Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

54.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56993

⸱

12 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Nebraska

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Streszczenie

Ten protokół demonstruje metodę uzyskiwania wysokiej wydajności i żywotności dla mysich hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka (SEC) odpowiednich do hodowli lub uzyskiwania lizatów komórkowych. W tym protokole żyła wrotna jest używana jako miejsce cewnikowania, a nie żyła główna, ponieważ ogranicza to zanieczyszczenie innych możliwych typów komórek w końcowym preparacie wątroby. Podczas całej procedury nie jest wymagane żadne specjalne oprzyrządowanie. Łaźnia wodna służy jako źródło ciepła w celu utrzymania temperatury wszystkich i roztworów. Do napędzania płynu używana jest standardowa pompa perystaltyczna, a do procedur wirowania wymagana jest wirówka stołowa z chłodzeniem. Jedynym ograniczeniem tej techniki jest umieszczenie cewnika w żyle wrotnej, co stanowi wyzwanie dla niektórych myszy w zakresie rozmiarów 18 - 25 g. Zaletą tej techniki jest to, że do perfuzji wykorzystywana jest tylko jedna żyła, a dostęp do żyły jest szybki, co minimalizuje niedokrwienie i reperfuzję wątroby, co zmniejsza żywotność komórek wątroby. Kolejną zaletą tego protokołu jest to, że łatwo jest odróżnić żywe hepatocyty od martwych za pomocą wzroku ze względu na różnicę w gęstości komórkowej podczas etapów wirowania. Komórki z tego protokołu mogą być wykorzystywane w hodowli komórkowej do dowolnego dalszego zastosowania, a także przetwarzane do dowolnej oceny biochemicznej.

Wprowadzenie

Perfuzja kolagenazy wątroby w celu uzyskania hepatocytów jest wykonywana od wczesnych lat 50. i jest stale ulepszana1,2,3,4. Bardzo ładny przegląd wielu metodologii, technik i odczynników stosowanych w oczyszczaniu komórek wątroby został opracowany w Meyer et al5. Uzyskanie zadowalającej wydajności wysoce żywotnych hepatocytów i SEC jest technicznie trudne. Siły mechaniczne, które oddzielają komórki, w tym jakość kolagenazy, to tylko niektóre ze zmiennych, które są trudne do kontrolowania. Ze względu na wrażliwość hepatocytów na siły mechaniczne, ich żywotność jest znacznie zmniejszona w warunkach nieoptymalnych, co powoduje potrzebę opracowania protokołu opisującego optymalne warunki izolacji. SEC wydają się nie być tak wrażliwe na mechaniczne ścinanie. Perfuzja in situ z trawieniem kolagenazy jest zdecydowanie najlepszą metodą przerywania połączeń komórka-komórka w celu uzyskania preparatów jednokomórkowych z wątroby i innych narządów, takich jak jelita i śledziona6. Protokół ten demonstruje prostą metodę wprowadzania buforu perfuzyjnego do żyły wrotnej za pomocą wysuwanego plastikowego cewnika zamiast nacięcia, które mogłoby spowodować zapadnięcie się żyły wrotnej, jak opisano w Smedsrød i wsp7.

Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie najważniejszych kroków wymaganych do osiągnięcia sukcesu w procedurze rozlewu wątroby. Etapy te obejmują umieszczenie cewnika, przepływ płynów perfuzyjnych i obchodzenie się z tkanką po trawieniu. Natężenie przepływu jest dostosowane powyżej naturalnego tempa przepływu krwi, ale wystarczająco niskie, aby kapsułka Glissona pozostała nienaruszona. Gdy wątroba jest prawidłowo strawiona, a komórki są rozdzielane w roztworze, oczyszczanie komórek jest stosunkowo proste, niezależnie od tego, czy odbywa się przez wirowanie różnicowe, adhezję płytek, czy oczyszczanie kulek magnetycznych. Żywe hepatocyty mają większą gęstość i można je łatwo oczyścić z komórek niemiąższowych (NPC) i martwych hepatocytów za pomocą wirowania z niską prędkością. W większości zastosowań powszechną metodą jest adhezja płytek do oddzielania komórek Kupffera (KC) i SEC8, chociaż istnieją doniesienia, że nie daje ona najlepszej czystości SEC9. KC mają tendencję do szybkiego przylegania do twardych, sztywnych powierzchni, a szalki Petriego (standardowy polistyren) są najczęściej używanym materiałem do tej procedury. Oczyszczanie SEC lub KC za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami jest niewątpliwie najlepszą metodą znacznego oczyszczenia tych komórek, chociaż procedura dodaje kolejne 3 - 4 godziny do tego protokołu, a ogólna wydajność ulega zmniejszeniu9. Raport ten szczegółowo przedstawia proces optymalnej perfuzji wątroby, który zazwyczaj daje dużą liczbę żywotnych komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dla zwierząt opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Lincoln - Nebraska zgodnie z protokołem #1435.

