Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Markus Götz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56896

⸱

30 stycznia 2018

Markus Götz¹ , Philipp Wortmann¹ , Sonja Schmid¹^,² , Thorsten Hugel¹

¹Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Streszczenie

Transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) stał się powszechnie stosowaną techniką biofizyczną do badania dynamiki biomolekuł. W przypadku wielu maszyn molekularnych w komórce białka muszą działać razem z partnerami interakcji w cyklu funkcjonalnym, aby spełnić swoje zadanie. Rozszerzenie dwukolorowego do wielokolorowego smFRET umożliwia jednoczesne badanie więcej niż jednej interakcji lub zmiany konformacyjnej. To nie tylko nadaje nowy wymiar eksperymentom smFRET, ale także oferuje unikalną możliwość bezpośredniego badania sekwencji zdarzeń i wykrywania skorelowanych interakcji przy użyciu unieruchomionej próbki i mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Dlatego wielokolorowy smFRET jest wszechstronnym narzędziem do badania kompleksów biomolekularnych w sposób ilościowy i w nieosiągalnych wcześniej szczegółach.

Tutaj pokazujemy, jak pokonać specjalne wyzwania związane z wielokolorowymi eksperymentami smFRET na białkach. Przedstawiamy szczegółowe protokoły pozyskiwania danych oraz pozyskiwania informacji kinetycznych. Obejmuje to kryteria wyboru śladów, separację stanów i odzyskiwanie trajektorii stanów z zaszumionych danych przy użyciu zespołowego modelu 3D Hidden Markov Model (HMM). W porównaniu z innymi metodami, informacja kinetyczna nie jest odzyskiwana z histogramów czasu przebywania, ale bezpośrednio z HMM. Ramy maksymalnego prawdopodobieństwa pozwalają nam na krytyczną ocenę modelu kinetycznego i zapewnienie znaczących niepewności dla wskaźników.

Stosując naszą metodę do białka szoku cieplnego 90 (Hsp90), jesteśmy w stanie rozplątać wiązanie nukleotydów i globalne zmiany konformacyjne białka. Pozwala nam to bezpośrednio obserwować kooperatywność między dwiema kieszeniami wiążącymi nukleotydy dimera Hsp90.

Wprowadzenie

Wiele białek spełnia swoją funkcję w dynamicznych kompleksach z innymi cząsteczkami, co jest zapośredniczone przez zmiany konformacyjne i przejściowe asocjacje w szerokim zakresie skal czasowych¹^,²^,³. Powiązane z zewnętrznym źródłem energii (np. ATP), te dynamiczne oddziaływania mogą prowadzić do kierunkowości w cyklu funkcjonalnym i w ostateczności utrzymywać w komórce stan stacjonarny poza równowagą, który jest warunkiem koniecznym dla życia.

Aby w pełni zrozumieć działanie tych maszyn molekularnych, opis statyczny oparty na badaniach strukturalnych jest niewystarczający. Ponadto niezbędna jest znajomość leżącego u podstaw modelu kinetycznego oraz wyznaczenie stałych szybkości kinetycznych. Kilka istniejących metod pozwala badaczom na analizę dynamiki oddziaływań binarnych pomiędzy dwiema wybranymi cząsteczkami, np. rezonans plazmonowy powierzchni, metody relaksacyjne z odczytem spektroskopowym (np. techniki skokowe lub przepływu zatrzymanego), oraz rezonans magnetyczny jądra. Jednakże ich zastosowanie jest w większości przypadków ograniczone do prostych układów dwustanowych (np. (jeden stan związany i jeden niezwiązany) ze względu na uśrednianie właściwe dla eksperymentów w skali makroskopowej. W przypadkach, gdy zaangażowanych jest więcej stanów lub produktów pośrednich, otrzymuje się jedynie złożoną mieszaninę stałych szybkości. Metody pojedynczych cząsteczek, takie jak pęsety optyczne lub magnetyczne bądź dwukolorowy smFRET, t.j. Zastosowanie jednego fluoroforu donora i jednego akceptora przy próbce unieruchomionej na powierzchni pozwala na wyznaczenie stałych szybkości wszystkich obserwowanych zmian konformacyjnych. Jednak w przypadku oddziaływań wpływających na więcej niż jedno miejsce wiązania metody te pozostają ograniczone, a informacje o możliwej korelacji między dwoma (lub większą liczbą) oddziaływaniami będą dostępne jedynie poprzez wnioski pośrednie wyciągnięte z serii eksperymentów.

Wielokolorowy smFRET⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹ daje możliwość bezpośredniego badania oddziaływań między tymi komponentami w czasie rzeczywistym i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych¹⁰. Pozwala to na badanie na przykład wiązania ligandu lub innego białka zależnego od konformacji⁸^,⁹^,¹¹. Ogólne podejście przedstawione w niniejszej pracy polega na znakowaniu badanych białek w określonych pozycjach, przytwierdzeniu jednego białka do powierzchni komory pomiarowej i śledzeniu intensywności fluorescencji w czasie przy użyciu TIRFM typu pryzmatycznego (szczegóły patrz ⁹^,¹²). Bliskość przestrzenną różnych barwników można następnie określić na podstawie transferu energii między nimi. Strategie znakowania mogą się różnić w zależności od białka (przegląd w ¹³), a istnieją wytyczne pozwalające uniknąć artefaktów w pomiarach smFRET¹⁴.

