Artykuł metodologiczny

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56859

⸱

29 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology and Experimental Medicine, University of Florida, 2Heller School for Social Policy and Management, Brandeis University, 3Department of Medicine, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, University of Florida, 5Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do obrazowania sekcji ludzkiej trzustki w trzech wymiarach (3D) przy użyciu zoptymalizowanych metod pasywnego oczyszczania. Niniejszy manuskrypt demonstruje te procedury pasywnego oczyszczania optycznego, a następnie wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego w celu zidentyfikowania kluczowych elementów autonomicznych i czuciowych sieci neuronowych unerwiających ludzkie wyspy trzustkowe.

Streszczenie

Korzystając z tradycyjnych metod histologicznych, badacze mają utrudnioną zdolność do obrazowania całych tkanek lub organów w 3D na dużą skalę. Przekroje histologiczne są zazwyczaj ograniczone do <20 μm jako przekrój parafinowy z formaliną na szkiełkach podstawowych lub <500 μm dla swobodnie pływających stałych odcinków. W związku z tym konieczne są znaczne wysiłki w zakresie seryjnego cięcia i metod rekonstrukcji obrazu na dużą skalę, aby odtworzyć 3D dla próbek >500 μm przy użyciu tradycyjnych metod. Ponadto rozproszenie światła od makrocząsteczek w tkankach, w szczególności lipidów, uniemożliwia obrazowanie do głębokości >150 μm za pomocą większości mikroskopów konfokalnych. Aby zmniejszyć rozproszenie światła i umożliwić głębokie obrazowanie tkanek za pomocą prostej mikroskopii konfokalnej, opracowano różne metody usuwania optycznego, które są odpowiednie dla próbek tkanek gryzoni i ludzkich utrwalonych przez zanurzenie. Kilka metod jest powiązanych i wykorzystuje sieciowanie białek za pomocą akrylamidu i oczyszczanie tkanek za pomocą dodecylosiarczanu sodu (SDS). Inne techniki oczyszczania optycznego wykorzystywały różne rozpuszczalniki, chociaż każda modyfikacja miała różne zalety i wady. W tym miejscu opisano zoptymalizowaną metodę pasywnego oczyszczania optycznego do badań unerwienia ludzkiej trzustki, a w szczególności do badania unerwienia ludzkich wysp trzustkowych.

Wprowadzenie

Do niedawna, trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja dużych tkanek lub całych organów była wykonywana poprzez pracochłonne seryjne cięcie, barwienie i rekonstrukcję obrazu wielu sekcji. Metody te miały kilka wad, w tym poleganie na dużej liczbie seryjnych odcinków, słabą penetrację tkanek przez przeciwciała i rozpraszanie światła, co uniemożliwiało głębokie obrazowanie w tkankach. Aby umożliwić większą penetrację światła i przeciwciał, naukowcy opracowali metody chemiczne do konserwacji antygenów białkowych przy jednoczesnym usunięciu większości lipidów rozpraszających światło. Kilka powiązanych metod to przezroczysty sztywny sztywny obrazowanie tkanki z wymianą lipidów i akrylamidem (CLARITY), technika pasywnej przejrzystości (PACT) i wspomagane perfuzją uwalnianie czynnika in situ (PARS) (recenzja w 1,2,3,4,5,6). Metoda CLARITY opiera się na stabilizacji białek za pomocą formaldehydu, akrylamidu i hydrożelu bis, a następnie usunięciu lipidów za pomocą elektroforezy w roztworze SDS2. Podejście to zostało później zmodyfikowane dla pasywnego czyszczenia i zaawansowanego obrazowania7. Dalsza optymalizacja doprowadziła do wyeliminowania bis i różnych procentów paraformaldehydu w roztworze hydrożelu (1 - 4%) w celu uzyskania optymalnej stabilizacji antygenu z najkrótszym czasem usuwania dla techniki zwanej PACT 8. Wczesne próby opracowania tych technik oczyszczania optycznego obejmowały związki organiczne lub inne, które były trudne do obróbki i wygaszały endogenne białka fluorescencyjne w transgenicznych modelach myszy. Te dodatkowe metody obejmowały metody ScaleS, Untracted Brain/Body Cocktails and Computational analysis (CUBIC), SWITCH i Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs (DISCO), wszystkie z różnymi zaletami i wadami9,10,11,12. Oryginalna metoda CLARITY została opracowana w bogatej w lipidy tkance mózgowej myszy, a metody oczyszczania optycznego miały ograniczone testy w tkankach ludzkich7,8,11,13,14.