1. Przygotowanie

  1. Przygotowanie roztworów i pożywek hodowlanych
    1. Przygotować wszystkie pożywki hodowlane i bufor zgodnie z tabelą materiałów.
  2. Przygotowanie instrumentów
    1. Ustawić łaźnię wodną (>10 l) o temperaturze 42 °C, pompę perystaltyczną o zmiennej prędkości obrotowej i zaciski do trzymania kolb. Przygotuj zakrzywione nożyczki i kleszcze (Rysunek 1).
    2. Na łaźni wodnej lub w jej sąsiedztwie ułóż blachę do pieczenia (około 38 x 26 cm) z podkładką styropianową (stożkowy ruszt 50 ml), pokrytą chłonnym podkładem pociętym na kawałek o wymiarach 20 x 20 cm (Rysunek 1).
    3. Umieść kawałek taśmy maskującej (5 - 8 cm) w pobliżu. Umieść w pobliżu poliestrową nić do szycia o długości 20 cm, która jest przycięta i gotowa do użycia. Zaopatrz się w plastikowy cewnik z wysuwaną igłą (7 mm x 19 mm, Rysunek 1).
  3. Przygotowanie wyrobów szklanych
    1. Za pomocą zacisków umieścić i unieruchomić kolbę o pojemności 1 l w łaźni wodnej zawierającej 200 ml 1x PBS z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml wprowadzane do roztworu. Gumowy korek jest nacięty, aby umożliwić recyrkulację płynu w obiegu zamkniętym.
    2. Za pomocą kolejnego zacisku umieścić kolbę o pojemności 125 ml zawierającą 45 ml buforu 2 wraz z korkiem zawierającym dwie pipety o pojemności 1 ml, z których jedna znajduje się w cieczy w pobliżu dna kolby, a druga, która pozostaje nad cieczą i wdmuchuje tlen do kolby.
      UWAGA: Każda pipeta w korkach będzie wyposażona w adapter szybkiego odłączania przymocowany do końca, który ułatwia wymianę rurki. Tlen będzie delikatnie przepływał do obu kolb przez pipetę umieszczoną w korku, który nie jest zanurzony w cieczy.
    3. Odłóż na bok dwie sterylne naczynia krystalizujące.

2. Procedura na zwierzętach

  1. Podgrzać roztwory PBS i buforu 2 do temperatury 42 °C w łaźni wodnej i cyrkulować PBS przez co najmniej 20 ml/min w rurkach w obiegu zamkniętym, aby utrzymać ciepło w przewodach cieczy. Zanurzyć nadmiar rurki w łaźni wodnej tak, aby pozostał jak najbliżej 42 °C. Opróżnić męski koniec rurki do 1-litrowej kolby zawierającej PBS.
  2. Umieścić wacik na podkładce chłonnej i dodać około 2 ml 30% izofluranu (wypełnionego glikolem polietylenowym 200, który zmniejsza szybkość parowania izofluranu) na wacik za pomocą pipety transferowej.
  3. Podnieś mysz za ogon, umieść ją w jednym z krystalizujących się naczyń, a następnie szybko przewróć naczynie na wacik, aby mysz miała niewielką przestrzeń, w której może wdychać znieczulenie. Obserwuj częstość oddechów myszy i upewnij się, że mysz jest skutecznie pod narkozą.
    UWAGA: Częstość oddechów powinna być wolniejsza i głębsza, ogon wiotki, a łapy nie reagują na test szczypania w znieczuleniu; Dodatkowe informacje można znaleźć w wytycznych IACUC.
  4. Podczas gdy mysz jest pod narkozą (trwa to 1-2 minuty), przygotuj cylinder strzykawki o pojemności 10 ml, wyciągając tłok i wkładając mały wacik. Dodaj 1-2 ml 30% izofluranu za pomocą pipety transferowej do wacika wewnątrz beczki i połóż lufę otwartym końcem na stole, czekając, aż mysz straci przytomność.
  5. Szybko zdejmij naczynie krystalizujące, odwróć mysz na plecy i umieść cylinder strzykawki na jego nosie. Dokładnie sprawdź częstość oddechów, szczypanie palców u nóg i wiotki ogon. Wszelkie reakcje na uszczypnięcie palca u nogi i wiotki ogon wskazują, że mysz nie jest w pełni znieczulona. Trzymaj lufę strzykawki nad pyskiem, aby zachować nieprzytomność.
  6. Umieść pinezki w łapach myszy, z kończynami wyciągniętymi w pozycji leżącej. Zwilż brzuch i klatkę piersiową 70% izopropanolem lub etanolem.
  7. Trzymając proste kleszcze w jednej ręce, podnieś skórę w pobliżu podstawy brzucha. Z drugiej strony nożyczkami przetnij skórę namiotu i otrzewną. Nacięcie powinno być poziome lub w poprzek podstawy skóry namiotu. Pamiętaj, aby przeciąć wszystkie warstwy skóry i otrzewnej, aby uzyskać dostęp do jelit. Przeciąć bocznie wokół brzucha aż do klatki piersiowej po obu stronach, nie nacinając żadnego z narządów.
  8. Odetnij płat skóry, przecinając dolną klatkę piersiową. Przesuń jelita w prawo z tyłem kleszczy, aby odsłonić żyłę wrotną.
    UWAGA: Krwawienie ze zwierzęcia powinno być minimalne; Zwierzę powinno nadal oddychać i być w głębokim znieczuleniu.
  9. Umieść zamknięte zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną między wątrobą a żyłą trzustkowo-dwunastniczą górną (strzałka Rysunek 3).
  10. Otwórz kleszcze, gdy znajdują się pod żyłą wrotną. Chwyć nić i ostrożnie przeciągnij ją tak, aby znalazła się wyśrodkowana pod żyłą wrotną. Zawiąż węzeł od góry wokół żyły wrotnej, nie zaciskając jej.
  11. Umieść zakrzywione kleszcze pod żyłą wrotną i delikatnie pociągnij ją w kierunku ogona myszy, aby wyprostować żyłę (Rysunek 4A).
  12. Trzymając cewnik w drugiej ręce, umieść skos igły skierowany do góry i równolegle do dolnej części żyły wrotnej w pobliżu kleszczy (Rysunek 4B).
  13. Delikatnie nakłuć żyłę igłą (Rysunek 4C). Upewnij się, że skos igły znajduje się w świetle żyły. Wycofaj igłę obciążoną sprężyną i kontynuuj wpychanie cewnika polimerowego przez żyłę, aż skos znajdzie się w pobliżu rozgałęzionego obszaru żylnego. To jest w wątrobie. Jeśli cewnik zostanie umieszczony prawidłowo, widoczny będzie wsteczny przepływ krwi. (Rysunek 4D).
  14. Zaciśnij węzeł nad dłonią i pociągnij go w dół na cewniku, aby go ustabilizować. Natychmiast zmniejsz wydajność pompy z 20 ml/min do 4 ml/min i odetnij kolejne główne naczynie krwionośne w celu drenażu. Wytnij aortę brzuszną, aby uzyskać optymalne rezultaty.
  15. Umieść męski koniec rurki na żeńskim końcu cewnika (Rysunek 5A). Upewnij się, że w przewodzie nie ma pęcherzyków powietrza. Należy uważać, aby cewnik nie został wepchnięty do wątroby lub z żyły. Umieszczenie nici nie jest konieczne, chociaż pomaga zapobiegać cofaniu się wody z żyły i pomaga utrzymać cewnik we właściwej pozycji (Rysunek 5B, C).
  16. Użyj taśmy maskującej, aby unieruchomić rurkę na podkładce. Użyj prostych kleszczy, aby ścisnąć naczynie krwionośne odpływu, aby kilkakrotnie napompować wątrobę, aby upewnić się, że cała krew odpłynęła (Rysunek 5D).
    UWAGA: Standardowa taśma laboratoryjna może nie działać; Jednak taśma maskująca pozostanie przyklejona do podkładu, nawet w mokrych warunkach.

