Artykuł metodologiczny

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

DOI:

10.3791/56972

⸱

5 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje histonów stanowią główny składnik epigenomu i odgrywają ważną rolę regulacyjną w określaniu statusu transkrypcyjnego powiązanych loci. Ponadto obecność określonych modyfikacji została wykorzystana do określenia pozycji i tożsamości niekodujących elementów funkcjonalnych, takich jak wzmacniacze. W ostatnich latach immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-seq) stało się potężnym narzędziem do określania profili poszczególnych modyfikacji histonów w całym genomie. Jednak staje się coraz bardziej jasne, że kombinatoryczne wzorce modyfikacji chromatyny, określane jako stany chromatyny, określają tożsamość i charakter powiązanego locus genomu. W związku z tym do kompleksowego określania stanów epigenomicznych w dużej liczbie próbek potrzebne są przepływy pracy składające się z solidnych metodologii o wysokiej przepustowości (HT) do profilowania wielu znaczników modyfikacji histonów, a także potoków analiz obliczeniowych zdolnych do obsługi niezliczonych zestawów danych profilowania ChIP-Seq. Przedstawiony tutaj przepływ pracy HT-ChIP-Seq składa się z dwóch modułów: 1) eksperymentalnego protokołu profilowania kilku modyfikacji histonów z niewielkich ilości próbek guza i linii komórkowych w formacie 96-dołkowym; oraz 2) potok obliczeniowej analizy danych, który łączy istniejące narzędzia do obliczania zarówno indywidualnego zajętości znaczników, jak i kombinatorycznych wzorców stanu chromatyny. Razem te dwa moduły ułatwiają łatwe przetwarzanie setek próbek ChIP-Seq w szybki i wydajny sposób. Przedstawiony tutaj przepływ pracy służy do wyprowadzania wzorców stanu chromatyny z 6 profili znaczników histonów w guzach czerniaka i liniach komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiamy kompleksowy przepływ pracy ChIP-seq, który można zastosować do dziesiątek próbek ludzkich guzów i linii komórek rakowych w celu określenia aberracji epigenomicznych w różnych nowotworach złośliwych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość genomów ssaków (98 - 99%) składa się z sekwencji niekodującej, a te regiony kodowania zawierają elementy regulatorowe, o których wiadomo, że uczestniczą w kontrolowaniu ekspresji genów i organizacji chromatyny1,2. W normalnej komórce specyficzne złożenie genomowego DNA w zagęszczoną strukturę chromatyny ma kluczowe znaczenie dla organizacji przestrzennej, regulacji i precyzyjnego czasu różnych procesów związanych z DNA3,4,5. Jednak w komórce nowotworowej modyfikacje chromatyny przez nieprawidłowe mechanizmy epigenetyczne mogą prowadzić do niewłaściwej organizacji struktury chromatyny, w tym dostępu do elementów regulatorowych, systemów pętli chromosomowych i wzorców ekspresji genów6,7,8,9,10.

Pomimo ostatnich osiągnięć, mamy ograniczoną wiedzę na temat zmian epigenetycznych, które są związane z progresją guza lub odpowiedzią terapeutyczną. Epigenom składa się z szeregu modyfikacji, w tym znaczników histonowych i metylacji DNA, które wspólnie tworzą stan dynamiczny (określany jako stan chromatyny), który wpływa na sieci ekspresji genów i inne procesy krytyczne dla utrzymania tożsamości komórkowej. Ostatnio wykazano zmiany w wzmacniaczach w wielu nowotworach złośliwych, badając profile H3K27Ac11. Chociaż takie badania dają wgląd w korelację izolowanych znaczników epigenetycznych, zidentyfikowano ponad 100 modyfikacji epigenetycznych12,13 bez jasnego zrozumienia ich ról biologicznych i współzależności. Co więcej, istnieje jeszcze większa liczba możliwych wzorców kombinatorycznych tych modyfikacji histonów i DNA, i to właśnie te wzorce kombinatoryczne - a nie indywidualne modyfikacje - dyktują stany epigenetyczne14. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba zidentyfikowania zmian w tych stanach chromatyny podczas progresji raka lub odpowiedzi na terapię. Kompleksowa wiedza na temat zmian epigenomu w nowotworach pozostaje w tyle częściowo ze względu na wyzwania techniczne (np. generowanie danych na dużą skalę z niewielkiej ilości materiału klinicznego/pojedynczych komórek) i analityczne (np. algorytmy do definiowania stanów kombinatorycznych). W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na solidne, wysokoprzepustowe metody profilowania dużej liczby znaczników modyfikacji histonów z materiału klinicznego oraz łatwe do wdrożenia podejścia obliczeniowe do przewidywania wzorców kombinatorycznych, które ułatwią określenie stanów epigenetycznych związanych z różnymi etapami nowotworzenia i opornością terapeutyczną. Ponadto dostępne są dane z ostatnich badań profilowania epigenomu15,16,17,18,19,20,21,22,23 W normalnych tkankach i liniach komórkowych można zintegrować z profilami chromatyny guzów w celu uzyskania dalszych informacji na temat wkładu epigenomu w biologię nowotworu.

