Artykuł metodologiczny

Tyłomózgowie myszy jako model do badania neurogenezy embrionalnej

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56793

⸱

29 stycznia 2018

 , 
1UCL Institute of Ophthalmology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł pokazuje, jak embrionalny tyłomózgowie myszy może być wykorzystany jako model do badania neurogenezy rozwojowej zarówno w preparatach całego narządu, jak i sekcji tkankowych.

Streszczenie

Przodomózgowie zarodka myszy jest najczęściej wykorzystywanym systemem do badania neurogenezy ssaków podczas rozwoju. Jednak silnie pofałdowany nabłonek neuronabłonka przodomózgowia nie jest podatny na całościową analizę w celu zbadania wzorców neurogenezy w całym narządzie. Co więcej, zdefiniowanie mechanizmów neurogenezy przodomózgowia niekoniecznie jest predyktorem neurogenezy w innych częściach mózgu; Na przykład ze względu na obecność podtypów progenitorów specyficznych dla przodomózgowia. Tyłomózgowie myszy stanowi alternatywny model do badania neurogenezy embrionalnej, który jest podatny na całościową analizę, a także skrawki tkanek do obserwacji czasoprzestrzennego rozmieszczenia i zachowania neuronalnych komórek progenitorowych. Co więcej, można go łatwo przeanalizować do innych dalszych zastosowań, takich jak izolacja komórek lub analiza biologii molekularnej. Ponieważ tyłomózgowie myszy może być łatwo analizowane w ogromnej liczbie reporterowych i zmutowanych szczepów myszy z linii komórkowych, które stały się dostępne, oferuje to potężny model do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów neurogenezy rozwojowej w organizmie ssaków. Tutaj przedstawiamy prostą i szybką metodę wykorzystania tyłomózgowia zarodka myszy do analizy zachowania neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) ssaków w preparatach pełnomocnych i skrawkach tkanek.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju embrionalnego ssaka, NPC dzielą się na strefy komorowe (VZ) i podkomorowe (SVZ) rozszerzającego się nabłonka nerwowego, aby wytworzyć nowe neurony w procesie zwanym 'neurogenezą'. Powstawanie nowych neuronów i ich prekursorów NPC zostało szeroko zbadane w forebrain1, podczas gdy mniej wiadomo o tym procesie w innych regionach.

Przodomózgowie to złożona i misternie pofałdowana struktura, która jest głównie badana metodami histologicznymi po przecięciu tkanek, co sprawia, że zrozumienie wzorców neurogenezy w całym narządzie jest trudne. Ponadto badania neurogenezy przodomózgowia niekoniecznie przewidują zachowanie neurogenne w innych obszarach mózgu lub w rdzeniu kręgowym. Na przykład sygnały sygnalizacyjne mogą wywoływać różne reakcje w różnych regionach OUN, jak zaobserwowano w przypadku rzęskowego czynnika neurotroficznego i czynnika hamującego białaczkę, które sprzyjają samoodnawianiu się NPC w bocznej wyniosłości zwojowej, ale napędzają różnicowanie komórek progenitorowych rdzenia kręgowego2. Co więcej, podklasa NPC, które zasiedlają rozwijające się przodomózgowie i znacząco przyczyniają się do ekspansji kory mózgowej1 są nieobecne w tyłomózgowiu i rdzeniu kręgowym3. I odwrotnie, można sobie wyobrazić, że rdzeń kręgowy i tyłomózgowie zawierają alternatywne podtypy NPC, których nie ma w korze mózgowej.

Tyłomózgowie zarodka myszy jest ewolucyjnie najstarszym regionem mózgu ssaków i generuje móżdżek oraz pień mózgu. Pomimo jego zachowania u różnych gatunków, stosunkowo niewiele wiadomo na temat neurogenezy tyłomózgowia, w tym podtypów NPC lub ich regulacji. Większość badań nad tyłomózgowiem u myszy koncentrowała się na procesie segmentacji tkanek, napędzanym przez geny Hox4, oraz wzorcach neuronów postmitotycznych 5. Ponadto tyłomózgowie zostało wykorzystane jako model do badania mechanizmów angiogenezy rozwojowej6.

W przeciwieństwie do tyłomózgowia myszy, tyłomózgowie gryboki było szeroko wykorzystywane do śledzenia różnicowania NPC i progresji linii w organizmie modelowym kręgowców (np.,7,8). Tyłomózgowie pisklęcia zostało również wykorzystane do badania neurogenezy podczas rozwoju kręgowców (np. 9,10). Podobnie jak w przypadku tyłomózgowia danio pręgowanego11, tyłomózgowie pisklęcia może być obrazowane na żywo w celu zbadania zachowania i regulacji NPC w czasie12. Analogiczna obserwacja podłużna za pomocą obrazowania na żywo nie jest obecnie możliwa w organizmach ssaków, ponieważ rozwijają się one w macicy. Co więcej, ukierunkowana manipulacja za pomocą technik takich jak elektroporacja może być łatwo zastosowana do wolno żyjących zarodków danio pręgowanego lub zarodków piskląt in ovo (np. 13), ale takie techniki są również trudniejsze w macicy.

