Artykuł metodologiczny

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

DOI:

10.3791/56901

⸱

26 stycznia 2018

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia mikroprzepływowa pokonuje wiele ograniczeń tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii. W przeciwieństwie do metod hodowli masowej, oferuje rozdzielczość pojedynczej komórki i długi czas obserwacji obejmujący setki pokoleń; W przeciwieństwie do mikroskopii opartej na padach agarozowych, ma jednolite warunki wzrostu, które można ściśle kontrolować. Ponieważ ciągły przepływ pożywki wzrostowej izoluje komórki w urządzeniu mikroprzepływowym od nieprzewidywalnych zmian w lokalnym środowisku chemicznym spowodowanych wzrostem i metabolizmem komórek, można z większą pewnością zaobserwować autentyczne zmiany w ekspresji genów i wzroście komórek w odpowiedzi na określone bodźce. Bacillus subtilis jest tutaj używany jako modelowy gatunek bakterii w celu zademonstrowania metody typu "maszyna matka" do analizy komórkowej. Pokazujemy, jak skonstruować i ustawić urządzenie mikroprzepływowe, obciążyć je komórkami, zainicjować obrazowanie mikroskopowe i wystawić komórki na bodziec poprzez przełączanie z jednej pożywki wzrostowej na drugą. Reporter reagujący na stres jest używany jako przykład w celu ujawnienia rodzaju danych, które można uzyskać tą metodą. Pokrótce omówiono również dalsze zastosowania tej metody w innych typach eksperymentów, takich jak analiza zarodnikowania bakterii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z najbardziej uderzających cech życia na Ziemi jest jego wielka odporność i różnorodność. Głównym celem biologii molekularnej jest zrozumienie logiki, za pomocą której komórki wykorzystują geny i białka, aby zmaksymalizować swój wzrost i przystosowanie w wielu różnych warunkach środowiskowych. Aby osiągnąć ten cel, naukowcy muszą być w stanie z pewnością obserwować, jak poszczególne komórki rosną, dzielą się i wyrażają swoje geny w danych warunkach, zauważając, jak komórki reagują na kolejne zmiany w ich środowisku. Jednak tradycyjne metody analityczne w mikrobiologii mają ograniczenia techniczne, które wpływają na rodzaje pytań, na które można odpowiedzieć. Na przykład analizy oparte na masowych hodowlach były bardzo przydatne na przestrzeni lat, ale oferują tylko dane na poziomie populacji, które mogą maskować znaczące różnice między komórkami lub zachowania mniejszych subpopulacji komórek w całej populacji. Analizy pojedynczych komórek żywych bakterii oparte na mikroskopii świetlnej ujawniają zachowanie pojedynczych komórek, ale są również ograniczone technicznie. Bakterie są zazwyczaj unieruchomione na płatkach agarozy zawierających pożywkę wzrostową, ale wzrost i podział komórek zapycha mikroskopowy widok i wyczerpuje dostępne składniki odżywcze już po kilku cyklach komórkowych, znacznie ograniczając czas obserwacji1,2. Co więcej, miejscowe wyczerpanie składników odżywczych i jednoczesne gromadzenie się metabolicznych produktów ubocznych w wyniku wzrostu komórek stale zmienia lokalne środowisko wzrostu komórek w sposób, który jest trudny do zmierzenia lub przewidzenia. Takie zmiany środowiskowe przy użyciu płatków agarozy stanowią wyzwanie dla badań nad zachowaniami w stanie ustalonym lub reakcjami komórkowymi na określone zmiany w warunkach wzrostu3.