Profilowanie chromatyny stało się potężnym narzędziem do identyfikacji globalnych wzorców wiązania różnych modyfikacji chromatyny15,24. W ostatnich latach ChIP-seq stał się "złotym standardem" w badaniu interakcji DNA-białko na skalę globalną25,26,27. W przypadku każdego eksperymentu ChIP-seq istnieją kluczowe etapy niezbędne do jego powodzenia, w tym przetwarzanie i dysocjacja tkanek, określanie optymalnych warunków sonikacji, określanie optymalnego stężenia przeciwciał do wytrącania, przygotowanie biblioteki, przetwarzanie danych po sekwencjonowaniu i dalsza analiza. Każdy z tych kroków zawiera kluczowe punkty kontrolne kontroli jakości, a gdy są rozpatrywane razem, mają kluczowe znaczenie dla prawidłowej identyfikacji potencjalnych celów walidacji funkcjonalnej. Dzięki innowacjom na tych etapach, w kilku wcześniejszych badaniach opracowano metodologie wykonywania ChIP lub ChIP-Seq z niewielkiej ilości tkanek28,29,30,31,32. Co więcej, niektóre badania sugerują protokoły dla wysokoprzepustowych eksperymentów ChIP, a następnie kwantyfikację opartą na PCR33,34. Wreszcie, niektóre publicznie dostępne platformy analityczne dla danych ChIP-Seq są już dostępne, takie jak Easeq35 i Galaxy36. Brakowało jednak zintegrowanej platformy do wykonywania ChIP-Seq w sposób wysokoprzepustowy w połączeniu z potokiem obliczeniowym do wykonywania analiz pojedynczych znaczników oraz stanu chromatyny.

Ten protokół opisuje kompletny i wszechstronny przepływ pracy ChIP-seq do mapowania całego genomu stanów chromatyny w tkankach nowotworowych i liniach komórkowych, z łatwymi do naśladowania wytycznymi obejmującymi wszystkie kroki niezbędne do udanego eksperymentu. Przyjmując metodę wysokoprzepustową opisaną wcześniej przez Blechera-Gonena i wsp.37, ten protokół może być wykonywany na dziesiątkach próbek równolegle i został z powodzeniem zastosowany na liniach komórek rakowych i nowotworach ludzkich, takich jak czerniak, okrężnica, prostata i glejak wielopostaciowy. Pokazujemy metodologię sześciu podstawowych modyfikacji histonów, które reprezentują kluczowe elementy epigenetycznego krajobrazu regulacyjnego w ludzkich liniach komórkowych czerniaka i próbkach guza. Modyfikacje te obejmują H3K27ac (wzmacniacze), H3K4me1 (aktywne i zrównoważone wzmacniacze), H3K4me3 (promotory), H3K79me2 (transkrybowane regiony), H3K27me3 (represja polycomb) i H3K9me3 (represja heterochromatyczna). Znaczniki te mogą być używane samodzielnie lub w połączeniu do identyfikacji funkcjonalnie odrębnych stanów chromatyny reprezentujących zarówno domeny represyjne, jak i aktywne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki kliniczne zostały uzyskane zgodnie z wytycznymi Institutional Review Board.

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotować 200 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) pH 8,0).
  2. Przygotować 200 ml buforu STE (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 140 mM NaCl).
  3. Przygotować 200 ml 2,0 M glicyny (37,52 g glicyny w 200 ml wody) i podgrzać do 65 °C.
  4. Przygotować 200 ml 5% roztworu deoksycholanu sodu (DOC) (10 g DOC w 200 ml wody).
  5. Przygotować 500 ml buforu do zbioru ChIP (12 mM Tris-Cl, 0,1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 6 mM EDTA, 0,5% dodecylosiarczan sodu (SDS)).
  6. Przygotować 500 ml buforu rozcieńczającego ChIP (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1% DOC, 1% Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Przygotuj 500 ml buforu do płukania RIPA (STE, 1% Triton x-100, 0,1% SDS, 0,1% DOC).
  8. Przygotować 500 ml buforu do płukania RIPA/500 (bufor RIPA + 360 mM NaCl).
  9. Przygotować 500 ml buforu do płukania LiCL (TE, 250 mM LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Przygotować 500 ml buforu do bezpośredniej elucji: 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0,5% SDS.
  11. Przygotować 50 ml buforu wiążącego/blokującego przeciwciała (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA wolnego od IgG).

2. Przetwarzanie i sieciowanie linii tkankowych/komórkowych

  1. Jeśli tkanka jest błyskawicznie zamrożona, rozmrozić ją na lodzie przed dysocjacją.
  2. Odłącz 50 mg tkanki (~ 8 mg na przeciwciało modyfikujące histony) ręcznie w 2 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) za pomocą sterylnej żyletki. Zmielić tkankę na kawałki o średnicy od 3 do 4 mm przez około 5 minut w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych.
  3. Przenieś tkankę i roztwór HBSS do probówki dysocjacyjnej i dodaj kolejne 8 ml HBSS. Dalej odłącz tkankę za pomocą dysocjatora, aż do homogenizacji.
  4. W przypadku guzów czerniaka umieść rurki w dysocjatorze i uruchom następujące cykle każdy raz w tej kolejności: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 i m_heart_02.01.
  5. Zeskrob 21 × 106 komórek w 10 ml pożywki (~3 × 106 na modyfikację histonów i wejście; można ją obniżyć do 100 000 komórek na znak dla rzadkich populacji) wyhodowanych w standardowym naczyniu do hodowli tkankowych i zebrać je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    Uwaga: Pożywka stosowana do reprezentatywnej linii komórkowej czerniaka WM115 to DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą i 5% penicyliną/streptomycyną.
  6. Usieciuj tkankę/komórki za pomocą 1% końcowego stężenia formaldehydu, dodając 200 μl 16% formaldehydu na 3 ml HBBS dla tkanki (lub 3 ml pożywki dla komórek). Wstrząsać mieszaniną przy 10 obr./min za pomocą miksera dokładnie przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Formaldehyd jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w odpowiednim dygestorium.
  7. Dodać 200 μl 2,0 M glicyny na 3 ml próbki i kontynuować wytrząsanie z prędkością 10 obr./min przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Glicyna działa jako środek gaszący. Przygotuj świeży roztwór glicyny co miesiąc, ponieważ pH roztworu ma tendencję do upływu czasu.
  8. Wirować próbki w temperaturze 934 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki stołowej. Usunąć sklarowany osad, dodać 5 ml lodowatego PBS, ponownie odwirować próbki przy stężeniu 934 x g i usunąć supernatant.
  9. Błyskawiczne zamrożenie granulatu i przechowywanie go w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania.

3. Liza tkanek, sonikacja i przygotowanie przeciwciał

  1. Rozpuścić 1 tabletkę inhibitora proteazy na 10 ml buforu do zbioru ChIP.
  2. Dodać 300 μl buforu do zbioru ChIP z inhibitorami proteazy na 50 mg tkanki i pozostawić na lodzie 30 minut lizy.
    UWAGA: Dodać 300 μl buforu do zbioru ChIP z inhibitorami proteazy na 1 X 107 linii komórkowych czerniaka WM115.
  3. Podczas lizy komórek włącz zakłócacz kąpieli wodnej i związany z nim system chłodzenia i pozwól, aby temperatura osiągnęła 4 °C. Umieść probówki sonikatora w zaburzaczu łaźni wodnej i poddaj soniku tkanki czerniaka przez 60 cykli przez 30 s włączania i 30 s przerwy, aby uzyskać fragmenty chromatyny o długości ~200 - 600 par zasad (bp).
    UWAGA: Czas sonikacji może się różnić w zależności od typu tkanki i powinien być odpowiednio dostosowany. Jest to krytyczny krok i powinien zostać zoptymalizowany w eksperymencie pilotażowym przed przystąpieniem do immunoprecypitacji.
  4. Podczas sonikacji należy trzykrotnie przepłukać 20 μl kulek magnetycznych białka G na przeciwciało na próbkę za pomocą 1000 μl buforu wiążącego/blokującego (PBS + 0,1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Dla ~8 mg tkanki czerniaka inkubować 3 μg każdego przeciwciała histonowego w 100 μl buforu wiążącego/blokującego przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z rotacją za pomocą rewolweru probówkowego. 12 próbek dla pojedynczego przeciwciała zawiera 240 μl kulek, 36 μg przeciwciała i 1200 μl buforu wiążącego/blokującego.
    UWAGA: W przypadku 3 × 106 komórek użyj 5 μg każdego przeciwciała i 30 μl kulek magnetycznych białka G na przeciwciało. Kulki przeciwciała i białka G należy miareczkować, jeśli używana jest różna ilość tkanki. Protokół ten ilustruje warunki immunoprecypitacji dla opisanych sześciu modyfikacji histonów (tabela materiałów), jednak stężenia przeciwciał powinny być zoptymalizowane pod kątem innych modyfikacji i czynników transkrypcyjnych.
  6. Aby określić wielkość fragmentu, usuń 20 μl soncyowanego roztworu chromatyny i dodaj główną mieszaninę buforu elucyjnego (temperatura pokojowa) zawierającą 44 μl buforu do bezpośredniej elucji, 1 μl RNazy (20 mg / ml) i 5 μl proteinazy K (20 mg / ml) na próbkę. Próbki należy inkubować w termocyklerze PCR przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 50 °C. Oczyść próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Upewnij się, że chromatyna jest wystarczająco ścinana, określając rozmiar fragmentu za pomocą elektroferogramu DNA o wysokiej czułości przed przejściem do kroku 3.6. Włącz instrument do elektroferogramu.
  8. Załadować 2 μl odczynnika buforowego o wysokiej czułości do każdej studzienki 8-dołkowego paska rurki optycznej. Załadować 2 μl drabinki o wysokiej czułości do pierwszego dołka i 2 μl oczyszczonych próbek do pozostałych studzienek.
  9. Umieść nasadki tubusu optycznego na końcówkach probówki i wiruj próbki z prędkością 2000 obr./min przez 1 minutę. Otwórz pokrywę i włóż nową taśmę sitową o wysokiej czułości oraz pudełko z końcówkami ładującymi. Zdejmij nakrętki pasków i załaduj próbki do przyrządu do elektroferogramu.
  10. Otwórz oprogramowanie do analizy, zaznacz pierwsze trzynaście pól na taśmie ekranowej i naciśnij zakładkę Start w prawym dolnym rogu. Fragmenty chromatyny w zakresie ~200 - 1000 pz są odpowiednie dla ChIP.
  11. Przenieść sonikowany roztwór do sterylnych probówek i wirować probówki przy 21,130 x g za pomocą wirówki stołowej przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowych probówek.
  12. Oznaczyć całkowitą objętość supernatantu i usunąć 10% całkowitego roztworu do kontroli wejściowej i przechowywać go w temperaturze 4 °C.

4. Immunoprecypitacja chromatyny

  1. Rozpuścić 2 tabletki inhibitora proteazy na 20 ml buforu rozcieńczającego ChIP.
  2. Po sonikacji rozcieńczyć pozostałą próbkę 5 razy, używając buforu rozcieńczającego ChIP, aby obniżyć poziom SDS do 0,1%. Rozcieńczyć 270 μl pozostałego supernatantu 1080 μl buforu rozcieńczającego ChIP, aby uzyskać końcową całkowitą objętość 1350 μl.
  3. Po zakończeniu inkubacji kulek magnetycznych przeciwciała i białka G umieść probówkę na magnesie i usuń supernatant.
  4. Gdy rurka nadal znajduje się na magnesie, umyj kulki raz, dodając 750 μl buforu rozcieńczającego ChIP z inhibitorami proteazy.
    UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie nie naruszać koralików ani nie obracać rurek.
  5. Usunąć bufor rozcieńczający ChIP, przemyć i ponownie zawiesić kulki w 240 μl tego samego buforu rozcieńczającego ChIP. Podzielić 20 μl kulek na 12 oddzielnych probówek, z których każda jest używana do oddzielnej próbki tkanki.
  6. Podwielokrotność sonikowanego materiału równomiernie podzielić na kulki białka G ze specyficznym przeciwciałem i bębnić za pomocą rewolweru rurowego przez noc w temperaturze 4 °C.

5. Mycie i odwrotne sieciowanie immunoprecypitowanych kompleksów DNA-białko

  1. Następnego ranka po odwrotnym usieciowaniu przenieś roztwór przeciwciała i białka na 96-dołkową płytkę i umieść ją na stojaku magnetycznym. Pozwól kulkom przylegać przez co najmniej 30 s i usuń supernatant.
  2. Umyj kulki 5 razy 150 μl lodowatego buforu myjącego RIPA za pomocą wielokanałowej pipety. Podczas etapów prania nie pipetuj kulek, ale przesuwaj magnes w sposób ciągły od prawej do lewej przez 30 sekund na pranie.
  3. Próbki należy przepłukać dwukrotnie 150 μl lodowatego buforu płuczącego RIPA-500.
  4. Przepłukać próbki dwukrotnie 150 μl lodowatego buforu do przemywania LiCl.
  5. Próbki należy przemyć jednorazowo 150 μl lodowatego buforu do przemywania TE i natychmiast usunąć bufor TE. Ten krok można pominąć w przypadku aplikacji o niskim wkładzie wejściowym.
  6. Dodaj kontrolkę wejściową z kroku 3.7 do świeżych studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej próbki DNA ChIP.
  7. Po etapach przemywania dodać główną mieszaninę buforu elucyjnego (temperatura pokojowa) zawierającą 44 μl buforu do bezpośredniej elucji, 1 μl RNazy (20 mg/ml) i 5 μl proteinazy K (20 mg/ml) na próbkę ChIP i próbkę wejściową w celu odwrotnego sieciowania.
  8. Próbki należy inkubować za pomocą termocyklera PCR przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, 4 godziny w temperaturze 50 °C i 8–16 godzin w temperaturze 65 °C.

6. Oczyszczanie i kwantyfikacja wytrąconego DNA

  1. Następnego ranka umieść próbki z powrotem na magnesie i przenieś supernatant na nową 96-dołkową płytkę PCR, która zawiera immunoprecypitowane DNA.
  2. Dodać 2,3 x kulki paramagnetyczne do roztworu (115 μl na 50 μl roztworu) i ostrożnie pipetować w górę i w dół 25 razy za pomocą pipety wielokanałowej. Roztwór stanie się jednorodny, jeśli zostanie odpowiednio wymieszany.
  3. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej z magnesu przez 4 minuty. Umieścić próbki z powrotem na magnesie i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 minuty. Wyrzucić supernatant.
  4. Pozostawiając próbki na magnesie, dodaj 150 μl 70% etanolu (vol/vol) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 s bez naruszania kulek.
  5. Usuń etanol i powtórz pranie. Pozostaw kulki paramagnetyczne do wyschnięcia na magnesie na powietrzu przez 5 minut.
    UWAGA: Usuń cały etanol po drugim praniu, ponieważ pozostały etanol będzie przeszkadzał w oczyszczaniu.
  6. Wyjmij próbki z magnesu i dodaj 30 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać pipetując 25 razy i inkubować próbki w temperaturze pokojowej z magnesu przez 4 minuty.
  7. Umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 minuty. Przenieś 20 μl każdej próbki na nową 96-dołkową płytkę w celu przygotowania biblioteki. Przechowuj pozostałe 10 μl DNA ChIP na wypadek jakichkolwiek potencjalnych problemów z generowaniem bibliotek.
  8. Na tym etapie należy określić ilościowo DNA ChIP przed przygotowaniem biblioteki. Stężenie DNA mierzy się za pomocą odczynników DNA o wysokiej czułości. Określ rozkład wielkości wytrąconego DNA za pomocą elektroferogramu DNA o wysokiej czułości, przechodząc do kroku 7.1.

7. Generowanie bibliotek za pomocą zestawu NEBNext Ultra II DNA Library Preparation Kit

  1. Wygeneruj biblioteki do sekwencjonowania NGS za pomocą przygotowania biblioteki DNA zgodnie z zalecanym protokołem producenta. Wszystkie reakcje przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych, a inkubacje przeprowadza się w termocyklerze PCR z temperaturą pokrywy ustawioną > 100 °C i objętością ustaloną na 50 μl.
  2. W przypadku indeksów używane są Multiplex Oligos dla platformy NGS. Wykonaj łącznie 10 cykli amplifikacji PCR przy użyciu następujących ustawień: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, denaturacja w temperaturze 98 °C przez 10 s, wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 65 °C przez 30 s (10 x cykle), końcowe przedłużenie 65 °C przez 5 minut i utrzymywanie w temperaturze 4°C.
    UWAGA: Tabela 1 zawiera startery używane do amplifikacji PCR.
  3. Po amplifikacji PCR usunąć próbki i doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz. Dokonaj dwustronnego wyboru rozmiaru paramagnetycznego (0,55x/0,8x), dodając najpierw 55 μl kulek i mieszając pipetując 25 razy. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej z dala od magnesu przez 4 minuty.
  4. Umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 minuty. Ten krok służy do zatrzymywania dużych fragmentów na koralikach, które nie nadają się do sekwencjonowania.
  5. Przenieść supernatant na nową 96-dołkową płytkę do PCR. Nie należy wyrzucać supernatantu, ponieważ zawiera on częściowo oczyszczone DNA.
  6. Dodać kolejne 25 μl kulek paramagnetycznych i wymieszać pipetując 25 razy, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej z magnesu przez 4 minuty.
  7. Umieścić próbki z powrotem na magnesie i inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 minuty, a następnie wyrzucić supernatant. Ten krok służy do przechowywania fragmentów o wielkości od ~200 do 600 pz, które będą używane dla sfinalizowanych bibliotek.
  8. Pozostawiając próbki na magnesie, dodaj 150 μl 70% etanolu (v/v) i pozostaw na inkubację przez 30 s bez naruszania kulek (nie poruszaj się, gdy jesteś na magnesie). Usuń etanol i powtórz pranie po raz drugi.
  9. Pozostaw kulki paramagnetyczne do wyschnięcia na magnesie na powietrzu przez 5 minut. Usuń cały etanol po drugim praniu, ponieważ pozostały etanol będzie przeszkadzał w oczyszczaniu.
  10. Wyjmij próbki z magnesu i dodaj 25 μl 10 mM Tris-Cl pH 8,0. Wymieszać pipetując 25 razy i inkubować w temperaturze pokojowej z magnesu przez 4 minuty. Umieść próbki z powrotem na magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 4 minuty.
  11. Określ ilościowo biblioteki za pomocą elektroferogramu DNA o wysokiej czułości przed multipleksowaniem, aby upewnić się, że rozmiary są odpowiednie do sekwencjonowania. Ukończone biblioteki wahają się między 200 - 600 pz i są pozbawione wszystkich dimerów starterów.
    UWAGA: W razie potrzeby przeprowadza się kolejne 0,7-krotne oczyszczanie kulek paramagnetycznych w celu usunięcia niechcianych dimerów starterów, które są obecne przy ~130 pz.
  12. Połącz ilościowo oznaczone DNA na podstawie unikalnych starterów indeksowych zgodnie ze stężeniem. W przypadku puli zawierającej sześć próbek o stężeniach od 1 ng/μl do 6 ng/μl rozkład wynosi 15 μl najniższej próbki i 2,5 μl najwyższej próbki. Ma to na celu zapewnienie, że liczba odczytów będzie równomiernie rozłożona na każdym torze komórki przepływowej.