Ponieważ barwnik donora może przekazywać energię do różnych barwników akceptora w wielokolorowym eksperymencie smFRET, względna pozycja wszystkich barwników nie jest dostępna poprzez wzbudzenie tylko jednego barwnika¹⁵^,¹⁶. Jednak w połączeniu z naprzemiennym wzbudzaniem laserowym (ALEX¹⁷, opisane w ¹⁸) metoda ta dostarcza pełnych informacji czasowo-przestrzennych z rozdzielczością poniżej sekundy i nanometra.

W zasadzie wysoką rozdzielczość informacji strukturalnych można uzyskać, wykorzystując odległości między barwnikami obliczone na podstawie kombinacji wszystkich intensywności fluorescencji w wielobarwnym eksperymencie smFRET z zastosowaniem ALEX. W niniejszej pracy skupiamy się jednak na identyfikacji i rozdzielaniu stanów, a także na wywodzeniu modeli kinetycznych, w których wielobarwny smFRET jest niezbędny. W przypadku, gdy pożądanym jest „wyłącznie” wyznaczenie struktury metodą triangulacji, można przeprowadzić zestaw prostszych dwubarwnych eksperymentów smFRET o wysokim stosunku sygnału do szumu¹²^,¹⁹.

Wykorzystujemy częściową fluorescencję ( Wzór na czynnik fotoniczny PF<sup>ex/em</sup>, związany z analizą emisji w spektroskopii. ) jako wskaźnik transferu energii między dwoma fluoroforami⁷. Wartość PF jest obliczana na podstawie intensywności fluorescencji analogicznie do wydajności FRET w eksperymencie dwukolorowym:

Wzór funkcji prawdopodobieństwa, PFa_b=Ia_b/ΣIai, niezbędny dla wykresu analizy danych.

Gdzie równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, schemat wolnego ciała, analiza sił, edukacja fizyczna to natężenie w kanale emisji em po wzbudzeniu kolorem ex, a c to akceptor o najdłuższej długości fali. Kanały detekcji reprezentują tę samą pozycję w komorze z próbką, ale rejestrują różne zakresy widmowe światła fluorescencyjnego. W niniejszym protokole stosuje się te same identyfikatory dla wzbudzenia i emisji (t.j. „niebieski”, „zielony” i „czerwony”).

Z powodu niedociągnięć eksperymentalnych zmierzone intensywności fluorescencji zależą nie tylko od przeniesienia energii, ale także od właściwości fluoroforów i konfiguracji układu. Aby uzyskać rzeczywistą wydajność przeniesienia energii między dwoma fluoroforami, zmierzone intensywności muszą zostać skorygowane. Poniższa procedura opiera się na referencji⁹. Współczynniki korekcyjne dla pozornego wycieku (lk, tj. detekcji fotonów z jednego fluoroforu w kanale przeznaczonym dla innego barwnika) oraz pozornej wartości gamma (ag, tj. wydajności kwantowej fluorescencji barwnika i wydajności detekcji kanału) są wyznaczane z pojedynczych śladów cząsteczkowych wykazujących zdarzenie wybielenia akceptora.

Przeciek barwnika donora do każdego z możliwych kanałów akceptora oblicza się na podstawie wszystkich punktów danych zarejestrowanych śladów fluorescencji, w których barwnik akceptora uległ wybieleniu, a donor nadal wykazuje fluorescencję ( Równanie operatora sztylet w mechanice kwantowej, symbolizowane jako I†, oznaczające operacje sprzężone. ):

Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, analiza równowagi strukturalnej, wzór do badań.

Medianę histogramu wycieku przyjmuje się jako pozorny czynnik wycieku. Po skorygowaniu o wyciek, z tego samego zestawu śladów wyznacza się pozorny czynnik gamma. Oblicza się go poprzez podzielenie zmiany fluorescencji w kanale akceptora przez zmianę fluorescencji w kanale donora po wybieleniu barwnika akceptora:

Równanie stanu równowagi statycznej w formacie symboli, pokazujące ag=a z wyrazami ΔIc i Ia.

Gdzie c ponownie oznacza kanał detekcji akceptora o najdłuższej długości fali. Mediana wynikowego rozkładu jest wykorzystywana jako pozorny współczynnik korekcji.

Skorygowane intensywności w każdym kanale uzyskuje się poprzez:

Równanie równowagi statycznej Σ; wzór matematyczny; zastosowanie edukacyjne; analiza równowagi

Następnie PF oblicza się zgodnie z wzorem:

Równanie równowagi statycznej, Σcy=ΣI corrI a/b, wzór do obliczeń analizy naukowej.