3. Perfuzja wątroby

  1. Podczas przepłukiwania wątroby PBS, odmierz około 24 mg kolagenazy typu IV i umieść ją w kolbie zawierającej 45 ml buforu 2 w łaźni wodnej. Należy upewnić się, że płyn w kolbie został zawirowany tak, aby kolagenaza całkowicie się rozpuściła i umieścić kolbę z powrotem w zacisku tak, aby płyn zawierający część kolby był całkowicie zanurzony w wodzie.
  2. Obserwuj zmianę koloru wątroby, gdy jest ona przepłukiwana PBS. Wymienić rurkę odpływową z kolby o pojemności 1 l na kolbę o pojemności 125 ml. Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza przedostały się do wątroby.
  3. Gdy bufor perfuzyjny dotrze do wątroby, krótko ściśnij mocno naczynie krwionośne odpływu, aby wytworzyć ciśnienie w naczyniu i pozwól, aby ten płyn wypełnił wszystkie płaty wątroby. Należy pamiętać, aby nie odcinać drenażu zbyt długo, ponieważ może to spowodować pęknięcie cienkiej tkanki łącznej otaczającej wątrobę (kapsułkę Glissona) i zniszczyć perfuzję lub przepływ płynu w łożysku kapilarowym wątroby.
  4. Pozwól, aby bufor 2 z kolagenazą przeniknął przez wątrobę, aż wszystkie 45 ml przepłynie przez tkankę.
    UWAGA: Jeśli się powiedzie, kapsułka Glissona powinna zostać oddzielona od miąższu lub tkanki wątroby, a sama wątroba powinna wyglądać na amorficzną.
  5. Dodaj około 10 ml buforu 1 do drugiego naczynia krystalizującego i umieść je obok myszy.
  6. Wyjmij cewnik i wyłącz pompę.
  7. Prostymi kleszczami i nożyczkami odetnij wątrobę od myszy. Jeśli trawienie kolagenazy było bardzo wydajne, może być konieczne posiadanie pod ręką czystej, sterylnej łyżki, aby zgarnąć wątrobę myszy i umieścić ją w buforze 1.

4. Oczyszczanie hepatocytów

UWAGA: Manipulacja komórkami odbywa się w sterylnym kapturze do hodowli tkanek, aby ograniczyć zanieczyszczenie, jeśli komórki mają być hodowane we wszystkich kolejnych krokach.