8. Przetwarzanie danych po ChIP-seq

  1. Potok oparty na snakemake38,39 jest używany do przetwarzania wszystkich poniższych kroków w jednym poleceniu. Co ważne, każdy z tych kroków jest omawiany indywidualnie z powiązanymi poleceniami.
  2. Określ jakość odczytów surowego sekwencjonowania fastq za pomocą FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Otwórz terminal unix i zmień katalog (cd) na folder zawierający surowe pliki fastq dla każdej z sześciu modyfikacji histonów. W terminalu uniksowym wpisz fastqc *fastq.gz i naciśnij [RETURN]. Spowoduje to uruchomienie metryk kontroli jakości dla wszystkich plików fastq w folderze.
  3. Dostosuj jakość odczytów do genomu referencyjnego i usuń duplikaty przed kompresją do plików bam. Odbywa się to za pomocą muszki w wersji 1.1.239, SAMBLASTER w wersji 0.1.2140 i SAMTOOLS w wersji 1.3.141: W terminalu uniksowym bowtie -m 1 -n 1 --best --strata -S -q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster -removeDups | samtools view -Sb - >histone1.bam i naciśnij [RETURN].
    UWAGA: path_to oznacza folder zawierający zestaw ludzkiego genomu hg19. Będzie się to zmieniać w zależności od interesującego nas organizmu.
  4. Sortuj pliki bam za pomocą SAMTOOLS za pomocą następującego polecenia: W terminalu uniksowym samtools sortuj histone1.bam -m 2G -@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted i naciśnij [RETURN].
  5. Indeksuj pliki bam za pomocą SAMTOOLS za pomocą następującego polecenia: W terminalu uniksowym wpisz samtools index histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai i naciśnij [RETURN].
  6. Określ unikatowo zmapowane i niewyrównane odczyty za pomocą SAMTOOLS flagstat za pomocą następującego polecenia: W terminalu uniksowym wpisz samtools flagstat histone1.sorted.bam i naciśnij [RETURN].
  7. Znormalizuj liczbę odczytów plików bam, wykonując losowe próbkowanie za pomocą następującego polecenia: W terminalu uniksowym typie sambamba view -f bam -subsampling-seed=3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools sort -m 2G -@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam i naciśnij [RETURN].
  8. Ponownie zindeksuj pliki bam za pomocą SAMTOOLS za pomocą następującego polecenia: W terminalu uniksowym wpisz samtools index histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai i naciśnij [RETURN].
  9. Aby zwizualizować biblioteki ChIP-seq w przeglądarce genomu (tj. UCSC lub IGV), generuj pliki bigwig za pomocą deepTools w wersji 2.4.040 poprzez skalowanie plików bam do odczytów na kilobazę na milion (RPKM). Można to zrobić za pomocą następujących poleceń:
    1. Dla standardowych plików bigwig: W terminalu uniksowym wpisz bamCoverage -b histone1. downsample.sorted.bam --normalizeUsingRPKM --binSize 30 --smoothLength 300 --extendReads 200 -o histone1.bw i naciśnij {RETURN].
    2. Dla odjętych plików bigwig z wejścia: W terminalu uniksowym wpisz bamCompare --bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam --bamfile2 input1.downsample.sorted.bam --normalizeUsingRPKM --ratio subtract --binSize 30 --smoothLength 300 --extendReads 200 -o histone1.subtracted.bw i naciśnij [RETURN].
  10. Zidentyfikuj wzbogacenie sygnału ChIP-seq w tle "wejściowym" przy użyciu analizy opartej na modelu ChIP-seq (MACS) w wersji 1.4.225,26 i wersji 2.1.0. Należy użyć macs1 dla współczynników "źródła punktowego" H3K4me3, H3K4me1 i H3K27ac oraz macs2 dla współczynników "szerokiego źródła" H3K79me2, H3K27me3 i H3K9me3. Odbywa się to za pomocą następujących poleceń:
    1. Dla źródła punktu: W terminalu uniksowym macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam -c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5 --nomodel --keep-dup all -n histone1.file i naciśnij [RETURN].
    2. Dla szerokiego źródła: W terminalu uniksowym wpisz macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam -c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6 --broad --broad-cutoff 1e-6 --keep-dup all --nomodel -n histone1.file i naciśnij [RETURN].
  11. Użyj ChromHMM24, aby zidentyfikować kombinatoryczne wzorce stanu chromatyny na podstawie badanych modyfikacji histonów za pomocą następujących poleceń:
    1. W terminalu uniksowym wpisz cd /path_to/ChromHMM_folder i naciśnij [RETURN].
    2. Po wejściu do katalogu ChromHMM wpisz java -mx2G -jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt /path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt /path_to/BinarizeBam_output i naciśnij [RETURN].
