Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

DOI:

10.3791/56896

⸱

30 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Physical Chemistry, University of Freiburg, 2Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) stał się powszechnie stosowaną techniką biofizyczną do badania dynamiki biomolekuł. W przypadku wielu maszyn molekularnych w komórce białka muszą działać razem z partnerami interakcji w cyklu funkcjonalnym, aby spełnić swoje zadanie. Rozszerzenie dwukolorowego do wielokolorowego smFRET umożliwia jednoczesne badanie więcej niż jednej interakcji lub zmiany konformacyjnej. To nie tylko nadaje nowy wymiar eksperymentom smFRET, ale także oferuje unikalną możliwość bezpośredniego badania sekwencji zdarzeń i wykrywania skorelowanych interakcji przy użyciu unieruchomionej próbki i mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM). Dlatego wielokolorowy smFRET jest wszechstronnym narzędziem do badania kompleksów biomolekularnych w sposób ilościowy i w nieosiągalnych wcześniej szczegółach.

Tutaj pokazujemy, jak pokonać specjalne wyzwania związane z wielokolorowymi eksperymentami smFRET na białkach. Przedstawiamy szczegółowe protokoły pozyskiwania danych oraz pozyskiwania informacji kinetycznych. Obejmuje to kryteria wyboru śladów, separację stanów i odzyskiwanie trajektorii stanów z zaszumionych danych przy użyciu zespołowego modelu 3D Hidden Markov Model (HMM). W porównaniu z innymi metodami, informacja kinetyczna nie jest odzyskiwana z histogramów czasu przebywania, ale bezpośrednio z HMM. Ramy maksymalnego prawdopodobieństwa pozwalają nam na krytyczną ocenę modelu kinetycznego i zapewnienie znaczących niepewności dla wskaźników.

Stosując naszą metodę do białka szoku cieplnego 90 (Hsp90), jesteśmy w stanie rozplątać wiązanie nukleotydów i globalne zmiany konformacyjne białka. Pozwala nam to bezpośrednio obserwować kooperatywność między dwiema kieszeniami wiążącymi nukleotydy dimera Hsp90.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele białek spełnia swoją funkcję w dynamicznych kompleksach z innymi cząsteczkami, w których pośredniczą zmiany konformacyjne i przejściowe asocjacje w szerokim zakresie skal czasowych1,2,3. W połączeniu z zewnętrznym źródłem energii (np. ATP) te dynamiczne interakcje mogą prowadzić do kierunkowości w cyklu funkcjonalnym i ostatecznie utrzymać nierównowagowy stan ustalony w komórce, co jest warunkiem wstępnym życia.

Aby w pełni zrozumieć te molekularne maszyny, statyczny opis oparty na badaniach strukturalnych nie jest wystarczający. Ponadto niezbędna jest wiedza na temat leżącego u podstaw modelu kinetycznego i określenie stałych szybkości kinetycznej. Kilka istniejących metod pozwala naukowcom badać dynamikę oddziaływań binarnych między dwiema interesującymi cząsteczkami, np. powierzchniowy rezonans plazmonowy, metody relaksacji z odczytem spektroskopowym (np. techniki skoku lub zatrzymanego przepływu) oraz magnetyczny rezonans jądrowy. Jednak ich zastosowanie jest w większości przypadków ograniczone do prostych systemów dwustanowych (np. jeden stan związany i jeden stan niezwiązany) ze względu na uśrednianie nieodłącznie związane z eksperymentami masowymi. W przypadkach, gdy zaangażowanych jest więcej stanów lub produktów pośrednich, dają one tylko złożoną mieszaninę stałych szybkości. Metody jednocząsteczkowe, takie jak pęseta optyczna lub magnetyczna lub dwukolorowy smFRET, tj. jeden fluorofor donorowy i jeden akceptorowy, z próbką unieruchomioną powierzchniowo mogą przywrócić stałe szybkości dla wszystkich obserwowanych zmian konformacyjnych. Jednakże, jeśli chodzi o interakcje wpływające na więcej niż jedno miejsce wiązania, metody te pozostają ograniczone, a informacje na temat możliwej korelacji dwóch (lub więcej) interakcji będą dostępne tylko poprzez pośrednie wnioski z zestawu eksperymentów.

Wielokolorowy smFRET4,5,6,7,8,9 oferuje możliwość badania interakcji między tymi komponentami bezpośrednio, w czasie rzeczywistym i w warunkach zbliżonych do fizjologicznych10. Pozwala to na zbadanie na przykład zależnego od konformacji wiązania liganda lub innego białka8,9,11. Ogólne podejście przedstawione tutaj polega na oznaczaniu interesującego białka (białek) w określonych pozycjach, dołączeniu jednego białka do powierzchni komory pomiarowej i śledzeniu intensywności fluorescencji w czasie na pryzmatycznym TIRFM (szczegóły patrz 9,12). Przestrzenną bliskość różnych barwników można następnie określić na podstawie transferu energii między nimi. Strategie znakowania mogą się różnić w zależności od białka (omówione w 13) i istnieją wytyczne dotyczące unikania artefaktów w pomiarach smFRET14.