  1. Używając sterylnej techniki, chwyć wątrobę kleszczami i delikatnie potrząśnij komórkami z wątroby. Rozerwij lub odciągnij kapsułkę Glissona: bufor stanie się nieprzezroczysty, gdy komórki zostaną wytrząśnięte z wątroby.
  2. Odlać roztwór komórkowy do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml z filtrem 100 μm umieszczonym na górze.
  3. Dodaj więcej buforu 1 do resztek wątroby i kontynuuj wytrząsanie komórek. Kontynuuj, aż wątroba wydaje się pozbawiona komórek lub gdy niestrawione części wątroby nie dają już komórek.
  4. Wlej płyn komórkowy do innego stożkowego filtra o pojemności 50 ml zawierającego filtr 40 μm.
  5. Odwirować stożek w obrotowym wirniku kubełkowym o sile 100 x g przez 3 min.
    UWAGA: Nie używaj maksymalnego hamulca, ponieważ może to spowodować przemieszczenie się osadu komórkowego. Użyć hamulca przy 80%, co jest wystarczające dla wszystkich pozostałych etapów wirowania w temperaturze 4 °C
  6. Wlej supernatant (który zawiera NPC i martwe hepatocyty) do czystego stożka i umieść go na lodzie. Upewnij się, że odbywa się to jednym ruchem, aby obserwować przyleganie granulek.
  7. Zawiesić osad w 40 ml buforu 1. Powtórz kroki 4.5 i 4.6. Zawiesić osad w 40 ml buforu 3. Powtórz kroki 4.5 i 4.6 dwukrotnie.
  8. Ponownie zawiesić oczyszczone hepatocyty w ciepłym DMEM + 10% FBS + 2x Penicylina-Streptomycyna (Pen/Strep).
  9. Jeśli komórki są hodowane na płytkach pokrytych kolagenem, pozwól im przylegać przez 1 godzinę i wymień pożywkę przynajmniej raz, ponieważ zapobiegnie to powstawaniu zanieczyszczeń bakteryjnych.
    1. Płytki pokryte kolagenem należy wykonać inkubując je z 0,05% kolagenem w 0,001% kwasie octowym przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przemywając 1x PBS.
  10. Jeśli żywotność hepatocytów jest niska i istnieje chęć uzyskania oczyszczonych, wysoce żywotnych hepatocytów, należy zastosować następujący protokół zaadaptowany z Kreamera i wsp. 10.
    1. Wymieszaj 9 objętości roztworu PVP (Percoll, 23% m/w roztwór wody i 15 - 30 nm koloidalnych cząstek krzemionki pokrytych poliwinylopirolidonem do odwirowania gęstości) i 1 objętość 10x HBSS, aby uzyskać izoosmotyczny roztwór PVP (SIP).
    2. Dodać 24 ml SIP do sterylnego stożkowego naczynia o pojemności 50 ml, które może być przechowywane w tych warunkach przez okres do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    3. Dostosuj stężenie hepatocytów do 5 - 10 × 106 komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej, takiej jak ta opisana w kroku 4.8.
    4. Dodać 25 ml zawiesiny komórkowej do każdego 24 ml SIP zawierającego stożkowy i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Gęstość tego roztworu wynosi 1,06 g/ml.
    5. Odwirować stożek o masie 50 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odessać SIP i flokulant, a następnie ponownie zawiesić komórki w HBSS.
    7. Przemyć komórki przez odwirowanie w temperaturze 50 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Powtórz krok 4.10.6 jeszcze raz, a następnie ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej.

5. Oczyszczanie SEC

  1. Osadzać komórki w supernatantach z kroku 4.6, obracając probówki pod ciśnieniem 163 x g przez 10 minut. Wyrzuć supernatanty z probówek i ponownie zawieś wszystkie granulki komórek w 5 ml RPMI bez surowicy i połącz je razem w jednej probówce.
  2. Po zebraniu wszystkich granulek dodaj RPMI do końcowej objętości 35 ml.
  3. Odwirować pulę stożkową o masie 25 x g przez 3 minuty. Ostrożnie zassać górne 25 ml RPMI za pomocą pipety 25 ml i umieścić pożywkę zawierającą NPC w czystym stożkowym zbiorniku o pojemności 50 ml na lodzie.
  4. Dodaj 25 ml świeżego RPMI z powrotem do probówki i ponownie zawieś granulki.
  5. Powtórzyć krok 5.3 dla drugiego przemycia i zebrać supernatant. Wyrzuć pozostałe 10 ml pożywki i osadu (osad składa się głównie z martwych hepatocytów). Odwirować zbiorczy supernatant o stężeniu 163 x g przez 10 minut.
  6. Podczas wirowania przygotuj gradienty roztworu PVP w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml.
  7. Dodaj 15 ml 50% roztworu PVP do 50 ml stożkowego, a następnie 20 ml 25% Percollu nałożonego pipetorem ustawionym na najmniejszą prędkość wyrzutu. Pamiętaj, aby obserwować linię załamania światła na znaku 15 ml, która wyznacza dwie warstwy, ponieważ jest to miejsce, w którym SEC i KC będą się agregować po odwirowaniu.
  8. Ponownie zawiesić ogniwa uprzednio granulowane w kroku 5.5 w 10 ml zimnego RPMI i nałożyć je na gradient roztworu PVP. Pamiętaj, aby zachować wyraźne rozgraniczenie między dwiema warstwami. Odwirować nachylenie przy 805 x g przez 20 minut z hamulcem ustawionym na 50%.
  9. Zassać od góry do oznaczenia 20 ml na probówce i wyrzucić ten materiał. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 5 ml zbierz SEC i KC, które znajdują się na granicy 25/50%. Wyrzuć wszelkie brązowe grudki komórek, ponieważ są to martwe hepatocyty.
  10. Umieść komórki w stożkowym zbiorniku o pojemności 50 ml i dodaj RPMI do oznaczenia 50 ml, aby rozcieńczyć roztwór PVP. Wirować przy 200 x g przez 10 minut, z 80% hamulcem.
  11. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, zmywając stożek stożka w 12 ml ciepłego RPMI.
  12. Oddzielić SEC od KC, umieszczając supernatant na polistyrenowej szalce Petriego i inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Zassać pożywkę pipetą o pojemności 25 ml i przepłukać płytkę tym samym podłożem, z pipetorem ustawionym na najniższą prędkość, aby zebrać pozostałe SEC, podczas gdy KC przylegają do płytki.
  14. Odwirować SEC przy 200 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Następnie mianejcie komórki i umieszczajcie w szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiono demonstracyjną, udoskonaloną metodę perfuzji wątroby oraz oczyszczania/wzbogacania hepatocytów i komórek śródbłonka zatokowego (SEC), zawierającą szczegółowe wskazówki dotyczące optymalnego oczyszczania/wzbogacania komórek, podobnie jak w innych raportach opisanych w przywołanym przeglądzie 5. Krytyczne kroki decydujące o powodzeniu oczyszczania komórkowego zależą od sposobu prowadzenia i szczegółów technicznych procedury perfuzji kolagenazą, które zostały opisane w niniejszym protokole. Układ aparatury jest dość prosty i ekonomiczny, oparty na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym, w przeciwieństwie do innych opublikowanych systemów11 (Rycina 1). W tym układzie taca z myszą spoczywa na łaźni wodnej, a część nadmiarowych przewodów znajduje się w łaźni w celu utrzymania temperatury płynów perfundujących wątrobę. Przedstawiona tutaj aparatura może być stosowana zarówno u myszy, jak i u szczurów, przy czym perfuzja wątroby szczura wymaga nieco innej geometrii układu12 (Rycina 2).