    3. Wpisz java -mx2G -jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000 /path_to/BinarizeBam /path_to/output_directory 15 hg19 i naciśnij [RETURN].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół umożliwia immunoprecypitację z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych, które mogą być przeprowadzane na dziesiątkach próbek równolegle przy użyciu metody wysokoprzepustowej (Rysunek 1A). Fragmenty chromatyny powinny mieścić się w zakresie ~200 - 1000 bps dla optymalnej immunoprecypitacji. Zauważyliśmy, że czas potrzebny do osiągnięcia tej samej długości ścinania różni się w zależności od typu tkanki i komórki. Sukce...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje kompletny i wszechstronny moduł ChIP-seq o wysokiej przepustowości do mapowania stanów chromatyny w całym genomie w ludzkich tkankach nowotworowych i liniach komórkowych. W każdym protokole ChIP-seq jednym z najważniejszych etapów jest swoistość przeciwciał. W tym przypadku metoda ta ilustruje warunki immunoprecypitacji dla opisanych sześciu modyfikacji histonów, z których wszystkie są klasy ChIP i zostały wcześniej zwalidowane w naszych i innych laboratoriach 42,44,45.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Marcusowi Coyle'owi, Curtisowi Gumbsowi, rdzeniowi SMF w MDACC za wsparcie w sekwencjonowaniu. Praca opisana w tym artykule została wsparta grantami z grantu NIH (CA016672) dla SMF Core i nagród NCI (1K99CA160578 i R00CA160578) dla K. R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało H3K4me1 klasy ChIPAbcamab8895
Przeciwciało H3K27ac klasy ChIPAbcamab4729
Przeciwciało H3K4me3 klasy ChIPAbcamab8580
Przeciwciało H3K79me2 klasy ChIPAbcamab3594
Przeciwciało H3K27me3 klasy ChIPAbcamab6002
Przeciwciało H3K9me3 klasy ChIP H3K9me3 przeciwciałoAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8,0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlicynaSigma-AldrichG8898
Deoksycholan soduSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Życie SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Bioodczynniki FisherBP337-500
BSA - Sigma bez IgG- Życie SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
Rurka GentleMACS CGentleMACS120-008-466rurka dysocjująca
16% FormaldehydPeierce28906
inhibitor miniproteazy Roche Diagnostics11836153001tabletki z inhibitorem proteazy
Dynabeads Protein G Probówki Invitrogen10009D
Bioruptor NGS 0,65 mlProbówki do sonikacjiDiagenodeC30010011
DynaMag - 96 Boczne listwyInvitrogen120.2796-dołkowy stojak magnetyczny
BuforTE PromegaV6231
RNaza AInvitrogen12091021
Proteinaza KInvitrogen100005393
Koraliki AMPure XP KoralikiparamagnetyczneBeckman CoulterA63882
EtanolSigma-AldrichE7023
Zestaw do oznaczania wysokiej czułości Qubit ds DNAOdczynniki DNA o wysokiej czułościInvitrogenQ32854
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowaniabiblioteki DNANew England BioLabsE7645L
Wodawolna od nukleazAmbionAM9932
Taśma ScreenTape o wysokiej czułości D1000Agilent Technologies5067-5584odczynniki DNA o wysokiej czułości
Odczynniki D1000 o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-5585odczynniki DNA o wysokiej czułości
Multiplex Oligos (Startery indeksowe - Zestaw 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multipleksy Oligonukleotyda (Startery indeksowe - Zestaw 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAinstrument do elektroferogramu DNA o wysokiej czułości
Urządzenie do sonikacji Bioruptor Pico DiagenodeB01060001łaźnia wodna Disruputor
MikserNutator421105
Bio-Rad C1000 Dotykowy termocyklerBio-Rad1851196PCR Termocykler
Kąpiel wodnaFisher Scientific2322
Wielokanałowa pipetaDenville1003123
Tube RewolwerThermo-Scientific
96-dołkowa płytka przypodłogowaEppendorf47744-110
Wirówka Allegra X-12R Wirówka stołowaBeckman CoulterA99464
5424Wirówka stołowaEppendorf22620461
Paski tub optycznych (8x pasek)Agilent Technologies401428
Nasadki do tub optycznych (8x pasek)Agilent Technologies401425
Końcówki ładowania, 10 sztAgilent Technologies5067-5599
Wir IKA MS3WirIKA3617000
88881001 Wirówka stołowa .

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modyfikacje histon wwysokoprzepustowe ChIP seqanaliza tkanki nowotworowejimmunoprecypitacja chromatynyobliczeniowa analiza danychanaliza ChromHMMsekwencjonowanie nowej generacjiprofilowanie epigenomiczne

Powiązane artykuły