Ponieważ barwnik donorowy może przekazywać energię do różnych barwników akceptorowych w wielokolorowym eksperymencie smFRET, względna pozycja wszystkich barwników nie jest dostępna na podstawie wzbudzenia tylko jednego barwnika15,16. Ale w połączeniu z naprzemiennym wzbudzeniem laserowym (ALEX17 i omówionym w 18) metoda ta dostarcza wszystkich informacji czasoprzestrzennych w rozdzielczości subsekundowej i subnanometrowej.

Zasadniczo, informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości można uzyskać, korzystając z odległości między barwnikami obliczonymi z kombinacji wszystkich intensywności fluorescencji w wielokolorowym eksperymencie smFRET z ALEX. Tutaj jednak skupiamy się na identyfikacji i separacji stanów oraz ekstrakcji modeli kinetycznych, gdzie wielokolorowy smFRET jest niezbędny. Gdy pożądane jest "tylko" określenie struktury za pomocą triangulacji, można przeprowadzić zestaw prostszych dwukolorowych eksperymentów smFRET o wysokim stosunku sygnału do szumu12,19.

Używamy częściowej fluorescencji (figure-introduction-1) jako wskaźnika zastępczego dla transferu energii między dwoma fluoroforami7. PF oblicza się na podstawie intensywności fluorescencji analogicznej do wydajności FRET w eksperymencie dwukolorowym:

figure-introduction-2

Gdzie, figure-introduction-3 to natężenie w kanale emisyjnym em po wzbudzeniu kolorem ex, a c to akceptor o najdłuższej długości fali. Kanały detekcyjne reprezentują to samo położenie w komorze próbki, ale rejestrują różne zakresy widmowe światła fluorescencyjnego. W tym protokole używany jest ten sam identyfikator wzbudzenia i emisji (tj. "niebieski", "zielony" i "czerwony").

Z powodu niedociągnięć eksperymentalnych, zmierzone intensywności fluorescencji zależą nie tylko od transferu energii, ale także od właściwości fluoroforu i ustawienia. Aby uzyskać rzeczywistą wydajność transferu energii między dwoma fluoroforami, zmierzone intensywności muszą zostać skorygowane. Poniższa procedura jest oparta na reference9. Współczynniki korekcyjne dla pozornego wycieku (lk, tj. detekcja fotonów z fluoroforu w kanale przeznaczonym dla innego barwnika) i pozornego gamma (ag, tj. wydajność kwantowa fluorescencji barwnika i skuteczność wykrywania kanału) uzyskuje się ze śladów pojedynczej cząsteczki, które wykazują zdarzenie bielenia akceptora.

Wyciek barwnika dawcy do każdego możliwego kanału akceptora jest obliczany na podstawie wszystkich punktów danych w zarejestrowanych śladach fluorescencji, w których barwnik akceptorowy wybielił, ale dawca nadal jest fluorescencyjny (figure-introduction-4):

figure-introduction-5

Mediana histogramu wycieku jest używana jako współczynnik pozornego wycieku. Po korekcie o nieszczelność pozorny współczynnik gamma jest wyznaczany z tego samego zestawu ścieżek. Oblicza się go, dzieląc zmianę fluorescencji w kanale akceptorowym przez zmianę fluorescencji w kanale donorowym po bieleniu barwnika akceptorowego:

figure-introduction-6

Gdzie c ponownie jest kanałem detekcji dla akceptora o najdłuższej długości fali. Mediana wynikowego rozkładu jest używana jako pozorny współczynnik korygujący.

Poprawione intensywności w każdym kanale są uzyskiwane przez:

figure-introduction-7

PF jest następnie obliczany według:

figure-introduction-8

Różne populacje mogą być oddzielone w wielowymiarowej przestrzeni rozpiętej przez PFs. Położenie i szerokość każdego stanu jest określana przez dopasowanie danych do wielowymiarowych funkcji Gaussa. Późniejsza optymalizacja jednego globalnego HMM w oparciu o wszystkie ślady PF zapewnia ilościowy opis obserwowanej kinetyki. Nawet niewielkie zmiany stawek są wykrywalne.

