Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Streszczenie

Ten protokół demonstruje metodę uzyskiwania wysokiej wydajności i żywotności dla mysich hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka (SEC) odpowiednich do hodowli lub uzyskiwania lizatów komórkowych. W tym protokole żyła wrotna jest używana jako miejsce cewnikowania, a nie żyła główna, ponieważ ogranicza to zanieczyszczenie innych możliwych typów komórek w końcowym preparacie wątroby. Podczas całej procedury nie jest wymagane żadne specjalne oprzyrządowanie. Łaźnia wodna służy jako źródło ciepła w celu utrzymania temperatury wszystkich i roztworów. Do napędzania płynu używana jest standardowa pompa perystaltyczna, a do procedur wirowania wymagana jest wirówka stołowa z chłodzeniem. Jedynym ograniczeniem tej techniki jest umieszczenie cewnika w żyle wrotnej, co stanowi wyzwanie dla niektórych myszy w zakresie rozmiarów 18 - 25 g. Zaletą tej techniki jest to, że do perfuzji wykorzystywana jest tylko jedna żyła, a dostęp do żyły jest szybki, co minimalizuje niedokrwienie i reperfuzję wątroby, co zmniejsza żywotność komórek wątroby. Kolejną zaletą tego protokołu jest to, że łatwo jest odróżnić żywe hepatocyty od martwych za pomocą wzroku ze względu na różnicę w gęstości komórkowej podczas etapów wirowania. Komórki z tego protokołu mogą być wykorzystywane w hodowli komórkowej do dowolnego dalszego zastosowania, a także przetwarzane do dowolnej oceny biochemicznej.

Wprowadzenie

Perfuzja kolagenazy wątroby w celu uzyskania hepatocytów jest wykonywana od wczesnych lat 50. i jest stale ulepszana^1,2,3,4. Bardzo ładny przegląd wielu metodologii, technik i odczynników stosowanych w oczyszczaniu komórek wątroby został opracowany w Meyer et al⁵. Uzyskanie zadowalającej wydajności wysoce żywotnych hepatocytów i SEC jest technicznie trudne. Siły mechaniczne, które oddzielają komórki, w tym jakość kolagenazy, to tylko niektóre ze zmiennych, które są trudne do kontrolowania. Ze względu na wrażliwość hepatocytów na siły mechaniczne, ich żywotność jest znacznie zmniejszona w warunkach nieoptymalnych, co powoduje potrzebę opracowania protokołu opisującego optymalne warunki izolacji. SEC wydają się nie być tak wrażliwe na mechaniczne ścinanie. Perfuzja in situ z trawieniem kolagenazy jest zdecydowanie najlepszą metodą przerywania połączeń komórka-komórka w celu uzyskania preparatów jednokomórkowych z wątroby i innych narządów, takich jak jelita i śledziona⁶. Protokół ten demonstruje prostą metodę wprowadzania buforu perfuzyjnego do żyły wrotnej za pomocą wysuwanego plastikowego cewnika zamiast nacięcia, które mogłoby spowodować zapadnięcie się żyły wrotnej, jak opisano w Smedsrød i wsp⁷.

Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie najważniejszych kroków wymaganych do osiągnięcia sukcesu w procedurze rozlewu wątroby. Etapy te obejmują umieszczenie cewnika, przepływ płynów perfuzyjnych i obchodzenie się z tkanką po trawieniu. Natężenie przepływu jest dostosowane powyżej naturalnego tempa przepływu krwi, ale wystarczająco niskie, aby kapsułka Glissona pozostała nienaruszona. Gdy wątroba jest prawidłowo strawiona, a komórki są rozdzielane w roztworze, oczyszczanie komórek jest stosunkowo proste, niezależnie od tego, czy odbywa się przez wirowanie różnicowe, adhezję płytek, czy oczyszczanie kulek magnetycznych. Żywe hepatocyty mają większą gęstość i można je łatwo oczyścić z komórek niemiąższowych (NPC) i martwych hepatocytów za pomocą wirowania z niską prędkością. W większości zastosowań powszechną metodą jest adhezja płytek do oddzielania komórek Kupffera (KC) i SEC⁸, chociaż istnieją doniesienia, że nie daje ona najlepszej czystości SEC⁹. KC mają tendencję do szybkiego przylegania do twardych, sztywnych powierzchni, a szalki Petriego (standardowy polistyren) są najczęściej używanym materiałem do tej procedury. Oczyszczanie SEC lub KC za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami jest niewątpliwie najlepszą metodą znacznego oczyszczenia tych komórek, chociaż procedura dodaje kolejne 3 - 4 godziny do tego protokołu, a ogólna wydajność ulega zmniejszeniu⁹. Raport ten szczegółowo przedstawia proces optymalnej perfuzji wątroby, który zazwyczaj daje dużą liczbę żywotnych komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Lincoln - Nebraska zgodnie z protokołem #1435.