W tej procedurze perfuzja wątroby odbywa się przez żyłę wrotną zamiast żyły głównej (która jest inną popularną drogą perfuzji) ze względu na łatwość dostępu do niej w obrębie jamy brzusznej oraz fakt, że żyła ta doprowadza krew bezpośrednio do wątroby. Należy pamiętać, że żyła wrotna posiada kilka małych odgałęzień, które mogą powodować przecieki perfuzatu, dlatego w celu uzyskania optymalnych rezultatów cewnik należy wprowadzić poza te odgałęzienia13 (Rysunek 3). Po zidentyfikowaniu żyły wrotnej za pomocą zakrzywionej pęsety przeciąga się szew chirurgiczny lub nitkę poliestrową pod żyłą wrotną, pomiędzy wątrobą a górną żyłą trzustkowo-dwunastniczą. Pęsety służą również do wyprostowania żyły wrotnej, w której panuje dodatnie ciśnienie krwi (Rysunek 4A). Igłę wewnątrz cewnika należy ustawić równolegle i obok żyły (Rysunek 4B), a ścięcie igły delikatnie wprowadzić do światła żyły (Rysunek 4C). Prawidłowe umieszczenie igły zostanie zasygnalizowane przez pojawienie się krwi wzdłuż cewnika. Po wycofaniu igły cewnik należy ustabilizować, zawiązując na nim nitkę, co spowoduje, że ciśnienie krwi wypchnie ją przez cewnik. Zaleca się podłączenie cewnika do drenu pompy przed wypłynięciem krwi (Rysunek 4D). Po podłączeniu drenu pompy należy natychmiast przeciąć duże naczynie krwionośne, takie jak żyła główna lub aorta abdominalis, aby umożliwić odpływ krwi/płynów (Rysunek 5A). Zazwyczaj konieczne jest nacięcie bocznej ściany jamy brzusznej myszy w celu zapewnienia wystarczającego drenażu, ponieważ gromadzenie się krwi w brzuchu utrudnia wizualizację procesu perfuzji, a krew może przedostać się do etapu oczyszczania komórek (Rysunek 5B). Gdy PBS zacznie perfundować wątrobę, organ ten zblednie wskutek usunięcia krwi (Rysunek 5C). Jeśli zblednie tylko kilka płatów, prawdopodobną przyczyną jest zbyt głębokie wprowadzenie cewnika do wątroby; należy go wówczas powoli wycofać. Po potwierdzeniu prawidłowego umiejscowienia cewnika, należy zabezpieczyć dren za pomocą wodoodpornej taśmy maskującej. Zwykła taśma laboratoryjna jest zazwyczaj niewystarczająca. Aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie cewnika, należy ścisnąć przecięte naczynie krwionośne, aby zatrzymać drenaż, i zaobserwować wzrost ciśnienia w wątrobie. Pomoże to w wypłukaniu krwi z wątroby (Rysunek 5D). Czynność tę należy powtórzyć również w momencie wprowadzania roztworu kolagenazy do wątroby, aby upewnić się, że wszystkie płaty są wystawione na działanie kolagenazy. Po zakończeniu podawania roztworu kolagenazy, oznaką prawidłowego trawienia kolagenazą jest oddzielenie torebki Glissona od miąższu.

Ogólna procedura oczyszczania komórek przedstawiona jest na Rysunku 6 oraz Rysunku 7, w których hepatocyty są zbierane na wczesnym etapie procedury podczas wirowania z niską prędkością i wykazują wysoką czystość po 4 przemyciach w buforach zawierających BSA (Rysunek 8). SEC są współoczyszczane z KC na gradiencie PVP (Rysunek 9A), a następnie rozdzielane poprzez selektywną adhezję na pokrytej kolagenem polistyrenowej szalce Petriego. Czystość SEC uzyskana tą metodą wynosi 83–90% i zależy w dużej mierze od ogólnej skuteczności trawienia kolagenazą (Rysunek 9B). Pomiary ilościowe z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej (ponieważ zarówno hepatocyty, jak i SEC posiadają cechy odróżniające je od innych komórek) wykazują, że w reprezentatywnej preparacji hepatocyty są niemal w 100% czyste, a SEC w nieco ponad 89% (Tabela 1). Alternatywnie, wyższy stopień wzbogacenia SEC można uzyskać poprzez separację na kolumnie magnetycznej po gradiencie PVP, choć wykracza to poza zakres niniejszego protokołu. Więcej informacji na temat separacji magnetycznej SEC i KC można znaleźć w pracy Meyer et al.9 oraz Liu et al.14. Należy pamiętać, że żywotność hepatocytów gwałtownie spada w niedostatecznie strawionej wątrobie, jednak nie musi to być prawdą w przypadku NPC. Niedostatecznie strawione wątroby produkują również więcej zanieczyszczeń komórkowych, które nie są całkowicie usuwane w etapach wirowania.