HMM umożliwiają wnioskowanie o modelu stanu na podstawie zbioru zaszumionych śladów czasu. Uważa się, że system znajduje się w jednym ze zbiorów dyskretnych, ukrytych stanów w danym momencie, a rzeczywista obserwacja (tj. emisja) jest funkcją probabilistyczną tego stanu ukrytego20. W przypadku danych TIRFM smFRET prawdopodobieństwa emisji bi na stan i mogą być modelowane za pomocą ciągłych gaussowskich funkcji gęstości prawdopodobieństwa. W regularnie rozmieszczonych dyskretnych punktach czasowych przejścia z jednego stanu do drugiego mogą zachodzić zgodnie z prawdopodobieństwem przejścia, które jest niezmienne w czasie i zależy tylko od bieżącego stanu. Macierz przejścia A zawiera te prawdopodobieństwa przejścia aij między wszystkimi ukrytymi stanami. Początkowy rozkład stanu figure-introduction-9 podaje prawdopodobieństwa specyficzne dla stanu figure-introduction-10 dla pierwszego punktu czasowego śladu czasowego. Korzystając z podejścia maksymalnego prawdopodobieństwa, parametry te można zoptymalizować, aby jak najlepiej opisywać dane za pomocą algorytmów Forward-Backward i Bauma-Welcha20,21. W ten sposób uzyskuje się estymatory maksymalnego prawdopodobieństwa (MLE). Wreszcie, sekwencję stanów, która najprawdopodobniej wytworzyła trajektorię obserwacji, można wywnioskować za pomocą algorytmu Viterbiego. W przeciwieństwie do innych analiz HMM smFRET data24,25,26 nie używamy HMM jako zwykłego "wygładzenia" danych, ale wyodrębniamy model stanu kinetycznego ze zbioru danych bez konieczności dopasowywania histogramów czasu przebywania27. Analiza HMM odbywa się za pomocą własnych skryptów przy użyciu Igor Pro. Implementacja kodu opiera się na reference21. Na naszej stronie internetowej udostępniamy zestaw oprogramowania i przykładowe dane w celu przestrzegania sekcji 5 i 6 niniejszego protokołu (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Pełne oprogramowanie jest dostępne na życzenie.

Punkty czasowe w danych z PF <-1 lub PF >2 w dowolnym kanale detekcji mają przypisane minimalne prawdopodobieństwo emisji dla wszystkich stanów (10-200). Zapobiega to sztucznym przejściom w tych punktach danych.

Parametry prawdopodobieństwa emisji są uzyskiwane z dopasowania histogramu PF 3D do funkcji Gaussa, jak opisano w kroku 5.7. Parametry te są utrzymywane na stałym poziomie podczas optymalizacji HMM.

W przedstawionym podejściu, wektor rozkładu stanu początkowego i macierz przejścia są używane globalnie do opisania całego zestawu śladów. Są one aktualizowane na podstawie wszystkich cząsteczek N ze zbioru danych zgodnie z reference27.

Parametry początkowe dla początkowego rozkładu stanu są określane na podstawie rzutów 2D histogramu PF (krok 5.3), a prawdopodobieństwa przejścia są ustawiane na 0,05, z wyjątkiem prawdopodobieństwa pozostania w tym samym stanie, które są wybierane tak, że prawdopodobieństwo opuszczenia określonego stanu jest znormalizowane do jedności.

Metoda profilowania prawdopodobieństwa służy do wyznaczania przedziałów ufności (CI) dla wszystkich wskaźników przejścia21,22, które służą jako miarodajne oszacowania ich niepewności. Aby obliczyć granice CI dla określonej stopy, prawdopodobieństwo przejścia odsetek ustala się na wartość inną niż MLE. W ten sposób uzyskuje się model testowy λ'. Test ilorazu prawdopodobieństwa (LR) prawdopodobieństwa figure-introduction-11 przy zbiorze danych 0 przeprowadza się zgodnie z:

figure-introduction-12

95% pewność graniczna dla parametru jest osiągana, gdy LR przekracza 3,841, 95% kwantyl rozkładu x2 o jednym stopniu swobody22,23.

Moc metody jest demonstrowana za pomocą Hsp90. To obfite białko występuje u bakterii i eukariontów i jest częścią komórkowej odpowiedzi na stres28. Jest to obiecujący cel leku w leczeniu raka29. Hsp90 jest homodimerem z jedną kieszenią wiążącą nukleotyd w domenie N-końcowej każdej podjednostki30. Może przechodzić przejścia między co najmniej dwiema globalnie odrębnymi konformacjami, jedną zamkniętą i jedną N-końcową otwartą, konformacją w kształcie litery V19,31,32. Dimeryczna natura bezpośrednio rodzi pytanie o wzajemne oddziaływanie między dwoma miejscami wiązania nukleotydów w Hsp90.

Poniżej przedstawiamy krok po kroku protokół pozyskiwania i analizy danych z trójkolorowego eksperymentu smFRET na drożdżach Hsp90 i nukleotydach. Analizowane jest zależne od konformacji wiązanie znakowanego fluorescencyjnie AMP-PNP (AMP-PNP*, niehydrolizowanego analogu ATP). Zastosowanie opisanej procedury pozwala na badanie wiązania nukleotydów i jednocześnie zmian konformacyjnych Hsp90, a tym samym ujawnia kooperatywność między dwiema kieszeniami wiążącymi nukleotydy Hsp90.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja i wymagania wstępne