1. Przygotowanie

1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych
   1. Przygotować wszystkie pożywki hodowlane i bufor zgodnie z tabelą materiałów.
2. Przygotowanie instrumentów
   1. Ustawić łaźnię wodną (>10 l) o temperaturze 42 °C, pompę perystaltyczną o zmiennej prędkości obrotowej i zaciski do trzymania kolb. Przygotuj zakrzywione nożyczki i kleszcze (Rysunek 1).
   2. Na łaźni wodnej lub w jej sąsiedztwie ułóż blachę do pieczenia (około 38 x 26 cm) z podkładką styropianową (stożkowy ruszt 50 ml), pokrytą chłonnym podkładem pociętym na kawałek o wymiarach 20 x 20 cm (Rysunek 1).
   3. Umieść kawałek taśmy maskującej (5 - 8 cm) w pobliżu. Umieść w pobliżu poliestrową nić do szycia o długości 20 cm, która jest przycięta i gotowa do użycia. Zaopatrz się w plastikowy cewnik z wysuwaną igłą (7 mm x 19 mm, Rysunek 1).
3. Przygotowanie wyrobów szklanych
   1. Za pomocą zacisków umieścić i unieruchomić kolbę o pojemności 1 l w łaźni wodnej zawierającej 200 ml 1x PBS z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml wprowadzane do roztworu. Gumowy korek jest nacięty, aby umożliwić recyrkulację płynu w obiegu zamkniętym.
   2. Za pomocą kolejnego zacisku umieścić kolbę o pojemności 125 ml zawierającą 45 ml buforu 2 wraz z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml, z których jedna znajduje się w cieczy w pobliżu dna kolby, a druga, która pozostaje nad cieczą i wdmuchuje tlen do kolby.
      UWAGA: Każda pipeta w korkach będzie wyposażona w adapter szybkiego odłączania przymocowany do końca, który ułatwia wymianę rurki. Tlen będzie delikatnie przepływał do obu kolb przez pipetę umieszczoną w korku, który nie jest zanurzony w cieczy.
   3. Odłóż na bok dwie sterylne naczynia krystalizujące.

2. Procedura na zwierzętach

1. Podgrzać roztwory PBS i buforu 2 do temperatury 42 °C w łaźni wodnej i cyrkulować PBS przez co najmniej 20 ml/min w rurkach w obiegu zamkniętym, aby utrzymać ciepło w przewodach cieczy. Zanurzyć nadmiar rurki w łaźni wodnej tak, aby pozostał jak najbliżej 42 °C. Opróżnić męski koniec rurki do 1-litrowej kolby zawierającej PBS.
2. Umieścić wacik na podkładce chłonnej i dodać około 2 ml 30% izofluranu (wypełnionego glikolem polietylenowym 200, który zmniejsza szybkość parowania izofluranu) na wacik za pomocą pipety transferowej.
3. Podnieś mysz za ogon, umieść ją w jednym z krystalizujących się naczyń, a następnie szybko przewróć naczynie na wacik, aby mysz miała niewielką przestrzeń, w której może wdychać znieczulenie. Obserwuj częstość oddechów myszy i upewnij się, że mysz jest skutecznie pod narkozą.
   UWAGA: Częstość oddechów powinna być wolniejsza i głębsza, ogon wiotki, a łapy nie reagują na test szczypania w znieczuleniu; Dodatkowe informacje można znaleźć w wytycznych IACUC.
4. Podczas gdy mysz jest pod narkozą (trwa to 1-2 minuty), przygotuj cylinder strzykawki o pojemności 10 ml, wyciągając tłok i wkładając mały wacik. Dodaj 1-2 ml 30% izofluranu za pomocą pipety transferowej do wacika wewnątrz beczki i połóż lufę otwartym końcem na stole, czekając, aż mysz straci przytomność.
5. Szybko zdejmij naczynie krystalizujące, odwróć mysz na plecy i umieść cylinder strzykawki na jego nosie. Dokładnie sprawdź częstość oddechów, szczypanie palców u nóg i wiotki ogon. Wszelkie reakcje na uszczypnięcie palca u nogi i wiotki ogon wskazują, że mysz nie jest w pełni znieczulona. Trzymaj lufę strzykawki nad pyskiem, aby zachować nieprzytomność.
6. Umieść pinezki w łapach myszy, z kończynami wyciągniętymi w pozycji leżącej. Zwilż brzuch i klatkę piersiową 70% izopropanolem lub etanolem.
7. Trzymając proste kleszcze w jednej ręce, podnieś skórę w pobliżu podstawy brzucha. Z drugiej strony nożyczkami przetnij skórę namiotu i otrzewną. Nacięcie powinno być poziome lub w poprzek podstawy skóry namiotu. Pamiętaj, aby przeciąć wszystkie warstwy skóry i otrzewnej, aby uzyskać dostęp do jelit. Przeciąć bocznie wokół brzucha aż do klatki piersiowej po obu stronach, nie nacinając żadnego z narządów.
8. Odetnij płat skóry, przecinając dolną klatkę piersiową. Przesuń jelita w prawo z tyłem kleszczy, aby odsłonić żyłę wrotną.
   UWAGA: Krwawienie ze zwierzęcia powinno być minimalne; Zwierzę powinno nadal oddychać i być w głębokim znieczuleniu.
9. Umieść zamknięte zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną między wątrobą a żyłą trzustkowo-dwunastniczą górną (strzałka Rysunek 3).
10. Otwórz kleszcze, gdy znajdują się pod żyłą wrotną. Chwyć nić i ostrożnie przeciągnij ją tak, aby znalazła się wyśrodkowana pod żyłą wrotną. Zawiąż węzeł od góry wokół żyły wrotnej, nie zaciskając jej.
11. Umieść zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną i delikatnie pociągnij ją w kierunku ogona myszy, aby wyprostować żyłę (Rysunek 4A).
12. Trzymając cewnik w drugiej ręce, umieść skos igły skierowany do góry i równolegle do dolnej części żyły wrotnej w pobliżu kleszczy (Rysunek 4B).
13. Delikatnie nakłuć żyłę igłą (Rysunek 4C). Upewnij się, że skos igły znajduje się w świetle żyły. Wycofaj igłę obciążoną sprężyną i kontynuuj wpychanie cewnika polimerowego przez żyłę, aż skos znajdzie się w pobliżu rozgałęzionego obszaru żylnego. To jest w wątrobie. Jeśli cewnik zostanie umieszczony prawidłowo, widoczny będzie wsteczny przepływ krwi. (Rysunek 4D).
14. Zaciśnij węzeł nad dłonią i pociągnij go w dół na cewniku, aby go ustabilizować. Natychmiast zmniejsz wydajność pompy z 20 ml/min do 4 ml/min i odetnij kolejne główne naczynie krwionośne w celu drenażu. Wytnij aortę brzuszną, aby uzyskać optymalne rezultaty.
15. Umieść męski koniec rurki na żeńskim końcu cewnika (Rysunek 5A). Upewnij się, że w przewodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Należy uważać, aby cewnik nie został wepchnięty do wątroby lub z żyły. Umieszczenie nici nie jest konieczne, chociaż pomaga zapobiegać cofaniu się wody z żyły i pomaga utrzymać cewnik we właściwej pozycji (Rysunek 5B, C).
16. Użyj taśmy maskującej, aby unieruchomić rurkę na podkładce. Użyj prostych kleszczy, aby ścisnąć naczynie krwionośne odpływu, aby kilkakrotnie napompować wątrobę, aby upewnić się, że cała krew odpłynęła (Rysunek 5D).
    UWAGA: Standardowa taśma laboratoryjna może nie działać; Jednak taśma maskująca pozostanie przyklejona do podkładu, nawet w mokrych warunkach.

3. Perfuzja wątroby

1. Podczas przepłukiwania wątroby PBS, odmierz około 24 mg kolagenazy typu IV i umieść ją w kolbie zawierającej 45 ml buforu 2 w łaźni wodnej. Należy upewnić się, że płyn w kolbie został zawirowany tak, aby kolagenaza całkowicie się rozpuściła i umieścić kolbę z powrotem w zacisku tak, aby płyn zawierający część kolby był całkowicie zanurzony w wodzie.
2. Obserwuj zmianę koloru wątroby, gdy jest ona przepłukiwana PBS. Wymienić rurkę odpływową z kolby o pojemności 1 l na kolbę o pojemności 125 ml. Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza przedostały się do wątroby.
3. Gdy bufor perfuzyjny dotrze do wątroby, krótko ściśnij mocno naczynie krwionośne odpływu, aby wytworzyć ciśnienie w naczyniu i pozwól, aby ten płyn wypełnił wszystkie płaty wątroby. Należy pamiętać, aby nie odcinać drenażu zbyt długo, ponieważ może to spowodować pęknięcie cienkiej tkanki łącznej otaczającej wątrobę (kapsułkę Glissona) i zniszczyć perfuzję lub przepływ płynu w łożysku kapilarowym wątroby.
4. Pozwól, aby bufor 2 z kolagenazą przeniknął przez wątrobę, aż wszystkie 45 ml przepłynie przez tkankę.
   UWAGA: Jeśli się powiedzie, kapsułka Glissona powinna zostać oddzielona od miąższu lub tkanki wątroby, a sama wątroba powinna wyglądać na amorficzną.
5. Dodaj około 10 ml buforu 1 do drugiego naczynia krystalizującego i umieść je obok myszy.
6. Wyjmij cewnik i wyłącz pompę.
7. Prostymi kleszczami i nożyczkami odetnij wątrobę od myszy. Jeśli trawienie kolagenazy było bardzo wydajne, może być konieczne posiadanie pod ręką czystej, sterylnej łyżki, aby zgarnąć wątrobę myszy i umieścić ją w buforze 1.

4. Oczyszczanie hepatocytów

UWAGA: Manipulacja komórkami odbywa się w sterylnym kapturze do hodowli tkanek, aby ograniczyć zanieczyszczenie, jeśli komórki mają być hodowane we wszystkich kolejnych krokach.

1. Używając sterylnej techniki, chwyć wątrobę kleszczami i delikatnie potrząśnij komórkami z wątroby. Rozerwij lub odciągnij kapsułkę Glissona: bufor stanie się nieprzezroczysty, gdy komórki zostaną wytrząśnięte z wątroby.
2. Odlać roztwór komórkowy do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml z filtrem 100 μm umieszczonym na górze.
3. Dodaj więcej buforu 1 do resztek wątroby i kontynuuj wytrząsanie komórek. Kontynuuj, aż wątroba wydaje się pozbawiona komórek lub gdy niestrawione części wątroby nie dają już komórek.
4. Wlej płyn komórkowy do innego stożkowego filtra o pojemności 50 ml zawierającego filtr 40 μm.
5. Odwirować stożek w obrotowym wirniku kubełkowym o sile 100 x g przez 3 min.
   UWAGA: Nie używaj maksymalnego hamulca, ponieważ może to spowodować przemieszczenie się osadu komórkowego. Użyć hamulca przy 80%, co jest wystarczające dla wszystkich pozostałych etapów wirowania w temperaturze 4 °C
6. Wlej supernatant (który zawiera NPC i martwe hepatocyty) do czystego stożka i umieść go na lodzie. Upewnij się, że odbywa się to jednym ruchem, aby obserwować przyleganie granulek.
7. Zawiesić osad w 40 ml buforu 1. Powtórz kroki 4.5 i 4.6. Zawiesić osad w 40 ml buforu 3. Powtórz kroki 4.5 i 4.6 dwukrotnie.
8. Ponownie zawiesić oczyszczone hepatocyty w ciepłym DMEM + 10% FBS + 2x Penicylina-Streptomycyna (Pen/Strep).
9. Jeśli komórki są hodowane na płytkach pokrytych kolagenem, pozwól im przylegać przez 1 godzinę i wymień pożywkę przynajmniej raz, ponieważ zapobiegnie to powstawaniu zanieczyszczeń bakteryjnych.
   1. Płytki pokryte kolagenem należy wykonać inkubując je z 0,05% kolagenem w 0,001% kwasie octowym przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przemywając 1x PBS.
10. Jeśli żywotność hepatocytów jest niska i istnieje chęć uzyskania oczyszczonych, wysoce żywotnych hepatocytów, należy zastosować następujący protokół zaadaptowany z Kreamera i wsp. ¹⁰.
    1. Wymieszaj 9 objętości roztworu PVP (Percoll, 23% m/w roztwór wody i 15 - 30 nm koloidalnych cząstek krzemionki pokrytych poliwinylopirolidonem do odwirowania gęstości) i 1 objętość 10x HBSS, aby uzyskać izoosmotyczny roztwór PVP (SIP).
    2. Dodać 24 ml SIP do sterylnego stożkowego naczynia o pojemności 50 ml, które może być przechowywane w tych warunkach przez okres do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    3. Dostosuj stężenie hepatocytów do 5 - 10 × 10⁶ komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej, takiej jak ta opisana w kroku 4.8.
    4. Dodać 25 ml zawiesiny komórkowej do każdego 24 ml SIP zawierającego stożkowy i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Gęstość tego roztworu wynosi 1,06 g/ml.
    5. Odwirować stożek o masie 50 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odessać SIP i flokulant, a następnie ponownie zawiesić komórki w HBSS.
    7. Przemyć komórki przez odwirowanie w temperaturze 50 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Powtórz krok 4.10.6 jeszcze raz, a następnie ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej.

5. Oczyszczanie SEC

1. Osadzać komórki w supernatantach z kroku 4.6, obracając probówki pod ciśnieniem 163 x g przez 10 minut. Wyrzuć supernatanty z probówek i ponownie zawieś wszystkie granulki komórek w 5 ml RPMI bez surowicy i połącz je razem w jednej probówce.
2. Po zebraniu wszystkich granulek dodaj RPMI do końcowej objętości 35 ml.
3. Odwirować pulę stożkową o masie 25 x g przez 3 minuty. Ostrożnie zassać górne 25 ml RPMI za pomocą pipety 25 ml i umieścić pożywkę zawierającą NPC w czystym stożkowym zbiorniku o pojemności 50 ml na lodzie.
4. Dodaj 25 ml świeżego RPMI z powrotem do probówki i ponownie zawieś granulki.
5. Powtórzyć krok 5.3 dla drugiego przemycia i zebrać supernatant. Wyrzuć pozostałe 10 ml pożywki i osadu (osad składa się głównie z martwych hepatocytów). Odwirować zbiorczy supernatant o stężeniu 163 x g przez 10 minut.
6. Podczas wirowania przygotuj gradienty roztworu PVP w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml.
7. Dodaj 15 ml 50% roztworu PVP do 50 ml stożkowego, a następnie 20 ml 25% Percollu nałożonego pipetorem ustawionym na najmniejszą prędkość wyrzutu. Pamiętaj, aby obserwować linię załamania światła na znaku 15 ml, która wyznacza dwie warstwy, ponieważ jest to miejsce, w którym SEC i KC będą się agregować po odwirowaniu.
8. Ponownie zawiesić ogniwa uprzednio granulowane w kroku 5.5 w 10 ml zimnego RPMI i nałożyć je na gradient roztworu PVP. Pamiętaj, aby zachować wyraźne rozgraniczenie między dwiema warstwami. Odwirować nachylenie przy 805 x g przez 20 minut z hamulcem ustawionym na 50%.
9. Zassać od góry do oznaczenia 20 ml na probówce i wyrzucić ten materiał. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 5 ml zbierz SEC i KC, które znajdują się na granicy 25/50%. Wyrzuć wszelkie brązowe grudki komórek, ponieważ są to martwe hepatocyty.
10. Umieść komórki w stożkowym zbiorniku o pojemności 50 ml i dodaj RPMI do oznaczenia 50 ml, aby rozcieńczyć roztwór PVP. Wirować przy 200 x g przez 10 minut, z 80% hamulcem.
11. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, zmywając stożek stożka w 12 ml ciepłego RPMI.
12. Oddzielić SEC od KC, umieszczając supernatant na polistyrenowej szalce Petriego i inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
13. Zassać pożywkę pipetą o pojemności 25 ml i przepłukać płytkę tym samym podłożem, z pipetorem ustawionym na najniższą prędkość, aby zebrać pozostałe SEC, podczas gdy KC przylegają do płytki.
14. Odwirować SEC przy 200 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Następnie mianejcie komórki i umieszczajcie w szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem.

Wyniki

Prezentowana jest tutaj demonstracyjna, udoskonalona metoda perfuzji wątroby i oczyszczania/wzbogacania hepatocytów i SEC, która dostarcza szczegółowych wskazówek dotyczących optymalnego oczyszczania/wzbogacania komórek, podobnie jak inne drukowane raporty zebrane w tym przeglądzie 5. Krytyczne kroki, które decydują o powodzeniu oczyszczania komórek, występują w drodze i szczegółach technicznych procedury perfuzji kolagenazy i są opisane w niniejszym protokole. Konfiguracja aparatury jest dość prosta i opłacalna przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, w przeciwieństwie do innych systemów, które zostały opublikowane¹¹ (Rysunek 1). W tej konfiguracji taca trzymająca mysz znajduje się na łaźni wodnej z częścią nadmiaru rurek w łaźni wodnej, aby utrzymać temperaturę płynów przenikających w wątrobie. Aparatura, jak pokazano tutaj, może być używana zarówno u myszy, jak i szczurów, z nieco inną geometrią do perfuzji wątroby szczura¹² (Rysunek 2).

W tej procedurze wątroba jest perfundowana przez żyłę wrotną zamiast żyły głównej (która jest inną popularną drogą perfuzji) ze względu na łatwość dostępu do wnętrza jamy brzusznej i to, że żyła zasila bezpośrednio wątrobę. Widz powinien być świadomy, że żyła wrotna ma kilka małych rozgałęzień, które mogą powodować zwarcie perfuzatu, a cewnik powinien być umieszczony za tymi gałęziami, aby zapewnić optymalny sukces¹³ (Rysunek 3). Po zidentyfikowaniu żyły wrotnej za pomocą zakrzywionych kleszczy wykonuje się szew chirurgiczny lub nić poliestrową pod żyłą wrotną między wątrobą a żyłą trzustkowo-dwunastniczą górną. Kleszcze są również używane do prostowania żyły wrotnej, która jest pod dodatnim ciśnieniem krwi (Rysunek 4A). Igłę w cewniku należy umieścić równolegle i obok żyły ( Rysunek 4B), a skos należy delikatnie wprowadzić do światła żyły (Rysunek 4C). Prawidłowe umieszczenie będzie wskazywane przez krew pojawiającą się wzdłuż cewnika. Po wsunięciu igły cewnik powinien zostać ustabilizowany za pomocą przywiązanej do niego nici, a ciśnienie krwi wypchnie krew przez cewnik. Zaleca się, aby cewnik był podłączony do rurki pompy przed wylaniem krwi (Rysunek 4D). Po podłączeniu rurki pompy natychmiast przeciąć główne naczynie krwionośne, takie jak żyła główna lub aorta brzuszna w celu drenażu krwi/płynów (Rysunek 5A). Zwykle konieczne jest przecięcie boku ściany brzucha myszy w celu wystarczającego drenażu, ponieważ nagromadzenie krwi w jamie brzusznej utrudnia wizualizację procesu perfuzji, a krew może przenieść się do oczyszczania komórek (Rysunek 5B). Gdy PBS zacznie przenikać do wątroby, wątroba blednie przy braku krwi (Rysunek 5C). Jeśli tylko kilka płatów blednie, prawdopodobną przyczyną jest to, że cewnik został umieszczony zbyt głęboko w wątrobie i będzie musiał być powoli wycofywany. Po potwierdzeniu umieszczenia cewnika użyj wodoodpornej taśmy maskującej, aby zabezpieczyć rurkę na miejscu. Ogólna taśma laboratoryjna zwykle nie wystarcza. Aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie cewnika, ściśnij przecięte naczynie krwionośne, aby zatrzymać drenaż i obserwuj wzrost ciśnienia w wątrobie. Pomoże to w wypłukaniu krwi z wątroby (Ryc. 5D). Należy to również zrobić, gdy roztwór kolagenazy początkowo dostaje się do wątroby, aby upewnić się, że wszystkie płaty są narażone na działanie kolagenazy. Po wyczerpaniu się roztworu kolagenazy dobre trawienie kolagenazy wskazuje na oddzielenie torebki Glissona od miąższu.

Ogólna procedura oczyszczania komórek jest opisana w Rysunek 6 i Rysunek 7, w którym hepatocyty są zbierane na wczesnym etapie procedury podczas wirowania z niską prędkością i są bardzo czyste po 4 płukaniach w zawierających BSA (Rysunek 8). SEC są współoczyszczane z KC na gradiencie PVP (Rysunek 9A), a następnie rozdzielane przez selektywną adhezję na pokrytej kolagenem polistyrenowej szalce Petriego. Czystość SEC przy użyciu tej metody wynosi 83 - 90% czystości i w dużej mierze zależy od ogólnej skuteczności trawienia kolagenazy (Rysunek 9B). Pomiary ilościowe z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej (ponieważ zarówno hepatocyty, jak i SEC mają cechy odróżniające od innych komórek) pokazują, że w reprezentatywnym preparacie hepatocyty są prawie 100% czyste, a SEC mają czystość nieco ponad 89% (tab. 1). Alternatywnie, wyższe wzbogacenie SEC można uzyskać poprzez separację kolumn magnetycznych po gradiencie PVP, chociaż wykracza to poza zakres tego protokołu. Więcej informacji na temat separacji magnetycznej SEC i KC można znaleźć w Meyer et al.⁹ oraz Liu et al.¹⁴ Należy pamiętać, że żywotność hepatocytów gwałtownie spada w niedostatecznie strawionej wątrobie, ale nie jest to konieczne w przypadku NPC. Niedostatecznie strawione wątroby również wytwarzają więcej resztek komórkowych, które nie są całkowicie eliminowane na etapach wirowania.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie zestawu perfuzji. Kolby są utrzymywane na miejscu za pomocą zacisków (nie pokazano); rurka zawierająca płyn jest zamieniana z kolby o pojemności 1 l na kolbę o pojemności 125 ml podczas zabiegu jest reprezentowana przez czerwoną przerywaną linię. Należy pamiętać, że podawany tlen nie dostaje się bezpośrednio do roztworów w kolbach. Korki powinny być również nacięte, aby umożliwić przepływ płynu w obiegu zamkniętym z rurką włożoną do wycięcia. Ma to kluczowe znaczenie podczas rozgrzewania rurki i wyrzucania całego powietrza z rurki. Odpowietrznik składa się ze złącza T, które jest połączone z rurką Tygon i zaciskami zaciskowymi do szybkiego otwierania i zamykania systemu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zestaw perfuzyjny podczas perfuzji wątroby myszy. Tacę z myszką umieszcza się w rogu łaźni wodnej. Tlen jest odłączany od roztworu kolagenazy, ponieważ został on już natleniony podczas rozgrzewki. Lokalizacja elementów to: A) przewody tlenowe, B) 1 litrowa kolba zawierająca PBS, C) 125 ml kolba zawierająca bufor 2 z kolagenazą, D) pompa, E) elementy sterujące pompy, F) pułapka pęcherzykowa, G) przewód płynu biegnący od kolby, przez pompę i do myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obraz unaczynienia brzucha myszy. Wprowadzenie cewnika powinno znajdować się tuż poniżej połączeń żył żołądkowych i trzustkowych wychodzących z żyły wrotnej (zielona kropka), a końcówka powinna być umieszczona w pobliżu lewej i prawej żyły wznów wątroby (żółta kropka), która tworzy rozwidlenie w głównych płatach wątroby. Po prawidłowym umieszczeniu cewnik należy ustabilizować za pomocą gwintu za pomocą prostego węzła naręcznego. K = nerka, L = wątroba, SI = jelito cienkie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Umieszczenie cewnika w żyle wrotnej. (A) Kleszcze służą do zapewnienia obrzęku krwi w żyle wrotnej i do wyprostowania żyły w celu umieszczenia cewnika. (B) Cewnik jest ustawiony równolegle do żyły wrotnej ze skosem do góry. (C) Skos igły w cewniku jest wprowadzany do żyły, a nie przez żyłę. (D) Igła cewnika jest cofnięta, a krew cofa się przez cewnik, jak wskazuje końcówka kleszczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Prawidłowa perfuzja wątroby. (A) Po umieszczeniu cewnika, żeński koniec Luer cewnika łączy się z męskim końcem Luer (wyciętym ze strzykawki o pojemności 1 ml) rurki pompy. (B) Po przecięciu jednego z głównych zstępujących naczyń krwionośnych, krew i PBS są odprowadzane z brzucha poprzez przecięcie boku myszy nożyczkami. (C) Wątroba powinna zblednąć, podczas gdy krew jest wypłukiwana i (D) pęcznieje pod ciśnieniem poprzez ściskanie przeciętego naczynia krwionośnego kleszczami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczny zarys oczyszczania hepatocytów i izolacji NPC. Większość etapów wirowania ma na celu usunięcie żywych i martwych hepatocytów z komórek niemiąższowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Schematyczny zarys wzbogacania i oczyszczania SEC. NPC są oddzielane gradientem PVP, a następnie rozdzielane SEC przez krótką przyczepność do standardowej płyty polistyrenowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Oczyszczone hepatocyty. Hepatocyty posiano na płytkach do hodowli tkankowych pokrytych kolagenem z DMEM + 8% FBS + Pen / Strep i inkubowano przez 6 godzin, a następnie pobrano obraz pod mikroskopem przy 400X. Słupek wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Oczyszczanie SEC. (A) SEC i KC zostały zebrane z interfejsu 25/50% PVP (żółte strzałki) i przemyte podłożem bez surowicy. (B) SEC oddzielono od KC poprzez selektywną adhezję na standardowych szalkach Petriego, umyto i posiano na pokrytych kolagenem szalkach do kultur tkankowych w RPMI + 5% FBS. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą odwróconego mikroskopu EVOS o powiększeniu 400x. Słupek wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Skaningowa mikroskopia elektronowa anatomii wątroby myszy. Wątrobę myszy perfundowano PBS, a następnie utrwalaczem (100 mM kakodylanu sodu, 12 ml 25% aldehydu glutarowego, 15,6 ml 16% paraformaldehydu, 2,65 mM chlorku wapnia, 180,2 mM sacharozy, zmieszany w 100 ml roztworu) z szybkością 1 ml / min przez 4 min. Tkanki pokrojono w plastry i przygotowano do skaningowej mikroskopii elektronowej. Obrazy zostały zebrane za pomocą SEM z emisją polową z prędkością 10 000X. Żółte strzałki wskazują mikrokosmki między hepatocytami. Słupek wynosi 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Wizualizacja martwych i żywych hepatocytów. Po 2 przemycikach Bufferem 1 granulowane hepatocyty mogą być oceniane pod kątem stosunku żywych do martwych na oko. Jaśniejsza kulka (po lewej) wskazuje, że co najmniej połowa hepatocytów jest martwa. Ciemniejsza kulka po prawej stronie jest mocniej osadzona na dnie rurki i jest w ponad 90% żywa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Oczyszczanie komórek Typ komórki % komórek docelowych % pozostałych komórek Hepatocyty 99 Rozdział 1 Sinsusoidalne komórki śródbłonka Nr 89,1 pkt. Rozdział 10,9

Tabela 1: Ocena czystości komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.

Dyskusja

Protokół ten podkreśla narzędzia, które są dostępne i które zapewnią użytkownikowi wysoki wskaźnik sukcesu w tej procedurze. Udana perfuzja ma fundamentalne znaczenie dla każdej dalszej aplikacji podczas pracy z komórkami pierwotnymi.

Istnieje kilka krytycznych etapów procedury, które decydują o powodzeniu. Po pierwsze, umieszczenie końcówki cewnika w żyle wrotnej musi być prawidłowe. Jeśli zostanie umieszczony zbyt głęboko w wątrobie, tylko mniejsze płaty zostaną perfundowane. Końcówka powinna znajdować się tuż poniżej prawej i lewej gałęzi żyły wrotnej. Zaletą stosowania cewnika polimerowo-kompozytowego w porównaniu z igłą jest to, że zadzior igły jest bardziej podatny na rozerwanie żyły podczas perfuzji niż cewnik. Po drugie, jakość i ilość kolagenazy decyduje o efektywności trawienia wątroby. W tej procedurze zastosowano wstępnie zakwalifikowaną kolagenazę typu 4, która jest ponownie zawieszana w dawce 0,5 mg/ml w buforze 2, jeśli aktywność kolagenazy, która ma być oznaczona, jest większa niż 900 j.m.

Pod koniec perfuzji kolagenazy wątroba powinna zachować nieco ciemnobrązowy lub brązowy kolor. Jeśli jest to jasnobrązowy kolor, oznacza to, że większość hepatocytów jest martwa. Wątroba powinna się rozpadać po odcięciu od myszy. W najlepszych warunkach wątrobę można wyjąć z jamy ciała myszy za pomocą małej łyżeczki. Wątroby w tym stanie zawsze dają bardzo wysoką żywotność komórek. Jeśli roztrząsnięcie komórek wymaga dużego wysiłku, jeśli wątroba jest nadal twarda podczas ekstrakcji lub jeśli do przemieszczenia hepatocytów przez filtry potrzebna jest duża siła, wówczas hepatocyty będą miały niższą żywotność. Hepatocyty pokryte są mikrokosmkami, co pozwala im mieć bardzo dużą powierzchnię (ryc. 10). Niepełne trawienie zachowuje połączenia komórka-komórka między hepatocytami, a mechaniczne ścinanie rozerwie błonę plazmatyczną. Perfuzja in situ z kolagenazą jest najlepszą metodą rozbijania komórek i utrzymania wysokiej żywotności. Na rycinie 11 wytwarza się dwa preparaty hepatocytów, w których granulki komórek porównano po kilku płukaniach w buforze 1. Osad po lewej stronie jest lżejszy i zawiera żywotność komórek około 50%. Śrut po prawej stronie jest ciemniejszy i ma żywotność 92%. Podobnie, gdy płyn jest nalewany z stożka o pojemności 50 ml, ciemniejszy granul jest nieruchomy w probówce, w przeciwieństwie do jaśniejszego granulatu, który będzie się przesuwał w probówce podczas wylewania cieczy. Niższa żywotność komórek lub nieefektywne perfuzje mogą wystąpić, gdy wątroba ma wysoki poziom stwardnienia.

Ponieważ żywe hepatocyty mają większą gęstość niż martwe hepatocyty, procedury wirowania spowodują uzyskanie preparatu, który jest wysoce czysty w żywotnych hepatocytach¹⁵. Jeśli występuje znaczna ilość martwych hepatocytów (co często występuje, gdy warunki są nieoptymalne), żywe komórki mogą być dodatkowo wzbogacone i oddzielone od martwych komórek za pomocą gradientów PVP. Dodatkowo, ponieważ żywe hepatocyty osadzają się szybciej niż martwe hepatocyty, aspiracja górnych 3^rd osadu również zwiększy stosunek żywych do martwych komórek w osadzie. Procedury te są szybkimi i łatwymi metodami oddzielania żywych hepatocytów i resztek komórkowych od martwych w razie potrzeby^10,16. Jest to szczególnie przydatne, jeśli próbka jest cenna, a do eksperymentu potrzeba tylko kilku milionów komórek.