Różne populacje można rozdzielić w wielowymiarowej przestrzeni rozpiętej przez PF. Położenie i szerokość każdego stanu są określane poprzez dopasowanie danych do wielowymiarowych funkcji Gaussa. Następna optymalizacja jednego globalnego modelu HMM w oparciu o wszystkie ślady PF zapewnia ilościowy opis zaobserwowanej kinetyki. Wykrywalne są nawet niewielkie zmiany szybkości reakcji.

Ukryte modele Markowa (HMM) umożliwiają wnioskowanie modelu stanów z zestawu zaszumionych przebiegów czasowych. Przyjmuje się, że w dowolnym momencie system znajduje się w jednym z zestawu dyskretnych, ukrytych stanów, a rzeczywista obserwacja (t.j. emisja) jest funkcją probabilistyczną tego stanu ukrytego²⁰. W przypadku danych TIRFM smFRET prawdopodobieństwa emisji b_i dla stanu i mogą być modelowane za pomocą ciągłych funkcji gęstości prawdopodobieństwa Gaussa. W regularnie rozmieszczonych dyskretnych punktach czasowych mogą następować przejścia z jednego stanu do drugiego zgodnie z prawdopodobieństwem przejścia, które jest niezmienne w czasie i zależy wyłącznie od stanu bieżącego. Macierz przejść A zawiera te prawdopodobieństwa przejść a_ij pomiędzy wszystkimi stanami ukrytymi. Rozkład stanu początkowego Symbol Pi, wzór Σπ=1, niezbędny w rachunku różniczkowym i równaniach matematycznych. określa prawdopodobieństwa specyficzne dla stanu Równowaga statyczna, ΣFx=0, analiza kratownic, diagram, rozkład obciążeń konstrukcyjnych. dla pierwszego punktu czasowego przebiegu. Wykorzystując podejście największej wiarygodności, parametry te można zoptymalizować w celu najlepszego opisania danych za pomocą algorytmów Forward-Backward i Baum-Welcha²⁰^,²¹. Pozwala to uzyskać estymatory największej wiarygodności (MLE). Ostatecznie, sekwencję stanów, która najprawdopodobniej wygenerowała trajektorię obserwacji, można wywnioskować za pomocą algorytmu Viterbi. W przeciwieństwie do innych analiz HMM danych smFRET²⁴^,²⁵^,²⁶ nie używamy HMM jako zwykłego „wygładzania” danych, lecz wyodrębniamy kinetyczny model stanów z zestawu danych bez konieczności dopasowywania histogramów czasu przebywania²⁷. Analiza HMM jest przeprowadzana za pomocą skryptów wewnętrznych w programie Igor Pro. Implementacja kodu opiera się na referencji²¹. Na naszej stronie internetowej udostępniamy zestaw oprogramowania i przykładowe dane, aby umożliwić realizację sekcji 5 i 6 niniejszego protokołu (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Pełne oprogramowanie jest dostępne na żądanie.

Punkty czasowe w danych, dla których PF <-1 lub PF >2 w dowolnym kanale detekcji, otrzymują minimalne prawdopodobieństwo emisji dla wszystkich stanów (10^-200). Zapobiega to sztucznym przejściom w tych punktach danych.

Parametry prawdopodobieństw emisji są uzyskiwane z dopasowania histogramu 3D PF do funkcji Gaussa, zgodnie z opisem w kroku 5.7. Parametry te pozostają stałe podczas optymalizacji HMM.

W przedstawionym podejściu początkowy wektor rozkładu stanów oraz macierz przejść są stosowane globalnie do opisu całego zespołu śladów. Są one aktualizowane na podstawie wszystkich N cząsteczek z zestawu danych zgodnie z referencją²⁷.

Parametry początkowe dla rozkładu stanów początkowych są określane na podstawie projekcji 2D histogramu PF (krok 5.3), a prawdopodobieństwa przejścia ustawia się na 0,05, z wyjątkiem prawdopodobieństw pozostania w tym samym stanie, które dobiera się tak, aby prawdopodobieństwo opuszczenia danego stanu było znormalizowane do jedności.

Do wyznaczenia przedziałów ufności (CIs) dla wszystkich stałych szybkości przejść²¹^,²², które służą jako istotne oszacowania ich niepewności, zastosowano metodę profilowania wiarygodności. Aby obliczyć granice przedziału ufności dla konkretnej stałej, prawdopodobieństwo przejścia, które jest przedmiotem analizy, ustala się na wartość inną niż MLE. W ten sposób otrzymuje się model testowy λ'. Test ilorazu wiarygodności (LR) wiarygodności Równowaga statyczna; Metoda statystyczna L(λ'|O); Równanie symboliczne dla analizy danych. dla zestawu danych 0 przeprowadza się zgodnie z:

Równanie współczynnika wiarygodności, formuła analizy statystycznej, przedstawiona jako LR = 2(ln𝓛(λ)|O) - ln𝓛(λ'|O).

Granicę ufności 95% dla parametru osiąga się, gdy LR przekroczy 3,841, czyli kwantyla 95% rozkładu x² z jednym stopniem swobody²²^,²³.