Metody optycznego oczyszczania są idealne do śledzenia nerwów na duże odległości, tak jak w nienaruszonym ośrodkowym układzie nerwowym myszy. Trzustka jest dobrze unerwiona zarówno przez autonomiczny, jak i czuciowy układ nerwowy. Przedział endokrynny trzustki, wysepki Langerhansa, stanowią bardzo małą część całego narządu (1 - 2%), a wyspy trzustkowe mają znaną niejednorodność pod względem rozmiarów (50 - 250 μm), proporcji komórek endokrynnych i gęstości, szczególnie w cukrzycy (recenzja w 15,16). Opracowując protokół, przetestowano kilka metod oczyszczania optycznego dla ludzkiej trzustki i stwierdzono, że procedura PACT zapewnia najlepszą równowagę czasu do oczyszczenia (~ 2 tygodnie) z doskonałym zachowaniem morfologicznym nerwów i wysp trzustkowych. Ostateczna zoptymalizowana procedura została opisana w opisie sieci nerwowo-wyspowej dla wielkoskalowego (odległości milimetrowe) i wysokorozdzielczego obrazowania 3D wielu nienaruszonych wysp trzustkowych. Technika ta jest odpowiednia dla ludzkiej trzustki bezpośrednio po utrwaleniu lub po przechowywaniu, a także dla próbek utrwalonych w obojętnej buforowanej formalinie i zatopionych w wosku parafinowym. Próbki nadają się do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej lub światło-arkuszowej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalną Komisją Rewizyjną Uniwersytetu Florydy i wytycznymi federalnymi.

Uwaga: Paraformaldehyd i akryloamid są toksycznymi substancjami drażniącymi. Z odczynnikami należy obchodzić się pod wyciągiem z odpowiednimi środkami ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice, ochrona oczu).

1. Deparafinizacja tkanek utrwalonych formaldehydem (jeśli pracujesz ze świeżymi tkankami, przejdź do kroku 2)

  1. Użyj nowej żyletki lub skalpela, aby przeciąć parafinę prostopadle do powierzchni tkanki. Przetnij parafinę na krawędzi tkanki, aby dokończyć jej rozluźnianie. Za pomocą kleszczy lub szpatułki delikatnie poluzuj i usuń tkankę, która ma zostać optycznie oczyszczona. Delikatnie zeskrob nadmiar parafiny z tkanki za pomocą szpatułki (Rysunek 1A).
  2. Napełnij szklany pojemnik ksylenem (około 30 ml na odcinek tkanki o wymiarach 3 x 3 x 3 mm) i inkubuj tkankę w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Napełnić kolejny szklany pojemnik świeżym ksylenem o tej samej objętości co w ppkt 1.2.1. Przenieść i inkubować tkankę w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Umieścić 100% etanolu w stożkowej probówce o tej samej objętości co w ppkt 1.2.1. Przenieść i inkubować tkankę w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić 95% etanolu w stożkowej probówce o tej samej objętości co 1.2.1. Przenieść i inkubować tkankę w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Umieścić 70% etanolu w stożkowej rurce o tej samej objętości co 1.2.1. Przenieść i inkubować tkankę w tym roztworze przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Opłucz tkankę w 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i umieść w 0,01 M PBS w stożkowej probówce, aby zrównoważyć przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że tkanka jest wolna od parafiny (Rysunek 1B, prawy panel).

2. Przygotuj 4% utrwalacz paraformaldehydu (PFA)

  1. Odpipetować 10 ml 16% PFA do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodać 4 ml 0,1 M PBS i dodać 26 ml destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O). Zamknij nakrętkę i krótko wymieszaj.
  2. Większe ilości 4% PFA można przygotować z wyprzedzeniem i zamrozić w podwielokrotnościach. Podwielokrotności są dobre przez 1 dzień w temperaturze pokojowej (RT), tydzień w temperaturze 4 °C i 1 miesiąc w temperaturze -20 °C.

3. Unieruchomienie trzustki

  1. Utrwalić próbkę trzustki (≤ 1 x 1 x 2 cm) w świeżo przygotowanym 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Jeśli próbka jest większa niż 1 x 1 x 2 cm, użyj skalpela lub żyletki, aby rozciąć na mniejsze kawałki o grubości nie większej niż 1 cm. Przemyć próbkę tkanki w trzech zmianach po 0,01 M PBS przez co najmniej 15 minut przy każdym płukaniu i przechowywać w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w 0,01 % PFA/0,01 M PBS lub 0,5 % azydku sodu/0,01 M PBS do momentu użycia.
  2. Po utrwaleniu pokrój tkankę na odcinki o grubości 1 - 2 mm w celu dalszej obróbki. Użyj wibratomu, aby pomóc w równomiernym cięciu.
    UWAGA: Ostateczna liczba sekcji będzie zależeć od wielkości próbki wyjściowej.

