Artykuł metodologiczny

Stymulacja nerwów jamistych i rejestracja ciśnienia w ciałach jamistych u szczura

DOI:

10.3791/56807

⸱

23 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Biomedical Laboratory and the Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 2Department of Surgery, University of Vermont, 3Research Unit of Urology, Department of Clinical Research, University of Southern Denmark, 4Department of Urology, Odense University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje uproszczoną procedurę chirurgiczną i technikę wykonywania stymulacji nerwów jamistych z izolacją kompleksu nerwowo-elektrodowego za pomocą kleju silikonowego i pomiarem ciśnienia w jamie jamistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stymulacja nerwu jamistego (CN) i pomiar ciśnienia wewnątrzjamistego (ICP) były szeroko stosowane do testowania i oceny terapii zaburzeń erekcji. Jednak stosowane metody różnią się w zależności od laboratoriów i nadal istnieją pułapki. Celem tego badania było opisanie techniki chirurgicznej, która zapewniłaby wiarygodny i powtarzalny model. Odsłaniając mięsień kulszowo-jamisty w miejscu jego przyczepu do guzowatości kulszowej, podudzia prącia można kaniulować przy minimalnym rozwarstwieniu i uszkodzeniu struktur zaangażowanych w funkcję erekcji. Ponowna stymulacja CN, bez konieczności podnoszenia i suszenia, została osiągnięta dzięki zastosowaniu bipolarnej srebrnej elektrody o mocy 125 μm i biokompatybilnego kleju krzemowego do wyizolowania kompleksu elektroda-nerw. Metoda ta zapobiega neuropraksji poprzez zmniejszenie rozciągania i wysuszania nerwu oraz zapewnia całkowitą izolację nerwu, negując wyciek elektryczny i zapobiegając stymulacji alternatywnych ścieżek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania in vivo funkcji erekcji u zwierząt doświadczalnych rozpoczęły się w 1863 roku od pionierskiej pracy eksperymentalnej Eckharda1. Elektrostymulację nerwów miednicy zastosowano w celu wywołania zwiększonego ICP u psów. Przez całyXX wiek podobne protokoły eksperymentalne były stosowane u większych zwierząt, takich jak psy, małpy, koty i króliki. Ocena funkcji erekcji u szczura została po raz pierwszy opracowana przez Quinlana i in. w 1989 roku2. Od tego czasu metoda została zmodyfikowana i zaktualizowana przez kilka innych grup34. Obecnie szczur jest najczęściej używanym modelem zwierzęcym do badania patologii zaburzeń erekcji i oceny pojawiających się opcji leczenia. Główne etapy procedury obejmują rejestrację ogólnoustrojowego ciśnienia krwi za pomocą linii w tętnicy szyjnej, kaniulację ciała prącia w celu pomiaru ICP oraz stymulację CN w celu wywołania wzrostu ICP. Chociaż kilku badaczy udoskonaliło model, jego odtwarzalność pozostaje problemem, a różne laboratoria zgłaszają różne wyniki. Nadal istnieje kilka pułapek.

Poprzednie artykuły5,6,7,8,9,10 opisują zastosowanie pełnego odsłonięcia prącia z deglovem penisa do kaniulacji ciał jamistych. Nie jest to optymalne podejście, ponieważ manipulacja i destrukcyjna sekcja powoduje uszkodzenie struktur, które są niezbędne do funkcjonowania erekcji. Sekcja CN została dobrze opisana10,11, ale stymulacja nerwu nie jest optymalna ze względu na wiele czynników, które mogą wpływać na wyniki eksperymentu. Technika stymulacji CN obejmuje uniesienie nerwu z otaczającej tkanki poprzez pociągnięcie za bipolarną elektrodę hakową, która jest umieszczona wokół nerwu, i osuszenie nerwu przed każdą stymulacją. Może to prowadzić do różnego stopnia uszkodzenia nerwów i wycieku prądu elektrycznego, co skutkuje zmniejszoną odpowiedzią lub fałszywym wzrostem ICP poprzez stymulację alternatywnych szlaków, np. mięśni dna miednicy, pęcherza moczowego i przewodu pokarmowego12. Wszystkie te czynniki ograniczają odtwarzalność.