Skuteczność tej metody zademonstrowano na przykładzie Hsp90. To powszechnie występujące białko znajduje się u bakterii i eukariotów i stanowi część komórkowej odpowiedzi na stres²⁸. Jest ono obiecującym celem terapeutycznym w leczeniu nowotworów²⁹. Hsp90 jest homodimerem z jedną kieszenią wiążącą nukleotyd w domenie N-końcowej każdej podjednostki³⁰. Może ono przechodzić przejścia pomiędzy co najmniej dwiema globalnie odmiennymi konformacjami: zamkniętą oraz otwartą w obrębie N-końca, przyjmującą kształt litery V¹⁹^,³¹^,³². Dimericzna natura białka bezpośrednio nasuwa pytanie o interakcje pomiędzy dwoma miejscami wiążącymi nukleotydy w Hsp90.

Poniżej przedstawiamy szczegółowy protokół pozyskiwania i analizy danych w eksperymencie trójkolorowego smFRET dotyczącym nukleotydów oraz białka Hsp90 z drożdży. Analizie poddano zależne od konformacji wiązanie fluorescencyjnie znakowanego AMP-PNP (AMP-PNP*, niehydrolizowalnego analogu ATP). Zastosowanie opisanego postępowania umożliwia badanie wiązania nukleotydów przy jednoczesnej analizie zmian konformacyjnych Hsp90, co pozwala ujawnić kooperatywność pomiędzy dwiema kieszeniami wiążącymi nukleotydy w białku Hsp90.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja i wymagania wstępne

Przeprowadź wielokolorowe pomiary smFRET przy użyciu TIRFM z pryzmatem. Opis układu dwukolorowego jako publikacji JoVE znajduje się w odniesieniu¹².
1. Zbuduj wielokolorowy układ TIRFM. Ogólny schemat szczegółowo opisano w ⁹.
2. Użyj przełączalnych laserów w funkcji ciągłej typu DPSS (diode pumped solid state), co eliminuje konieczność stosowania mechanicznych migawek w torach wzbudzenia.
3. Zastosuj asymetryczny, wydłużony pryzmat, który zapobiega przedostawaniu się do obiektywu odbić wstecznych wiązki wzbudzenia od tylnej powierzchni.
4. W torach detekcji zastosuj 2-calowe achromatyczne asferyczne soczewki z topionego kwarcu, które zbierają jak najwięcej światła i zapobiegają autofluorescencji oraz aberracjom, np. zniekształceniom w obszarach poza centrum obrazu.
5. Skup każdy tor detekcji na matrycy EMCCD za pomocą oddzielnej soczewki. Pozwala to na optymalne ogniskowanie każdego kanału detekcji.
  Uwaga: W układzie TIRFM używane są lasery klasy 3B. Oznacza to, że są one niebezpieczne w przypadku bezpośredniej ekspozycji oka, natomiast odbicia rozproszone nie są szkodliwe. Przed uruchomieniem systemu należy zapewnić przestrzeganie zasad bezpieczeństwa pracy z laserami zgodnie z lokalnymi przepisami.
Wyznacz wcześniej współczynniki korekcyjne dla właściwości układu i fluoroforów, wykorzystując próbki dsDNA.
1. Użyj jednej próbki dsDNA o wysokim FRET dla każdego barwnika w kombinacji z akceptorem o najdłuższej długości fali wzbudzenia (dla prezentowanego układu: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Upewnij się, że DNA jest dodatkowo zmodyfikowane biotyną.
2. Rozcieńcz próbkę do stężenia 5 nM w buforze TNM (5 mM Tris pH 7.5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl₂) i 2 mM Trolox (używaj tego buforu również do pomiarów).
3. Unieruchom dsDNA zgodnie z opisem dla Hsp90 w krokach 2.5 i 2.7.
4. Oblicz współczynniki korekcyjne dla pozoristego wycieku (lk) i pozornego gamma (ag) na podstawie śladów pojedynczych cząsteczek wykazujących zdarzenie wybielenia akceptora.
Zbuduj komorę przepływową będącą kanapką złożoną z płytki kwarcowej pasywowanej PEG/biotin-PEG, cienkiej folii dwustronnie przylepnej oraz szkiełka nakrywkowe. Szczegółowe protokoły czyszczenia płytek kwarcowych i pasywacji znajdują się w odniesieniu⁹.
1. Użyj grubych (3 mm) płytek kwarcowych, aby geometrycznie zapobiec zbieraniu światła laserowego rozproszonego na granicy kwarc-glicerol-kwarc między pryzmatem a funkcjonalizowaną płytką kwarcową.
2. Użyj cienkiej (40 µm) folii uszczelniającej, która po stronie nieprzylepnej jest spryskana klejem. Cienka folia zmniejsza odległość między cząsteczkami przytwierdzonymi do powierzchni a obiektywem. Podgrzej do 80 °C i dociśnij.
3. Na górze umieść szkiełko nakrywkowe. Podgrzej do 80 °C i dociśnij. Podczas umieszczania komory przepływowej nad pryzmatem użyj kropli glicerolu.
  UWAGA: Materiały pryzmatu i płytek kwarcowych, a także glicerol, są dopasowane pod względem współczynnika załamania światła.
Wyprodukuj białko Hsp90 z Saccharomyces cerevisiae w formie dwóch pojedynczych mutantów punktowych cysteiny w pozycjach D61 lub Q385. Dodaj motyw coiled-coil na C-końcu, aby zapobiec dysocjacji dimerów przy stężeniach pikomolarnych. Oznakuj białka mutanty oddzielnie, a następnie wymień monomery, aby uzyskać heterodimery oznakowane Atto488 w pozycji aminokwasowej 61 i Atto550 w pozycji aminokwasowej 385⁹.