  1. Wykonaj wielokolorowe pomiary smFRET na pryzmatycznym TIRFM. Opis dwukolorowej konfiguracji jako publikacji JoVE znajduje się w reference12.
    1. Zbuduj wielokolorowy TIRFM. Ogólny układ jest szczegółowo opisany w 9.
    2. Stosować przełączalne, pompowane diodami lasery półprzewodnikowe o fali ciągłej, które sprawiają, że stosowanie mechanicznych przesłon w ścieżkach wzbudzenia nie jest konieczne.
    3. Zastosuj asymetryczny, wydłużony pryzmat, który zapobiega tylnemu odbiciu wiązki wzbudzenia z tylnej strony przed wejściem do obiektywu.
    4. Używaj 2-calowych achromatycznych asferycznych soczewek ze stopionej krzemionki w ścieżkach wykrywania, które zbierają jak najwięcej światła i zapobiegają autofluorescencji i aberracjom, np. zniekształceniom w niecentrycznych obszarach obrazu.
    5. Skoncentruj każdą ścieżkę wykrywania na chipie EMCCD za pomocą oddzielnej soczewki. Pozwala to na optymalne skupienie każdego kanału detekcji.
      ostrożność: W TIRFM stosowane są lasery klasy 3B. Oznacza to, że są niebezpieczne, jeśli oko jest wystawione bezpośrednio, ale rozproszone odbicia nie są szkodliwe. Przed uruchomieniem systemu należy upewnić się, że należy przestrzegać środków ostrożności dotyczących lasera zgodnie z lokalnymi przepisami rządowymi.
  2. Określ wcześniej współczynniki korygujące dla konfiguracji i właściwości fluoroforu za pomocą próbek dsDNA.
    1. Dla każdego barwnika należy użyć jednej próbki dsDNA o wysokiej FRET w połączeniu z akceptorem o najdłuższej długości fali wzbudzenia (dla prezentowanej konfiguracji: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Upewnij się, że DNA jest dodatkowo zmodyfikowane biotyną.
    2. Rozcieńczyć próbkę do 5 nM buforem TNM (5 mM Tris pH 7,5, 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2) i 2 mM Trolox (użyć tego buforu również do pomiaru).
    3. Unieruchomić dsDNA zgodnie z opisem dla Hsp90 w krokach 2.5 i 2.7.
    4. Obliczyć współczynniki korygujące dla pozornego wycieku (lk) i pozornego promieniowania gamma (ag) ze śladów pojedynczych cząsteczek, które wykazują zdarzenie bielenia akceptora.
  3. Zbuduj komorę przepływową, która jest kanapką ze szkiełka kwarcowego pasywowanego PEG/biotyną-PEG, cienką folią, która jest klejona po obu stronach i szkiełkiem nakrywkowym. Szczegółowe protokoły czyszczenia zjeżdżalni kwarcowych i pasywacji znajdują się w reference9.
    1. Użyj grubych (3 mm) szkiełek kwarcowych, aby geometrycznie zapobiec gromadzeniu się światła laserowego rozproszonego na granicy faz kwarcowo-glicerolowo-kwarcowej między pryzmatem a funkcjonalizowanym szkiełkiem kwarcowym.
    2. Użyj cienkiej (40 μm) folii uszczelniającej, która jest spryskana klejem po stronie nieprzylepnej. Cienka warstwa zmniejsza odległość między cząsteczkami przyczepionymi do powierzchni a obiektywem. Podgrzej do 80 °C i naciśnij dalej.
    3. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze. Podgrzej do 80 °C i naciśnij dalej. Użyj kropli glicerolu podczas umieszczania komory przepływowej nad pryzmatem.
      UWAGA: Materiały, z których wykonane są pryzmat i szkiełka kwarcowe, a także glicerol są dopasowane pod względem indeksu.
  4. Ekspresja Hsp90 z Saccharomyces cerevisiae w postaci dwóch pojedynczych mutantów punktu cysteinowego w pozycjach D61 lub Q385. Dodaj motyw cewki spiralnej na końcu C, aby zapobiec dysocjacji dimerów przy stężeniach pikomolarnych. Oznacz zmutowane białka oddzielnie i wymień monomery, aby otrzymać heterodimery znakowane Atto488 w pozycji aminokwasowej 61 i Atto550 w pozycji aminokwasowej 3859.