Podczas naszego badania zaobserwowaliśmy, że zarówno głębokość, jak i rodzaj znieczulenia mają głęboki wpływ na ICP. Stosowane środki znieczulające to pentobarbital sodu, ketamina/ksylazyna lub ketamina/midazolam do wstrzykiwań lub inhalacja izofluranem/tlenem.

Tutaj opisujemy uproszczoną metodę chirurgiczną i dostarczamy dane wspierające standaryzację protokołu eksperymentalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta były trzymane w Ośrodku Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Danii zgodnie z wytycznymi instytucji. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Jest to ostry zabieg chirurgiczny, który nie daje przeżycia.

1. Przygotowanie przewodów, elektrod i narzędzi do zabiegu chirurgicznego

  1. Użyj następujących narzędzi mikrochirurgicznych: nożyczki chirurgiczne, mikronożyczki kątowe, kleszczyki do tkanek, para zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7 i #5, uchwyt na mikroigły i zwijacze.
    nuta: Ponieważ jest to ostra procedura, narzędzia nie muszą być sterylizowane. Po użyciu wyczyść i przetrzyj końcówki 70% etanolem.
  2. Namocz rurkę w 70% etanolu, a następnie przepłucz ją sterylnym 0,9% NaCl ze 100 U/ml heparyny przed użyciem. Pozostaw rurkę wypełnioną, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do systemu.
  3. Wytnij kawałek rurki z polietylenu (PE)-50 o długości 20-30 cm, aby wykonać cewnik do pomiaru ICP. Upewnij się, że rurka jest jak najkrótsza, aby zmniejszyć tłumienie ciśnienia.
  4. Zegnij sterylną igłę 24G na boki, aż igła złamie się w środku. Połącz kawałek ze skosem do dystalnego końca rurki PE w celu włożenia do podudzia prącia. Włóż drugą połowę do piasty w celu podłączenia do przetwornika ciśnienia. Napełnij system heparynizowaną solą fizjologiczną (100 U/ml).
  5. Aby wykonać bipolarną elektrodę pokrytą teflonem, przytnij dwa srebrne druty o średnicy 125 μm na równą długość. Użyj kawałka taśmy, aby przymocować przewody do krawędzi stołu i skręć je ze sobą. Następnie przymocuj elektrodę do czarnej płytki.
  6. Wykonaj małe nacięcie w teflonie i użyj mikro kleszczyków #5, aby zdjąć powłokę teflonową o długości 4-5 mm z końcówek elektrod. Odetnij końcówki skalpelem, aby uzyskać równą długość i utwórz haczyki, zaginając końce wokół krawędzi ostrza skalpela.
  7. Przyklej elektrodę tak, aby koniec wystawał lekko poza krawędź czarnej płytki z haczykami skierowanymi do góry. Mieszaj klej silikonowy na plastikowej płytce przez 10 s i owiń bąbelek kleju wokół elektrody w odległości 1-2 mm od haczyka.
  8. Pozostaw do wyschnięcia na około 5 minut przed użyciem (Rysunek 1). Zdejmij teflon z dłuższej części na drugim końcu, aby umożliwić połączenie ze stymulatorem.
    nuta: Dzięki ponownemu wykonaniu haczyków na dystalnym końcu, elektroda może być wielokrotnie używana.

2. Przygotowanie zwierzęcia

  1. Po znieczuleniu zwierzęcia ogol dolną połowę brzucha, szyję i krocze. Wyszoruj zwierzę 70% alkoholem, a następnie trzykrotnie jodowidonem. Umieść szczura na podgrzewanej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Nałóż maść do oczu weterynarza i zmień znieczulenie na stożek nosowy z 2,5% izofluranem i 0,8 l/min tlenu jako nośnikiem.
    nuta: Dostosuj poziom izofluranu i tlenu, aby osiągnąć akceptowalny poziom znieczulenia.

3. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Całą procedurę chirurgiczną należy wykonać pod mikroskopem operacyjnym: wystarczy powiększenie od 3,15X do 20X. Używaj rękawiczek i utrzymuj czyste środowisko przez cały czas trwania zabiegu. Umieść szczura na zasłonie.

4. Rozwarstwienie mięśnia kulszowo-jamistego do pomiaru ICP

  1. Użyj skalpela, prostych nożyczek i zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7, aby wykonać 1 cm pionowe nacięcie skóry 5 mm w bok od linii środkowej, zaczynając od poziomu podstawy penisa i rozciągając się w dół (Rysunek 2A). Użyj patyczka higienicznego i ostrożnie oddziel powięź boczną od moszny (Rysunek 2B). Po wypreparowaniu powięzi przymocuj retraktory i zbadaj palpacyjnie za pomocą bawełnianej końcówki, aby znaleźć guzowatość kulszową (Rysunek 2C).
  2. Przeprowadź sekcję przez tkankę tłuszczową przyśrodkową tego punktu, aż do uwidocznienia mięśnia kulszowo-jamistego (Rysunek 3A). Użyj pary zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7 i podłużnie oddziel mięsień. Tunica albuginea pojawi się jako jasna biała struktura (Ryc. 3B). Używając mikro kleszczyków i mikro nożyczek, odpowiednio nałóż osłonkę białawą, aby zobaczyć jej przebieg (Rysunek 3C).
  3. Po kalibracji ustawień systemu, wprowadź rurkę przez skórę na kroczu, upewniając się, że biegnie równolegle do podudzia prącia (Rysunek 4). Pozostaw linię na miejscu i utrzymuj nacięcie wilgotne solą fizjologiczną.

5. Sekcja CN do stymulacji

  1. Wykonaj o 2 cm niższe, pośrodkowe nacięcie brzucha przez skórę, używając najpierw skalpela, a następnie prostych nożyczek i mikrokleszczyków. Wykonaj pasujące nacięcie przez powięź wzdłuż kresy białej i leżącej pod nią tkanki mięśniowej, aby odsłonić pęcherz moczowy i prostatę.
  2. Użyj zwijaczy, aby uzyskać dobrą ekspozycję. Użyj wacików z bawełnianą końcówką, aby oddzielić prostatę od tkanki tłuszczowej, aby uzyskać wyraźną wizualizację głównego zwoju miednicy (MPG) i CN, biegnących po grzbietowo-bocznej stronie prostaty (Ryc. 5).
  3. Po wizualizacji MPG i CN, ostrożnie naciąć powięź leżącą nad nerwem 2-5 mm dystalnie do MPG za pomocą kątowych mikronożyczek (Rysunek 6a). Za pomocą mikro kleszczyków #5 rozprowadź tkankę po obu stronach nerwu i pod nim, aby uwolnić 4-milimetrową część (Rysunek 6b) i wsuń szew 9-0 pod nerw (Rysunek 6c).
  4. Lekko podnieś nerw za pomocą szwu ( Rysunek 7a), aby ułatwić umieszczenie haczyków elektrody bipolarnej wokół nerwu (Rysunek 7b). Pozwól asystentowi wymieszać dwuskładnikowy klej silikonowy z końcówką igły insulinowej przez 5 sekund. Osusz nerw i nałóż klej na obszar wokół haczyków i nerwu (Rysunek 7c, d). Utrzymuj nerw uniesiony, lekko pociągając za elektrodę przez około 1 minutę, aby klej wyschł.
  5. Wyjmij zwijacze, z wyjątkiem zwijaczy po prawej stronie, aby uniknąć ciągnięcia lub skręcania elektrody. Zwilż odsłonięte narządy solą fizjologiczną i połóż gazę nasączoną solą fizjologiczną na nacięciu.