2. Pomiar

Uruchom oprogramowanie kamery i ustaw parametry obrazowania zgodnie z poniższymi wytycznymi:
1. Ustaw temperaturę chłodzenia sensora na jak najniższą (-95 °C przy zewnętrznym chłodzeniu wodnym), aby zmniejszyć szum prądu ciemnego.
2. Użyj ustawień kamery zoptymalizowanych do rejestracji pojedynczych cząsteczek: prędkość przesunięcia pionowego 3.3 µs, normalne napięcie zegara pionowego, 16-bitowy poziomy odczyt 17 MHz, wzmocnienie przedwzmacniacza 3, wzmocnienie mnożnika elektronów 1,000.
3. Ustaw wyzwalanie akwizycji na „External” (zewnętrzne), a czas ekspozycji na 70 ms. Nagrywaj filmy o długości 750 cykli akwizycji.
  UWAGA: Wyłącz oświetlenie pomieszczenia podczas akwizycji obrazu, aby zapobiec nasyceniu sensora EMCCD.
Utwórz folder na lokalnym dysku SSD na dane z pomiaru. W ustawieniach oprogramowania przejdź do zakładki , włącz funkcję i wybierz format pliku „Tiff” dla akwizycji filmów. Wybierz folder na dysku SSD jako lokalizację autozapisu.
Uruchom oprogramowanie sterujące akustyczno-optycznym filtrem przestrajalnym (AOTF), oprogramowanie sterujące pracą laserów oraz oprogramowanie wyzwalające, które synchronizuje lasery, AOTF, migawki w torze detekcji oraz kamery. Dostosuj moc lasera za pomocą AOTF (ok. 3 mW przed wejściem do pryzmatu) i załaduj odpowiedni wzorzec wyzwalania.
Zamontuj uchwyt próbki z pryzmatem i komorą przepływową, podłącz rurki, umieść rurkę wlotową w probówce do mikrocentryfugi i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej. Przepłucz komorę około 150 µL buforu, wyrównaj wiązkę wzbudzenia i ustaw ostrość. Wybiel wszelkie fluorescencyjne zanieczyszczenia na powierzchni, powoli przesuwając się wzdłuż całego zakresu detekcji szkiełka przy mocy lasera około 10 mW dla wszystkich laserów. Trwa to około 1 h.
UWAGA: Jeśli nie zaznaczono inaczej, użyty bufor zawiera 40 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl oraz 10 mM MgCl₂.
Wprowadź do komory około 300 µL roztworu NeutrAvidyny (0.25 mg/mL w buforze) i inkubuj przez 1 min. Wypłucz niezwiązaną NeutrAvidynę buforem, a następnie przepłucz komorę około 300 µL roztworu BSA (0.5 mg/mL w buforze).
UWAGA: Etap ten blokuje pozostałe defekty funkcjonalizacji powierzchni poprzez nieswoistą adsorpcję BSA na powierzchni.
Unieruchom próbkę, wprowadzając do komory przepływowej około 150 µL biotynilowanego i znakowanego Hsp90 w rosnących stężeniach (rozcieńczonego w buforze + 0.5 mg/mL BSA), aż do osiągnięcia wystarczającej gęstości powierzchniowej, co zazwyczaj następuje przy stężeniu 5 - 10 pM. Wypłucz niezwiązane białko około 300 µL buforu + 0.5 mg/mL BSA.
Wprowadź 150 µL 25 nM AMP-PNP* w buforze + 0.5 mg/mL BSA. Inkubuj przez 5 min i powtórz ten krok raz, aby zapewnić prawidłowe stężenie nukleotydów.
UWAGA: W przypadku eksperymentów w obecności dodatkowego, nieznakowanego AMP-PNP, dodaj również 250 µM AMP-PNP.
Rozpocznij akwizycję danych. Aby uzyskać odpowiednią ilość danych, zarejestruj około 20 filmów, co zajmuje około 1.5 h.
1. Zmień pozycję komory z próbką prostopadle do wiązki wzbudzenia za pomocą piezo-skokowego napędu, aby zmienić pole widzenia.
2. W razie potrzeby skoryguj ostrość za pomocą piezo-elementu z, który kontroluje wysokość obiektywu. Nie powinno być to konieczne zbyt często, jeśli komora pomiarowa jest zamontowana bez nachylenia.
3. Przygotuj kamery do rejestracji, naciskając w oprogramowaniu kamery, a następnie uruchom cykle wzbudzenia/akwizycji za pomocą przycisku w oprogramowaniu wyzwalającym. Rozpocznie to akwizycję intensywności fluorescencji.
Wykonaj rejestrację kanałów, nagrywając najpierw film z kuleczkami fluorescencyjnymi, które wykazują emisję fluorescencji w zakresie widmowym wszystkich kanałów detekcyjnych układu. Następnie wykryj pozycje kuleczek w filmie kalibracyjnym, szukając najjaśniejszych punktów, i wyznacz pozycję centralną na podstawie dopasowania gaussowskiego do profilu intensywności. Zapisz współrzędne kuleczek znalezionych we wszystkich kanałach i dopasuj przesunięcie mapowania w kierunku x oraz y za pomocą wielomianu 2D trzeciego stopnia⁹.