Podsumowując, jest to łatwa i skuteczna metoda zbierania hepatocytów i SEC z wątroby. Przy obecnych cenach koszt wykonania tej procedury wraz ze wszystkimi odczynnikami i materiałami jednorazowego użytku wynosi poniżej 75 USD za preparat. Jeśli pożądanych jest wiele myszy, najlepiej przystąpić do oczyszczania hepatocytów i trzymać frakcję NPC na lodzie, dopóki wszystkie myszy nie zostaną przetworzone. NPC są na ogół stabilni na lodzie przez co najmniej 5 godzin, ale dłuższe czasy nie zostały przetestowane w tym laboratorium.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba Erlenmeyera 1 L	Fisher Scientific	S63274
250 ml Kolba Erlenmeyera	Rurka silikonowa Fisher Scientific	S63271
	Cole-Parmer	96400-14	Ten przewód biegnie od kolb przez pompę do złącza T, a następnie do strzykawki o pojemności 1,0 ml, która jest podłączona do cewnika.
Rurka Tygon	Fisher Scientific	R3603	Używana jako adapter między 96400-14 a pipetami i złączem T.  Może to być również używane do przewodów tlenowych.
Trójniki	Cole-Parmer	EW-06294-82
Szybkozłączki	Fisher Scientific	6150-0010
Zaciski zaciskowe	Fisher Scientific	6165-0002
Masterflex L/S Pompa o zmiennej prędkości, model 7553-70	Cole-Parmer	EW-07559-00	Pompa peryplastyczna o zmiennej prędkości
Głowica pompy, model 7014-20	Cole-Parmer	EW-07014-20
szklane pipety z podziałką 1,0 ml	Fisher Scientific	13-678
zakrzywione nożyczki nieząbkowane	Fine Science Tools	14069-12
Kleszcze Dumont	Fine Science Tools	11252-20
Zakrzywione kleszcze	Fine Science Tools	13009-12
Strzykawka 10 ml	Fisher Scientific	03-377-23	Potrzebna będzie tylko beczka strzykawki
sterylowana łyżka			z artykułami domowymi
Wacik(y)Sklep			z artykułami domowymi
Poliestrowa nić do szycia			z artykułami domowymi
Taśma maskująca	Sklep
pinezki	Sklep
podkładka styropianowa	50 ml stożkowy stojak
ciastka/blachę do pieczenia	Sklep
Podkłady chłonne	Fisher Scientific	14-206-64
Łaźnia wodna 19 L	Fisher Scientific	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd Osłonięty cewnik dożylny 24 mierniki	Becton Dickinson	381412	Plastikowy cetelek z wysuwaną igłą
Naczynia krystalizujące 100x50	VWR	89000-290
Polistyrenowe płytki Petriego	Sigma Aldrich	P5481-500EA
Probówki stożkowe 50 ml	Pipety miarowe Fisher Scientific	12-565-270
(5 ml)	Pipety miarowe Fisher Scientific	170355
(25 ml)	Fisher Scientific	170357
EasyStrainer 100 μ M	Greiner bio-one	542000	100 μ m filtr
siatkowy EasyStrainer 40 μ M	Greiner bio-one	542040	40μ m filter
Sterylne pipety transferowe	Fisher Scientific	13-711-20
Wirówka kubełkowa z chłodzeniem	Sorvall Legend XTR	75-217-406	Wirówka z obrotowym wiadrem
Inkubator kultur tkankowych Galaxy 170R	Eppendorf	CO170R-120-0000	Nawilżany inkubator do hodowli tkankowych
odczynniki
Nazwa	Związek	gramów (g/L)	milimolowy (mM)
Bufor 1, pH 7,4	NaCl	8,3	142
	KCl	0,5	6,7
	KREWNE	2,4	10
	BSA	15	0,226
Bufor 2, pH 7,4	NaCl	3,9	66,74
	KCl	0,5	6,71
	CaCl2	0,7	6,31
	HEPES	24	100
	BSA	15	0,226
	Czerwień fenolowa	0,01	0,03
Bufor 3, pH 7,4	NaCl	8	137
	KCl	0,35	4,7
	MgSO4	0,08	0,66
	CaCl2	0,18	1,62
	HEPES	2,4	10
	BSA	15	0,226
PBS, pH 7,4	NaCl	8	137
	KCl	0,2	2,7
	Na2HPO4-7H2O	1,15	4,3
	KH2PO4	0,2	1,4
Inne odczynniki
Nazwa<	strong>Firma	Numer katalogowy	>Komentarze
Percoll (roztwór PVP)	GE Healthcare	288555
Kolagenaza typu IV	Sigma Aldrich	C5138
Izofluran	Abcam	ab144581
Pożywka do wzrostu hepatocytów
DMEM	Gibco	11965118
10% objętościowo płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148
Długoterminowy średni wzrost hepatocytów
DMEM
10% objętościowo płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148
Glukagon	Sigma	G3157-2mg	14 ng/ml
Insulina	Sigma	I9278-5mL	0,5 U/ml
Hydrokortyzon	Sigma	H0888-1g	7,5 mg / ml
Naskórkowy czynnik wzrostu	BD Biosciences	354001-100ug	20 ng / mL
LSEC medium
RPMI	Gibco	11875119
10% objętościowo płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437010
Pen/Strep (2x)	Gibco	15140148