4. Zanurz tkankę w hydrożelu

  1. Przygotować 200 ml roztworu monomeru hydrożelowego 4 % akryloamidu/1 % paraformaldehydu (A4P1) w następujący sposób:
    1. Umieść kolbę na lodzie w wiadrze na górze magnetycznej płytki mieszającej. Upewnij się, że kolba jest płaska i dodaj mieszadło magnetyczne.
    2. Dodaj kolejno: 147,8 ml zimnego (4 - 8 °C) ddH2O, 20 ml 0,1 M PBS, 20 ml zimnego (4 - 8 °C) 40% roztworu akryloamidu, 12,2 ml 16 % roztworu PFA i 250 mg inicjatora VA-044. Wymieszaj cały roztwór hydrożelu z mieszadłem magnetycznym przez co najmniej 10 minut i pozostaw roztwór na lodzie do następnego kroku.
  2. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 15 ml w lodzie obok kolby zawierającej roztwór hydrożelu. Pobrać pipetą 14 ml roztworu monomeru do probówki i dodać jeden kawałek utrwalonej próbki tkanki o grubości 1-2 mm. Następnie zakryj rurkę.
  3. Inkubować próbkę w roztworze monomeru przez 3 dni w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. Pozostałą ilość roztworu monomeru należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

5. Odgazuj roztwór monomeru i spolimeryzuj hydrożel

  1. Usunąć tlen z roztworu monomeru hydrożelowego za pomocą gazowego N28.
    1. Przygotować wiadro z lodem i umieścić próbkę w roztworze monomeru hydrożelowego na lodzie.
    2. Zbierz 2-3 igły podskórne o rozmiarze 18 na próbkę, film parafinowy i timer. Podłącz rurkę do zbiornika azotu, aby azot mógł przepływać. Trzymając próbkę na lodzie, ostrożnie przekłuć z jednej strony nasadkę stożkowej rurki zawierającej próbkę i wcisnąć przez nią jedną igłę podskórną, aż znajdzie się pod powierzchnią ciekłego roztworu monomeru.
    3. Użyj innej igły podskórnej, aby nakłuć przeciwną stronę nasadki, ale nie pozwól, aby została zanurzona.
      UWAGA: Druga igła odpowietrzy rurkę.
    4. Podłącz rurkę ze zbiornika azotu do igły podskórnej zanurzonej pod hydrożelem i powoli włączaj azot, aż zacznie równomiernie bulgotać w płynie.
    5. Pozwól azotowi przepuścić się przez ciecz przez 10 minut.
  2. Po usunięciu tlenu szybko usuń obie igły i przykryj nakrętkę folią parafinową, aby zapobiec dalszej wymianie gazów między rurką a otoczeniem. Odgazowaną próbkę umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 godziny w celu polimeryzacji hydrożelu.

6. Oczyszczanie tkanek

  1. Przygotować 500 ml roztworu klarującego (4% SDS przy pH 8,5). Do ~300 ml ddH2O dodaj 50 ml 0,1 M PBS i 20 g proszku SDS, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować roztwór za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego do pH 8,5. Dodawać ddH2O, aż ostateczna objętość osiągnie 500 ml.
  2. Po polimeryzacji odlej nadmiar hydrożelu i wyrzuć go do pojemnika na odpady chemiczne. Użyj ręcznika papierowego, aby delikatnie zetrzeć hydrożel z próbki i wyrzuć do pojemnika na odpady chemiczne.
  3. Przemyć próbkę w 3 - 5 wymianach po 0,01 M PBS (wyrzucić płyn płuczący do odpadów chemicznych) przez 15 minut na każdym etapie mycia. Przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 40 ml buforu czyszczącego.
  4. Inkubować próbkę w buforze czyszczącym w temperaturze 37 °C i co drugi dzień zmieniać próbkę na świeży bufor klarujący.
    1. Pozostaw próbkę w buforze czyszczącym na 2 - 8 tygodni w zależności od wielkości próbki (~8 tygodni dla próbki o wymiarach 3 mm x 3 mm x 3 mm), aby zapewnić prawidłowe oczyszczenie.
    2. Monitoruj oczyszczanie tkanek i zatrzymaj się po zakończeniu. Upewnij się, że próbka jest odpowiednio przezroczysta, trzymając ją pod światło, aby sprawdzić, czy jest prawidłowo oczyszczona (zwykle w obszarach zewnątrzwydzielniczych pozostaną pewne brązowe zabarwienie).
      UWAGA: Nadmiernie oczyszczona próbka będzie wyglądać na postrzępioną na krawędziach, a tekstura będzie bardzo miękka po podniesieniu kleszczami. Często zdarza się, że próbka oczyszcza się nierównomiernie. Ponadto tkanka nie będzie w pełni przezroczysta, dopóki nie zostanie umieszczona w podłożu montażowym (Insert, Rysunek 1C).

