Artykuł metodologiczny

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57017

⸱

27 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry L 1, Department of Biocatalysis, Technical University of Berlin, 2Institute of Chemistry PC 14, Department of Bioenergetics, Technical University of Berlin, 3Institute of Chemistry TC 7, Department of Physical Chemistry/Molecular Material Sciences, Technical University of Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Streszczenie

Białka fluorescencyjne są podstawowymi narzędziami dla nauk przyrodniczych, w szczególności dla mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek. Podczas gdy warianty białka zielonej fluorescencji z Aequorea victoria (avGFP) typu dzikiego i zmodyfikowanego, a także homologi innych gatunków pokrywają już dużą część widma optycznego, w obszarze bliskiej podczerwieni pozostaje luka spektralna, dla której fluorofory na bazie avGFP nie są dostępne. Przesunięte ku czerwieni warianty białka fluorescencyjnego (FP) znacznie rozszerzyłyby zestaw narzędzi do spektralnego mieszania wielu gatunków molekularnych, ale naturalnie występujące przesunięte ku czerwieni FP pochodzące z koralowców lub ukwiałów mają niższą wydajność kwantową fluorescencji i gorszą fotostabilność w porównaniu z wariantami avGFP. Dalsza manipulacja i ewentualna ekspansja sprzężonego układu chromoforu w kierunku dalekiego czerwonego obszaru spektralnego jest również ograniczona przez repertuar 20 kanonicznych aminokwasów przepisanych przez kod genetyczny. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, biologia syntetyczna może osiągnąć dalsze widmowe przesunięcie ku czerwieni poprzez wprowadzenie niekanonicznych aminokwasów do triady chromoforowej. Opisujemy zastosowanie SPI do inżynierii wariantów avGFP o nowych właściwościach spektralnych. Ekspresja białek odbywa się w tryptofanowo-auksotroficznym szczepie E. coli oraz poprzez uzupełnienie pożywki wzrostowej odpowiednimi prekursorami indolu. Wewnątrz komórek te prekursory są przekształcane w odpowiednie analogi tryptofanu i włączane do białek przez maszynerię rybosomalną w odpowiedzi na kodony UGG. Zastąpienie Trp-66 w ulepszonym "cyjanowym" wariancie avGFP (ECFP) przez 4-aminotryptofan oddający elektrony powoduje, że GdFP charakteryzuje się przesunięciem Stokesa o 108 nm i silnie przesuniętym ku czerwieni maksimum emisji (574 nm), a jednocześnie jest termodynamicznie bardziej stabilny niż jego poprzednik ECFP. Specyficzne dla reszty włączenie aminokwasu niekanonicznego analizuje się za pomocą spektrometrii mas. Właściwości spektroskopowe GdFP są charakteryzowane przez czasowo-rozdzielczą spektroskopię fluorescencyjną jako jedno z cennych zastosowań genetycznie kodowanych FP w naukach przyrodniczych.

Wprowadzenie

Od czasu odkrycia białka zielonej fluorescencji u meduzy Aequorea victoria (avGFP) w 1962 roku1 i pierwszego heterologicznego wyrażenia w 1994 roku2 w innych komórkach eukariotycznych, białka fluorescencyjne z rodziny GFP stały się bardzo cennymi narzędziami i celami w naukach przyrodniczych. Rozległa inżynieria genetyczna i molekularna obejmowała dostosowanie specyficznego dla gatunku użycia kodonów, przyspieszenie fałdowania, poprawę dojrzewania, zwiększenie jasności, zapobieganie oligomeryzacji oraz dostosowanie właściwości spektralnych i fotochemicznych, w tym możliwość odwracalnego fotoprzełączania3,4,5,6. GFP zawdzięcza swoją fluorescencję chromoforowi 4-(p-hydroksybenzylideno)imidazolidyno-5-onu (HBDI). Ten ostatni powstaje autokatalitycznie z tzw. triady chromoforowej aminokwasów (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 w avGFP) po utworzeniu dodatkowego wiązania kowalencyjnego w szkielecie peptydowym pod wpływem tlenu cząsteczkowego7. Stabilizowany rezonansowo układ sprzężony oddziałuje dynamicznie ze swoim środowiskiem molekularnym, pozwalając na absorpcję w zakresie widzialnym i charakterystyczną zieloną fluorescencję tych białek.