6. Kaniulacja ciał jamistych do pomiaru ICP

  1. Przywróć wizualizację tunica albuginea za pomocą retraktorów. Upewnij się, że nie przyczepiasz retraktorów do mięśnia kulszowo-jamistego, ponieważ spowoduje to zniekształcenie podudzia.
  2. Przymocuj igłę i przepłucz rurkę heparynizowaną solą fizjologiczną przed wprowadzeniem jej do osłonki białawej. Utrzymuj osłonkę białawą rozciągniętą, używając zakrzywionych mikrokleszczyków Dumont #7 w jednej ręce (niedominujących), przytrzymując osłonkę białawą i resztę leżącego nad nią mięśnia dystalnego do punktu przyczepu. Trzymaj igłę prostymi mikrokleszkami w drugiej dominującej ręce i upewnij się, że wprowadzasz ją równolegle do przebiegu ciała jamistego (Ryc. 8).
  3. Wbić igłę 5-8 mm w ciało jamiste. Przepłucz rurkę i naciśnij crus, aby przetestować linię (Rysunek 9). Upewnij się, że nie ma wycieków. Przymocuj rurkę do stołu za pomocą taśmy, aby zapobiec przypadkowemu pociągnięciu za żyłkę. Zdemontować zwijacze.

7. Stymulacja CN

  1. Przy uruchomionym programie rejestrującym (np. Spike 2) należy w sposób ciągły rejestrować zarówno ciśnienie wewnątrzjamiste, jak i średnie ciśnienie tętnicze.
  2. Ustaw następujące parametry na stymulatorze (np. SD9 Grass Instruments, patrz Tabela Materiałów) do stymulacji CN: prąd przy 1,5 mA, częstotliwość przy 16 Hz, napięcie przy 3 V i szerokość impulsu przy 5 ms. Zastosuj 50 s stymulacji z minimum 1 minutą odpoczynku między stymulacjami.
    nuta: Pierwsze stymulacje zwykle skutkują zmniejszoną reakcją (Rysunek 10).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie tego protokołu z zalecanymi ustawieniami stymulacji, w znieczuleniu wziewnym izofluranem 2,0% tlenu 0,8 L/min, powinno przynieść wyniki jak pokazano na Rysunek 11 i Rysunek12, gdzie występuje wiele stymulacji od tyłu do tyłu między 75-80 mm Hg. Rysunek 13 wykazuje taką samą stabilną odpowiedź przez 20-minutową stymulację, przy czym odpowiedź jest stabilna na poziomie 73-77 mm Hg. Przetestuj linię do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem pracy było opisanie uproszczonej techniki chirurgicznej kaniulacji podudzia prącia w celu rejestracji ICP i izolacji CN do elektrostymulacji. Wprowadziliśmy modyfikacje w rozwarstwianiu ciał jamistych, aby uprościć operację i zapewnić powtarzalne zapisy wzrostu ICP przy stymulacji CN. Dzięki pionowemu nacięciu skóry o długości 1 cm, bocznemu do podstawy prącia, wykorzystując wyczuwalną guzowatość kulszową jako wskazówkę, uzyskaliśmy dobrą ekspozycję mięśnia kulszowo-jamistego i osłonki białawej. Zabieg ten ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kleszcze AdsonFine Science Tool11006-12
Dumont #7 KleszczeFine Science Tool11271-30
Kleszcze Dumont #5Fine Science Tool11273-20
Nożyczki Mayo ToughCutFine Science Tool14110-15
Miniaturowe Vannas Nożyczki sprężynoweFine Science Tool15006-09
Ultra Fine HemostatFine Science Tool13020-12
Crile HemostatFine Science Tool13004-14
Kwik-Sil AdhesiveWorld Precyzyjne instrumentyKWIK-SIL
Drut srebrny pokryty teflonem 0,125 mmWorld Precision InstrumentsAGT0510
Elastyczne zwijacze drutuWykonane
na zamówienieOstrze skalpelaFine Science Tool10023-00
Rurka PE-50Warner Instruments64-0753
23 G IgłaKruuse121272
SD-9 Kwadratowy stymulator impulsówSomatco1077/183
Przetwornik ciśnienia krwi iWorld Precision InstrumentsBLPR2
Raucotupf Aplikatory z bawełnianą końcówkąLohmann-Raucher11966
Pro-ophta Pałeczki do oczuLohmann-Raucher16515
NaCl 0,9 % 100 mlApteka
HeparynaApteka lokalna 25
ml StrzykawkaSzpital
Maść do oczu weterynarza - Viscotears Lokalna apteka
druty srebrne Science Products GmbH, Heidelberg, Niemcy
Klej silikonowy Kwik-Sil, World Precision Instruments, Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone
lokalnaUniwersytecki Odense