7. Immunofluorescencja mnoga

  1. Próbki należy myć na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min w temperaturze pokojowej przez jeden dzień, często zmieniając 40 ml 0,01 M PBS na świeży bufor (łącznie 4 - 5 zmian buforu, 40 ml przy każdym płukaniu, zmieniając co godzinę aż do ostatniego płukania). Pozwól końcowemu praniu kontynuować przez noc w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować bufor do barwienia PACT. Do 500 ml 0,01 M PBS dodać 50 mg azydku sodu i 0,5 ml TritonX-100. Dobrze wymieszaj.
  3. Inkubować próbkę z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
    1. Dodać 2% normalnej surowicy (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe) do podstawowego buforu barwiącego PACT w probówce o płaskim dnie o pojemności 2 ml (zalecana jest co najmniej 1 ml całkowitej objętości na próbkę/probówkę).
    2. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe do 2 % buforu barwiącego surowicę/PACT. Do barwienia PACT należy użyć około 5 razy większej ilości przeciwciała pierwszorzędowego, niż w przypadku standardowej immunohistochemii (tj. jeśli przeciwciało jest rozcieńczone w stosunku 1:500 do standardowej immunohistochemii, należy użyć 1:100 do barwienia PACT).
    3. Za pomocą szpatułki wyjmij próbkę z buforu do płukania i zetrzyj nadmiar buforu na ręcznik papierowy, a następnie umieść w probówce z pierwszorzędowym roztworem przeciwciał.
  4. Inkubować 2-4 dni w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min. Próbki należy dokładnie umyć w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min w 0,01 M PBS, 4-5 razy zmienić na świeży bufor i pozostawić końcowe płukanie na noc, jak w kroku 7.1.
  5. Inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi.
    1. Dodać 2% normalnej surowicy (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe) do podstawowego buforu barwiącego PACT w probówce o płaskim dnie o pojemności 2 ml (zalecana jest całkowita objętość 1 ml na próbkę/probówkę).
    2. Dodać przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 1:200 (5 μl w 1 ml buforu).
      UWAGA: Preferowane są przeciwciała małoformatowe, a także przeciwciała o silnej adsorpcji krzyżowej, jeśli stosuje się więcej niż jedno przeciwciało pierwszorzędowe.
    3. Za pomocą szpatułki wyjmij próbkę z buforu do płukania i zetrzyj nadmiar buforu na ręcznik papierowy, a następnie umieść w probówce z wtórnym roztworem przeciwciał.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min przez 2 dni i chronić próbkę przed światłem.
  7. Próbki należy dokładnie umyć, jak w kroku 7.1, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min przy 0,01 mln PBS, zmieniając 4-5 razy na świeży bufor i pozostawiając końcowe płukanie włączone na noc, chronić przed światłem podczas mycia.

8. Montaż próbek do obrazowania

  1. Przygotować bufor roztworu dopasowanego do współczynnika załamania światła (RIMS).
    1. Odważyć 11 g pożywki o niejonowym gradiencie gęstości (np. Histodenz) i ostrożnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj ~5 ml 0,02 M buforu fosforanowego (PB)8 za pomocą szpatułki, aby uwolnić powietrze z proszku o niejonowym gradiencie gęstości.
      UWAGA: Roztwór będzie bardzo lepki, dobrze wymieszaj.
    3. Doprowadzić objętość do 10 ml za pomocą większej ilości PB, wymieszać szpatułką i zeskrobać nadmiar szpatułki do probówki.
    4. Inkubować RIMS w temperaturze 37 °C aż do rozpuszczenia, odwrócić i delikatnie wymieszać w razie potrzeby.
  2. Przenieś próbki do RIMS. W tym celu należy odpipetować 1 ml RAID do probówki o płaskim dnie o pojemności 2 ml. Za pomocą szpatułki wyjmij próbkę z bufora do płukania i zetrzyj nadmiar buforu na ręcznik papierowy, a następnie umieść w probówce z roztworem RIMS.
    1. Delikatnie postukaj w rurkę, aby zanurzyć próbkę w RIMS. Umieścić próbki w RIMS na stole chronionym przed światłem w temperaturze pokojowej przez 2 - 4 dni przed obrazowaniem.
  3. Aby wykonać obraz, umieść niewielką ilość obręczy w 8-dołkowym szkiełku nakrywkowym z dolną komorą. Dodaj tylko tyle, aby pokryć dno, więcej spowoduje, że próbka będzie unosić się na wodzie, co utrudni obrazowanie na odwróconej lunecie. Dodaj próbkę do studzienki i zakryj szkiełko do obrazowania.