Technologia mikroprzepływowa, w której płynne medium jest stale przepływane przez urządzenia wykonane w mikrofabrykach, oferuje rozwiązanie klasycznych ograniczeń eksperymentalnych. Urządzenie mikroprzepływowe może utrzymywać poszczególne komórki w pozycji do mikroskopii żywych komórek, podczas gdy przepływ pożywki wzrostowej stale dostarcza komórkom świeżych składników odżywczych i zmywa produkty uboczne przemiany materii i nadmiar komórek, tworząc w ten sposób wysoce jednolite środowisko wzrostu. W stałych warunkach wzrostu zachowania komórek można obserwować w izolacji od wpływu czynników środowiskowych, co pozwala na niezakłócony wgląd w wewnętrzną logikę komórek. Ponieważ przepływ płynu zapobiega zatłoczeniu urządzenia mikroprzepływowego komórkami, możliwa staje się obserwacja pojedynczych linii komórkowych przez dziesiątki lub setki pokoleń4,5. Tak długi czas obserwacji pozwala na wykrycie niewykrywalnych w inny sposób długoterminowych lub rzadkich zachowań komórek. Wreszcie, skład pożywki, która przepływa przez urządzenie, może być dowolnie zmieniany, co pozwala na obserwację komórek, gdy reagują na nadejście stresu lub na wprowadzenie lub usunięcie określonego związku.

Mikrofluidyka ma już wiele ważnych zastosowań. Na przykład, został on wykorzystany w urządzeniach tkankowych, narządowych lub typu ciało na chipie, w których wiele typów komórek ludzkich jest hodowanych wspólnie w celu symulacji stanu in vivo6; do badania ruchu nicieni w środowiskach mikrostrukturalnych7; do badania interakcji między biofilmami bakteryjnymi (np. 8); oraz do hermetyzacji i manipulacji małymi objętościami komórek lub substancji chemicznych (np. 9). Urządzenia mikroprzepływowe stają się również coraz bardziej popularne w dziedzinie mikrobiologii (doskonałe recenzje można znaleźć w 10 i 11), zwłaszcza że ich właściwości fizyczne i przepływowe są dobrze dopasowane do naturalnych nisz mikrobiologicznych12. Na przykład mikrofluidyka została ostatnio wykorzystana przez mikrobiologów do takich celów, jak precyzyjny pomiar wzrostu i podziału komórek13,14,15, analizowanie ruchu patogenów16, monitorowanie quorum sensing17 i fizjologiczne przejścia18, oraz do zliczania białek19, wśród wielu innych przykładów. Przedstawiona tutaj metoda została specjalnie zaprojektowana do analizy pojedynczych linii komórek bakteryjnych, a nie kombinacji szczepów lub gatunków. Zademonstrowane tutaj urządzenie mikroprzepływowe wykorzystuje jedną z odmian projektu "maszyny matki"4, w którym komórki są hodowane pojedynczo w rowie mikroprzepływowym z jednym zamkniętym końcem i jednym otwartym końcem; Wzrost i podział komórek wypycha komórki potomne w górę i na zewnątrz otwartego końca do przepływu płynu. Nasze analizy zazwyczaj koncentrują się tylko na komórce "macierzystej", która jest zamknięta na zamkniętym końcu wykopu. Uważamy tę metodę za postęp w stosunku do poprzednich technik analizy pojedynczych komórek opartych na mikroskopii świetlnej, takich jak immobilizacja komórek na płatkach agarozowych. Podczas gdy B. subtilis jest tutaj używany jako model, metoda ta ma również zastosowanie do innych gatunków bakterii (Escherichia coli jest innym powszechnym modelem; niektóre gatunki o różnych rozmiarach komórek lub morfologii mogą wymagać produkcji nowych urządzeń o innych wymiarach). Wykorzystanie fluorescencyjnych reporterów do oznaczania komórek i wizualizacji zmian w ekspresji genów wymaga użycia genetycznie podatnych gatunków; Jednak analizy wzrostu i morfologii komórek są możliwe nawet bez markerów fluorescencyjnych.

Obecny protokół wyklucza proces wytwarzania wzorca krzemowego za pomocą fotolitografii, który został obszernie opisany gdzie indziej5; mastery można również łatwo zlecić na zewnątrz z zakładów mikroprodukcji. Obejmuje formowanie urządzenia PDMS ze wzmocnionego wzorca krzemowego; przyklejenie urządzenia do kawałka szkła nakrywkowego; montaż mikroprzepływowej instalacji wlotowej i wylotowej, w tym zaworów zaciskowych umożliwiających przełączanie medium; pasywacja urządzenia, przygotowanie komórek bakteryjnych i załadowanie do urządzenia komórek bakteryjnych; podłączenie instalacji wodno-kanalizacyjnej do urządzenia i wyrównanie komórek; i załadowanie urządzenia do mikroskopu fluorescencyjnego w celu obrazowania. Ponieważ do wizualizacji i analizy różnych interesujących nas danych można użyć wielu różnych narzędzi programowych do akwizycji i przetwarzania obrazów4,5, pokazane są przykładowe obrazy, ale metody przechwytywania obrazów nie są uwzględnione w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przesyłanie urządzeń PDMS

  1. W środowisku wolnym od pyłu wymieszaj polimer PDMS i utwardzacz w stosunku 10:1 i odgazuj w próżni przez co najmniej 10 minut.
  2. Umieść silikonowy wzorzec (lub jego epoksydową lub poliuretanową replikę) na kawałku nieprzerwanej folii aluminiowej w styropianowej płytce Petriego. Wlać odgazowaną mieszaninę PDMS na urządzenie wzorcowe na głębokość około 5 mm. Odgazować szalkę Petriego na co najmniej 10 minut. Użyj delikatnego strumienia powietrza, aby rozbić pęcherzyki powierzchniowe.
    UWAGA: Wymiary zastosowanego urządzenia dwupoziomowego są podane w dołączonym pliku CAD 5 (patrz Plik uzupełniający 1). Plastikowa replika główna może częściowo unosić się na wodzie podczas odgazowywania; W takim przypadku należy docisnąć replikę czystym plastikowym aplikatorem.
  3. Utwardzać PDMS przez co najmniej 1 godzinę w piecu w temperaturze 60 °C i schłodzić do temperatury pokojowej. Usuń folię aluminiową zawierającą wzorzec i utwardzony PDMS z płytki Petriego. Ostrożnie odklej folię aluminiową z tyłu urządzenia głównego, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od urządzenia głównego.
    UWAGA: Alternatywnie, PDMS można utwardzać przez noc w temperaturze pokojowej. Względną kruchość wzorca wafla krzemowego można przezwyciężyć za pomocą kleju epoksydowego do trwałego połączenia płytki z aluminiowym dyskiem o grubości 1/16 cala i tym samym rozmiarze co płytka.
  4. Ponieważ płytka zawiera zazwyczaj kilka urządzeń mikroprzepływowych o nieco różnych wymiarach (patrz plik uzupełniający 1), przytnij pojedyncze urządzenie na wymiar za pomocą czystego, ostrego skalpela.
    UWAGA: Do rutynowych prac z B. subtilis należy używać urządzeń z rowami komórkowymi o szerokości 1,0 μm, które są oznaczone literą C lub F w dołączonym pliku CAD.

2. Wykrawanie i klejenie urządzeń

  1. Umieść kawałek półprzezroczystej taśmy biurowej (patrz Tabela materiałów) na wzorzystej stronie urządzenia, aby zwiększyć widoczność wzorzystych elementów. Porty wlotowe i wylotowe są oznaczone jako okrągłe obszary na przeciwległych końcach widocznych kanałów przepływowych (Rysunek 1). Aby poprawić ich widoczność podczas wykrawania otworów w urządzeniu na kołki wlotowe i wylotowe, należy oznaczyć wloty i wyloty kropkami za pomocą markera z cienką końcówką.
    UWAGA: Aby upewnić się, że kołki wlotowe i wylotowe nie są zatłoczone, każdy inny kanał jest dziurkowany, zaczynając od kanału znajdującego się tuż pod alfabetycznym oznaczeniem urządzenia.
  2. Odwróć urządzenie PDMS tak, aby wzorzysta strona była skierowana w dół, i przebij urządzenie do zaznaczonych kropek za pomocą dziurkacza do biopsji 0,75 mm; wyrzuć dziurki.
    UWAGA: Urządzenia są dziurkowane wzorzystą stroną do dołu, ponieważ otwór generowany przez stempel biopsyjny jest zwykle lekko rozszerzony w miejscu, w którym stempel wchodzi w polimer. Przekrawanie urządzenia w odwróconej orientacji zapewnia, że otwór po wzorzystej stronie ma ostrą obwódkę.
  3. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego upewnij się, że wybite otwory zachodzą na obszary wlotu i wylotu urządzenia. Użyj pęsety z cienką końcówką, aby usunąć wszelkie obce fragmenty PDMS z wybitych otworów.
  4. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć kurz z obu stron urządzenia i umieść go w czystej styropianowej płytce Petriego. Przygotuj szklaną osłonę o wymiarach 22 mm x 40 mm, zwilżając ją 100% alkoholem izopropylowym i przecierając chusteczką do pomieszczeń czystych; suszyć strumieniem bezpyłowego powietrza lub azotu.
  5. Umieść dziurkowane urządzenie PDMS stroną do góry wraz z oczyszczoną szkłem nakrywkowym w tlenowym urządzeniu do czyszczenia plazmowego.
    1. Urządzenie należy traktować plazmowo przy następujących ustawieniach: podciśnienie, 70 mTorr; Ciśnienie Ø2, 200 mTorr; czas trwania, 15 s; moc, 30 W. Natychmiast po zakończeniu okresu obróbki plazmowej wyjmij urządzenie i szkło osłonowe z myjki plazmowej.
    2. Odwróć PDMS i umieść go na środku szkła nakrywkowego tak, aby wzorzysta strona stykała się ze szkłem; upewnij się, że kanały zasilające (biegnące między obszarem wlotu i wylotu) są wyrównane z długą osią szkła nakrywkowego. Dociśnij bardzo delikatnie, aby upewnić się, że PDMS przylega do szkła.
  6. Zmontowane urządzenie piec w piekarniku przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Po upieczeniu ręcznie sprawdź, czy PDMS jest połączony ze szklanką, delikatnie naciskając jeden róg urządzenia.
    UWAGA: Po połączeniu urządzenia należy je zużyć w ciągu 24 godzin, ponieważ polimer będzie stawał się coraz bardziej hydrofobowy wraz z upływem czasu po obróbce plazmowej.

3. Przygotowanie mikroprzepływowej instalacji wodno-kanalizacyjnej

  1. Przytnij odcinki rurek polimerowych (średnica wewnętrzna (ID) 0.02 cala, średnica zewnętrzna (OD) 0.06 cala) na odpowiednie długości, aby sięgały od pompy strzykawkowej do aparatu przełączającego (jeśli jest używany) i urządzenia po zamontowaniu na mikroskopie. Wytnij tyle długości, ile jest pasów mikroprzepływowych.
  2. Zamontuj złącza Y dla zaworów zaciskowych (jeśli używasz), przycinając i mocując 2-centymetrowe odcinki elastycznej rurki silikonowej (0.03 cala ID, 0.065 cala OD) do górnych zadziorów "Y" i 1-cm długości rurki silikonowej do dolnego króćca "Y".
  3. Wytnij 10-centymetrowe (lub odpowiednie) odcinki rurki polimerowej; podłącz je na jednym końcu do złącza przełącznika, wkładając je do 1-centymetrowych silikonowych segmentów rurki na dolnym zadziorze "Y". Podłącz je na drugim końcu do igieł 21G, które zostały wyjęte z plastikowych adapterów strzykawek i wygięte pod kątem około 90°, około 9 mm od końca igły.
  4. Podłącz igły 21G do jednego końca segmentów rurki, które będą biegły od strzykawek do aparatu przełączającego, wkładając igły do rurki. Włóż drugie końce każdej długości rurki do silikonowych segmentów rurki na króćcach wlotowych złączy Y.
    UWAGA: Użyj jakiegoś urządzenia, aby przytrzymać zawory zaciskowe i złącza na miejscu; można to łatwo zrobić z pudełka na końcówki do mikropipet (Rysunek 2D).
  5. Odetnij odcinki rurek polimerowych, aby przenieść odpady z wylotu urządzenia do zlewki na odpady. Połącz je z jednej strony z wygiętymi igłami 21G przygotowanymi w sposób opisany powyżej. Przyklej drugi koniec rurek taśmą do zlewki na odpady.
  6. Przygotować odpowiednie objętości pożywki zawierającej 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i napełnić strzykawki żądaną wielkością i liczbą. Podłączyć strzykawki z BSA do przygotowanych igieł 21G przymocowanych do rurki wlotowej i załadować strzykawki do pomp strzykawkowych.
    UWAGA: Do typowych eksperymentów używanych jest 5 kanałów urządzenia, każdy ze strzykawką o pojemności 20 ml. Eksperyment, w którym zmienia się pożywkę, będzie wymagał 2 banków po 5 strzykawek każdy. W tym przypadku pompa zawierająca pierwszy rząd jest określana jako pompa fazy 1, a pompa zawierająca drugi rząd, z medium po przełączeniu, jest określana jako pompa fazy 2.
  7. Usunąć powietrze z instalacji wodociągowej, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużym natężeniem przepływu (>500 μl/min), zaczynając od ustawienia pomp strzykawkowych pionowo i stukania w strzykawki, aby doprowadzić pęcherzyki powietrza do góry. Po usunięciu powietrza ze strzykawek, należy ustawić pompę strzykawkową poziomo i stopniowo stukać lub przesuwać przewody polimerowe ze strzykawek w górę przez aparat przełączający, aby usunąć i usunąć pęcherzyki powietrza. Powtórzyć ten proces dla drugiego zestawu strzykawek (w przypadku zmiany pożywki).
  8. Po usunięciu pęcherzyków powietrza należy ustawić pompę strzykawkową fazy 2 (tj. z medium, które zostanie użyte jako drugie, po przełączniku) na 1,5 μl/min, a następnie wstrzymać przepływ. Umieść małe klipsy do segregatora na segmentach elastycznej rurki na odgałęzieniu złączy Y odpowiadających drugiej fazie medium. Kontynuuj pracę pompy strzykawkowej fazy 1 ze skromnym natężeniem przepływu (np. 10 μl/min) przez co najmniej 30 minut, aby usunąć drugie medium z rurki wlotowej za złączem Y.

4. Przygotowanie hodowli komórkowej

  1. Wyhoduj prekulturę interesującej Cię odmiany w pożądanym podłożu z dnia na dzień, do fazy stacjonarnej. Szczep bakteryjny powinien zawierać mutację, która unieruchamia komórki, tak aby komórki nie wypływały z kanałów urządzenia.
    UWAGA: W tym protokole szczepem bakteryjnym jest B. subtilis 3610 zawierający substytucję wiedźmyA233V (ta mutacja powoduje, że wić jest prosta, a nie spiralna, co zapobiega ruchliwości komórek), reporter PrsbV-mNeonGreen dla stresu komórkowego i konstytutywny reporter Phyperspank-mNeptune (czerwony) do podświetlania komórek. W przykładowym protokole użyto podłoża LB Lennox. Typowe szczepy do eksperymentów mikrofluidycznych zawierają jeden lub więcej fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i konstytutywnie wytwarzane, cytoplazmatyczne białko fluorescencyjne, aby ułatwić automatyczne wykrywanie komórek. Nie zaobserwowano wad wzrostu, gdy zastosowano pożywkę bogatą w LB Lennox, ale wzrost B. subtilis w minimalnej pożywce może być zahamowany w warunkach mikroprzepływowych, ponieważ wydzielane siderofory są wypłukiwane przez przepływ pożywki. W takich okolicznościach wzrost może zostać przywrócony przez dodanie cytrynianu sodu i chlorku żelaza do pożywki, jak podano dla S750 medium11.
  2. Rano w dniu eksperymentu rozcieńczyć komórki B. subtilis w stosunku 1:50 do przegrody 250 ml kolby zawierającej 25 ml pożywki wzrostowej. Hodować komórki przez 5-6 godzin w kulturze wytrząsającej w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej większej niż 1,
    UWAGA: Preferowana jest gęsta hodowla komórkowa, ponieważ komórki B. subtilis w fazie stacjonarnej są mniejsze i rzadziej występują w łańcuchach komórkowych, co ułatwia ładowanie urządzenia. Różne gatunki bakterii mogą wymagać innych pożywek lub warunków wzrostu w celu optymalnego obciążenia.
  3. Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr o wielkości porów 5 μm przefiltruj około 15 ml kultury komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia łańcuchów komórkowych B. subtilis (nie jest to konieczne w przypadku E. coli i może nie być konieczne w przypadku innych gatunków).
    UWAGA: Należy usunąć stosunkowo niewiele komórek; Przesącz powinien być mętny.
  4. Przefiltrowaną kulturę należy odwirowywać przez 10 minut przy 4 000 x g w temperaturze pokojowej. Odlać sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórek w pozostałym płynie sklarowanym nad osadem pozostałym w probówce, dodając około 500 μl świeżej pożywki, jeśli to konieczne, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny komórek.

5. Wczytywanie urządzenia

  1. Delikatnie umieść puste, cienkie końcówki mikropipet z żelem (patrz Tabela materiałów) w otworach wylotowych urządzenia mikroprzepływowego.
  2. Używając cienkich końcówek do ładowania żelu z mikropipetą P200, pasywować urządzenie, wstrzykując pożywkę zawierającą 1 mg/ml BSA do otworów wlotowych, obserwując końcówki w otworach wylotowych w celu monitorowania wypełnienia kanałów mikroprzepływowych (Rysunek 2A). Inkubować urządzenie w temperaturze pokojowej przez około 5 minut
    UWAGA: BSA jest powszechnie stosowany jako środek blokujący lub pasywacyjny, który wiąże się z hydrofobową powierzchnią polimeru PDMS, zwiększając jego hydrofilowość i zmniejszając wiązanie innych białek lub komórek (poprzez cząsteczki na powierzchni komórki).
  3. Używając cienkich końcówek do ładowania żelu, załaduj każdy kanał ponownie zawieszonymi komórkami (z sekcji 4), używając końcówek w kanale wylotowym do monitorowania postępu ogniw przez urządzenie (Rysunek 2B).
    UWAGA: Ładowanie ułatwia ustawienie maksymalnej objętości mikropipety P200 wynoszącej 200 μl, a następnie zassanie poduszki powietrznej przed zassaniem niewielkiej objętości (około połowy objętości cienkiej części końcówki pipety) komórek. Objętość zawieszonych komórek nie musi być precyzyjna, ponieważ objętość urządzenia PDMS jest mała w stosunku do objętości mikropipety. Nie znamy górnego limitu gęstości ponownie zawieszonych komórek, o ile zawiesina komórek może być pipetowana do urządzenia. Grudki komórek mogą zatkać urządzenie i należy ich unikać poprzez dokładne pipetowanie i/lub mieszanie wirowe.
  4. Delikatnie wyjmij końcówki żelowe z otworów wylotowych, pracując pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu urządzenia.
  5. Odwirować urządzenie w mikrowirówce stołowej w odpowiednim adapterze wirnika o sile około 6 000 x g przez 10 minut (Rysunek 2C).
    UWAGA: Użyto specjalnie obrobionego aluminiowego adaptera wirnika, który został zaprojektowany tak, aby pasował do wirnika mikrowirówki (Rysunek 2C); Różne modele wirówek mogą być używane z odpowiednimi adapterami wirnika. Ważną cechą adaptera jest to, że zapewnia on siłę boczną w kierunku zamkniętych końców rowów komórkowych, wpychając w ten sposób komórki do kanałów bocznych.
  6. Sprawdź pomyślne ładowanie pod mikroskopem (Rysunek 3), ale bez mocowania urządzenia do uchwytu szkiełka/wkładki stolika.
    UWAGA: W tym protokole obiektyw zanurzeniowy 60X, 1,4 NA Ph3 jest używany zarówno do weryfikacji na tym etapie, jak i do późniejszego obrazowania.

6. Montaż, równoważenie i montaż urządzenia

  1. Ostrożnie zamontuj załadowane urządzenie na wkładzie stage, przyklejając szkło osłonowe po obu stronach PDMS do dolnej części stage insert (tj. odwróć stage insert przed zamocowaniem urządzenia). Odwróć zespół wkładki stage i urządzenia tak, aby PDMS był skierowany do góry i umieść na miękkiej powierzchni, takiej jak chusteczka bezpyłowa (Rysunek 2D).
  2. Dostosować natężenie przepływu pompy strzykawkowej fazy 1 do 35 μl/min. Pracując z jednym pasem na raz, włożyć igłę wlotową, a następnie igłę wylotową (tj. biegnącą do zlewki na odpady; Rysunek 2E).
  3. Zetrzyj nadmiar medium czystą, bezpyłową chusteczką i sprawdź wzrokowo urządzenie pod kątem wycieków. Zbadaj rurkę wylotową pod kątem nadmiaru komórek (zwykle pojawiających się jako mętny pasek) i średniej menisku, która powoli przesuwa się w kierunku zlewki na odpady.
  4. Pozwól urządzeniu pracować z prędkością 35 μl/min przez około 15 - 30 minut, aż wszystkie połączone tory spłyną do zlewki na odpady.
  5. Ustawić pompę strzykawkową fazy 1 na 1,5 μl/min i wstrzymać przepływ. Przynieś całą pompę i aparaturę urządzenia do mikroskopu (proces ten jest wspomagany przez umieszczenie wszystkiego na wózku na kółkach) i uruchom ponownie przepływ medium fazy 1 z prędkością 1,5 μl/min. Ostrożnie zamontuj stage wkładkę z urządzeniem na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, używając w razie potrzeby taśmy do poprowadzenia rurki dolotowej i wylotowej.
  6. Zlokalizuj żądane pozycje na urządzeniu do obrazowania i rozpocznij obrazowanie zgodnie z potrzebami. Należy pamiętać, że komórki zazwyczaj potrzebują kilku godzin (około 10 pokoleń), aby osiągnąć wzrost w fazie wykładniczej w stanie ustalonym, a początek akwizycji obrazu może być opóźniony w zależności od potrzeb, tak aby obrazowanie rozpoczęło się po okresie równowagi.
    UWAGA: Wzrost komórek w stanie ustalonym utrzymywanych w fazie wykładniczej powinien być weryfikowany podczas późniejszej analizy obrazu poprzez śledzenie czasów podziału komórek i upewnienie się, że osiągnęły one stałą wartość minimalną.

7. Przełączanie medium

  1. Pomiędzy kolejnymi rundami obrazowania należy wstrzymać przepływ pompy strzykawkowej fazy 1. Ostrożnie odpiąć zaciski segregatora od silikonowej rurki fazy 2, przesuwając każdy z nich do silikonowej rurki na odgałęzieniu fazy 1 złącza Y. Odblokuj wstrzymanie przepływu pompy strzykawkowej fazy 2 (która została ustawiona na 1,5 μl/min w kroku 3.8) i kontynuuj obrazowanie.
    UWAGA: Przy prędkości 1,5 μm/min z rurką polimerową o długości 10 cm za złączami Y, medium drugiej fazy dociera do urządzenia w ciągu około 50 minut. Czas do urządzenia można empirycznie przetestować przy użyciu pożywek zawierających fluorescencyjne cząstki znacznikowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne początkowe obciążenie komórek, ocenione za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego przed podłączeniem mikroprzepływowej instalacji hydraulicznej do urządzenia, zostanie uznane za posiadające wszystkie lub prawie wszystkie boczne kanały mikroprzepływowe zawierające jedną lub więcej komórek bakteryjnych (Rysunek 3A). Optymalne ładowanie pokazałoby kilka komórek w każdym kanale, ale kanały mimo to wypełnią się komórkami z powodu wzrostu komórek w okresie równowagi ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół mikrofluidyczny jest elastyczny pod tym względem, że wiele kroków może być modyfikowanych w celu optymalizacji jego użycia dla określonego gatunku lub szczepu lub do określonego celu. Rzeczywiście, w tym protokole dokonaliśmy modyfikacji oryginalnej koncepcji "maszyny matki"4 , aby zoptymalizować jej użycie z B. subtilis. Często rowy, w których zamknięte są komórki, stanowią element jednowarstwowy, podczas gdy w tym protokole stosujemy dwuwarstwowe rowy komórkowe, z płytkim k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health pod GM018568. Protokół ten został częściowo przeprowadzony w Center for Nanoscale Systems (CNS), członku National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF nr 1541959. CNS jest częścią Uniwersytetu Harvarda. Wielkie podziękowania należą się Thomasowi Normanowi i Nathanowi Lordowi za ich pracę włożoną w wymyślenie i wyprodukowanie wzorca używanego w pokazanych tutaj urządzeniach oraz za zbudowanie oryginalnej wersji urządzenia. Dziękujemy również Johanowi Paulssonowi za jego cenne wspólne rady i dziękujemy członkom jego laboratorium za ich rady i ciągłe ulepszenia bakteryjnych aparatów mikroprzepływowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning(240)4019862W protokole jest to określane jako PDMS. Istnieją 2 składniki, które są mieszane w stosunku 10:1
0,75 mm dziurkacz do biopsjiWorld Precision Instruments504529
22 x 40 mm Szkło osłonowe nr 1,5VWR48393 172
Wytrawianie plazmowe PE-50Plasma Etch Inc.PE-50Przyrząd służący do łączenia PDMS ze szkłem za pomocą obróbki plazmą tlenową
Tygon elastyczny przewód ID 0,02", OD 0,06"Saint-Gobain PPL Corp.AAD04103Do głównej części rurki, np. przymocowanej do igieł
Rurka silikonowa, 0,04" ID, 0,085" ODHelixMark Standardowa rurka silikonowa60-795-05Do zaworów zaciskowych i złącza Y
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906-100GStosowany jako środek pasywacyjny
ART Żelowe końcówki do pipet (P200)Molecular BioProducts2155Do załadunku urządzenia medium i komórek
Acrodisc 32-mm filtr strzykawkowy z 5-μ m Membrana SuporPall Life Sciences4560Do filtrowania kultur przed załadowaniem urządzenia
igły 21-ga, 1"McMaster-Carr75165A681
Złącze Y z zadziorami serii 200, rurka 1/16" ID, polipropylenNordson MedicalY210-6005Firma jest AKA Value Plastics
Mikroskop odwrócony Eclipse Ti-ENikonTa jednostka została wycofana przez producenta i została zastąpiona przez Ti 2 E.
LB LennoxSigma-AldrichL3022
Microfuge 18Beckman Coulter367160
Bacillus subtilis szczep NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1rodzicielski typu dzikiego zmodyfikowany do wykorzystania w eksperymentach przedstawionych w tym protokole
Grawitacyjny piec konwekcyjnyVWR414005-106do utwardzania PDMS i pieczenia zmontowany urządzenia
Zestaw Scotch-Weld Epoxy Kit3M2216 B/Amoże być używany do przyklejania płytki krzemowej do aluminiowej płyty nośnej
Taśma Scotch Magic o szerokości 3/4"3Mdo usuwania kurzu z urządzeń PDMS oraz do umieszczania na elementach zwiększających widoczność (oznaczona w protokole jako "taśma biurowa" lub "taśma samoprzylepna")
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ800Nwymienione tutaj jako przykład; prawie każdy mikroskop stereoskopowy to zrobi
Alkohol izopropylowySigma-AldrichW292907Do czyszczenia szkła nakrywkowego
Pompa strzykawkowa, 6-kanałowaNew Era Pump Systems Inc.NE-1600
KimwipesKimberly-Clark34120marka chusteczek bezpyłowych
, , szczep

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  2. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  3. Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
  4. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  5. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
  6. Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
  7. Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
  8. Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
  9. Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
  10. Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
  11. Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
  12. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  13. Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11(2017).
  14. Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
  15. Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
  16. Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
  17. Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
  18. Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
  19. Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641(2016).
  20. Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
  21. Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
  22. Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
  23. Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenie mikroprzep ywoweanaliza pojedynczych kom rekMother Machinewi zanie PDMSpompa strzykawkowareporter fluorescencyjnysporulacja bakteryjnakontrast fazowylinia kom rkowa

Powiązane artykuły