na 30 sekund w celu usunięcia czerwonych krwinek.
10. Dodaj 2 ml lodowatego 10X PBS, aby zatrzymać reakcję, a następnie przefiltruj mieszaninę przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, aby usunąć lizowane czerwone krwinki.
11. Odwirować probówkę o masie 465 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 20 ml lodowatego PBS.
12. Umyj komórki, powtarzając krok 2.11 po raz drugi.
13. Przenieś osad komórkowy na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm z 10 ml pożywki warunkowej OP9 z kroku 1.2 uzupełnionej 20% FBS i mieszaniną 0,5 ng/ml mysiej IL-7, 30 ng/ml mysiego SCF i 100 U/ml mysiego flt3L.
14. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2 godziny. Przenieść nieprzyłączone komórki do nowego pojemnika hodowlanego o gęstości 5 x 10⁵ żywotnych komórek/ml (policzyć komórki za pomocą hemocytometru z wykluczeniem trypan-błękit) z tą samą formułą pożywki, co w kroku 2.13, i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
15. W 4 dniu zmień warunki hodowli na warunkową pożywkę OP9 uzupełnioną 20% FBS i 2,000 U/ml mysiej IL-2.
16. Odświeżać pożywkę hodowlaną co 3 dni; dojrzałe komórki NK można uzyskać do 7 dnia i zakwalifikować jak w sekcji 4.

3. Wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA w różnicujących się komórkach NK

1. Wymieszaj siRNA lub kontrolę nonsensowną (NC) ze środkiem transfekcyjnym zgodnie z instrukcją produktu.
2. Wykonaj krok 3.1 w dowolnym momencie od dnia 0.
3. Dodaj 50 nM mieszaniny siRNA lub NC do komórek z kroku 2.14.
4. Powtórzyć krok 3.1 dla każdego odświeżenia pożywki (np. dzień 0, 4 i 7) aż do punktu końcowego doświadczenia.

4. Analiza różnicowania komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej

1. W odpowiednim momencie zebrać zawiesinę różnicujących się komórek i przemyć lodowatym PBS.
2. Zamocuj komórki za pomocą bufora do utrwalania komórek zgodnie z instrukcją produktu.
3. Przemyć utrwalone komórki lodowatym PBS, a następnie ponownie zawiesić 1 x 10⁶ komórek w 100 μl buforu barwiącego cytometrii przepływowej zawierającego anty-mysie przeciwciała anty-mysie NKp46 i PE sprzężone z PE przeciwko mysim CD244 w stosunku rozcieńczenia 1:100.
4. Próbkę barwić w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
5. Ponownie zawiesić barwione próbki za pomocą 300 μl PBS, a następnie uzyskać dane FACS i przeanalizować za pomocą Cytobank platform²⁰ (http://cytobank.org/).

Wyniki

Reprezentatywne wyniki uzyskano po zastosowaniu opisanego protokołu. Komórki z całkowitej zawiesiny szpiku kostnego hodowano w systemie różnicowania bez komórek pokarmowych przez 11 dni; do 7. dnia zaobserwowano znaczny wzrost tempa proliferacji w porównaniu z całkowitą liczbą komórek w dniu 0 (Rysunek 1A). W 6. dniu w systemie stwierdzono obecność dojrzałych komórek NK o wysokim stosunku jądra do cytoplazmy oraz morfologii cytoplazmy bogatej...

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano nowatorską metodę wytwarzania mysich komórek NK pochodzących ze szpiku kostnego in vitro. Podajnik komórek w pierwotnym systemie^21,22 został z powodzeniem zastąpiony przez warunkową pożywkę komórek OP9, co znacznie zwiększyło stabilność układu różnicowania. Ponadto system może wytwarzać dużą ilość i czystość dojrzałych komórek NK do testów in vitro i in vivo, co może ułatwić badania mechanistyczne, a także bad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa OP9	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, bez nukleozydów	Gibco	22561021
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10500064
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
Rekombinowana mysia IL-7	PEPROTECH	217-17
Rekombinowana mysia SCF	PEPROTECH	250-03
Rekombinowana mysz Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
Rekombinowana mysia IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofektamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcji	Invitrogen	1377815
IC Fixation Buffer	eBioscience	00-8222-49
Bufor do barwienia cytometrii przepływowej	eBioscience	00-4222-26
PE-sprzężone anty-mysie CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-sprzężone anty-mysie NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Kontrola nonsensu (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA przeciwko mysiemu E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& pierwszy;