9. Obrazowanie

  1. Oprogramowanie do mikroskopii konfokalnej i obrazowania
    1. Dobierz odpowiednie lasery do widm wzbudzenia i emisji fluoroforów używanych do barwienia próbek PACT. Dostosuj ustawienia oprogramowania do akwizycji tak, aby wyeliminować nakładanie się kanałów. W razie potrzeby należy użyć oddzielnych ścieżek (gdy dwa fluorofory mają podobne widma wzbudzenia).
    2. Konfigurowanie pobierania obrazów
      1. Wybierz maksymalną szybkość akwizycji, 16 bitów, 4 lub więcej średnich i rozdzielczość 1024 x 1024 lub lepszą.
      2. Powiększ obiekt, który ma zostać sfotografowany.
        UWAGA: Skróci to czas akwizycji, aby zmniejszyć wybielanie zdjęć, a także zmniejszy rozmiar pliku i edycję podrzędną.
    3. Skonfiguruj stos z.
      1. Wybierz optymalny podział na sekcje dla używanego celu. Jeśli dekonwolucja jest pożądana później, użyj kroku z mniejszego niż optymalny, takiego jak 1 μm.
      2. Użyj korekcji z-stack.
        1. Zacznij najbliżej powierzchni tkanki i zwiększaj wzmocnienie, gdy obiektyw skupia się na płaszczyźnie z i dodaj poprawki. Nie zmieniaj ustawień lasera do korekcji!
        2. Uzyskaj stos testowy z jedną średnią rozdzielczością 512 x 512 i maksymalną szybkością akwizycji. Sprawdź obraz w 3D, aby upewnić się, że jasność każdego koloru jest równa w całym stosie przed uzyskaniem końcowego stosu z o wysokiej rozdzielczości.
  2. Obrazowanie w arkuszu Lightsheet
    1. Upewnij się, że próbki były zrównoważone w RIMS do obrazowania przez co najmniej 24 godziny. Najlepiej przenieść próbki do świeżego RIMS w komorze obrazowania i pozostawić do zrównoważenia w komorze przez co najmniej jeden dzień.
    2. Zamontuj próbkę do obrazowania
      1. Wybierz najmniejszą (czarną) kapilę do zamontowania próbki
      2. Użyj szpachli lub naczynia, aby przytrzymać próbkę, nakładając super klej na koniec kapilary. Przyklej tkankę do naczynia włosowatego, dotykając jak najmniej powierzchni tkanki.
      3. Wstawić próbkę do obrazowania.
    3. Obraz przy użyciu obiektywów 5X lub 25X odpowiednich do optycznie oczyszczonych próbek przy użyciu opcji skanowania obrotowego. Jeśli wystąpi cienie lub rozmycie, obróć próbkę i spróbuj ponownie lub pozwól, aby próbka nadal się równoważyła w RIMS.
      UWAGA: Stos 1 mm można zazwyczaj uzyskać w mniej niż pięć minut, w zależności od ustawień.
    4. Przeglądaj i edytuj stosy obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazów.

Wyniki

Niniejsze procedury barwienia opracowano w celu przeprowadzenia szeroko zakrojonych badań trzustki ludzkiej pod kątem analizy wysepek oraz powiązanych z nimi sieci autonomicznych i sensorycznych. Przetestowano kilka procedur, w tym CLARITY7, iDISCO17 oraz PACT8, przy czym stwierdzono, że metoda PACT jest najlepiej dostosowana do badania trzustki ludzkiej i obrazowania konfokalnego.

Przeciwciała pierwszorzędowe przetestowano początkowo na utrwalonych próbkach ludzkiej trzustki wraz z odpowiednimi próbkami kontrolnymi dodatnimi i ujemnymi (mózg myszy, inne). Przeciwciała pierwszorzędowe oraz sugerowane rozcieńczenia wymieniono w Tabeli materiałów, przy czym każde laboratorium może spodziewać się konieczności optymalizacji rozcieńczeń przeciwciał w zależności od numeru partii i źródła tkanki. Zmienność między partiami przeciwciał pierwszorzędowych może wpływać na intensywność barwienia oraz swoistość i wymagać walidacji w celu uzyskania takiego samego stopnia intensywności barwienia, jak w przypadku wcześniejszych odczynników.

W ludzkiej trzustce wysepki zostały wyznaczone za pomocą insuliny, glukagonu i sekretograniny 3 (Rysunek 2). Komórki Schwanna wyznaczono przy użyciu glialej białka włóknistego kwasowego (GFAP, Rysunek 2 oraz Rysunek 3A). Nerwy barwione przeciwciałami przeciwko markerowi przywspółczulnemu – peptydowi jelitowo-aktywnemu naczyniowo (VIP) – obrazowano za pomocą mikroskopu Lightsheet (Rysunek 3B). Nerwy współczulne można zaobserwować dzięki barwieniu na tyrozynową hydroksylazę (nie pokazano).

Proces deparafinizacji, usuwanie parafiny z próbek tkanki, przygotowanie szkiełek, wyniki mikroskopowe.
Rysunek 1. Przejaśnianie optyczne ludzkiej trzustki. (A) Żyletka służy do nacięcia i poluzowania fragmentu tkanki zatopionej w parafinie (panele górne) przed usunięciem fragmentu tkanki i zeskrobaniem nadmiaru parafiny z tkanki (panele dolne). Reprezentatywne próbki tkanki przedstawiono przed (B lewo, C góra) oraz po (B prawo, C środek) przejaśnianiu optycznym tkanki zatopionej w parafinie, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Przejaśniona, utrwalona tkanka nie jest całkowicie przezroczysta bezpośrednio po przejaśnianiu (B prawo, C góra), a często można zaobserwować obrzęk tkanki (C, panel środkowy). Przejaśniona tkanka staje się w pełni przezroczysta po równoważeniu w RIMS (C, panel dolny). Paski skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące struktury komórkowe; obrazowanie 3D i analiza markerów białkowych.
Rycina 2. Ludzka sieć neuro-wyspowa. Próbki ludzkiej trzustki zostały poddane procesowi utrudniania (clearing) zgodnie z opisem, pobrano je od dawców organów nPOD lub z archiwalnych tkanek zatopionych w parafinie. (A-D) Przedstawiono komórki Schwanna (GFAP+, białe) oraz komórki endokrynne zabarwione na insulinę (czerwony) i glukagon (zielony). (A) Mikroskopia konfokalna i projekcja maksymalnej intensywności (MIP) pokazują przebieg komórek Schwanna (GFAP+) w nerwach biegnących obok naczyń krwionośnych na obrzeżach wysp i wnikających do ich wnętrza. Wstawka obrazuje uzyskaną wysoką rozdzielczość i pokazuje kontakt między komórkami Schwanna GFAP+ a komórkami endokrynnymi. (B) Obraz 3D panelu (skala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. Próbka paraffin-PACT obrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej, przedstawiona jako projekcja maksymalnej intensywności (C) oraz w 3D (D), skala: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Paski skali A, C: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia 3D: Rekonstrukcja neuronów, dendryt (D), zgrubienie (G); schemat mapowania przestrzennego.
Rycina 3. Wizualizacja 3D i zszywanie obrazów. Pozyskano trzy zszyte stosy obrazów komórek Schwanna barwionych przy użyciu GFAP i mikroskopii konfokalnej, a następnie wykreślono je przy użyciu wtyczki do śledzenia neurytów w oprogramowaniu do analizy obrazu. (A) Przedstawiono wypełnienie 3D śladu (Paski skali: x = 150 µm, y = 200 µm (0,2 mm), z = 120 µm) (B) Próbkę PACT zabarwiono przeciwciałami VIP i obrazowano przy użyciu mikroskopu arkuszowego (lightsheet). Stos ma głębokość >1 mm, a włókna nerwowe są wyraźnie widoczne w wysokiej rozdzielczości. Widoczne są włókna oplatające przewód (D, pierwszy plan) oraz zwoj (G, tło) (Duża siatka: x, y, z = 200 µm; znaczniki: x, y, z = 40 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Dostępność nowych metod oczyszczania optycznego pozwoliła na bezprecedensowe badania na dużą skalę ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego na modelach zwierzęcych. Ogólne wzorce unerwienia ludzkiej trzustki są w dużej mierze niezbadane ze względu na gęstość tkanek i trudności w pozyskiwaniu wysokiej jakości próbek biologicznych. Protokół ten oferuje zoptymalizowany protokół oczyszczania tkanek ludzkiej trzustki z próbek archiwalnych utrwalonych lub zatopionych w parafinie.

Czas czyszczenia zależy od wielkości próbki, rodzaju utrwalacza, czasu trwania, czasu przechowywania i może wymagać od 1 do 8 tygodni, dlatego kluczowe znaczenie mają następujące kwestie. Jeśli to możliwe, najlepiej jest usunąć tkanki wkrótce po utrwaleniu 4% PFA, ponieważ długotrwałe przechowywanie wydłuża czas oczyszczania. Aby zminimalizować czas klarowania, ilość PFA w monomerze hydrożelu została zmniejszona z 4% w przypadku utrwalania do 1% w przypadku ludzkiej trzustki. W przypadku innych tkanek, zwłaszcza tkanek myszy, ilość PFA niezbędna do zapewnienia wystarczającej sztywności hydrożelu w celu zachowania antygenów musi być określona empirycznie. Niezbędne jest również odpowiednie oczyszczanie, ponieważ penetracja przeciwciał jest zmniejszona w słabo oczyszczonych tkankach, a barwienie powierzchni przez przeciwciała wtórne jest zwiększone. Wymiana roztworu czyszczącego co drugi dzień (lub nawet codziennie) jest najlepsza, aby utrzymać stałe pH i świeżość detergentu. I odwrotnie, nadmierne oczyszczanie negatywnie wpływa na morfologię komórek i zwiększa kruchość tkanek. Ponieważ niektóre próbki trzustki oczyszczają się nierównomiernie z powodu nieodłącznych patologii, takich jak obszary zwłóknienia spowodowane przewlekłym zapaleniem trzustki lub innymi patologiami, ważne jest, aby często monitorować ten proces. Użycie grubych odcinków wibratomu może być również używane do wykonywania jednolitych grubości, ale nie jest to wymagane. Monitorowanie procesu oczyszczania, w którym próbki są usuwane z detergentu, gdy tylko światło łatwo przechodzi przez próbkę, zapewnia, że próbka jest wystarczająco oczyszczona.

Penetracja przeciwciał i barwienie powierzchni są ważnymi kwestiami, które należy wziąć pod uwagę w przypadku próbek PACT. Aby zapewnić dobrą penetrację przeciwciał, ważne jest, aby inkubować próbki z przeciwciałami pierwotnymi przez co najmniej 2 dni. Różne przeciwciała mają różne szybkości dyfuzji i powinny być optymalizowane indywidualnie, ale w przypadku większości przeciwciał 4 dni były wystarczającym czasem do pełnej penetracji w próbce o wielkości 1 mm3 . Jeśli problemem jest barwienie powierzchni, szczególnie w przypadku obrazowania Lightsheet, próbka może zostać przecięta na pół lub powierzchnia może zostać wycięta po barwieniu. Oczekuje się, że przeciwciała małoformatowe, jeśli są dostępne, pomogą w penetracji tkanek8. Wydaje się, że przeciwciała wstępnie sprzężone nie działają tak dobrze, jak ten sam niesprzężony klon i wyższe tło wynikające z niespecyficznego wiązania i gorszej penetracji tkanki, jeśli w ogóle działają. Aby uzyskać lepsze wyniki z przeciwciałami wstępnie sprzężonymi, należy zwiększyć stężenie TritonX-100 w surowicy i buforze barwiącym i stosować dłuższe inkubacje (>4 dni). Po barwieniu krytyczne znaczenie ma inkubacja próbki w RIMS przez kilka dni. Oczyszczone tkanki pęcznieją w inkubacji PBS i RIMS powodują ich kurczenie się z powrotem do pierwotnego rozmiaru. Szczególnie w przypadku obrazowania lightsheet próbka powinna być w pełni zrównoważona przed obrazowaniem.

Podczas obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym korekcję należy ustawiać za każdym razem, gdy wybierana jest nowa pozycja. Różne głębokości pobierania i różnice w intensywności barwienia w tkance wymagają dostosowania dla każdego obszaru tkanki, który ma być optymalnie zobrazowany. Podobnie, należy dokładnie rozważyć stosowane przeciwciała drugorzędowe. Mieszanie spektralne jest trudne w próbkach PACT, dlatego fluorofory muszą być odpowiednio dobrane pod kątem niskiego wzbudzenia lub nakładania się emisji, aby zapewnić jasny sygnał podczas filtrowania emisji pod mikroskopem konfokalnym. W przypadku każdego zastosowania należy zachować równowagę między rozdzielczością, szybkością obrazowania i redukcją szumów, aby można było uzyskać najlepszą jakość obrazu bez wybielania fotograficznego. Rozdzielczość większa niż 1024 x 1024 nie jest wykrywalna przez ludzkie oko, ale może być niezbędna w niektórych zastosowaniach, jeśli wymagane jest ilościowe określenie plamy.

Jest wiele rzeczy, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze techniki czyszczenia optycznego oraz przy wyborze czyszczenia optycznego zamiast innych, bardziej tradycyjnych metod. Antygeny o niskiej liczebności mogą nie być wykrywalne przy użyciu metody PACT, dlatego istnieją ograniczenia w wykrywaniu antygenów. Niektóre antygeny, takie jak antygeny immunologiczne (CD3, CD4, CD8 itp.) są niszczone metodą PACT i są niewykrywalne pomimo dostępności wysokiej jakości przeciwciał do ich wykrywania. Innym ograniczeniem tej metody jest nieodłączna zmienność między trzustkami dawcy, która jest trudna do zauważenia aż do usunięcia barwienia. Każda tkanka dawcy ma tendencję do oczyszczania i barwienia w podobny sposób między zabiegami, ale różne tkanki dawcy mają bardzo różne czasy oczyszczania i jakość morfologii tkanki po oczyszczeniu. Możliwość wykorzystania tkanek archiwalnych może złagodzić to ograniczenie, jeśli można mieć odpowiedni dostęp do dużej liczby próbek trzustki pacjenta, chociaż nie zostało to dokładnie zbadane. Protokół PACT opisany w niniejszym dokumencie okazał się niedrogi i łatwy do wdrożenia przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Oczyszczone próbki nadawały się do obrazowania za pomocą tradycyjnej mikroskopii konfokalnej, a także technologii 2-fotonowych i Lightsheet oraz dostarczyły wysokiej rozdzielczości obrazów 3D nerwów i wysp trzustkowych w dużych odcinkach ludzkiej trzustki. Przyszłe zastosowania tej procedury obejmują badania nad rozwojem trzustki płodu zarówno dla przedziałów zewnątrzwydzielniczych, jak i endokrynnych oraz badania wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1 i typu 2.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Ann Fu i Josephowi Canzano za pomoc techniczną, dr Jennifer Treweek za nieocenione rady, a dr Kristin Overton i dr Karlowi Deisserothowi za szkolenie w zakresie MCT podczas warsztatów CLARITY Uniwersytetu Stanforda. JDRF nPOD i Organizacja Pozyskiwania Narządów dostarczyły próbki tkanek. Ta praca została sfinansowana przez JDRF (47-2014-1), Helmsley Charitable Trust (HCT 2015-PG-T1D052) i NIDDK 1OT2 TR001773 MCT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)FisherBP399-1
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnyFisherS375-500PB (RIMS)
Jednowodny fosforan sodu jednowodnySigma71507-250PB Bufor (RIMS)
16% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15714-5Utrwalanie zanurzeniowe, hydrożel, przechowywanie roztwór
40% akryloamidBio-Rad161-0140Hydrożel
2% bis-akryloamidBio-Rad161-0142Hydrożel
VA-044 inicjatorWako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044Hydrożel
Dodecylosiarczan sodu (SDS)FisherBP166-5Bufor czyszczący
Azydek soduSigmaS8032Bufor do przechowywania próbek
18 igieł Fisher14-840-91Odgazowujący roztwór hydrożelu
zbiornik N2AirGasOdgazowujący roztwór hydrożelu
Triton X-100Sigma-Aldrich100 ml
Koza, normalna surowicaWektorS-1000Stosować jako 2% w buforze blokującym
HistodenzSigmaD2158-100GRIMS
Szkiełka 8-dołkoweIbidi80827Obrazowanie
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyObrazowanie Zeiss710Mikroskop
LightSheetObrazowanie ZeissZ1
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało pierwotne
CD45Biossbs-4820R-A488Gospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:100
Uwagi: Nie działało
CD45DAKOM0754Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Nie działało
GFAPDAKOZ0334Gospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Pracował
GlucagonBD Biosciences565891Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Działało
Sygnalizacja komórkowaglukagonu2760SGospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Nie działało
GlucagonAbcamab10988Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Pracował
InsulinaDAKOA0564Gospodarz: Świnka morska
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Pracował
NCAM (CD56)DAKOM730429-2Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Nie zadziałało
koniugat NCAM (CD56)-FITCDAKOM730429-2Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Nie zadziałało
PeripherinEnCorRPCA-PeriGospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:100
Uwagi: Pracował
PGP9.5DAKOZ5116Gospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Nie działało
Secretogranin 3SigmaHPA006880Gospodarz: Rabbit
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Pracował
Aktyna mięśni gładkichSigmaA5228; C6198 (Cy5)Gospodarz: Mouse
Rozcieńczenie: 1:200; 1:200
Uwagi: Pracował; Sprzężony działał lepiej niż niesprzężony
Substancja PBioRad8450-0505Gospodarz: Rat
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Pracował
Hydroksylaza tyrozynyMilliporeAB152Gospodarz: Królik
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Pracował
Hydroksylaza tyrozynyAbcamAb76442Gospodarz: Kurczak
Rozcieńczenie: 1:100
Uwagi: Pracowało, ale słabe barwienie
Wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP)Immunostar20077Gospodarz: Królik
Rozcieńczenie: 1:100
Uwagi: Pracował
pęcherzykowy transporter acetylocholiny (VAChT)Systemy synaptyczne139103Gospodarz: Królik
Rozcieńczenie: 1:50
Uwagi: Przeciwciało robocze
wtórne
Gwinea świnia IgGThermoFisher ScientificRóżneGospodarz: Koza
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: AlexaFluor koniugaty
Mysie IgGThermoFisher ScientificRóżneGospodarz: Koza
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: AlexaFluor koniugaty
IgG królikaThermoFisher ScientificRóżneGospodarz: Koza
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Konsygnaty AlexaFluor
Szczur IgGThermoFisher ScientificRóżneGospodarz: Koza, Osioł
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: AlexaFluor koniugaty
Kurczak IgGThermoFisher ScientificRóżneGospodarz: Koza
Rozcieńczenie: 1:200
Uwagi: Konugaty AlexaFluor
Bufor

Bibliografia

  1. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  4. Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903(2017).
  5. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
  6. Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899(2017).
  7. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  8. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  9. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).
  12. Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  13. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48(2014).
  14. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  15. Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
  16. Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Metoda utrudniania optycznegotkanka trzustki ludzkiejobrazowanie o wysokiej rozdzielczościmikroskopia konfokalnapolimeryzacja hydrożeludopasowanie współczynnika załamania światłaanaliza unerwienia wysepekdetekcja komórek Schwannaobrazowanie włókien nerwowychmikroskopia arkusza światła
Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości sieci neurowyspiowej ludzkiej trzustki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.