3. Wybór śladów pojedynczych cząsteczek

Analiza danych jest wykonywana za pomocą wewnętrznych skryptów w programie Igor Pro. Załaduj wszystkie niezbędne skrypty, otwierając plik „iniTIRF.ipf”, a następnie wybierz odpowiedni typ eksperymentu.
UWAGA: W dalszej części tekstu oznaczenie określa elementy klikalne w menu lub interfejsie użytkownika. Wywołania funkcji są podane w cudzysłowie, np., „Print "Hello World"”. Polecenia te można wkleić do wiersza poleceń programu Igor Pro (bez cudzysłowu).
Upewnij się, że załadowano parametry rejestracji kanału detekcyjnego.
Uruchom GUI, klikając .
Załaduj filmy (tzn. sekwencje klatek o wymiarach 512 x 512 pikseli zapisane jako 16-bitowe stosy TIFF), które zawierają natężenie w poszczególnych kanałach. Zrób to, naciskając przycisk i wybierając kolejno pliki z tzw. kamer „master” oraz „slave”.
Zidentyfikuj pozycje potencjalnych pojedynczych cząsteczek, wyszukując najjaśniejsze punkty w sumie pierwszych pięciu klatek w określonym kanale detekcyjnym. Oblicz odpowiadające im pozycje we wszystkich pozostałych kanałach detekcyjnych na podstawie mapowania kanałów. Aby uzyskać przebieg natężenia fluorescencji, zsumuj natężenie kwadratu pikseli wokół pozycji centralnej dla każdej klatki. Zrób to, naciskając przycisk w GUI.
UWAGA: Długość boku kwadratu (w pikselach) jest określona wzorem: 2 * + 1.
Dla każdej cząsteczki oblicz wspólny surowy przebieg natężenia jako sumę wszystkich przebiegów tego punktu dla tego samego koloru wzbudzenia. Oceń profil natężenia cząsteczki we wszystkich kanałach pod kątem następujących kryteriów:
1. Wstępnie płaski poziom w wspólnym surowym natężeniu i pojedynczy stopień wybielania dla wszystkich kolorów wzbudzenia, antykorelacja zachowania w odpowiednich kanałach detekcyjnych, detekcja fluorescencji czerwonej (wskazująca na FRET do związanego AMP-PNP*) przynajmniej raz w obrębie przebiegu oraz brak wielu stopni w fluorescencji czerwonej, co mogłoby wskazywać na obecność dwóch cząsteczek AMP-PNP* związanych z jednym dimerem Hsp90.
Zapisz przebiegi fluorescencji punktu do dalszej analizy, jeśli kryteria te zostały spełnione. Zrób to, zaznaczając przebieg kursorem, a następnie naciskając przycisk na wykresie „timelines”. Ręcznie sprawdź przebiegi natężenia we wszystkich trzech kanałach detekcyjnych po wzbudzeniu niebieskim dla około 200 cząsteczek na film.

4. Obliczanie cząstkowych śladów fluorescencji

Wyświetl wszystkie ślady intensywności fluorescencji dla jednej z zapisanych cząsteczek. Użyj kursorów na wykresie, aby wybrać zakresy czasowe.
Wybierz przedział czasowy, w którym wszystkie fluorofory zostały już wybielone. Średnia intensywność tła jest obliczana z tego zakresu i odejmowana od śladu intensywności w każdym kanale. Wykonaj tę czynność, naciskając przycisk .
Wybierz zakres wydajności FRET, w którym obecne są co najmniej oba barwniki przyłączone do Hsp90 (Atto488 i Atto550). Należy pamiętać o wykluczeniu śladów zawierających zdarzenie mrugania (patrz Rycina 3B). Zdarzenia te charakteryzują się spadkiem intensywności fluorescencji w jednym kanale bez towarzyszącego temu wzrostu w jakimkolwiek innym kanale.
Oblicz ślady PF. Wykonaj tę czynność, naciskając przycisk . Predefiniowane współczynniki korekcji dla pozornego przecieku (lk) i pozornego gamma (ag) są stosowane do surowej intensywności w celu skorygowania właściwości fotofizycznych oraz parametrów układu.