2. Pomiar

  1. Uruchom oprogramowanie aparatu i ustaw parametry obrazowania zgodnie z poniższymi instrukcjami:
    1. Ustaw temperaturę chłodzenia czujnika tak niską, jak to możliwe (-95 °C przy zewnętrznym chłodzeniu wodą), aby zmniejszyć szum ciemnego prądu.
    2. Użyj ustawień kamery, które są zoptymalizowane pod kątem nagrywania pojedynczych cząsteczek: prędkość przesunięcia w pionie 3,3 μs, normalne napięcie zegara w pionie, 17 MHz 16-bitowy odczyt poziomy, wzmocnienie przed wzmocnieniem 3, wzmocnienie mnożnika elektronów 1,000.
    3. Ustaw wyzwalanie akwizycji na "Zewnętrzne", a czas ekspozycji na 70 ms. Nagrywaj filmy o długości 750 cykli akwizycji.
      UWAGA: Wyłącz światło w pomieszczeniu, gdy kamera nabiera, aby zapobiec nasyceniu czujnika EMCCD.
  2. Utwórz folder na lokalnym dysku SSD do pomiaru. W ustawieniach oprogramowania przejdź do rider, włącz i wybierz format pliku "Tiff" do pobierania filmu. Wybierz folder na dysku SSD jako lokalizację automatycznego zapisywania.
  3. Uruchom oprogramowanie sterujące przestrajalnym filtrem akustyczno-optycznym (AOTF), oprogramowanie sterujące działaniem laserów i oprogramowanie wyzwalające, które synchronizuje lasery, AOTF, migawki na ścieżce wykrywania i kamery. Dostosuj moc lasera za pomocą AOTF (ok. 3 mW przed wejściem do pryzmatu) i załaduj prawidłowy wzór wyzwalania.
  4. Zamontuj uchwyt próbki z pryzmatem i komorą przepływową, podłącz rurkę, umieść rurkę wlotową w kubku mikrowirówki i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej. Przepłukać komorę buforem o pojemności około 150 μl, wyrównać wiązkę wzbudzenia i ustawić ostrość. Wybielać wszelkie zanieczyszczenia fluorescencyjne na powierzchni, powoli przesuwając się po pełnym zakresie wykrywania szkiełka z mocą lasera około 10 mW dla wszystkich laserów. Trwa to około 1 godz.
    UWAGA: Jeśli nie zaznaczono inaczej, zastosowany bufor zawiera 40 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl i 10 mM MgCl2.
  5. Przepłukać około 300 μl roztworu neutrawidyny (0,25 mg/ml w buforze) do komory i inkubować przez 1 minutę. Wypłukać niezwiązaną neutrawidynę buforem i przepłukać około 300 μl roztworu BSA (0,5 mg/ml w buforze) przez komorę.
    UWAGA: Ten blok powoduje defekty funkcjonalizacji pozostałej powierzchni przez niespecyficzną adsorpcję BSA do powierzchni.
  6. Unieruchomić próbkę, ładując komorę przepływową około 150 μl biotynylowanego i znakowanego Hsp90 w rosnących stężeniach (rozcieńczony w buforze + 0,5 mg/ml BSA) aż do osiągnięcia wystarczającej gęstości powierzchniowej, co zwykle ma miejsce przy stężeniu 5 - 10 pM. Wypłukać niezwiązane białko około 300 μl buforu + 0,5 mg/ml BSA.
  7. Przepłukać 150 μl 25 nM AMP-PNP* w buforze + 0,5 mg/ml BSA. Pozostaw do inkubacji przez 5 minut i powtórz ten krok raz, aby zapewnić prawidłowe stężenie nukleotydów.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów w obecności dodatkowych, nieznakowanych AMP-PNP, należy również dodać 250 μM AMP-PNP.
  8. Rozpocznij od pozyskania danych. Dla odpowiedniej ilości danych należy pobrać około 20 filmów, co zajmuje około 1,5 godziny.
    1. Przesunąć położenie komory próbki prostopadle do belki wzbudzenia za pomocą krokowca piezoelektrycznego, aby zmienić pole widzenia.
    2. W razie potrzeby wyreguluj ostrość za pomocą z-piezoelektrycznego, który kontroluje wysokość obiektywu. Nie powinno to być konieczne zbyt często, gdy komora pomiarowa jest montowana bez nachylenia.
    3. Przygotuj nagranie z kamer, naciskając w oprogramowaniu kamery i rozpocznij cykle wzbudzenia/akwizycji za pomocą przycisku w oprogramowaniu wyzwalającym. W ten sposób rozpoczyna się nabywanie intensywności fluorescencji.
  9. Wykonaj rejestrację kanału, nagrywając najpierw film z koralikami fluorescencyjnymi, które pokazują emisję fluorescencji w zakresie widmowym wszystkich kanałów detekcyjnych konfiguracji. Następnie wykryj pozycje ściegu na filmie kalibracyjnym, wyszukując najjaśniejsze punkty i określ pozycję środkową od dopasowania Gaussa do profilu intensywności. Zapisz współrzędne ściegów, które znajdują się we wszystkich kanałach i dopasuj zarówno przesunięcie odwzorowania w kierunku x, jak i w kierunku y, za pomocą wielomianu 2D stopnia trzeciego9.

