Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W celu zwiększenia efektywności w tworzeniu genetycznie modyfikowanych myszy za pomocą metodologii ES Cell, prezentujemy adaptację do obecnego protokołu wstrzykiwania blastocyst. Tutaj donosimy, że prosta rotacja zarodka i wstrzyknięcie przez masę komórkową Trans-Inner (TICM) zwiększyło odsetek myszy chimerycznych z 31% do 50%, bez dodatkowego sprzętu lub dalszego specjalistycznego szkolenia. 26 różnych wsobnych klonów, a łącznie 35 klonów zostało wstrzykniętych w ciągu 9 miesięcy. Nie stwierdzono istotnej różnicy ani w odsetku ciąż, ani w odsetku wyzdrowień zarodków między tradycyjnymi technikami iniekcji a TICM. W związku z tym, bez większych zmian w procesie wstrzykiwania i prostego pozycjonowania blastocysty i wstrzykiwania przez ICM, uwolnienie komórek ES do jamy blastocoelu może potencjalnie poprawić ilość produkcji chimerycznej i późniejszą transmisję linii zarodkowej.
Wprowadzenie
Przez prawie 25 lat, tworzenie genetycznie ukierunkowanych myszy było powolnym procesem, często hamowanym przez wąskie gardło na etapie mikroiniekcji komórek ES blastocyst w celu wytworzenia chimer przenoszących linię zarodkową. Ostatnie osiągnięcia, w tym CRISPR/Cas91,2 w komórkach ES i wysokoprzepustowe konsorcja generujące komórki ES, takie jak KOMP, poprawiły generację/dostępność genetycznie modyfikowanych komórek ES. Jednak generowanie chimer linii zarodkowej pozostaje wąskim gardłem w tworzeniu genetycznie zmodyfikowanych myszy z tych komórek ES3,4. Wysokoprzepustowe projekty generowania komórek ES są nękane przez dużą zmienność jakości komórek ES, co ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego tworzenia chimer linii zarodkowej. Dodatkowo, niektóre z powszechnie wykorzystywanych linii komórkowych ES są znane z wysokiej aneuploidii i trudnej produkcji chimerów kompetentnych dla linii zarodkowej5.
Wiele metod zostało opracowanych do tworzenia myszy z wyższą chimerą lub całkowicie pochodzącymi z komórek ES myszy6,7,8,9,10. Chociaż każdy z tych systemów ma swoje zalety, mają one również swoje wady. Generowanie tetraploidalnych chimer, podczas gdy generuje myszy pochodzące w 100% z komórek ES, jest nieefektywne i generalnie ograniczone do linii niekrewniaczych 5,6. Nowsze metody wstrzykiwania moruli mogą dawać wysoki procent chimer, zbliżający się do 100%, ale generalnie wymagają znacznego dodatkowego sprzętu (lasery lub piezosy) i treningu10,11. W laboratoriach, w których techniki te są już stosowane, ta nowa metodologia może nie być konieczna.
Celem tego badania było znalezienie metody, która wykorzystuje powszechne techniki i łatwo dostępny sprzęt w celu zwiększenia tempa wytwarzania chimer, zwiększając szansę na transmisję linii zarodkowej zmutowanego allelu w celu założenia kolejnej kolonii myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie operacje zostały wykonane w ramach normalnego działania obiektu NIEHS Knock Out Mouse Core. Wszystkie myszy były utrzymywane w cyklu światło: ciemność o godzinie 12:12 i były karmione dietą NIH-31 i wodą ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym.
1. Przygotowanie zwierząt
- Rasa myszy dawców, samice myszy B6(Cg)-Tyr/J w wieku 8 - 10 tygodni naturalnie do samców myszy B6(Cg)-Tyr/J w wieku od 8 do 26 tygodni. Sprawdź wzrokowo wtyczki następnego ranka (E0.5).
- Myszy biorcy rasy szwajcarskiej Webster w wieku od 6 do 9 tygodni są naturalnie hodowane na samcach myszy szwajcarskich Webster poddanych wazektomii. Sprawdź wzrokowo wtyczki następnego ranka (E0.5).
2. Przygotowanie komórek ES
- W przypadku komórek ES AB2.2 pochodzących ze 129 źródeł, komórki hodowlane w DMEM uzupełnione 15% FBS, 1% glutaminy, 1% Penna / paciorkowca i 0,1% β-merkaptoetanolu. Hoduj wszystkie inne komórki ES zgodnie z instrukcjami dostawcy komórek ES, stosując zalecane przez nich protokoły.
3. Pobieranie zarodków
- Sekcja zwierząt
- Przygotuj kilka naczyń o średnicy 60 mm, około 1 na 5 myszy plus 3 dodatkowe, z 10 ml pożywki do zbierania strumieniowo-ściernego (BCM) (10% FBS W DMEM) i jednej 4-dołkowej pożywki z 0,5 ml BCM na studzienkę. Zrównoważyć w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Poddaj eutanazji samice myszy B6(Cg)-Tyr/J w E3,5 za pomocą uduszenia CO2 przy natężeniu przepływu 10%.
- Po eutanazji ułóż myszy w pozycji leżącej na plecach i dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem.
- Wykonaj pierwsze nacięcie tylko przez skórę, w środku brzucha, tak aby otwór był jak najszerszy. Następnie otwórz przez ścianę brzucha, ponownie wykonując nacięcie tak szerokie, jak to możliwe.
UWAGA: Wykonanie tej czynności w dwóch krokach pomaga zmniejszyć lub wyeliminować zanieczyszczenie sierści. - Zaczynając od jajnika i przytrzymując poduszeczkę tłuszczową jajnika kleszczami, ostrożnie usuń jajnik, jajowód i macicę, zwracając szczególną uwagę, aby ograniczyć tkankę tłuszczową do minimum. Usuń macicę jako pojedynczą jednostkę lub jako pojedyncze rogi, bez zmian w poniższej procedurze.
- Po usunięciu umieść macicę w naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym pożywkę do zbierania ścierniwa.
- Usuwanie zarodków
- Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną BCM i wyposażyć ją w igłę o pojemności 25 g.
- Po jednej macicy na raz, wyjmij je z naczynia podtrzymującego BCM, osusz je na tkance w celu usunięcia nadmiaru krwi i umieść w naczyniu o średnicy 60 mm pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu.
- Ostrożnie i delikatnie trzymając macicę tuż poniżej dystalnego końca (w pobliżu jajowodu) kleszczami preparacyjnymi, włóż igłę do środka macicy w jak najbardziej równoległej płaszczyźnie. Włóż igłę tuż za końcówki kleszczy.
- Wywieraj pewien nacisk na kleszcze, aby przytrzymać macicę przy igle i wydalić około 1 ml BCM przez róg macicy.
UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ zbyt duży nacisk na strzykawkę spowoduje niekontrolowany strumień pożywki, który często opuszcza naczynie. - Po przepłukaniu macicy, do 5 całych macic na miskę 60 mm, umieść naczynie z powrotem w inkubatorze do momentu pobrania.
- Pobieranie zarodków
- Używając ręcznie rysowanej szklanej pipety i pipety do jamy ustnej, zbierz blastocysty pod lunetą sekcyjną, ustawioną między 25X a 35X. (Rysunek 1).
UWAGA: Pipeta doustna składa się z elastycznej rurki o długości 30 - 40 cm, o średnicy wewnętrznej poniżej 5 mm. Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl, skieruj najpierw do jednego końca i umieść w niej szklaną pipetę. Dodaj filtr strzykawkowy na drugi koniec, z dołączoną lufą strzykawki o pojemności 1 cm3, bez tłoka, aby działał jako ustnik. - Wyjmując szalki z inkubatora i używając wzoru siatki, zbadaj każdą część szalki pod kątem zarodków. Zarodki są pobierane pojedynczo i umieszczane na kropli BCM w naczyniu wtórnym.
- Po zebraniu ze wszystkich szalek umyj zarodki jeszcze raz w kropli świeżego BCM, a następnie umieść w naczyniu z 4 dołkami w oczekiwaniu na wstrzyknięcie.
- Używając ręcznie rysowanej szklanej pipety i pipety do jamy ustnej, zbierz blastocysty pod lunetą sekcyjną, ustawioną między 25X a 35X. (Rysunek 1).
4. Wstrzyknięcie zarodka
- Komórki ES należy pobrać pojedynczo za pomocą igły do wstrzykiwań na podstawie potwierdzenia.
- Przygotować naczynie iniekcyjne, dodając 5 - 7 ml pożywki iniekcyjnej (DMEM, 10% FBS i 20 mM HEPES) do naczynia iniekcyjnego ze szklanym dnem. Iniekcje wykonuje się w temperaturze pokojowej.
- Używając mikrowtryskiwacza powietrznego lub olejowego, zastosuj podciśnienie do igły iniekcyjnej, aby wciągnąć komórki ES. Zadbaj o to, aby między komórkami było jak najmniej miejsca. Policz komórki ES tutaj lub na etapie wstrzykiwania.
- Wybierz komórki ES, które są średniej lub małej wielkości w porównaniu z ogólną populacją komórek, o gładkiej powierzchni i bez widocznych defektów, takich jak wakuole.
UWAGA: Populacje komórek ES różnią się znacznie pod względem jakości morfologicznej, a stosowane standardy będą musiały się do nich dostosować.
- Wstrzyknąć zarodkom około 15 komórek ES (Ryc. 1).
- Przymocuj końcówkę pipety do drugiego mikrowstrzykiwacza powietrza i umieść zarodek w pobliżu otworu uchwytu. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować zarodek do uchwytu.
- Dostosuj do osi z, przesuwając pipetę trzymającą w górę lub w dół, tak aby zarodek dotykał szkiełka, a następnie dokładnie ustaw ostrość na zonę. Następnie wyreguluj oś Z igły do wstrzykiwań tak, aby komórki ES w pobliżu końcówki były ostre.
- Wyreguluj teraz zarodek, delikatnie popychając igłę do wstrzykiwań u góry lub u dołu, obracając ją, aby ustawić ICM w żądanej pozycji.
- Wprowadzić igłę do wstrzykiwań przez zonę i ICM lub trofoblast, używając mocnego, ale kontrolowanego nacisku. Lekko docisnąć mikrowstrzykiwacz igły do wstrzykiwań, aby zapobiec zapadnięciu się blastocoelu.
- Gdy igła wbije się w blastocoel, należy wywrzeć nacisk na mikrowstrzykiwacz, aby przenieść komórki ES do blastocoelu zarodka. Zatrzymaj się na chwilę, gdy skos igły zacznie wychodzić z zarodka, aby ciśnienie w zarodku powróciło do normy, jednocześnie zachowując komórki.
UWAGA: Komórki ES grupy referencyjnej zostały wstrzyknięte normalnie, zgodnie z tradycyjnym protokołem wstrzykiwania komórek ES9, uważając, aby nie dotknąć ICM. Komórki ES zostały również wstrzyknięte przez ICM, przepychając igłę bezpośrednio przez ICM (TICM) (Rysunek 2, film uzupełniający).
5. Transfer eEmbrionów
- Przenieś zarodki do szwajcarskich myszy Webster w E2.5, używając niechirurgicznego urządzenia do transferu zarodków, zgodnie z procedurami producenta. Ta niechirurgiczna procedura nie wymaga znieczulenia ani specjalnej opieki pooperacyjnej. Myszy domowe pojedynczo po transferze zarodków oraz podczas porodu i późniejszego odsadzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Traktując linię komórkową jako efekt losowy, do analizy danych w oprogramowaniu (np. SAS (wersja 9.2)) wykorzystano liniowy model mieszany. W każdej analizie uwzględniono liczbę przeniesionych embrionów oraz linię komórkową. Druga analiza uwzględniała również liczbę przeżyłych szczeniąt.
W niniejszym badaniu każda linia i klon komórek ES zostały zainfekowane zarówno za pomocą tradycyjnych technik, jak i techniki TICM, naprzemien...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Od dawna uważano, że jakiekolwiek zaburzenie ICM może prowadzić do śmiertelności, w rzeczywistości obecne protokoły mikroiniekcji blastocyst nadal ostrzegają przed tym12,13. Wykazaliśmy tutaj, że mikroiniekcja przez ICM nie jest szkodliwa dla zarodka i zwiększa wydajność chimer.
Dokładny mechanizm tego efektu nie został zidentyfikowany. Jednak mechaniczne rozerwanie ICM i towarzyszący mu hipoblast powinny zwiększyć częstość integracji ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
To badanie było wspierane [częściowo] przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Specjalne podziękowania dla Shyamala Peddady za analizę statystyczną. Pragniemy również podziękować Humphreyowi Yao, Gary'emu Birdowi i Yuki Arao za recenzję tego manuskryptu oraz Franco DeMayo za jego nieustające wsparcie i rady.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła do wstrzykiwań ES Cell | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET Urządzenie | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | partie powinny być indywidualnie testowane pod kątem kompatybilności z ES Cell. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-merkaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Mikromanipulator | Leica | Mikromanipulator | |
| Mikro wtryskiwacz | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Mikroskop | Leica | DM IRB | |
| 4-dołkowy | talerz Thermo Scientific | 176740 | |
| Talerz 60 mm | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster myszy | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Naczynie iniekcyjne | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Bibliografia
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse embryo. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