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eckhard, C. Untersuchungen über die Erektion des Hundes In: Beiträge zur Anatomie und Physiologie. , Vol. Band III Giessen: Ferber 123-166 (1863).
  2. Quinlan, D. M., Nelson, R. J., Partin, A. W., Mostwin, J. L., Walsh, P. C. The rat as a model for the study of penile erection. J Urol. 141 (3), 656-661 (1989).
  3. Heaton, J. P., Varrin, S. J., Morales, A. The characterization of a bio-assay of erectile function in a rat model. J Urol. 145 (5), 1099-1102 (1991).
  4. Martinez-Pineiro, L., et al. Rat model for the study of penile erection: pharmacologic and electrical-stimulation parameters. Eur Urol. 25 (1), 62-70 (1994).
  5. Hayashi, N., et al. The effect of FK1706 on erectile function following bilateral cavernous nerve crush injury in a rat model. J Urol. 176 (2), 824-829 (2006).
  6. Burnett, A. L., Becker, R. E. Immunophilin ligands promote penile neurogenesis and erection recovery after cavernous nerve injury. J Urol. 171 (1), 495-500 (2004).
  7. Yamashita, S., et al. Nerve injury-related erectile dysfunction following nerve-sparing radical prostatectomy: a novel experimental dissection model. Int J Urol. 16 (11), 905-911 (2009).
  8. Burnett, A. L., et al. GGF2 is neuroprotective in a rat model of cavernous nerve injury-induced erectile dysfunction. J Sex Med. 12 (4), 897-905 (2015).
  9. Lin, H., et al. Nanoparticle Improved Stem Cell Therapy for Erectile Dysfunction in a Rat Model of Cavernous Nerve Injury. J Urol. 195 (3), 788-795 (2016).
  10. Kapoor, M. S., Khan, S. A., Gupta, S. K., Choudhary, R., Bodakhe, S. H. Animal models of erectile dysfunction. J Pharmacol Toxicol Methods. 76, 43-54 (2015).
  11. Mehta, N., Sikka, S., Rajasekaran, M. Rat as an animal model for male erectile function evaluation in sexual medicine research. J Sex Med. 5 (6), 1278-1283 (2008).
  12. Cellek, S., Bivalacqua, T. J., Burnett, A. L., Chitaley, K., Lin, C. S. Common pitfalls in some of the experimental studies in erectile function and dysfunction: a consensus article. J Sex Med. 9 (11), 2770-2784 (2012).
  13. Chung, E., De Young, L., Brock, G. B. Investigative models in erectile dysfunction: a state-of-the-art review of current animal models. J Sex Med. 8 (12), 3291-3305 (2011).
  14. Mullerad, M., Donohue, J. F., Li, P. S., Scardino, P. T., Mulhall, J. P. Functional sequelae of cavernous nerve injury in the rat: is there model dependency. J Sex Med. 3 (1), 77-83 (2006).
  15. Albersen, M., et al. Injections of adipose tissue-derived stem cells and stem cell lysate improve recovery of erectile function in a rat model of cavernous nerve injury. J Sex Med. 7 (10), 3331-3340 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja ci nienia wewn trzpie ciowegokanulacja zst puj ca pr ciaizolacja nerw w obwodowychumieszczanie elektrod bipolarnychaplikacja kleju silikonowegoszczurzy model dysfunkcji erekcyjnejpowtarzalno procedury chirurgicznejefekty natlenienia podczas znieczuleniama oinwazyjna dyssekcja

Powiązane artykuły