3. Wybór śladów pojedynczych cząsteczek

  1. Analiza danych odbywa się za pomocą wewnętrznych skryptów za pomocą Igor Pro. Załaduj wszystkie niezbędne skrypty, otwierając plik "iniTIRF.ipf" i wybierz odpowiedni typ eksperymentu.
    UWAGA: W poniższym określa elementy, które można kliknąć, w menu lub interfejsie użytkownika. Wywołania funkcji są oznaczone w cudzysłowie, np. 'Drukuj 'Hello World'". Polecenia te można wkleić do wiersza poleceń Igor Pro (bez otaczających cudzysłowów).
  2. Upewnij się, że załadowane są parametry rejestracji kanału detekcji.
  3. Uruchom GUI, klikając .
  4. Załaduj filmy (tj. sekwencję klatek o wymiarach 512 x 512 pikseli zapisanych jako 16-bitowe stosy TIFF), które utrzymują intensywność w odpowiednich kanałach. W tym celu należy wcisnąć przycisk i wybrać pliki z tzw. kamer "master" i "slave" jeden po drugim.
  5. Zidentyfikuj pozycje potencjalnych pojedynczych cząsteczek, szukając najjaśniejszych punktów w sumie pierwszych pięciu ramek w określonym kanale detekcji. Oblicz odpowiednie pozycje we wszystkich innych kanałach detekcji na podstawie mapowania kanałów. Aby uzyskać ślad intensywności fluorescencji, zsumuj intensywność kwadratu piksela wokół środkowej pozycji dla każdej klatki. Zrób to, naciskając przycisk w GUI.
    UWAGA: Długość boku kwadratu (w pikselach) jest określona wzorem: 2 * + 1.
  6. Dla każdej cząsteczki oblicz wspólny ślad surowej intensywności jako sumę wszystkich śladów tego miejsca o tym samym kolorze wzbudzenia. Oceń profil intensywności cząsteczki we wszystkich kanałach dla następujących kryteriów:
    1. Mniej więcej płaski plateau w intensywności surowej stawy i pojedynczy etap wybielania dla wszystkich kolorów wzbudzenia, antyskorelowane zachowanie w odpowiednich kanałach detekcji, wykrywanie czerwonej fluorescencji (wskazującej FRET na związany AMP-PNP*) co najmniej raz w obrębie śladu i brak wielu etapów czerwonej fluorescencji, co wskazywałoby na obecność dwóch AMP-PNP* związanych z jednym dimerem Hsp90.
  7. Zachowaj ślady fluorescencji plamki do dalszej analizy, jeśli te kryteria są spełnione. Zrób to, zaznaczając ślad kursorem, a następnie naciskając przycisk na wykresie "osie czasu". Ręcznie sprawdź ślady intensywności we wszystkich trzech kanałach detekcji po wzbudzeniu niebieskim dla około 200 cząsteczek na film.

4. Obliczanie częściowych śladów fluorescencji

  1. Wyświetl wszystkie ślady intensywności fluorescencji dla jednej z zapisanych cząsteczek. Użyj kursorów na wykresie, aby wybrać zakresy czasu.
  2. Wybierz przedział czasu, w którym wszystkie fluorofory są już wybielone. Na podstawie tego zakresu oblicza się średnią intensywność tła i odejmuje od śladu intensywności w każdym kanale. Zrób to, naciskając przycisk .
  3. Wybierz zakres wydajności FRET, w którym obecne są co najmniej oba barwniki przyłączone do Hsp90 (Atto488 i Atto550). Upewnij się, że wykluczyłeś ślady, które zawierają zdarzenie (patrz Rysunek 3B). Zdarzenia te charakteryzują się spadkiem intensywności fluorescencji w jednym kanale bez towarzyszącego mu wzrostu w jakimkolwiek innym kanale.
  4. Oblicz ślady PF. W tym celu należy nacisnąć przycisk . Predefiniowane współczynniki korekcyjne dla przecieku pozornego (lk) i pozornego promieniowania gamma (ag) są stosowane do intensywności surowca w celu skorygowania właściwości fotofizycznych i ustawień.

5. Wybór populacji i dopasowanie histogramu 3D

  1. Usuń cząsteczki, które wykazują niski stosunek sygnału do szumu w śladach PF. Cząsteczki, które przekraczają przedział [-1; 2] w dowolnym śladzie PF dla więcej niż 10% ramek jest usuwanych ze zbioru danych. W tym celu należy wykonać polecenie "RemoveTracesLowSNR()" w oknie poleceń.
  2. Obliczanie binarnych projekcji 2D danych PF. Wykres figure-protocol-1over figure-protocol-2 i figure-protocol-3 over figure-protocol-4 w zakresie [-0.5; 1.5] o rozdzielczości 100 x 100 bins. W tym celu należy wykonać:
    1. "HistFret2D("r_b", "r_g", binHist=100)"
    2. "HistFret2D("r_b", "g_b", binHist=100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25"
  3. Określ względną populację każdego rozróżnialnego stanu w rzutach 2D.
    1. Przenieś odpowiedni wykres na wierzch i wykonaj polecenie "panelHist2DCount()".
    2. Naciśnij przycisk i narysuj wielokąt odręczny wokół szczytu.
    3. Kliknij przycisk . Liczba punktów danych w wielokącie i łączna liczba punktów danych w odwzorowaniu są drukowane w oknie poleceń.
  4. Przygotuj histogram 3D danych PF, wykonując "HistFret3D("g_b", "r_b", "r_g")".
  5. Znormalizuj histogram 3D do całki z liczby 1. Wykonaj następujące czynności:
    1. "NewDataFolder/S fit0"
    2. "Duplikat/O ::FRET:Hist3D, Hist3D"
    3. "Zmienna /G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0))^3"
    4. "Hist3D /= div; Drukuj div"
  6. Podaj początkowe parametry dla pasowania gaussowskiego 3D i przygotuj niezbędne struktury danych.
    1. Wykonaj polecenie "Gauss3D_initParam(); edytuj W_coef_old."
    2. Dodaj populacje stanów na końcu wektora parametru.
    3. Wykonaj polecenie "Gauss3D_prepareFit()."
      nuta: W_coef_old jest wektorem, który zawiera początkowe parametry pasowania. Dla każdego stanu oznacza to figure-protocol-5 oraz populację stanu, która jest łączona na końcu wektora. Upewnij się, że macierz kowariancji jest symetryczna.
  7. Dopasuj sumę funkcji Gaussa S 3D do histogramu PF 3D, gdzie S jest liczbą rozróżnialnych stanów.
    1. Wykonaj polecenie "do3D()". Na normalnym komputerze biurowym może to potrwać godzinę lub dłużej, w zależności od jakości parametrów początkowych.
    2. Wykonaj polecenie "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); edytuj W_coef."
  8. Wyświetla wynik dopasowania. Dla każdego z dwóch rzutowania 2D użyj następujących poleceń:
    1. "contourPF3D_new ust. 0; contourPF3D_new ust. 1; contourPF3D_new ust. 2; contourPF3D_new ust. 3; contourPF3D_new ust. 4"
    2. "contourPF3D_colorize()"