5. Wybór populacji i dopasowanie histogramu 3D

Usuń cząsteczki wykazujące niski stosunek sygnału do szumu w śladach PF. Z zestawu danych usuwane są cząsteczki, które w dowolnym śladzie PF przekraczają przedział [-1;2] przez więcej niż 10% klatek. Wykonaj tę czynność, uruchamiając polecenie „RemoveTracesLowSNR()” w oknie poleceń (Command Window).
Oblicz binnedowe projekcje 2D danych PF. Wykreśl względem oraz względem w zakresie [-0,5; 1,5] z rozdzielczością 100 x 100 binów. Aby to zrobić, wykonaj:
1. "HistFret2D("r_b", "r_g", binHist=100)"
2. "HistFret2D("r_b", "g_b", binHist=100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25"
Wyznacz względną populację każdego rozróżnialnego stanu w projekcjach 2D.
1. Przenieś odpowiedni wykres na pierwszy plan i wykonaj „panelHist2DCount()”.
2. Naciśnij przycisk i narysuj odręczny wielokąt wokół piku.
3. Kliknij przycisk . Liczba punktów danych w wielokącie oraz całkowita liczba punktów danych w projekcji zostaną wyświetlone w oknie poleceń.
Przygotuj histogram 3D danych PF, wykonując polecenie „HistFret3D("g_b", "r_b", "r_g")”.
Znormalizuj histogram 3D do całki równej 1. Wykonaj następujące operacje:
1. "NewDataFolder/S fit0"
2. "Duplicate/O ::FRET:Hist3D, Hist3D"
3. "Variable /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0))^3"
4. "Hist3D /= div; Print div"
Podaj parametry początkowe dla dopasowania Gaussa 3D i przygotuj niezbędne struktury danych.
1. Wykonaj „Gauss3D_initParam(); edit W_coef_old.”
2. Dodaj populacje stanów na koniec wektora parametrów.
3. Wykonaj „Gauss3D_prepareFit()”.
  Uwaga: W_coef_old jest wektorem zawierającym parametry początkowe dopasowania. Dla każdego stanu oznacza to oraz populację stanu, która jest dołączana na końcu wektora. Upewnij się, że macierz kowariancji jest symetryczna.
Dopasuj sumę S funkcji Gaussa 3D do histogramu PF 3D, gdzie S oznacza liczbę rozróżnialnych stanów.
1. Wykonaj „do3D()”. W zależności od jakości parametrów początkowych proces ten może zająć godzinę lub więcej na standardowym komputerze biurowym.
2. Wykonaj „postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); edit W_coef.”
Wyświetl wynik dopasowania. Dla każdej z dwóch projekcji 2D użyj następujących poleceń:
1. "contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"
2. "contourPF3D_colorize()"

6. Analiza kinetyczna z użyciem 3D Ensemble HMM

Przygotuj uruchomienie zespołowego modelu HMM w celu wyodrębnienia informacji kinetycznych. Jeden model HMM jest optymalizowany na podstawie wszystkich cząsteczek w zestawie danych. Wykorzystaj informacje uzyskane w poprzednim kroku, aby zdefiniować położenie i szerokość każdego stanu w trójwymiarowej przestrzeni PF.
1. Uruchom interfejs użytkownika HMM () i wybierz odpowiednią liczbę stanów (w przypadku danych Hsp90 oznacza to = 5), liczbę wymiarów sygnału wejściowego ( = 3) oraz typ wejścia ( = "FRET 3D bgr").
Zoptymalizuj parametry HMM, pozwalając oprogramowaniu na zbieżność wiarygodności modelu (wykonaj "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)"), aż zmiana w macierzy przejść w porównaniu z poprzednią iteracją spadnie poniżej progu (10^-14 dla sumy bezwzględnych zmian dla każdego prawdopodobieństwa przejścia). Pozwala to uzyskać MLE dla prawdopodobieństw przejść w ciągu około godziny na standardowym komputerze biurowym.
Powtórz selekcję populacji, dopasowanie Gaussa oraz optymalizację HMM dla podzbiorów danych (np. 75% pełnego zestawu danych). Jeśli pełny zestaw danych został połączony z różnych eksperymentów, powtórz optymalizację również dla każdego z pojedynczych eksperymentów. Analiza podzbiorów pozwala oszacować niepewność ręcznej selekcji populacji oraz zmienność wewnątrz zestawu danych.
Oblicz przedział ufności CI dla prawdopodobieństw przejść, co pozwoli określić heterogeniczność zestawu danych i precyzję modelu HMM.
1. Uzyskaj wstępne oszacowanie granic CI, wykonując "cd $(root:path3Dimport + "HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."
2. Oblicz dokładne granice CI, wykonując:
3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
4. "CIresults_conv_new()"
5. "cd ::HMM_CIresult; reportCI_conv()"
6. "cd ::cmp_CI_conv; CI_plot2("HMM", doAppend=0)"
Skondensuj dostępne informacje kinetyczne, aby uprościć interpretację.
1. Zbierz informacje o czasie, przez który znakowany nukleotyd pozostaje związany z Hsp90. Zrób to poprzez połączenie stanów związanych z AMP-PNP* (tzn. S₁, S₂ i S₃, patrz również Rycina 2) i sporządź histogram czasu przebywania. Wykonaj "cd $(root:path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0})", co łączy czasy przebywania w stanach S₀ i S₄ oraz S₁, S₂ i S₃.
2. Wyodrębnij czasy przebywania ze ścieżki Viterbiego dla każdego stanu zainteresowania i porównaj wynikowy histogram czasu przebywania dla różnych warunków eksperymentalnych. Wykonaj "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
3. Aby uzyskać bardziej szczegółowy obraz, połącz stany, które mają różne PF, ale są funkcjonalnie identyczne, co ułatwi dalszą analizę danych; np. w przypadku eksperymentu trójkolorowego ze znakowanym Hsp90 i nukleotydem można połączyć stany S₂ i S₃. Wykonaj "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wielokolorowe pomiary smFRET umożliwiają bezpośrednią detekcję korelacji między dwoma lub więcej odrębnymi miejscami interakcji. Sprawia to, że technika ta jest unikalna w badaniu układów wieloskładnikowych, takich jak kompleksy białkowe. Skupiamy się tutaj na prezentacji trzykolorowego eksperymentu smFRET, który służy jako przykład ilustrujący.