Mimo to, tyłomózgowie zarodka myszy doskonale nadaje się do zdefiniowania molekularnych i komórkowych mechanizmów rządzących neurogenezą. Po pierwsze, analiza tyłomózgowia myszy w wielu przypadkach dostarczy informacji, które są bardziej istotne dla rozwoju człowieka niż te uzyskane poprzez badanie niższych kręgowców. Co więcej, dostępna jest ogromna liczba genetycznie zmodyfikowanych szczepów myszy, które mogą być wykorzystywane do mapowania losu mysich NPC lub do zmiany mechanizmów regulacyjnych za pomocą konstytutywnych lub warunkowo zmutowanych alleli odpowiednich genów. Wreszcie, niedawno wykazano, że mikroiniekcja komórek progenitorowych tyłomózgowia komory ex vivo pozwala przynajmniej na krótkie badanie kinetyki NPC w tyłomózgowiu14. Jednak obecnie bardzo niewiele wiadomo na temat czasoprzestrzennej organizacji i zachowania NPC tyłomózgowia w kontekście całego narządu.

Tutaj pokazujemy prostą i szybką metodę wykorzystania tyłomózgowia jako potężnego modelu do analizy zachowania NPC ssaków w preparatach i sekcjach tkanek. Ponadto udostępniamy protokoły wykorzystujące znakowanie immunologiczne do badania różnych parametrów neurogenezy oraz do dalszego przetwarzania próbek tyłomózgowia do dalszych zastosowań molekularnych, takich jak ilościowa odwrotna transkryptaza (qRT)-PCR.

Protokół

Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjskim Home Office i lokalnymi wytycznymi etycznymi.

1. Podsumowanie kroków i czasu

  1. Przeprowadzić krycie w określonym czasie dorosłych myszy ze szczepu odpowiedniego do odpowiedzi na badane pytanie biologiczne w celu uzyskania ciąży w dniu embrionalnym (e) 9,5-e13,5; wymaga 12 - 15 dni.
  2. Opcjonalnie należy przygotować roztwór 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU)/5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i wykonać iniekcję (punkt 2 Protokołu); wymaga to ~ 1 h w dniu poprzedzającym lub w dniu izolacji zarodka, w zależności od pożądanej długości znakowania EdU/BrdU.
  3. Wykonać izolację zarodka i wycięcie tyłomózgowia (punkt 3 Protokołu); wymaga ~ 10 min/zarodek.
  4. Wykonać znakowanie immunofluorescencyjne metodą całościową (punkt 4 protokołu); wymaga to 3 dni.
  5. Wycięcie za pomocą wibratomu i wykonanie znakowania immunofluorescencyjnego odcinka pływającego (punkt 4 Protokołu): wymaga 2 dni.
  6. Cięcie za pomocą kriostatu i wykonanie znakowania immunofluorescencyjnego kriosekcji (punkt 5 Protokołu); wymaga 2 dni.

2. Wstrzyknij ciężarnej samicy myszy BrdU lub EdU (opcjonalnie)

  1. Rozpuścić BrdU lub EdU w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do stężeń odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml.
    Uwaga: BrdU i EdU są toksyczne; Nosić odpowiednią ochronę.
  2. Zważyć ciężarną mysz i obliczyć objętość roztworu BrdU lub EdU, którą należy podać, aby osiągnąć 100 mg/kg BrdU lub 5 mg/kg EdU.
  3. Roztwór BrdU lub EdU należy wstrzyknąć drogą dootrzewnową 1 godzinę lub 1 dzień przed pobraniem zarodków, w zależności od wymaganej długości znakowania.
    UWAGA: Etykietowanie przez 1 godzinę wizualizuje komórki tyłomózgowia w fazie S. Etykietowanie na 1 dzień wizualizuje potomstwo NPC z tyłomózgowia.