W triadzie chromoforowej obecność aminokwasu aromatycznego jest obowiązkowa. Jednak standardowy repertuar aminokwasów obejmuje tylko cztery reszty aromatyczne (His, Phe, Trp i Tyr). Ogranicza to konwencjonalne podejścia mutagenezy do uzyskania znacznie bardziej przesuniętych ku czerwieni wariantów avGFP w stosunku do najbardziej przesuniętych ku czerwieni naturalnych FP, takich jak DsRed8 z Discosoma striata coralimorphs lub mKate/mNeptune9 z ukwiału Entacmaea quadricolor. W związku z tym daleka czerwień i bliska podczerwień widma optycznego powyżej 600 nm jest słabo pokryta przez warianty GFP. Jest to oczywiście poważne ograniczenie dla podejść opartych na mikroskopii fluorescencyjnej, które wymagają demultipleksacji spektralnej kilku gatunków fluoroforów w tym samym czasie. Na przykład, markery o długich falach są również niezbędne do wykorzystania reżimu niskiej absorpcji tkanki skórnej między 700-1,000 nm w ustawieniach obrazowania tkanek głębokich10.

Białka fluorescencyjne pochodzące z avGFP są podzielone na kilka klas w zależności od właściwości spektroskopowych i chemicznej natury ich chromoforów11. Dzięki triadzie Ser-65/Tyr-66/Gly-67 chromofor typu dzikiego występuje jako zrównoważona mieszanina między obojętną formą fenolową (λmax = 395 nm, ε = 21 000 M-1 cm-1) a anionową formą fenolanu (λmax = 475 nm, ε = 7 100 M-1 cm-1), a widmo emisyjne wykazuje pojedynczy pik przy 508 nm. Grupa hydroksylowa Ser-65 ma kluczowe znaczenie, ponieważ oddaje wiązanie H z Glu-222 w pobliżu chromoforu (odległość: 3,7 A), co sprzyja jonizacji tego karboksylanu. Klasa I charakteryzuje się anionowym chromoforem fenolanowym, jak w EGFP (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr; λmax = 488 nm, ε = 35 600 M-1 cm-1, λem = 509 nm). Ze względu na podstawienie Ser-65-Thr(Ala,Gly), pik wzbudzenia 395 nm neutralnej formy fenolowej jest tłumiony, a pik 470-475 nm fenolanu anionowego jest pięcio- do sześciokrotnie zwiększony i przesunięty do 490 nm. Klasa II obejmuje białka o obojętnym chromoforze fenolowym, jak w szafir-GFP. W tym przypadku podstawienie Thr-203-Ile prawie całkowicie tłumi wzbudzenie 475 nm, pozostawiając tylko pik przy 399 nm. Ponieważ anionowy chromofor nie może być prawidłowo solwatowany, preferowana jest jego neutralna forma. Klasa III obejmuje "żółte" warianty fluorescencyjne (EYFP; Ser-65-Gly/Val-68-Leu/Ser-72-Ala/Thr-203-Tyr; λmax ε = 514 nm, ε=84,600 M-1 cm-1, λem = 527 nm) z oddziaływaniem π-układanie aromatycznego łańcucha bocznego i fenolanu, co wynika z podstawień Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr), które prowadzą do maksimów emisji przesuniętych ku czerwieni do 20 nm (Thr-203-Tyr). Dalsza podstawienie (Gln-69-Lys) powoduje kolejne przesunięcie ku czerwieni o 1-2 nm do 529 nm, najbardziej przesuniętego ku czerwieni wariantu avGFP znanego11. Wymiana fenolu na indol (Tyr-66-Trp) tworzy klasę IV, podobnie jak w cyjanowo-fluorescencyjnym ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24 800 M-1 cm-1; λmax2 = 452 nm, ε = 23 600 M-1 cm-1; λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). Akomodacja masywnego indolu jest prawdopodobnie możliwa dzięki innym, kompensacyjnym mutacjom. Maksima wzbudzenia i emisji ECFP mieszczą się pomiędzy maksimami białek o obojętnych lub anionowych chromoforach. Białka klasy V zawierają imidazol zamiast fenolu (Tyr-66-His), np. białka o niebieskiej fluorescencji, takie jak EBFP. Klasa VI jest wytwarzana w wyniku wymiany fenol-fenyl faworyzującej wyłącznie neutralną formę chromoforu, co w konsekwencji prowadzi do najbardziej przesuniętych ku niebieskiemu pozycji szczytowych wzbudzenia i emisji (odpowiednio 360 nm i 442 nm).