Układ do izolacji komórek z PBS i kolagenazą w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C, pułapką pęcherzykową i schematem przepływu tlenu.
Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie zestawu do perfuzji. Kolby są utrzymywane w miejscu za pomocą zacisków (niewidoczne); zamiana przewodów z cieczą z kolby 1 L do kolby 125 mL w trakcie procedury jest przedstawiona czerwoną linią przerywaną. Należy zauważyć, że dopływ tlenu nie bąbelkuje bezpośrednio do roztworów w kolbach. Korki powinny być również nacięte, aby umożliwić przepływ cieczy w obiegu zamkniętym z przewodami włożonymi w nacięcie. Jest to kluczowe podczas rozgrzewania przewodów oraz w celu usunięcia całego powietrza z przewodów. Odpowietrznik składa się z łącznika T, który jest połączony z przewodami Tygon oraz zaciskami do szybkiego otwierania i zamykania układu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do perfuzji narządu ilustrujący dynamikę płynów, zawory oznaczone A-F; eksperyment laboratoryjny.
Rycina 2: Zestaw do perfuzji podczas perfuzji wątroby myszy. Taca z myszą jest umieszczona na narożniku łaźni wodnej. Tlen jest odłączony od roztworu kolagenazy, ponieważ został on uprzednio natleniony podczas podgrzewania. Położenie elementów: A) linie tlenowe, B) kolba 1 L zawierająca PBS, C) kolba 125 mL zawierająca bufor 2 z kolagenazą, D) pompa, E) sterownik pompy, F) pułapka pęcherzyków powietrza, G) linia płynowa biegnąca z kolby, przez pompę do myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat sekcji anatomicznej z oznaczeniami żył wrotnych wątroby, żołądka, trzustki, wątroby i nerek.
Rysunek 3: Obraz układu naczyniowego jamy brzusznej myszy. Cewnik należy wprowadzić tuż poniżej złączy żył żołądkowej i trzustkowej odchodzących od żyły wrotnej (zielona kropka), a jego końcówkę umieścić w pobliżu lewej i prawej żyły wrotnej wątroby (żółta kropka), która rozwidla się w stronę głównych płatów wątroby. Po osiągnięciu prawidłowego położenia cewnik należy ustabilizować nicią, wykonując zwykły węzeł nadgarstkowy. K = nerka, L = wątroba, SI = jelito cienkie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu perfuzji wątroby przedstawiający procedurę wstrzykiwania do żyły wrotnej u myszy laboratoryjnej.
Rycina 4: Umieszczenie cewnika w żyle wrotnej. (A) Pinceta służy do zapewnienia przekrwienia żyły wrotnej oraz do jej wyprostowania w celu umieszczenia cewnika. (B) Cewnik jest ustawiony równolegle do żyły wrotnej, z otworem igły skierowanym do góry. (C) Otwór igły znajdującej się w cewniku jest wprowadzany do wnętrza żyły, a nie przez jej ścianki na wylot. (D) Igła cewnika jest wycofana, a krew zaczyna cofać się przez cewnik, co jest wskazane końcówką pincety. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura chirurgiczna u myszy w celu kanulacji aorty, przedstawiająca krok po kroku sekcję i pozycjonowanie.
Rycina 5: Prawidłowa perfuzja wątroby. (A) Po umieszczeniu cewnika, żeński koniec Luer cewnika jest łączony z męskim końcem Luer (odciętym od strzykawki 1 mL) rurki pompy. (B) Po przecięciu jednego z głównych zstępujących naczyń krwionośnych, krew i PBS są odprowadzane z jamy brzusznej poprzez nacięcie boku myszy nożyczkami. (C) Wątroba powinna zblednąć podczas wypłukiwania krwi i (D) napuchnąć pod wpływem ciśnienia po zaciśnięciu przeciętego naczynia krwionośnego pęsetą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu wirowania; izolacja NPC; zmienne siły g; układ eksperymentalny.
Rysunek 6: Schematyczna analiza oczyszczania hepatocytów i izolacji NPC. Większość etapów wirowania ma na celu oddzielenie żywych i martwych hepatocytów od komórek nieparenchymalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat separacji komórek: mieszanina NPC wirowana w gradientach Percoll, selektywna adhezja, wzbogacone SEC.
Rysunek 7: Schematyczny zarys wzbogacania i oczyszczania SEC. Komórki NPC są rozdzielane za pomocą gradientu PVP, a następnie poddawane separacji SEC poprzez krótkotrwałą adhezję do standardowej płytki polistyrenowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Morfologia komórek, obraz mikroskopowy; analiza struktury komórkowej, skala 50 µm.
Rysunek 8: Oczyszczone hepatocyty. Hepatocyty wysiano na płytki hodowlane pokryte kolagenem w pożywce DMEM + 8% FBS + Pen/Strep i inkubowano przez 6 h, po czym wykonano zdjęcia za pomocą mikroskopu przy powiększeniu 400X. Odcinek skali odpowiada 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces wirowania; rozdzielenie probówek, rozkład komórek, wyniki mikroskopowe, analiza osadu.
Rycina 9: Oczyszczanie metodą SEC. (A) Komórki SEC i KC zostały zebrane z interfazy 25/50% PVP (żółte strzałki) i przemyte medium bezsurowiczym. (B) Komórki SEC oddzielono od KC poprzez selektywną adhezję na standardowych szalkach Petriego, przemyto i wysiano na naczynia do hodowli tkankowej pokryte kolagenem w pożywce RPMI + 5% FBS. Zdjęcia wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu EVOS przy powiększeniu 400X. Pasek skali odpowiada 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy struktury biofilmu; rozkład bakterii; strzałki wskazują skupiska bakterii; skala 5 μm.
Rycina 10: Skaningowa mikroskopia elektronowa anatomii wątroby myszy. Wątrobę myszy perfundowano PBS, a następnie utrwalaczem (100 mM kodylanu sodu, 12 mL 25% glutaraldehydu, 15,6 mL 16% paraformaldehydu, 2,65 mM chlorku wapnia, 180,2 mM sacharozy, zmieszanych w 100 mL roztworu) z prędkością 1 mL/min przez 4 min. Tkanki pocięto i przygotowano do skaningowej mikroskopii elektronowej. Obrazy zarejestrowano za pomocą SEM z emisją polową przy powiększeniu 10 000X. Żółte strzałki wskazują mikrokosmki między hepatocytami. Pasek skali odpowiada 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Eksperyment z wirowaniem; dwie probówki stożkowe z osadami do separacji i analizy komórek.
Rycina 11: Wizualizacja martwych i żywych hepatocytów. Po dwukrotnym przemyciu Buforem 1 stosunek żywych do martwych hepatocytów w osadzie można ocenić wzrokowo. Jaśniejszy osad (po lewej) wskazuje, że co najmniej połowa hepatocytów jest martwa. Ciemniejszy osad po prawej jest bardziej ściśle zbity na dnie probówki i składa się w ponad 90% z żywych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Oczyszczanie komórek
Typ komórek% komórek docelowych% pozostałych komórek
Hepatocyty991
Komórki śródbłonka zatokowego89.110.9