6. Analiza kinetyczna z 3D Ensemble HMM

  1. Przygotuj przebieg HMM zespołu, aby wyodrębnić informacje kinetyczne. Jeden HMM jest optymalizowany ze wszystkich cząsteczek w zestawie danych. Użyj informacji uzyskanych w poprzednim kroku, aby zdefiniować położenie i szerokość każdego stanu w przestrzeni PF 3D.
    1. Zainicjuj interfejs użytkownika HMM () i wybrać odpowiednią liczbę stanów (w przypadku danych Hsp90 oznacza to = 5), liczbę wymiarów sygnału wejściowego ( = 3) oraz rodzaj wejścia ( = "FRET 3D bgr").
  2. Zoptymalizuj parametry HMM, pozwalając oprogramowaniu na zbieżność prawdopodobieństwa HMM (wykonaj "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)") do momentu, gdy zmiana w macierzy przejścia w porównaniu z poprzednią iteracją spadnie poniżej progu (10-14 dla sumy bezwzględnej zmiany dla każdego prawdopodobieństwa przejścia). Daje to MLE dla prawdopodobieństwa przejścia w ciągu około godziny na normalnym komputerze biurowym.
  3. Powtórz wybór populacji, dopasowanie Gaussa i optymalizację HMM dla podzbiorów danych (np. 75% pełnego zestawu danych). Jeśli cały zestaw danych został scalony z różnych eksperymentów, powtórz optymalizację również dla każdego z pojedynczych eksperymentów. Analiza podzbiorów pozwala na oszacowanie niepewności ręcznej selekcji populacji oraz zmienności w obrębie zbioru danych.
  4. Oblicz CI dla prawdopodobieństw przejścia, które informują o niejednorodności zbioru danych i precyzji HMM.
    1. Uzyskaj przybliżone oszacowanie granic ciągłej integracji, wykonując polecenie "cd $(root:path3Dimport + "HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."
    2. Oblicz dokładne limity CI, wykonując:
    3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
    4. "CIresults_conv_new()"
    5. "cd ::HMM_CIresult; reportCI_conv()"
    6. "cd ::cmp_CI_conv; CI_plot2("HMM", doDołącz=0)"
  5. Skondensuj dostępne informacje kinetyczne, aby uprościć interpretację.
    1. Zbierz informacje o czasie, w którym znakowany nukleotyd pozostaje związany z Hsp90. Zrób to, zwijając stany, które są powiązane z AMP-PNP* (tj. S1, S2 i S3, zobacz także Rysunek 2) i skompiluj histogram czasu przebywania. Wykonaj polecenie "cd $(root:path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0})", który łączy stany S0 i S4 oraz S1, S2 i S3.
    2. Wyodrębnij czasy przebywania ze ścieżki Viterbiego dla każdego stanu zainteresowania i porównaj wynikowy histogram czasu przebywania dla różnych warunków eksperymentalnych. Wykonaj "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)".
    3. Aby uzyskać bardziej szczegółowy obraz, stany kolapsu, które mają wyraźny PF, ale są funkcjonalnie identyczne, aby ułatwić dalszą analizę danych, np. w przypadku trójkolorowego eksperymentu z oznaczonym Hsp90 i nukleotydem, stany S2 i S3 mogą być zwinięte. Wykonaj polecenie "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokolorowe pomiary smFRET pozwalają na bezpośrednie wykrycie korelacji między dwoma lub więcej różnymi miejscami interakcji. To sprawia, że technika ta jest unikalna w badaniu układów wieloskładnikowych, takich jak kompleksy białkowe. Skupiamy się tutaj na przedstawieniu trójkolorowego eksperymentu smFRET, który służy jako przykład poglądowy.

Ogólny przebieg metody jest pokazany w Rysunek 1. Pier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET dla złożonego układu białkowego oraz opis krok po kroku analizy tych pomiarów. Takie podejście oferuje unikalną możliwość bezpośredniej oceny korelacji między wieloma miejscami interakcji lub zmianami konformacyjnymi.

W celu uzyskania odpowiednich, wielokolorowych, jednocząsteczkowych danych o białkach, ważne jest wykonywanie powtarzalnych pomiarów przy niskim poziomie szumów. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (INST 39/969-1) oraz Europejską Radę ds. Badań Naukowych na podstawie umowy o grant ERC nr 681891.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Konfiguracja
nbsp;  Newport, Irvine, Kalifornia, Stany ZjednoczoneRS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1196625
laserowa jednostka sterującaCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1234465Scientific Remote
soczewki teleskopu asferycznegoThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAd=25,4mm, f=50mm i f=100mm
CF ex1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyZET 473/10wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyZET 532/10wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyZET 594/10wzbudzenie filtra czyszczącego
CF ex4Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAFL635-10wzbudzenie filtra czyszczącego
DM ex1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyZQ594RDCwzbudzenie zwierciadła dichroicznego
DM ex2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy570DCXRdichroiczne wzbudzenie zwierciadlane
DM ex3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyZQ491RDCwzbudzenie zwierciadła dichroicznego
AOTFnC-VisAA Opto-Electronic, Orsay, Francja
λ/4 płytaThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAAQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100xNikon Instruments Inc, Melville, NY, USA
pozycjoner piezoelektryczny obiektywu high-NA MIPOS 250 CAPpiezosystem jena GmbH, Jena, NiemcyPiezoelektryczny kontroler NV 40/1 CLE
piezoelektryczny krokowyNewport, Irvine, CA, USAPZA12PZC200-KT NanoPZ Zestaw siłowników
achromatyczne soczewki asferyczneQioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Gö ttingen, NiemcyG322-304-000d=50mm, f=200mm
regulowana szczelina optycznaOwis GmbH, Staufen i. Br., Niemcy27.160.1212max. apertura 12 x 12 mm
DM det1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyT 600 LPXRdetekcja lustra dichroicznego
DM det2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyH 560 LPXR superpłaskiedetekcja zwierciadła dichroicznego
DM det3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, NiemcyHC BS R635detekcja lustra dichroicznego
BP det1AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy525/40 BrightLine HCdetekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det2AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy586/20 BrightLine HCdetekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det3AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy631/36 BrightLine HCdetekcja filtra pasmowo-przepustowego
BP det4AHF analysentechnik AG, Tü bingen, Niemcy700/75 ET BandpassFiltr pasmowo-przepustowy detekcja
żaluzji optycznychVincent Associates, Rochester, NY, USAUniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897Andor Technology Ltd, Belfast, Irlandia
cyfrowa karta I/O, PCIe-6535National Instruments, Austin, Teksas, USA
strzykawkowaHarvard Apparatus, Holliston, MA, USAPHD22/2000
Nazwa>CompanyNumer katalogowyUwagi
>Flow chamber
quartz slidesG. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USASpectrosil2000, h=3mm
Folia TEGADERM3M Deutschland GmbH, Neuss, Niemcy1626W10 x 12cm
klej w sprayu3M Deutschland GmbH, Neuss, NiemcyUchwyt fotograficzny 050777
glicerolCarl Zeiss AG, Oberkochen, NiemcyOlejek immersyjny Immersol G
OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, NiemcyPryzmat IMMOIL-F30CC
Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, NiemcyAluminiowy
pryzmatycznyna zamówienie
pustedociskoweThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAz niestandardowym wierceniem
Tygon S3 E-3603 rurkaneoLab Migge GmbH, Heidelberg, Niemcy2-4450 ACF00001
Rurka PTFEBohlender GmbH, Grü nsfeld, NiemcyS1810-08
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Próbka
drożdże Hsp90 D61C, Q385C_biotinUniProt ID P02829
Pochodne maleimidu Atto488, Atto550ATTO-TEC GmbH, Siegen, Niemcy
AMP-PNP*Jena Bioscience, Jena, Niemcyγ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
FluospheresThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAF8764modyfikowany aminami, 0,2 μ m, żółto-zielony fluorescencyjny
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Andor SolisAndor Technology Ltd, Belfast, Irlandiawersja 4.30
LabVIEWNational Instruments, Austin, Teksas, USAwersja 2012, 32bit; różne sterowanie sprzętowe
Oprogramowanie sterujące MDSAA Opto-Electronic, Orsay, Francjawersja 2.03a
Coherent ConnectionCoherent Inc, Santa Clara, CA, USAwersja 3
Igor ProWaveMetrics Inc, Portland, OR, USAwersja 6.37
tłumiony drganiami&Północnapompauchwyt Suprasil1 Północna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
  5. Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
  6. Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
  7. Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90's mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
  8. Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192(2014).
  9. Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
  10. Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
  11. Wortmann,P ,, Götz M,, Hugel T , Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
  12. Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782(2017).
  13. Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
  14. Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
  15. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  16. Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
  17. Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  18. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  19. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
  20. Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
  21. Fink, G. A. Markov Models for Pattern Recognition. , Springer London. London. (2014).
  22. Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
  23. Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
  24. McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
  25. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  26. Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024(2012).
  27. Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
  28. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
  29. Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
  30. Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
  31. Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
  32. Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
  33. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  34. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  35. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  36. Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
  37. Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
  38. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  39. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  40. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Trzykolorowy smFRETukryty model Markowamikroskopia TIRFdimer Hsp90wi zanie nukleotyd wzmiany konformacyjnetrajektorie stan wanaliza kinetycznaprzebiegi fluorescencji

Powiązane artykuły