Ogólny schemat postępowania w tej metodzie przedstawiono na Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET dla złożonego układu białkowego oraz opis krok po kroku analizy tych pomiarów. Takie podejście oferuje unikalną możliwość bezpośredniej oceny korelacji między wieloma miejscami interakcji lub zmianami konformacyjnymi.

W celu uzyskania odpowiednich, wielokolorowych, jednocząsteczkowych danych o białkach, ważne jest wykonywanie powtarzalnych pomiarów przy niskim poziomie szumów. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest finansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (INST 39/969-1) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych na podstawie umowy o grant ERC nr 681891.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Konfiguracja
nbsp;	Newport, Irvine, Kalifornia, Stany Zjednoczone	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
laserowa jednostka sterująca	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
soczewki teleskopu asferycznego	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25,4mm, f=50mm i f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	ZET 473/10	wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	ZET 532/10	wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	ZET 594/10	wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	wzbudzenie filtra czyszczącego
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	ZQ594RDC	wzbudzenie zwierciadła dichroicznego
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	570DCXR	dichroiczne wzbudzenie zwierciadlane
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	ZQ491RDC	wzbudzenie zwierciadła dichroicznego
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, Francja
λ/4 płyta	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA
pozycjoner piezoelektryczny obiektywu high-NA MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Niemcy		Piezoelektryczny kontroler NV 40/1 CLE
piezoelektryczny krokowy	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ Zestaw siłowników
achromatyczne soczewki asferyczne	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Gö ttingen, Niemcy	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
regulowana szczelina optyczna	Owis GmbH, Staufen i. Br., Niemcy	27.160.1212	max. apertura 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	T 600 LPXR	detekcja lustra dichroicznego
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	H 560 LPXR superpłaskie	detekcja zwierciadła dichroicznego
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	HC BS R635	detekcja lustra dichroicznego
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	525/40 BrightLine HC	detekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	586/20 BrightLine HC	detekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	631/36 BrightLine HC	detekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy	700/75 ET Bandpass	Filtr pasmowo-przepustowy detekcja
żaluzji optycznych	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Irlandia
cyfrowa karta I/O, PCIe-6535	National Instruments, Austin, Teksas, USA
strzykawkowa	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
Nazwa	>Company	Numer katalogowy	Uwagi
>Flow chamber
quartz slides	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
Folia TEGADERM	3M Deutschland GmbH, Neuss, Niemcy	1626W	10 x 12cm
klej w sprayu	3M Deutschland GmbH, Neuss, Niemcy	Uchwyt fotograficzny 050777
glicerol	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy	Olejek immersyjny Immersol G
	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Niemcy	Pryzmat IMMOIL-F30CC
	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Niemcy		Aluminiowy
		pryzmatyczny	na zamówienie
puste	dociskoweThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		z niestandardowym wierceniem
Tygon S3 E-3603 rurka	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy	2-4450 ACF00001
Rurka PTFE	Bohlender GmbH, Grü nsfeld, Niemcy	S1810-08
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Próbka
drożdże Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Pochodne maleimidu Atto488, Atto550	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Niemcy
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Niemcy		γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	modyfikowany aminami, 0,2 μ m, żółto-zielony fluorescencyjny
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Irlandia		wersja 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Teksas, USA		wersja 2012, 32bit; różne sterowanie sprzętowe
Oprogramowanie sterujące MDS	AA Opto-Electronic, Orsay, Francja		wersja 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		wersja 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		wersja 6.37

tłumiony drganiami&Północnapompauchwyt Suprasil1 Północna

Bibliografia

Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192(2014).
Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782(2017).
Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024(2012).
Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trzykolorowy smFRET ukryty model Markowa mikroskopia TIRF dimer Hsp90 wiązanie nukleotydów zmiany konformacyjne trajektorie stanów analiza kinetyczna przebiegi fluorescencji

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek