Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar odkształcalności i niejednorodności krwinek czerwonych we krwi za pomocą ektacytometrii

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56910

⸱

12 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Saint Louis University School of Medicine, 2Molecular and Clinical Nutrition Section, Digestive Diseases Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 3Molecular and Clinical Hematology Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 4Sickle Cell Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 5Edward A. Doisy Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saint Louis University School of Medicine, 6Red Cell Physiology Laboratory, New York Blood Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy techniki pomiaru deformowalności krwinek czerwonych i heterogeniczności komórkowej za pomocą ektacytometrii. Techniki te mają zastosowanie do ogólnych badań odkształcalności krwinek czerwonych i szczegółowych badań chorób krwi charakteryzujących się obecnością w krążeniu zarówno sztywnych, jak i odkształcalnych krwinek czerwonych, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa.

Streszczenie

Zmniejszona odkształcalność czerwonych krwinek jest charakterystyczna dla kilku zaburzeń. W niektórych przypadkach stopień wadliwej odkształcalności może przewidywać ciężkość choroby lub wystąpienie poważnych powikłań. Ektacytometria wykorzystuje wiskozymetrię dyfrakcji laserowej do pomiaru odkształcalności czerwonych krwinek poddanych rosnącemu naprężeniu ścinającemu lub gradientowi osmotycznemu przy stałej wartości przyłożonego naprężenia ścinającego. Jednak bezpośrednie pomiary odkształcalności są trudne do interpretacji przy pomiarze krwi niejednorodnej, która charakteryzuje się obecnością zarówno sztywnych, jak i odkształcalnych krwinek czerwonych. Wynika to z niezdolności sztywnych komórek do prawidłowego wyrównania w odpowiedzi na naprężenie ścinające i powoduje zniekształcony wzór dyfrakcyjny charakteryzujący się nadmiernym spadkiem pozornej odkształcalności. Pomiar stopnia zniekształcenia stanowi wskaźnik niejednorodności erytrocytów we krwi. W niedokrwistości sierpowatokrwinkowej jest to skorelowane z odsetkiem sztywnych komórek, co odzwierciedla stężenie hemoglobiny i skład hemoglobiny w erytrocytach. Oprócz pomiaru odkształcalności, ektacytometria gradientu osmotycznego dostarcza informacji o kruchości osmotycznej i stanie nawodnienia erytrocytów. Parametry te odzwierciedlają również skład hemoglobiny w czerwonych krwinkach pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Ektacytometria mierzy odkształcalność w populacjach krwinek czerwonych i dlatego nie dostarcza informacji na temat odkształcalności lub właściwości mechanicznych poszczególnych erytrocytów. Niezależnie od tego, celem opisanych tutaj technik jest zapewnienie wygodnej i niezawodnej metody pomiaru odkształcalności i niejednorodności komórkowej krwi. Techniki te mogą być przydatne do monitorowania zmian czasowych, a także progresji choroby i odpowiedzi na interwencję terapeutyczną w kilku zaburzeniach. Anemia sierpowatokrwinkowa jest jednym z dobrze scharakteryzowanych przykładów. Inne potencjalne zaburzenia, w przypadku których interesujące są pomiary odkształcalności krwinek czerwonych i/lub niejednorodności, obejmują magazynowanie krwi, cukrzycę, zakażenie Plasmodium, niedobór żelaza i niedokrwistości hemolityczne spowodowane wadami błony.

Wprowadzenie

Ektacytometria dostarcza wygodnej miary odkształcalności krwinek czerwonych w odpowiedzi na zmiany naprężenia ścinającego (mierzone w paskalach (Pa)) lub osmolalności zawieszającej średni. Istotne parametry odkształcalności krwinek czerwonych obejmują maksymalny wskaźnik wydłużenia (EI Max), miarę maksymalnej odkształcalności krwinki czerwonej w odpowiedzi na rosnące naprężenie ścinające, oraz naprężenie ścinające 1/2 (SS 1/2), naprężenie ścinające wymagane do osiągnięcia połowy maksymalnej odkształcalności. 1 Ektacytometria gradientu osmotycznego ma kilka parametrów informacyjnych. Należą do nich minimalny wskaźnik wydłużenia (EI Min), miara stosunku powierzchni do objętości oraz osmolalność, przy której występuje (O Min), która jest miarą kruchości osmotycznej. EI Max i osmolaliczność, przy której zachodzi (O (EI Max)) dostarczają informacji na temat elastyczności błony i powierzchni komórki. Połowa maksymalnego wydłużenia w ramieniu hipertonicznym gradientu osmotycznego jest reprezentowana przez hiper EI. EI hyper i osmolaliczność, przy której występuje, O hyper, dostarczają informacji o lepkości wewnątrzkomórkowej krwinek czerwonych, która jest określana przez stężenie hemoglobiny. 2,3 Pomiar odkształcalności w krwi heterogenicznej jest skomplikowany przez fakt, że sztywne komórki, takie jak sierpowate krwinki czerwone, nie ustawiają się prawidłowo w kierunku przepływu, jak np. komórki odkształcalne w odpowiedzi na rosnące naprężenia ścinające. Zamiast wytwarzać charakterystyczny eliptyczny obraz dyfrakcyjny, sztywne komórki wytwarzają kulisty wzór, który po nałożeniu na eliptę utworzoną przez odkształcalne komórki powoduje powstanie wzoru dyfrakcyjnego w kształcie rombu. 4,5,6 Wykazano, że sferyczny wzór odpowiada nieodwracalnie sierpowatym komórkom poprzez wykonanie ektacytometrii na izolowanych frakcjach komórek po odwirowaniu gęstości. 6 Obliczanie wskaźnika wydłużenia obejmuje pomiary zarówno długiej, jak i krótkiej osi elipsy; Kształt rombu powoduje zatem pozorne zmniejszenie wydłużenia poprzez zwiększenie szerokości krótkiej osi. 7 Wcześniej wykazano, że stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego jest skorelowany zarówno z procentem hemoglobiny sierpowatej (HbS), jak i procentem komórek sierpowatych we krwi pacjentów z anemią sierpowatą. 5 Stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego można uzyskać za pomocą skomplikowanych analiz matematycznych. 8 Można to również uzyskać, dostosowując otwarcie otworu kamery na ektakytometrze lub poziom szarości w oprogramowaniu do dopasowania, aby zmienić wysokość wzoru dyfrakcyjnego. 5 Jednak szczegóły dotyczące regulacji poziomu szarości nie są dobrze zdefiniowane, a przysłona kamery nie jest łatwo dostępna w najnowszej generacji dostępnego na rynku ektacytometru. Aby obejść te problemy, łatwo dostępne wzmocnienie kamery można wykorzystać do regulacji wysokości wzoru dyfrakcyjnego. 9 Korzystając z tej metody do oszacowania niejednorodności komórek, stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego może być skorelowany z procentem hemoglobiny płodowej we krwi pacjentów z anemią sierpowatą. 10 Kilka parametrów ektacytometrii gradientu osmotycznego jest również skorelowanych z procentem hemoglobiny płodowej lub sierpowatej we krwi pacjentów z anemią sierpowatą. Korelacje zniekształceń wzoru dyfrakcyjnego prawdopodobnie odzwierciedlają udział składu hemoglobiny w odsetku sztywnych, nieodkształcalnych komórek. Dodatkowym interesem jest to, że cały profil ektacytometrii gradientu osmotycznego ulega dwufazowym zmianom, które odpowiadają procentowi gęstych komórek w krążeniu podczas przełomu sierpowatokrwinkowego. 11

Ektacytometria jest również przydatna w badaniu kilku innych zaburzeń. Ektacytometria gradientu osmotycznego służy do diagnostyki dziedzicznych zaburzeń błony krwinek czerwonych, takich jak dziedziczna sferocytoza, dziedziczna eliptocytoza i dziedziczna piropoikilocytoza. 3,12,13,14 Zmniejszona odkształcalność występuje przy niedoborze żelaza. 15 Charakterystyka "zmiany magazynowej" krwi została wykorzystana za pomocą ektacytometrii, a przyszłe badania badające zarówno naturę zmiany, jak i interwencje zapobiegające jej powstawaniu podczas przechowywania bankowej krwi prawdopodobnie skorzystają z przedstawionych tutaj technik. 16 Zmniejszona odkształcalność czerwonych krwinek jest również skorelowana z chorobami mikrokrążenia w cukrzycy. 17 Ostatnie badania łączące hiperglikemię, stężenie askorbinianu krwinek czerwonych i kruchość osmotyczną sugerują, że te czynniki mogą być ważne w rozwoju chorób mikronaczyniowych. 18 Obecnie trwają badania ektacytometryczne mające na celu zbadanie tej hipotezy (Parrow i Levine, dane niepublikowane). Zakażenie malarią w stadium krwi to kolejny interesujący kierunek badań nad odkształcalnością krwinek czerwonych. Odkształcalność komórkowa czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum dramatycznie zmniejsza się w ciągu 48 godzin wewnątrzkomórkowego dojrzewania pasożyta od stadium pierścienia do stadium schizonta. Dowody wskazują, że ta zmniejszona odkształcalność ulega odwróceniu po dojrzewaniu pasożyta. Odwrócenie zbiega się z uwolnieniem zakażonych krwinek czerwonych do krążenia. Uważa się, że zmniejszona odkształcalność jest spowodowana przez białka Plasmodium, które promują sekwestrację krwinek czerwonych. 19 Te badania reprezentują niewielką próbkę klinicznie ważnych stanów, w których pomiar deformowalności erytrocytów i parametrów gradientu osmotycznego jest istotny. Istnieje kilka dodatkowych obszarów badań.

Alternatywne techniki pomiaru odkształcalności czerwonych krwinek obejmują pęsety optyczne (znane również jako pułapki laserowe), które wykorzystują fizyczne właściwości fotonów do rozciągania pojedynczych czerwonych krwinek w jednym lub więcej kierunkach. 20 Ta technika ma tę zaletę, że mierzy odkształcalność pojedynczych erytrocytów, ale pewna niepewność w kalibracji siły spowodowała znaczną zmienność między badaniami 21 i analiza danych może być pracochłonna, chyba że zostanie zautomatyzowana. 22 Aspiracja mikropipet, która wykorzystuje podciśnienie do zasysania erytrocytów do mikropipety, została również wykorzystana do pomiaru odkształcalności czerwonych krwinek. 7,23 Możliwe są wielokrotne pomiary, takie jak ciśnienie wymagane do zassania krwinki czerwonej, przy czym każda miara określa inną charakterystykę krwinki czerwonej. 23 Mikroskopia sił atomowych to technika o wysokiej rozdzielczości, która mierzy sztywność membrany poprzez ilościowe określenie ugięcia wiązki laserowej jako wskaźnika ugięcia wspornika wzdłuż powierzchni czerwonej krwinki. 24 Techniki te dostarczają informacji o poszczególnych erytrocytach, nie są łatwe do pomiaru zmian w populacjach czerwonych krwinek i ogólnie wymagają znacznej wiedzy technicznej.

Chęć jednoczesnego pobierania próbek zarówno pojedynczych, jak i populacji komórek doprowadziła do postępu w automatyzacji oraz rozwoju mikrofluidyki i metod opartych na tablicach. Podobnie jak ektacytometria, reoskopia mierzy odkształcalność w funkcji naprężenia ścinającego, ale obrazy są pozyskiwane bezpośrednio przez mikroskop. 25 Dla analiz o wyższej przepustowości, zastosowano automatyczne obrazowanie komórek, które pozwala na uzyskanie rozkładu odkształcalności za pomocą reoskopu. 26 Niejednorodność komórkowa może być określona ilościowo za pomocą tej metody, jeśli dostępne są dane od zdrowego podmiotu kontrolnego. 27 Techniki mikrofluidyczne pozwalają również na wysokoprzepustowe analizy pojedynczych komórek; Opracowano wiele projektów wykorzystujących adaptacje filtracji, 28 Cell Transit Analyzers,29, który mierzy czas potrzebny na przepływ erytrocytów przez mikropory, oraz alternatywy, które mierzą ciśnienie wymagane do tranzytu erytrocytów, a nie czas 30. Inną platformą do wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek jest układ scalony z pojedynczą komorą mikrokomórkową, który ma dodatkową zaletę polegającą na umożliwieniu dalszej charakterystyki komórek w oparciu o fluorescencję. 31 Chociaż każda z tych technik jest potencjalnie przydatna i może być lepsza w konkretnych zastosowaniach, do zalet ektacytometrii zalicza się czułość, łatwość użycia i precyzję. 32 Najnowsza generacja dostępnych na rynku ektacytometrów posiada również znaczną wszechstronność w liczbie testów, które można wykonać.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszyscy uczestnicy niniejszego badania wyrazili pisemną zgodę na udział w nim, zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję Recenzyjną Narodowych Instytutów Zdrowia.

1. Włączanie ektacytometru

  1. Podłącz przewody z roztworu czyszczącym do roztworów poliwinilopirorolonu (PVP) o niskiej i wysokiej osmolarności. Należy upewnić się, że przewód 0 osmolar zostaje podłączony do roztworu o niskiej osmolarności, a przewód 500 osmolar do roztworu o wysokiej osmolarności.
    Uwaga: Roztwór PVP o niskiej osmolarności powinien mieć osmolalność w zakresie od 35 do 55 miliosmoli na kilogram (mOsm/kg) oraz pH w zakresie 7,25–7,45 przy 25 °C oraz lepkością od 27,0 do 33,0 centipoise (cP) w temperaturze 37,0 ± 0.5 °CRoztwór PVP o wysokiej osmoliarności powinien mieć osmolalność w zakresie od 764 do 804 mOsm/kg oraz pH w zakresie 7,25–7,45 przy 25 °C oraz lepkość w zakresie 27,0–33,0 cP w temperaturze 37.0 ° 0.5 °C.
  2. Upewnij się, że pływak został całkowicie opuszczony do kubka. Uruchom oprogramowanie i wykonaj płukanie urządzenia (Kontrola sprzętu | Wejścia/Wyjścia instrumentu). Pozostaw instrument do zakończenia cyklu przygotowania (primingu). Po zakończeniu cyklu wyjmij pływak z kubka i całkowicie osusz pływak oraz kubek za pomocą ściereczki czyszczącej niepozostawiającej włókien.
    Uwaga: Pozostała woda spowoduje lizę erytrocytów, co wywoła interferencję.

2. Pomiar odkształcalności w funkcji zwiększającego się naprężenia ścinającego

  1. Pobrać krew (ilość poniżej 1 mL jest wystarczająca do przeprowadzenia tych technik z powtórzeniami) do fiolki zawierającej odpowiedni antykoagulant.
    Uwaga: EDTA jest preferowany nad heparyną, ponieważ ma mniejszy wpływ na parametry hemoreologiczne.33 Krew należy przechowywać w temperaturze pokojowej, jeśli pomiary są wykonywane w ciągu 6 godzin od pobrania.
  2. Przed badaniem delikatnie wymieszać próbkę krwi pełnej, kilkakrotnie odwracając fiolkę. Za pomocą pipety dodać 25 µL krwi pełnej do 5 mL izoosmolarnego roztworu PVP, zakręcić fiolkę i delikatnie wymieszać, kilkakrotnie ją odwracając. Izoosmolarny roztwór PVP powinien mieć osmolalność między 284 a 304 mOsm/kg, pH 7,3-7,4 w 25 °C oraz lepkość 27,0-33,0 cP w temperaturze 37,0 ± 0,5 °C.
  3. W oprogramowaniu wybrać deformowalność (deformability) z menu głównego. Utworzyć nową analizę i dodać szczegóły eksperymentu (Deformability | Add desired details | Okay).
    1. Podnieść pokrywę ektacytometru, sprawdzić, czy rotor (bob) jest całkowicie opuszczony do kubka i czy kubek się obraca.
    2. Za pomocą pipety dodać 1 mL roztworu krwi w PVP do przestrzeni między kubkiem a rotorem.
    3. Lekko unieść rotor, aby przenieść próbki w dół. Odczekać, aż wszystkie pęcherzyki powietrza wypłyną z roztworu, a następnie zamknąć pokrywę ektacytometru. W razie potrzeby nacisnąć przycisk aspiracji, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków.
  4. Ustawić wzmocnienie (gain) na 200, przesuwając strzałkę wzdłuż paska przewijania w oprogramowaniu (patrz uwaga). Gdy temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C, a obraz dyfrakcyjny będzie stabilny, nacisnąć start (Start).
    Uwaga: W wielu badaniach dobry obraz dyfrakcyjny z krwi zdrowej (stężenie hemoglobiny > 12,0 g/dL, średnia objętość krwinki 80-96 fL i średnie stężenie hemoglobiny w krwinkach 33-36 g/dL) można uzyskać przy wzmocnieniu kamery ustawionym na 200. W badaniach krwi w anemii sierpowatej zasugerowano ustawienie wzmocnienia kamery tak, aby uzyskać obraz dyfrakcyjny o rozmiarze 4,5 cm, jako ustawienie domyślne, co pozwala na porównanie wyników między badaniami i laboratoriami.9
  5. Obserwować wzory dyfrakcyjne w miarę postępu akwizycji danych, aby upewnić się, że pozostają one okrągłe, eliptyczne lub w kształcie rombu. Po zakończeniu akwizycji danych zapisać lub wydrukować raport (File | Save lub File | Print). Wartości EI Max i SS ½ zostaną podane automatycznie, wraz z indeksami wydłużenia odpowiadającymi określonym przez użytkownika lub domyślnym naprężeniom ścinającym. Dane zostaną również automatycznie zapisane przez oprogramowanie.
  6. Na koniec nacisnąć opcję czyszczenia w oknie dialogowym na monitorze komputera (Clean). Po aspiracji próbki przepłukać przestrzeń między kubkiem a rotorem, wtryskując wodę dejonizowaną do tej przestrzeni, podczas gdy instrument pozostaje w cyklu czyszczenia. Po zakończeniu cyklu czyszczenia wyciągnąć rotor z kubka i całkowicie osuszyć rotor oraz kubek za pomocą chusteczki czyszczącej niepozostawiającej kłaczków (krytyczne: pozostała woda spowoduje lizę erytrocytów, powodując zakłócenia).
  7. Kliknąć przycisk Menu Głównego w oprogramowaniu, aby powrócić do strony głównej (Main Menu).

3. Pomiar heterogeniczności komórkowej

  1. Przed badaniem delikatnie wymieszaj próbkę krwi pełnej, odwracając fiolkę kilka razy. Pipetą przenieś 25 µL krwi pełnej do nowej fiolki o pojemności 5 mL zawierającej izoosmolarny roztwór PVP, zakręć fiolkę i delikatnie mieszaj przez odwracanie, aż mieszanina stanie się jednorodna.
  2. Z menu głównego wybierz deformowalność (deformability). Utwórz nową analizę i dodaj szczegóły eksperymentu (Deformability | Add desired details | Okay).
    1. Podnieś pokrywę ektacytometru i sprawdź, czy rdzeń (bob) jest całkowicie opuszczony do kubka i czy kubek się obraca.
    2. Pipetą przenieś 1 mL roztworu krwi w PVP do przestrzeni między kubkiem a rdzeniem.
    3. Odczekaj, aż wszystkie pęcherzyki powietrza wypłyną z roztworu, a następnie zamknij pokrywę ektacytometru.
    4. Upewnij się, że na ekranie widoczny jest stabilny obraz dyfrakcyjny. Dostosuj wzmocnienie kamery, przesuwając strzałkę wzdłuż paska przewijania w oprogramowaniu, aż wysokość dyfrakcji wyniesie 3,8 cm. Użyj linijki, aby zweryfikować wysokość obrazu na ekranie komputera.
  3. Gdy temperatura ustabilizuje się na poziomie 37 °C i obraz dyfrakcyjny będzie stabilny, naciśnij start (Start).
  4. W trakcie akwizycji danych obserwuj wzory dyfrakcyjne, aby upewnić się, że zachowują one kształt kołowy, eliptyczny lub rombowy. Po zakończeniu akwizycji danych zapisz lub wydrukuj raport (File | Save lub File | Print).
  5. Na koniec wybierz opcję czyszczenia w oknie dialogowym na monitorze komputera (Clean). Po zasysaniu próbki przepłucz przestrzeń między kubkiem a rdzeniem, wlewając do niej wodę dejonizowaną z butelki z rozpylaczem, podczas gdy urządzenie pozostaje w cyklu czyszczenia. Po zakończeniu cyklu czyszczenia wyjmij rdzeń z kubka i całkowicie osusz rdzeń oraz kubek ściereczką niepozostawiającą włókien (krytyczne: pozostała woda spowoduje lizę erytrocytów, co wywoła interferencje).
  6. Powtórz kroki 2.1–2.5 i dostosuj wzmocnienie kamery, aby uzyskać wysokość wzoru dyfrakcyjnego 4,5 cm (krok 2.2).
  7. Powtórz kroki 2.1–2.5 i dostosuj wzmocnienie kamery, aby uzyskać wysokość wzoru dyfrakcyjnego 5,4 cm (krok 2.2).
  8. Na koniec kliknij przycisk menu głównego, aby powrócić do strony głównej oprogramowania (Main Menu).
  9. Aby określić stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego na podstawie EI Max wyrażonego w procentach, zastosuj poniższe równanie (to samo równanie można zastosować do danych dla wysokości wzoru dyfrakcyjnego 4,5 cm, jeśli jest to wymagane):
    Równanie do obliczania indeksu elastyczności w schemacie edukacyjnym analizy sztywności materiału.
  10. Podobnie, aby określić stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego na podstawie SS1/2, zastosuj to samo równanie z raportowaną wartością SS1/2:
    Równanie obliczające procentową zmianę ze zmiennymi SS 1/2 przy różnych długościach, istotne dla analizy danych.