3. Sekcja tyłomózgowia z e9.5 - e13.5 Embriony myszy

  1. Poddaj eutanazji samicę myszy w ciąży w czasie przy użyciu etycznie zatwierdzonej procedury na wymaganym etapie ciąży (np. zwichnięcie szyjki macicy). Ostrymi nożyczkami rozetnij jamę otrzewnej i ostrożnie wytnij macicę. Umieść wyciętą macicę zawierającą zarodki w plastikowym naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym 20 ml lodowatego PBS.
    UWAGA: Technika aseptyczna nie jest wymagana.
  2. Wykonaj całą dalszą sekcję za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 5 rozerwij ścianę mięśnia macicy, aby odsłonić zarodki, uwolnij każdy zarodek, przecinając pępowinę i usuń woreczek żółtkowy.
  3. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura z otworem o szerokim otworze, przenieś każdy zarodek do czystego plastikowego naczynia z lodowatym PBS.
  4. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich numer 55 odetnij głowę (Rysunek 1E).
  5. Opcjonalnie należy zachować niewielki fragment tkanki (np. 1/4 woreczka żółtkowego lub około 2 mm końcówki ogona) w celu izolacji genomowego DNA i późniejszego genotypowania.
  6. Używając kleszczy zegarmistrzowskich numer 55, wytnij tkankę zawierającą tyłomózgowie równolegle do i bezpośrednio poniżej nabłonka neuronabłonka tyłomózgowia, aby oddzielić go od tkanki twarzy i przodomózgowia (Rysunek 1F).
  7. Ustaw tyłomózgowie i tkankę głowy ogona grzbietową do góry i zidentyfikuj 4. komorę, która jest pokryta cienką warstwą tkanki (płytą dachową). Ostrożnie przebij płytę dachową za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich numer 55 (Rysunek 1G) i oderwij nadmiar tkanki za pomocą kleszczy, przesuwając się wzdłuż linii środkowej nad śródmózgowiem, a następnie doogonowo nad tylnym tyłomózgowiem i rdzeniem kręgowym (Rysunek 1G); tyłomózgowie powinno być teraz wyeksponowane w otwartej książce (Rysunek 1H).
  8. Przygotuj tyłomózgowie do całościowego znakowania immunologicznego (opcja 1).
    1. Używając kleszczyków zegarmistrzowskich numer 55, ostrożnie usuń pozostałą mezenchymę głowy i wszelkie opony mózgowe przymocowane do strony tyłomózgowia za pomocą kleszczy (Rysunek 1I). Usuń tkankę śródmózgowia i rdzeń kręgowy (Rysunek 1J), aby pozostawić tylko tkankę tyłomózgowia (Rysunek 1K).
      UWAGA: Ten etap procedury nie powinien być wykonywany przy e9.5 lub e10.5, ponieważ próba wykonania tego prawdopodobnie uszkodziłaby nabłonek neuronabłonka tyłomózgowia; Co więcej, usunięcie opon mózgowych nie jest konieczne, ponieważ nabłonek neuronabłonka tyłomózgowia jest na tym etapie wystarczająco cienki, aby umożliwić skuteczną penetrację przeciwciał w celu znakowania immunologicznego. Ten krok należy jednak wykonywać począwszy od e11.5, kiedy tkanka oponowa konsoliduje się, aby zwiększyć penetrację przeciwciał do nabłonka nerwowego w tyłomózgowiu. Sekcja jest najłatwiejsza, gdy jest wykonywana w lodowatym PBS (użyj czystego PBS dla każdego tyłomózgowia).
  9. Przygotuj tyłomózgowie do wibratomu i kriosekcji (opcja 2)
    1. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 55 usuń tkankę śródmózgowia i rdzeń kręgowy (Rysunek 1J).
      UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie mezenchymy i opon mózgowo-rdzeniowych tyłomózgowia przeznaczonych do cięcia (jak pokazano w Rysunek 1I).
  10. Przenieść tyłomózgowie z plastikowego naczynia do okrągłodennych probówek o pojemności 2 ml za pomocą pipety Pasteura, odessać cały PBS i utrwalić na 2 godziny w temperaturze 4°C z delikatnym mieszaniem w świeżo rozmrożonym 4% w/v formaldehydzie rozpuszczonym w PBS.
    Uwaga: Formaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  11. Opłucz tyłomózgowie 3 razy za pomocą PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS, jeśli znakowanie immunologiczne rozpocznie się w ciągu 2-3 dni lub zastąpić PBS 50% metanolem/50% PBS przez 5 minut przed przeniesieniem do 100% metanolu w celu dłuższego przechowywania w temperaturze -20°C.

4. Wholemount Immunofluorescencja

  1. W razie potrzeby należy nawodnić tyłomózgowie w seryjnie zmniejszających się rozcieńczeniach metanolu w PBS (np. 75% metanolu, 50% metanolu, 25% metanolu) w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut, a następnie przenieść do PBS.
    UWAGA: Stopniowana seria metanolu jest wymagana do delikatnego nawodnienia tyłomózgowia i zapewnienia odpowiedniej konserwacji tkanek.
  2. Przepuszczalność tyłomózgowia przez 30 minut w temperaturze 4 °C w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 (PBT) z delikatnym mieszaniem.
  3. Inkubować tyłomózgowie przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w PBT zawierającym 10% inaktywowanej termicznie surowicy koziej z delikatnym mieszaniem.
    UWAGA: Użyj surowicy od gatunku gospodarza, w którym wyhodowano przeciwciała drugorzędowe. W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u kóz należy inkubować w bloku białkowym bez surowicy, na przykład 5% albuminy surowicy bydlęcej w PBS lub odpowiedniej alternatywie handlowej (patrz tabela materiałów). Zmniejszy to nieswoiste barwienie często obserwowane podczas stosowania przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u kóz.
  4. Inkubować tyłomózgowie przez noc w temperaturze 4 °C w PBT zawierającym 1% inaktywowanej termicznie surowicy i pierwszorzędowe przeciwciała z delikatnym mieszaniem (np. króliczy anty-fosfohiston H3 [pHH3] rozcieńczony w stosunku 1:400).
    UWAGA: W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u kóz należy użyć PBT bez surowicy.
  5. Tyłomózgowie myć w temperaturze 4 °C 5x za pomocą PBT przez 1 godzinę każde.
  6. Inkubować tyłomózgowie przez noc w temperaturze 4 °C w PBT zawierającym odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (np. kozie przeciwciała anty-królicze Alexa Fluor 488) w stosunku 1:200 w PBT ukierunkowanym przeciwko zastosowanym przeciwciałom pierwszorzędowym. Od tego momentu trzymaj tyłomózgowie w ciemności, aby chronić fluorofory przed fotowybielaniem.
    UWAGA: W przypadku przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u kóz należy użyć fragmentów przeciwciał drugorzędowych Fab przeciwko kozie, aby zmniejszyć nieswoiste barwienie.
  7. Tyłomózgowie myć w temperaturze 4 °C 5x za pomocą PBT przez 1 godzinę każde.
  8. Postfix tyłomózgowia w 4% formaldehydzie w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu długotrwałego zachowania wiązania przeciwciał. Krótko spłukać dwukrotnie w PBS.
  9. Przykryj szklane szkiełko mikroskopowe dwiema warstwami czarnej taśmy izolacyjnej i wytnij mały kwadrat z warstwowej taśmy, aby utworzyć kieszeń wystarczająco dużą, aby pomieścić jedną tylną część mózgu.
  10. Przenieś każde tyłomózgowie do kieszeni za pomocą pipety Pasteura, usuń nadmiar płynu i dodaj odpowiedni odczynnik zapobiegający blaknięciu do kieszonki, a następnie powoli przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe i przymocuj je do szkiełka cienką warstwą lakieru do paznokci. Szkiełko należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu uzyskania obrazu (punkt 7 protokołu).

5. Sekcja wibratomu i sekcja pływająca Immunofluorescencja

  1. W razie potrzeby nawodnij tyłomózgowie z metanolu, jak opisano w kroku 4.1.
  2. Osadź tyłomózgowie w stopionej 3% w/v agarozie przygotowanej w wodzie destylowanej.
    UWAGA: Pozwól stopionej agarozie ostygnąć do około 55°C na krótko przed osadzeniem, aby zapobiec uszkodzeniom cieplnym tyłomózgowia.
  3. Wytnij poprzeczne odcinki tyłomózgowia na grubość 70 μm za pomocą wibratomu. Przenieś każdy świeżo ścięty fragment pędzlem do jednego dołka 24-dołkowej płytki zawierającej lodowaty PBS.
  4. Oznaczyć sekcje pływające zgodnie z opisem w krokach 4.2-4.7, ale zmodyfikować kroki w następujący sposób: przemyć sekcje pływające w temperaturze 4 °C 3x PBT przez 15 minut każda, skrócić czas inkubacji przeciwciał drugorzędowych do 2 godzin i inkubować w przeciwciałie drugorzędowym w temperaturze pokojowej.
  5. Opcjonalnie, po znakowaniu przeciwciałami dla innych epitopów, jak opisano w kroku 5.4, wykryj jądra EdU+ za pomocą zestawu do znakowania EdU zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować pływające sekcje w koktajlu reakcyjnym przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Myć tyłomózgowie w temperaturze 4 °C 3x PBT przez 15 minut każda.
  6. Opcjonalnie, po znakowaniu innych epitopów, jak opisano w kroku 5.4, wykryj jądra BrdU+ w następujący sposób.
    1. Inkubować sekcje pływające w 2 N kwasie solnym w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
    2. Inkubować sekcje pływające w 0,1 M buforze boranowym o pH 8,5 dwa razy po 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby zneutralizować kwas solny.
    3. Umyć sekcje pływające 3x krótko w PBS w temperaturze 4 °C.
    4. Wykonać znakowanie immunofluorescencyjne dla BrdU zgodnie z opisem w kroku 5.4.
  7. Inkubować pływające sekcje przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w 10 μg/ml dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w PBS w celu przeciwdziałania barwieniu jąder komórkowych.
  8. Umieść pływające sekcje w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj krótko sekcje pływające w PBS. Ostrożnie przenieś pływające sekcje na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą pędzla. Zetrzyj nadmiar PBS wokół sekcji za pomocą bibuły lub chusteczek.
  10. Zamontuj sekcje przy użyciu 80% glicerolu w PBS i powoli przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza. Przechowywać szkiełko w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu uzyskania obrazu (krok 7).

6. Cięcie kriostatu i znakowanie immunofluorescencyjne kriosekcji

  1. W razie potrzeby nawodnij tyłomózgowie z metanolu, jak opisano w kroku 4.1.
  2. Inkubuj tyłomózgowie w 30% w/v sacharozy w PBS, aby kriochronić tyłomózgowie przed zamrożeniem.
    UWAGA: Tyłomózgowie jest gotowe do zamrożenia, gdy opadną na dno rurki, co zwykle zajmuje ≤ 2 godzin w przypadku tyłomózgowia e9,5-10,5 i 3-6 godzin w przypadku tyłomózgowia e11,5-13,5.
  3. Zanurz tyłomózgowie w optycznym związku o temperaturze skrawania (OCT) i szybko zamroź, przenosząc formy zawierające tyłomózgowie w OCT do izopentanu schłodzonego do temperatury od -40 °C do -50 °C na suchym lodzie.
    UWAGA: Zamrożone, osadzone tyłomózgowie można przechowywać w temperaturze -20 °C przez krótki czas i -80 °C przez długi czas do momentu sekcji.
  4. Wyciąć poprzeczne odcinki tyłomózgowia na grubość 10 μm za pomocą kriostatu i przenieść na elektrostatycznie przyklejane szkiełka mikroskopowe.
    UWAGA: Kriosekcje tyłomózgowia można przechowywać w temperaturze -20 °C przez krótki czas i -80 °C przez długi czas do momentu etykietowania.
  5. Inkubuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby wysuszyć sekcje do szkiełek. Przemyj kriosekcje PBS, aby rozpuścić OCT i oznaczyć hydrofobową barierę wokół kriosekcji za pomocą pisaka PAP. Powtórz kroki 5.4-5.8.
  6. Powtórz krok 5.10, używając podłoża montażowego na bazie alkoholu poliwinylowego zamiast glicerolu.

7. Akwizycja obrazu

  1. Próbki obrazowe za pomocą epifluorescencyjnego lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w soczewki odpowiednie do szkiełek montowanych na podłożach wodnych oraz filtry optyczne odpowiednie dla fluoroforów stosowanych do znakowania immunologicznego.
  2. Aby zobrazować całe tyłomózgowie lub część tyłomózgowia, użyj soczewki o 10-krotnym powiększeniu (np. Rysunek 2B); aby uwidocznić obszary tyłomózgowia do kwantyfikacji, użyj 40-krotnego powiększenia (np. Rysunek 2D), a do wizualizacji pojedynczych komórek użyj soczewki o powiększeniu 63x (np. Rysunek 2C).

8. Metody alternatywne

  1. Postępując zgodnie z krokiem 3.8, homogenizuj nieutrwalone tyłomózgowie, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki do zastosowań cytometrii przepływowej15.
  2. Postępując zgodnie z krokiem 3.8, homogenizuj nieutrwalone tyłomózgowie, aby wyekstrahować RNA z zawiesin pojedynczych komórek do RT-qPCR (np. 16).
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt są przez cały czas sterylne i wolne od RNaz, aby zapobiec degradacji RNA.
  3. Postępując zgodnie z krokiem 3.8, homogenizuj nieunieruchomione tyłomózgowie, aby wyizolować NPC i rozmnażać je in vitro jako neurosfery do analizy zachowania NPC w tyłomózgowiu17.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt są sterylne, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteryjnemu/grzybiczemu kultur neurosfery.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać podczas badania neurogenezy w zarodkowym rąbie tylnym myszy poprzez analizę całych preparatów oraz sekcji tkankowych.

Wykazujemy, że immunoznakowanie całego preparatu mikrodysekcyjnego tylnego mózgowia przeciwciałem przeciwko markerowi mitotycznemu pHH3 pozwala na wizualizację dzielących się NPC w strefie VZ (Rycina 2B - D). Przedstawiamy NPC pHH3+ przy dużym powiększeniu, aby wyróżnić różne stadia mitozy (Rycina 2C). Wykazaliśmy, że ta metoda znakowania nadaje się do zastosowania w kilku kolejnych etapach rozwoju tylnego mózgowia w celu obserwacji przebiegu czasowego mitozy NPC w tym organie (Rycina 2D).

Wykazano, że obrazowanie poprzecznych, immunoznakowanych przekrojów rdzenia przedniego wykonanych za pomocą wibratomu 1 h po wstrzyknięciu EdU pozwala na wizualizację orientacji podziału mitotycznych NPC (Rysunek 3B), pseudowarstwowego wzorca międzykinetycznej migracji jąder progenitorów w cyklu komórkowym18 (Rysunek 3B, D) oraz ogólnej struktury VZ (Rysunek 3B - D). Należy zauważyć, że mitotyczne pHH3+ NPC znajdują się wyłącznie na powierzchni komorowej, a nie bardziej basalnie (Rysunek 3C), co kontrastuje z basalnym wzorcem podziału bardziej zróżnicowanych NPC w przedmózgowiu19.

Przedstawiamy również sposób znakowania BrdU lub EdU cyklicznych NPC oraz ich zróżnicowanego potomstwa w celu oceny progresji linii NPC (Rysunek 4). Immunoznakowanie poprzecznych kriosiekcji tylnego mózgowia myszy 1 dzień po wstrzyknięciu BrdU pod kątem BrdU i Ki67 obrazuje liczbę i rozmieszczenie cyklicznych NPC w neuroepitelium (Rysunek 4A, B), przy czym liczba samoodnawiających się NPC może być określona poprzez obliczenie procentowego udziału komórek Ki67+ BrdU+ spośród wszystkich komórek BrdU+ (Rysunek 4A, C).