Tabela 1: Ocena czystości komórek za pomocą mikroskopii świetlnej.

Dyskusja

Protokół ten podkreśla narzędzia, które są dostępne i które zapewnią użytkownikowi wysoki wskaźnik sukcesu w tej procedurze. Udana perfuzja ma fundamentalne znaczenie dla każdej dalszej aplikacji podczas pracy z komórkami pierwotnymi.

Istnieje kilka krytycznych etapów procedury, które decydują o powodzeniu. Po pierwsze, umieszczenie końcówki cewnika w żyle wrotnej musi być prawidłowe. Jeśli zostanie umieszczony zbyt głęboko w wątrobie, tylko mniejsze płaty zostaną perfundowane. Końcówka powinna znajdować się tuż poniżej prawej i lewej gałęzi żyły wrotnej. Zaletą stosowania cewnika polimerowo-kompozytowego w porównaniu z igłą jest to, że zadzior igły jest bardziej podatny na rozerwanie żyły podczas perfuzji niż cewnik. Po drugie, jakość i ilość kolagenazy decyduje o efektywności trawienia wątroby. W tej procedurze zastosowano wstępnie zakwalifikowaną kolagenazę typu 4, która jest ponownie zawieszana w dawce 0,5 mg/ml w buforze 2, jeśli aktywność kolagenazy, która ma być oznaczona, jest większa niż 900 j.m.

Pod koniec perfuzji kolagenazy wątroba powinna zachować nieco ciemnobrązowy lub brązowy kolor. Jeśli jest to jasnobrązowy kolor, oznacza to, że większość hepatocytów jest martwa. Wątroba powinna się rozpadać po odcięciu od myszy. W najlepszych warunkach wątrobę można wyjąć z jamy ciała myszy za pomocą małej łyżeczki. Wątroby w tym stanie zawsze dają bardzo wysoką żywotność komórek. Jeśli roztrząsnięcie komórek wymaga dużego wysiłku, jeśli wątroba jest nadal twarda podczas ekstrakcji lub jeśli do przemieszczenia hepatocytów przez filtry potrzebna jest duża siła, wówczas hepatocyty będą miały niższą żywotność. Hepatocyty pokryte są mikrokosmkami, co pozwala im mieć bardzo dużą powierzchnię (ryc. 10). Niepełne trawienie zachowuje połączenia komórka-komórka między hepatocytami, a mechaniczne ścinanie rozerwie błonę plazmatyczną. Perfuzja in situ z kolagenazą jest najlepszą metodą rozbijania komórek i utrzymania wysokiej żywotności. Na rycinie 11 wytwarza się dwa preparaty hepatocytów, w których granulki komórek porównano po kilku płukaniach w buforze 1. Osad po lewej stronie jest lżejszy i zawiera żywotność komórek około 50%. Śrut po prawej stronie jest ciemniejszy i ma żywotność 92%. Podobnie, gdy płyn jest nalewany z stożka o pojemności 50 ml, ciemniejszy granul jest nieruchomy w probówce, w przeciwieństwie do jaśniejszego granulatu, który będzie się przesuwał w probówce podczas wylewania cieczy. Niższa żywotność komórek lub nieefektywne perfuzje mogą wystąpić, gdy wątroba ma wysoki poziom stwardnienia.

Ponieważ żywe hepatocyty mają większą gęstość niż martwe hepatocyty, procedury wirowania spowodują uzyskanie preparatu, który jest wysoce czysty w żywotnych hepatocytach15. Jeśli występuje znaczna ilość martwych hepatocytów (co często występuje, gdy warunki są nieoptymalne), żywe komórki mogą być dodatkowo wzbogacone i oddzielone od martwych komórek za pomocą gradientów PVP. Dodatkowo, ponieważ żywe hepatocyty osadzają się szybciej niż martwe hepatocyty, aspiracja górnych 3rd osadu również zwiększy stosunek żywych do martwych komórek w osadzie. Procedury te są szybkimi i łatwymi metodami oddzielania żywych hepatocytów i resztek komórkowych od martwych w razie potrzeby10,16. Jest to szczególnie przydatne, jeśli próbka jest cenna, a do eksperymentu potrzeba tylko kilku milionów komórek.