Klasyczna mutageneza ukierunkowana na miejsce jest szczególnie odpowiednia do produkcji nowych wariantów chromoforu avGFP, poprzez permutację tripeptydu 65-67 i oddziałujących reszt w ramach 20 kanonicznych aminokwasów. Możliwości te mogą być jeszcze bardziej rozszerzone, gdy podczas syntezy białek rybosomalnych zostaną wprowadzone niekanoniczne warianty aminokwasów aromatycznych12. W zasadzie można to osiągnąć na dwa sposoby. Pierwsza strategia opiera się na tolerancji substratów maszynerii translacji białek, zwłaszcza syntetaz aminoacylo-tRNA (aaRS) w kierunku pokrewnych analogów aminokwasów. Aby osiągnąć to z wysoką skutecznością, stosuje się auksotroficzne szczepy ekspresyjne E. coli, które nie są w stanie syntetyzować odpowiedniego naturalnego aminokwasu. Pozwala to na zastąpienie tych ostatnich poprzez dodanie odpowiednich aminokwasów niekanonicznych (ncAA) lub ich prekursorów do pożywki hodowlanej. Ta strategia, znana również jako Selective Pressure Incorporation (SPI)13,14, umożliwia wymianę specyficzną dla pozostałości, co skutkuje globalną inkorporacją ncAA. Druga strategia wykorzystuje tRNA supresorowe kodonów stop, które są ładowane ncAA przez zmodyfikowane enzymy aaRS. Powoduje to odczyt kodonów stop w ramce i umożliwia włączenie ncAA specyficznego dla miejsca. W związku z tym ta metoda supresji kodonów stop (SCS) prowadzi do ekspansji kodu genetycznego15. Poprzez mutagenezę kodon stop jest umieszczany w genie docelowym w pożądanym miejscu. Zasadniczo SPI może być również używany do tworzenia rekombinowanych peptydów i białek posiadających unikalną instalację ncAA, biorąc pod uwagę, że do substytucji wybiera się rzadkie aminokwasy kanoniczne, takie jak Met lub Trp. Wykazano, że dzięki Trp podejścia SPI działają z wieloma różnymi analogami, w tym 4-F-, 5-F- i 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH- i 5-OH-Trp, a także 4- i 5-NH2-Trp, a nawet pochodnymi β(tienopirrolilo)alaniny16,17,18,19,20. W związku z tym SPI może być bardzo korzystny dla zastąpienia aminokwasów aromatycznych chromoforów GFP wariantami niekanonicznymi w celu zbadania możliwości dalszego dostosowania widm i przesunięcia Stokesa tych FP. Podobnie jak w przypadku wszystkich modyfikacji sekwencji białek, kompatybilność z fałdowaniem FP i dojrzewaniem chromoforów musi być testowana eksperymentalnie.

W tej pracy używamy klasy IV ECFP21, która zamiast dzikiego typu avGFP Tyr, przenosi pozostałość Trp w swojej triadzie chromoforowej. Używając SPI, ten Trp-66 (i Trp-57, jedyna inna reszta Trp w ECFP) jest podstawiony przez 4-amino-Trp. Obecność grupy aminowej 4-amino-Trp oddającej elektrony w chromoforze sprzyja stabilizacji rezonansowej znacznie przesuniętego ku czerwieni przeniesienia protonów w stanie wzbudzonym (ESPT) wyposażonym w przesunięcie Stokesa o 108 nm. To "złote" białko fluorescencyjne (GdFP) stanowi wariant o największym przesunięciu ku czerwieni maksimum fluorescencji (574 nm) spośród wszystkich białek pochodzących z avGFP. Opisujemy metodę wytwarzania białka GdFP metodą SPI i udostępniamy protokoły obowiązkowej analizy otrzymanych zmodyfikowanych białek za pomocą spektroskopii mas. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób GdFP może być wykorzystywane i analizowane w podejściach do czasowo-rozdzielczej spektroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Przemiana Trp-auksotroficznej E. coli