Na koniec przedstawiamy przykład immunoznakowania przekrojów rdzenia przedniego wykonanych za pomocą wibratomu w kierunku RC2, antygenu w specyficznym dla neuronów filamentcie pośrednim nestin, w celu wizualizacji stopnia końcowego NPC (Rysunek 5B) oraz ich wypustek (Rysunek 5C). Przekroje wykonane wibratomem, w przeciwieństwie do cienkich przekrojów mrożonych, umożliwiają lepszą obserwację silnie rozgałęzionych NPC, a także ogólnej struktury neuroepitelium.

figure-results-1
Rycina 1Kluczowe etapy wypreparowania tylnego mózgowia z zarodka myszy w stadium e11.5. (A - D) Schematyczne przedstawienie mikrosekcji rąbka mózgu. (A) Tkankę z tylnej części głowy usuwa się, przecinając wzdłuż czerwonych linii przerywanych. (BPłyta dachowa zostaje przebita, a następnie rozerwana w kierunku rostralnym i kaudalnym wzdłuż linii środkowej (pionowe czerwone linie), a następnie bocznie, aby odsłonić neuroepithelium tylnego mózgowia.C) Neuroepitel zostaje oddzielony od opon mózgowo-rdzeniowych po wprowadzeniu pęsety pomiędzy obie struktury, a następnie usuwa się tkanki mózgu średniego i rdzenia kręgowego, przecinając je pęsetą wzdłuż czerwonych przerywanych linii. (D) W wyniku tej procedury otrzymuje się spłaszczony ród tylny. (E-K) Rejestracja obrazu kluczowych etapów procedury mikrodysekcji rąbka tylnego mózgu. (EZarodek zostaje zdekapitowany poprzez przecięcie wzdłuż linii przerywanej.F) tyłomózgowie i 4th komora, otoczona płytą dachową, zostaje wycięta i oddzielona od głowy poprzez przecięcie wzdłuż linii przerywanych.G) 4th komora jest skierowana ku górze przed wykonaniem niewielkiego otworu w płytce dachowej (gwiazdka). Otwór jest poszerzany poprzez ostrożne oddzielenie tkanki zarówno w kierunku rostralnym, jak i kaudalnym wzdłuż linii środkowej (strzałki), aby odsłonić ródmózg. Ródmózg jest ułożony stroną oponą miękką do dołu i pozostawiony do rozłożenia w formie preparatu otwartej książki (H; czarna grotowata strzałka wskazuje tkankę neuronalną ródmózgu). Jeśli ródmózg jest wymagany do immunoznakowania całego preparatu, błonę pialną usuwa się, delikatnie oddzielając neuroepitel ródmózgu od otaczających go błon oponowych za pomocą pęsety (I). Nadmiar tkanki śródmózgowia (mb) i rdzenia kręgowego (sc) zostaje usunięty (linie przerywane w J) w celu wyizolowania rąbka (K). Pasek skali: 500 µm dla (E), 300 µm dla (F - K). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Immunoznakowanie całego preparatu (wholemount) może być wykorzystane do ilościowego oznaczenia mitoz NPC w obrębie tylnego mózgowia. (A) Schemat przedstawiający obrazowanie en face mitotycznych NPC w warstwie komorowej tylnego mózgowia. V, strona komorowa tylnego mózgowia; P, strona pialna tylnego mózgowia. (B) Konfokalny skan mozaikowy (tile scan) z serii optycznych przekrojów (z stack) tylnego mózgowia w stadium e10.5 po immunoznakowaniu całego preparatu na marker mitotyczny pHH3 (czerwony). Biała ramka wskazuje obszar pokazany w większym powiększeniu na drugim panelu w punkcie (D). (C) W całkowitej grupie mitotycznych NPC można rozróżnić postacie mitotyczne w fazie przedanafazowej (biała grotka) i anafazowej (czarna grotka). (D) Przebieg czasowy znakowania pHH3 w całym preparacie od e9.5 do e13.5. Paski skali: 500 µm w (B); 20 µm w (C); 100 µm w (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Cyklujące NPC w obrębie ich strefy zarodkowej w rostralnej części tylnego mózgowia. (A) Schemat przedstawiający położenie NPC w fazie mitotycznej (zielone) i fazie S (czerwone) odpowiednio na powierzchni komorowej tylnego mózgowia oraz w obszarze okołokomorowym. Po prawej stronie przedstawiono w większym powiększeniu wirtualny przekrój poprzeczny tylnego mózgowia. Czarna strzałka wskazuje kierunek migracji potomstwa NPC, które opuściło cykl komórkowy i zmierza w stronę strefy różnicowania. (B) Konfokalny stos obrazów z (z-stack) pływającego przekroju tylnego mózgowia embrionu e11.0 po 1-godzinnym pulsie EdU; do wizualizacji NPC w fazie mitotycznej (zielone) i fazie S (czerwone) wykorzystano immunobarwienie na pHH3 i EdU. Powierzchnie tylnego mózgowia zaznaczono liniami przerywanymi; V, strona komorowa tylnego mózgowia; P, strona oponowa tylnego mózgowia. Obszar zaznaczony białym prostokątem pokazano w większym powiększeniu na wstawce; strzałki wskazują płaszczyznę podziału NPC w anafazie względem powierzchni komorowej. (C) Pojedynczy kanał prezentujący wyłącznie immunobarwienie pHH3. NPC w fazie mitotycznej zaznaczono błękitnymi grotami strzałek; brak podziałów bazalnych zaznaczono symbolem Δ. (D) Pojedynczy kanał prezentujący wyłącznie barwienie EdU. NPC EdU+ przyjmują rozkład pseudowarstwowy ze względu na interkinetyczną migrację jąder. Odległość, na jaką NPC migrują od powierzchni komorowej, można zmierzyć, co zilustrowano reprezentatywną pomarańczową linią. Paski skali: 100 µm w (B - D); 10 µm we wstawce w (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Łączenie znakowania BrdU z Ki67 w celu określenia zdolności do samoodnowy NPC w tylustrzebie. (A) Seria obrazów konfokalnych (z-stack) krioprzekroju tylustrzebia zarodka e10.5 po znakowaniu Ki67 (zielony) i BrdU (czerwony) po jednodniowym impulsie BrdU. Komórki podwójnie dodatnie w strefie komorowej to NPC, które włączyły BrdU i nadal przechodzą przez cykl komórkowy, co wskazuje znakowanie Ki67. Proporcja komórek podwójnie znakowanych w całkowitej populacji BrdU+ reprezentuje procent samoodnawiających się NPC. (B, C) Pojedyncze kanały wyświetlające wyłącznie immunoznakowanie Ki67 (B) oraz BrdU (C). Komórka BrdU+, która nie wykazuje Ki67 i prawdopodobnie opuściła cykl komórkowy, jest zaznaczona cyjanową grotą strzałki w (A,C). Powierzchnie tylustrzebia zaznaczono liniami przerywanymi; V, strona komorowa tylustrzebia; P, strona pialna tylustrzebia. Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Immunoznakowanie nestyny uwidacznia wypustki i stopki komórek NPC. (A - C) Immunofluorescencja dla RC2, który rozpoznaje epitop na neuralnym włóknie pośrednim nestynie, ilustruje morfologię NPC w obrębie neuroepitelium tylnego mózgowia. (A) Konfokalny stos z (z-stack) pływającego przekroju tylnego mózgowia z etapu e11.5 po immunoznakowaniu RC2; obszary zaznaczone ramką przedstawiono w większym powiększeniu w (B, B'; region apikalny/komorowy) oraz (C, C'; region bazalny). Powierzchnie tylnego mózgowia zaznaczono liniami przerywanymi; V, strona komorowa tylnego mózgowia; P, strona pialna tylnego mózgowia. (B, C) Konfokalne stosy z zaznaczonych obszarów w (A); pojedyncze przekroje optyczne przedstawiono odpowiednio w (B', C'). Stopka apikalna komórki NPC zakotwiczona na powierzchni komorowej zaznaczona jest strzałką w (B'). Pojedyncze i pęczkowate wypustki NPC zaznaczono odpowiednio białymi i czarnymi grotami strzałek w (C'). Paski skali: 100 µm, (A); 25 µm dla (B, C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać embrionalną tyłomózgowie myszy jako model do badania mechanizmów neurogenezy rozwojowej. Korzystając z wielu różnych metod znakowania immunologicznego, można wizualizować NPC w tyłomózgowiu i określać ilościowo ich liczbę w sekcjach tkanek lub w całych narządach. Łatwość sekcji i płaska anatomia zapewniają, że tyłomózgowie może być zobrazowane w "otwartej książce" w celu zebrania informacji na temat wzorców neurogenezy w całym narządzie.