Podsumowując, jest to łatwa i skuteczna metoda zbierania hepatocytów i SEC z wątroby. Przy obecnych cenach koszt wykonania tej procedury wraz ze wszystkimi odczynnikami i materiałami jednorazowego użytku wynosi poniżej 75 USD za preparat. Jeśli pożądanych jest wiele myszy, najlepiej przystąpić do oczyszczania hepatocytów i trzymać frakcję NPC na lodzie, dopóki wszystkie myszy nie zostaną przetworzone. NPC są na ogół stabilni na lodzie przez co najmniej 5 godzin, ale dłuższe czasy nie zostały przetestowane w tym laboratorium.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie jest częściowo zapewnione przez NIH z grantów R01HL130864.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Kolba Erlenmeyera 1 LFisher ScientificS63274
250 ml Kolba ErlenmeyeraRurka silikonowa Fisher ScientificS63271
 Cole-Parmer96400-14Ten przewód biegnie od kolb przez pompę do złącza T, a następnie do strzykawki o pojemności 1,0 ml, która jest podłączona do cewnika.
Rurka TygonFisher ScientificR3603Używana jako adapter między 96400-14 a pipetami i złączem T.  Może to być również używane do przewodów tlenowych.
TrójnikiCole-ParmerEW-06294-82
SzybkozłączkiFisher Scientific6150-0010
Zaciski zaciskoweFisher Scientific6165-0002
Masterflex L/S Pompa o zmiennej prędkości, model 7553-70Cole-ParmerEW-07559-00Pompa peryplastyczna o zmiennej prędkości
Głowica pompy, model 7014-20Cole-ParmerEW-07014-20
szklane pipety z podziałką 1,0 ml Fisher Scientific13-678
zakrzywione nożyczki nieząbkowaneFine Science Tools14069-12
Kleszcze DumontFine Science Tools11252-20
Zakrzywione kleszczeFine Science Tools13009-12
Strzykawka 10 mlFisher Scientific03-377-23Potrzebna będzie tylko beczka strzykawki
sterylowana łyżkaz artykułami domowymi
Wacik(y)Sklepz artykułami domowymi
Poliestrowa nić do szyciaz artykułami domowymi
Taśma maskującaSklep
pinezkiSklep
podkładka styropianowa 50 ml stożkowy stojak
ciastka/blachę do pieczeniaSklep
Podkłady chłonneFisher Scientific14-206-64
Łaźnia wodna 19 LFisher ScientificTSCOL19
BD Insyte Autogaurd Osłonięty cewnik dożylny 24 miernikiBecton Dickinson381412Plastikowy cetelek z wysuwaną igłą
Naczynia krystalizujące 100x50VWR 89000-290
Polistyrenowe płytki PetriegoSigma AldrichP5481-500EA
Probówki stożkowe 50 mlPipety miarowe Fisher Scientific12-565-270
(5 ml)Pipety miarowe Fisher Scientific170355
(25 ml)Fisher Scientific170357
EasyStrainer 100 μ MGreiner bio-one542000100 μ m filtr
siatkowy EasyStrainer 40 μ MGreiner bio-one54204040μ m filter
Sterylne pipety transferoweFisher Scientific13-711-20
Wirówka kubełkowa z chłodzeniemSorvall Legend XTR75-217-406Wirówka z obrotowym wiadrem
Inkubator kultur tkankowych Galaxy 170R EppendorfCO170R-120-0000Nawilżany inkubator do hodowli tkankowych
odczynniki
NazwaZwiązek gramów (g/L)milimolowy (mM)
Bufor 1, pH 7,4NaCl8,3142
KCl0,56,7
KREWNE2,410
BSA150,226
Bufor 2, pH 7,4NaCl3,966,74
KCl0,56,71
CaCl20,76,31
HEPES24100
BSA150,226
Czerwień fenolowa0,010,03
Bufor 3, pH 7,4NaCl8137
KCl0,354,7
MgSO40,080,66
CaCl20,181,62
HEPES2,410
BSA150,226
PBS, pH 7,4NaCl8137
KCl0,22,7
Na2HPO4-7H2O1,154,3
KH2PO40,21,4
Inne odczynniki
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowy>Komentarze
Percoll (roztwór PVP)GE Healthcare288555
Kolagenaza typu IVSigma AldrichC5138
Izofluran Abcamab144581
Pożywka do wzrostu hepatocytów
DMEMGibco11965118
10% objętościowo płodowa surowica bydlęcaGibco10437010
Pen/Strep (2x)Gibco15140148
Długoterminowy średni wzrost hepatocytów
DMEM
10% objętościowo płodowa surowica bydlęcaGibco10437010
Pen/Strep (2x)Gibco15140148
Glukagon SigmaG3157-2mg14 ng/ml
InsulinaSigmaI9278-5mL0,5 U/ml
HydrokortyzonSigmaH0888-1g7,5 mg / ml
Naskórkowy czynnik wzrostuBD Biosciences354001-100ug20 ng / mL
LSEC medium
RPMIGibco11875119
10% objętościowo płodowa surowica bydlęcaGibco10437010
Pen/Strep (2x)Gibco15140148
Sklep Sklep z artykułami domowymiz artykułami domowymi na z artykułami gospodarstwa domowego

Bibliografia

  1. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
  2. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  3. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
  4. Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation. Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).
  5. Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review. PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).
  6. Sies, H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).
  7. Smedsrod, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. Munin open research archive. , University of Tromsø. 1-10 (2012).
  8. Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).
  9. Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).
  10. Kreamer, B. L., et al. Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).
  11. Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. Isolated perfused rat liver technique. Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).
  12. Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion. J Vis Exp. (57), e3138(2011).
  13. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. 2008 edn (1965).
  14. Liu, J., et al. Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells. Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).
  15. Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures. Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).
  16. Clarke, B. L., Weigel, P. H. Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis. J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja hepatocyt wkaniulacja y y wrotnejtrawienie kolagenazgradient g sto ci Percollprzygotowanie hodowli kom rkowejskaningowa mikroskopia elektronowaanaliza w mikroskopii wietlnejprocedury wirowania
Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.