4. Ektacytometria z gradientem osmotycznym

  1. Pobrać próbkę zgodnie z opisem w sekcji 1.1. Przed badaniem delikatnie wymieszać próbkę krwi pełnej, odwracając probówkę kilka razy. Za pomocą pipety przenieść 250 µL krwi pełnej do fiolki z 5 mL izoosmolarnego roztworu PVP, zakręcić fiolkę i delikatnie mieszać przez odwracanie do uzyskania homogenicznej mieszaniny.
  2. Wybrać opcję osmoscan z menu głównego (Osmoscan). Umieścić fiolkę zawierającą roztwór krwi z PVP pod igłą po lewej stronie urządzenia. Obniżyć igłę, aż dotknie dna fiolki. Upewnić się, że przewody są prawidłowo podłączone do roztworów o niskiej i wysokiej osmolarności w celu wytworzenia gradientu. Zamknąć pokrywę ektacytometru i otworzyć drzwiczki w dolnej części, aby móc obserwować wpływanie krwi do przewodów.
  3. Nacisnąć przycisk nowej analizy i wprowadzić szczegóły eksperymentu (Osmoscan | New Analysis | Enter desired details | Okay). Ustawić wzmocnienie kamery (gain) na 200, przesuwając odpowiednią strzałkę w oprogramowaniu, i pozwolić urządzeniu pracować do momentu, aż krew zacznie wpływać do komory z przewodów znajdujących się pod instrumentem.
    1. Gdy krew wpłynie do komory, a na ekranie komputera pojawi się stabilny obraz wzoru dyfrakcyjnego, rozpocząć akwizycję danych, naciskając przycisk start now w oknie dialogowym (Start Now).
  4. Pozostawić ektacytometr w trybie akwizycji danych do wartości około 500 mOsm/kg, a następnie zatrzymać urządzenie. Zapisać lub wydrukować raport (File | Save lub File | Print). Dane zostaną również zapisane automatycznie.
  5. Usunąć zużytą fiolkę z krwią i PVP. Zastąpić ją czystą fiolką zawierającą wodę dejonizowaną. Umieścić ją pod igłą, opuścić igłę tak, aby dotykała dna fiolki, i nacisnąć przycisk płukania w oknie dialogowym, aby przepłukać system gradientowy (Rinse).
  6. Po zakończeniu płukania nacisnąć opcję czyszczenia w oknie dialogowym na monitorze komputera (Clean). Po zakończeniu cyklu czyszczenia wyjąć pływak z komory i całkowicie osuszyć pływak oraz komorę za pomocą niepozostawiającej włókien chusteczki do czyszczenia (krytyczne: pozostała woda spowoduje lizę erytrocytów, co wywoła interferencję).
    Uwaga: Raport z osmoscanu dostarcza wskaźniki elongacji w całym gradiencie osmotycznym. Parametry EI Min, O (EI Min), EI Max, O (EI Max), EI hyper oraz O hyper są generowane automatycznie i zawarte w raporcie. Zakres parametrów ektacytometrii gradientu osmotycznego uzyskany z krwi 9 zdrowych ochotników wynosi: EI Min 0.12-0.196 jednostek arbitralnych (a.u.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 a.u.; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg; EI hyper 0.278-0.286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.