Dalej pokazujemy, że morfologię NPC i pozycjonowanie NPC związane z cyklem komórkowym można łatwo zwizualizować w pływających lub kriosekcjach tyłomózgowia. Oba zachowania mogą być wykorzystane do zdefiniowania nowych populacji progenitorów, tak jak to miało miejsce w przypadku kresomózgowiassaków 20. Na przykład wcześnie uformowany neuroepitelia Sox2 + i glej promieniowy wierzchołkowy Pax6 + są obecne w tyłomózgowiu21,22, ale w tyłomózgowiu brakuje podstawowych przodków Tbr2 + 3.

Opisany tutaj protokół można również dostosować do obserwacji zachowania określonych subpopulacji NPC poprzez znakowanie fluorescencyjne do obrazowania na żywo i/lub śledzenia linii w utrwalonych tkankach. Można to osiągnąć, na przykład, badając tyłomózgowie myszy będących nosicielami indukowanego tamoksyfenem transgenu Sox1-iCreERT2 i reportera Rosa26tdTomato 23.

Oprócz poszerzenia wiedzy na temat neurogenezy myszy, badanie tyłomózgowia może wyjaśnić szeroko istotne mechanizmy neurogenne, które są wspólne dla wszystkich gatunków, ponieważ tyłomózgowie jest wysoce konserwatywnym obszarem mózgu, który prawdopodobnie będzie bardziej podobny między gatunkami kręgowców niż przodomózgowie.