  1. Transformacja chemicznie lub elektrokompetentnych komórek (50 μl) szczepu E. coli Trp-auksotroficznego, np. ATTC 49980 (WP2, mutant pochodzący ze szczepu E. coli B/R22), z 1 μl wodnego roztworu 1 ng/μL plazmidu pQE-80L His6-ECFP przy użyciu odpowiednio szoku cieplnego lub elektroporacji. Szczegółowe informacje można znaleźć w Bazie Danych Edukacji Naukowej JoVE23,24 w celu uzyskania szczegółowych informacji.
    UWAGA: Wektor wyrażenia pQE-80L His6-ECFP koduje N-końcowy 6x oznaczony przez Hisa ECFP21 sterowany przez bakteryjny promotor T5 z operatorem lac. Ponadto zawiera znacznik wyboru AmpR i początek replikacji colE1 (sekwencję szkieletową wektora pQE-80L można znaleźć na: https://www.qiagen.com/mx/resources/resourcedetail?id=c3b71572-4d82-4671-a79b-96357fe926d1&lang=en&autoSuggest=true). Teoretyczna masa cząsteczkowa białka typu dzikiego His6-ECFG (po dojrzewaniu chromoforu25) wynosi 28303,92 Da. Przetłumaczona sekwencja białka docelowego jest następująca (podkreślenie znacznika His, pogrubienie pochodzące od wektorów): MRGSHHHHHHGSMVSGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMK
    QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGS
    VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK.
  2. Komórki przekształcone na płytce LB-agar (Tabela 1) uzupełnione 10 g/l glukozyny, 100 μg/ml ampicyliny i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.

2. Ekspresja białka rekombinowanego

  1. Nocny porój E. coli ATCC 49980 pQE-80L His6-ECFP
    1. Przygotować 5 ml pożywki LB (Tabela 1; uzupełniona 10 g/l glukozy, 100 μg/ml ampicyliny) w sterylnej probówce do hodowli polistyrenu o pojemności 14 ml do wzrostu tlenowego i zaszczepić pojedynczą kolonią z płytki agarowej za pomocą sterylnej końcówki pipety lub pętli do zaszczepiania.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie kolonii ze świeżo przekształconych komórek. Płytki z koloniami bakteryjnymi (z kroku 1.2.) można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200-250 obr./min przez noc.
  2. Wyrażenie ECFP typu dzikiego
    1. Zaszczepić 10 ml świeżej pożywki LB (Tabela 1; uzupełniona 10 g/l glukozy, 100 μg/ml ampicyliny) 100 μl nocnej hodowli w 100 ml kolby Erlenmeyera. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min.
      UWAGA: Opcjonalnie ten krok można wykonać w 10 ml pożywki NMM19 (Tabela 1) uzupełnionej 100 μg/L ampicyliny i 0,5 mM L-tryptofanu (alternatywnie można użyć indolu).
    2. Mierzyć gęstość optyczną przy długości fali zewnętrznej 600 nm (OD600) co 20 minut. Preferencyjnie mierzyć gęstość komórek, określając ekstynkcję przy długości fali 600 nm (OD600) w spektrofotometrze przy użyciu kuwety o długości drogi 1 cm. Pomiar referencyjny należy zawsze wykonywać przy użyciu odpowiedniej pożywki hodowlanej. Rozcieńczyć próbki i dobrze je wymieszać, aby uzyskać wartość pomiarową 0,1-0,8, a następnie obliczyć OD600 przy użyciu współczynnika rozcieńczenia. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z poprzednią publikacją 26.
    3. Po osiągnięciu wartości OD600 wynoszącej 0,5-0,8 (około 2-3 godziny po inokulacji) należy pobrać próbkę "przed indukcją" do SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu, etap 4).
    4. Indukować ekspresję białka docelowego poprzez dostosowanie płynnej kultury do 0,5 mM IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu z 1 M roztworu podstawowego) i inkubować ją w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min przez 4-8 h.
      UWAGA: Białka fluorescencyjne cyjanu są zwykle wyrażane w temperaturach poniżej 37 °C27.
    5. Weź próbkę "po wyrażeniu" dla SDS-PAGE (krok 4.).
    6. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C.
    7. Odrzucić supernatant przez dekantację i zamrozić osadki komórek w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu oczyszczenia białka docelowego.
  3. SPI do produkcji GdFP
    1. Zaszczepić 10 ml pożywki NMM19 (Tabela 1) uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny, 15 μM tryptofanu i 10 μl nocnej hodowli w 100 ml kolby Erlenmeyera i inkubować kolbę hodowlaną przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min.
      UWAGA: Dostępnych jest wiele chemicznie zdefiniowanych pożywek do hodowli E. coli i SPI. Oprócz NMM użytego w niniejszym dokumencie, można użyć MOPS medium28, sole glukozowo-mineralne medium29, Davis minimal medium30, M9 minimal medium31, lub GMML32.
    2. Następnego dnia mierz OD600 co 30 minut, aż wartość zmieni się tylko o mniej niż 0,05 w ciągu 30 minut. Wartość plateau powinna wynosić około 1,
      UWAGA: Dopuszczalne są odchylenia o ± 0,3 jednostki. W zależności od użytego szczepu bakteryjnego i pożywki, początkowe stężenie tryptofanu (krok 2.3.1) może wymagać dostosowania.
    3. Pobierz próbkę "przed indukcją" dla SDS-PAGE (krok 4.).
    4. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez dekantację.
    5. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki NMM19 ze 100 μg/ml ampicyliny do 100 ml kolby Erlenmeyera i dodać 4-aminoindol do końcowego stężenia 1 mM przy użyciu 50 mM roztworu podstawowego. Kontynuować inkubację przez 30 minut w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min.
      UWAGA: Ten krok jest zalecany ze względu na niską stabilność chemiczną ampicyliny i zapewnia wychwyt komórkowy 4-aminoindolu.
    6. Indukować ekspresję białka docelowego przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 0,5 mM przy użyciu 1 M zapasu i inkubować próbkę przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 200 obr./min.
      UWAGA: Białka fluorescencyjne cyjanu są zwykle wyrażane w temperaturach poniżej 37 °C27.
    7. Następnego dnia zmierz OD600.
    8. Weź próbkę "po wyrażeniu" dla SDS-PAGE (krok 4.).
    9. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant przez dekantację.
    10. W przypadku, gdy takie naczynie nie było używane do wirowania, przenieś osad komórkowy do stożkowej rurki polistyrenowej o pojemności 50 ml za pomocą szpatułki. Zamrażać osad komórkowy w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu oczyszczenia białka docelowego.