5. Wyłączanie ektacytometru

  1. Przed wyłączeniem należy odpowiednio wyczyścić instrument.
    1. W tym celu podłącz przewody z roztworów o niskiej i wysokiej osmolarności do adaptera Y prowadzącego do roztworu czyszczącego. Umieść fiolkę z roztworem czyszczącym pod igłą po lewej stronie urządzenia i opuść igłę, aż dotknie dna fiolki. Upewnij się, że pływak jest całkowicie opuszczony do kubka.
    2. Zamknij oprogramowanie i naciśnij przycisk start w oknie dialogowym czyszczenia końcowego dnia na monitorze komputera (Zamknij | Start). Pozostaw instrument do pełnego zakończenia cyklu czyszczenia.
  2. Odłącz przewody prowadzące do butelki z odpadami i usuń ją z instrumentu, aby wylać odpady. Całkowicie osusz pływak. Wyłącz urządzenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki ektacytometrii opisane w niniejszym manuskrypcie mogą być wykorzystane do pomiaru odkształcalności erytrocytów w dowolnych warunkach. Schemat ogólnej budowy ektacytometru przedstawiono na Rysunku 1. Homogeniczne populacje erytrocytów w odpowiedzi na zwiększające się naprężenie ścinające wytworzą eliptyczny wzór dyfrakcyjny, który może służyć do obliczenia indeksu wydłużenia, jak pokazano na Rysunku 2. Zniekształcenie wzoru...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane techniki ektacytometrii są proste i dobrze zautomatyzowane, co zapewnia ważne i powtarzalne wyniki. Niemniej jednak istnieją pewne krytyczne kroki. Ważna jest właściwa kontrola temperatury krwi. Przechowywanie w temperaturze pokojowej przez ponad osiem godzin może mieć wpływ na wartości SS 1/2. 34 Ważne jest również zapewnienie, że temperatura maszyny jest stabilna na poziomie 37 °C, ponieważ lepkość zawiesiny zależy od temperatury. Krew powinna być w pełni natleniona, aby uniknąć zmniejsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program Narodowych Instytutów Cukrzycy, Chorób Układu Pokarmowego i Nerek oraz Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia. Wyłączną odpowiedzialność za opinie wyrażone w niniejszym dokumencie ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LoRRca MaxSis wersja standardowaMechatronikaLORC109000
LoRRca MaxSis OsmoscanMechatronikaLORC109001
Roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) 0mOsmMechatronikaQRR030910
Roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) 500mOsmMechatronikaQRR030930
Roztwór poliwinylopirolidonu (PVP) 5mL fiolkiMechatronikaQRR030901
X czystaQRR010946Mechatronika
P1000 MilliporeSigmaZ646555
P200Końcówki filtrujące MilliporeSigmaZ646547
P200Końcówki filtrujące MidSciAV200-H
P1250 Chusteczkifiltracyjne MidSciAV1250-H
ChusteczkiMidSci8091
1,5 mlMidSci
15 mlMidSciZobacz materiał C15R
Eppendorf Fiolka stożkowa AVSS1700

Bibliografia

  1. Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
  2. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
  3. Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
  4. Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
  5. Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
  6. Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
  7. Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
  8. Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
  9. Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
  10. Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
  11. Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
  12. Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
  13. Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
  14. Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
  15. Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
  16. Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
  17. Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
  18. Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
  19. Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
  20. Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
  21. Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
  22. Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702(2015).
  23. Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
  24. Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
  25. Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
  26. Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
  27. Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
  28. Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
  29. Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
  30. Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
  31. Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
  32. Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
  33. Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
  34. Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
  35. Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
  36. Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
  37. von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
  38. Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Deformowalno krwinek czerwonychheterogeniczno krwianemia sierpowatagradient osmotycznywz r dyfrakcyjnywska nik wyd u eniask ad hemoglobinynawodnienie kom rkowekrucho osmotyczna
Pomiar odkształcalności i niejednorodności krwinek czerwonych we krwi za pomocą ektacytometrii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.