Ponieważ neurogeneza tyłomózgowia zachodzi w stosunkowo krótszym oknie czasowym niż neurogeneza przodomózgowia23, ważne jest, aby rozważyć potrzebę porównania odpowiednio zaawansowanych zarodków. W związku z tym unika się błędu systematycznego, licząc i rejestrując liczbę par somitów w zarodku przed wyizolowaniem jego tyłomózgowia. Sama tkanka tyłomózgowia jest delikatna i dlatego należy obchodzić się z kleszczami ostrożnie podczas oddzielania tkanki tylnego mózgu od mezenchymii głowy i opon mózgowych; W związku z tym zaleca się przeprowadzenie kilku "prób praktycznych" przed przystąpieniem do sekcji cennych zarodków. Ponadto tyłomózgowie powinno być przenoszone z jednej rurki do drugiej za pomocą pipety Pasteura o szerokim otworze, a nie kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia (otwór pipety można poszerzyć, przecinając końcówkę czystymi nożyczkami). Wreszcie, choć rzadko, stopień włączenia EdU/BrdU do NPC fazy S może być zmienny, w szczególności podczas krótkich (tj. 1 h) impulsów. Aby poprawić etykietowanie, należy upewnić się, że EdU/BrdU został prawidłowo rozpuszczony przed załadowaniem roztworu do strzykawki i ostrożnie wstrzyknąć do jamy otrzewnej. Złe wstrzyknięcia, takie jak te wykonane przypadkowo podskórnie, spowodują utratę lub uwięzienie roztworu EdU/BrdU i uniemożliwią jego przedostanie się do krążenia.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Vasiliki Chantzara za przeprowadzenie kryć z określonym czasem oraz personelowi Jednostki Zasobów Biologicznych w Instytucie Okulistyki UCL za hodowlę myszy. Badanie to zostało wsparte nagrodą Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z dla CR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okrągłodenna probówka z odczynnikiem, 2,0 ml (Safe-Lock)VWR211-2120Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Naczynie do hodowli komórkowych z tworzywa sztucznego, 60 mmThermo Fisher150288Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Płytki do hodowli komórkowych, 12-dołkoweThermo Fisher150628Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Pipety PasteuraCopan200CDostępne również u innych dostawców komercyjnych
Dumont Kleszcze zegarmistrzowskie, nr 5FST91150-20
Kleszcze zegarmistrzowskie Dumont, nr 55FST11295-51
Igła/strzykawka 29GBDBD Micro-Fine +1ml
Przeciwciało pierwszorzędowe antyfosfohistonu H3Millipore06-570Koza, rozcieńczenie 1:400
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-BrdUAbcamab6326Szczur, rozcieńczenie 1:400
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-Ki67BD Biosciences550609Mysz, rozcieńczenie 1:400
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-RC2Badania rozwojowe Hybridoma BankRC2Mysz (IgM), rozcieńczenie 1:400
Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowiThermo FisherA11029Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 594-sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowiThermo FisherA11037Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało anty mysie IgMThermo FisherA21042Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszomThermo FisherA11001Rozcieńczenie 1:200
Alexa Fluor 594-sprzężone kozie przeciwciało przeciw szczurom przeciwciało wtórneThermo FisherA11007Rozcieńczenie 1:200
4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)SigmaD9542Stosować przy 10 μ g na ml
5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU)Sigma900584
5-bromo-2´-deoksyurydyna (BrdU)SigmaB5002
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 594Thermo FisherC10086
Inaktywowana termicznie surowica koziaSigmaG9023
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906
Nie zawiera surowicy białkowej DAKOAgilentX0909
Triton X-100SigmaT8787Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaSigmaP4417Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
ParaformaldehydSigmaP6148Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Sód tetraboranSigmaB9876Dostępny również u innych dostawców komercyjnych
SacharozaSigmaS0389Dostępny również u innych dostawców komercyjnych
AgarozaSigmaA9539Dostępny również u innych dostawców komercyjnych
Bloker w płynie Super PAP TedPella, Inc.22309
Zestaw SlowFade Antifade ThermoFisherS-2828
GlycerolFisher Scientific10337700
MowiolMillipore475904
OCTScigen4583Dostępny również u innych dostawców komercyjnych
IsopentaneSigmaM32631Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
MetanolThermo Fisher10675112Dostępny również u innych dostawców komercyjnych
Kwas solnyThermo Fisher10316380Dostępne również u innych dostawców komercyjnych
Szkiełka mikroskopoweVWR631-0912
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostVWR631-0108
TermometrVWR620-0858
Szkło osłonoweVWR631-0137
, Leica MZ16Leicanie dotyczy
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy  LSM710Zeissnie dotyczy
Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

  1. Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
  2. Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
  3. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
  4. Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
  5. Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
  6. Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
  7. Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
  8. Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
  9. Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
  10. Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
  11. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  12. Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57(2016).
  13. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
  14. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
  15. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  16. Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
  17. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  18. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
  19. Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
  20. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125(2013).
  21. Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
  22. Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
  23. Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza ca ego preparatuci cie tkanekkom rki progenitorowe neuron wznakowanie immunofluorescencyjneci cie w wibrotomieci cie w kriotomiemikroskopia konfokalnacytometria przep ywowa

Powiązane artykuły