3. Oczyszczanie białka docelowego za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC)

  1. Liza komórek bakteryjnych
    1. Rozmrażaj granulki komórek na lodzie przez 10-20 minut.
    2. Zawiesić osad komórkowy w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml, używając 5 ml lodowatego buforu wiążącego (tabela 1) na lodzie.
    3. Dodać 20 μl lizozymu o stężeniu 50 mg/ml, 20 μl roztworu DNazy I o stężeniu 1 mg/ml i 20 μl roztworu RNazy A. Zamknąć probówkę, delikatnie wymieszać, odwracając 5 razy, i trzymać na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Częściowe rozerwanie komórek następuje jako katalizowane przez lizozym.
    4. Liza komórek przez sonifikację za pomocą końcówki homogenizatora ultradźwiękowego przy użyciu trzech cykli po 3 minuty w probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml chłodzonej lodem z błotem pośniegowym z 2 s impulsu, 4 s przerwy i 45% amplitudo.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować homogenizację wysokociśnieniową, np. 20 cykli przy 14 000 psi. W razie potrzeby rozcieńczyć za pomocą buforu wiążącego, aby osiągnąć minimalną objętość instrumentu. Co więcej, odczynniki do ekstrakcji białek mogą być stosowane do rozbijania komórek. Przykłady można znaleźć w tabeli materiałów.
    5. Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 15 000-18 000 x g, 4 °C.
    6. Przenieść supernatant do świeżej probówki i zanotować objętość cieczy.
    7. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,45 μm za pomocą plastikowej strzykawki Luer lock o pojemności 5 ml i filtra strzykawkowego z polifluorku winylidenu (PVDF).
    8. Pobrać próbkę "lizatu" dla SDS-PAGE (krok 4.).
    9. Zawiesić osad resztek komórkowych w ddH2O (taka sama objętość jak poprzedni lizat).
    10. Weź próbkę "granulki" dla SDS-PAGE (krok 4.).
  2. Oczyszczanie IMAC
    1. Użyj 1 ml paczkowanej lub samodzielnie zapakowanej kolumny IMAC FPLC (szybkiej chromatografii cieczowej białek) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć buforu wiążącego (tabela 1) do równoważenia kolumny, jak również do etapu płukania, który następuje po nałożeniu lizatu komórkowego na kolumnę.
    2. Zbieraj i łącz frakcje eluacyjne za pomocą GdFP, które można zidentyfikować po złotym kolorze światła widzialnego.
      UWAGA: Opcjonalnie białko docelowe można eluować za pomocą liniowego gradientu imidazolu (0-250 mM) przy użyciu zautomatyzowanego systemu FPLC.
    3. Określić stężenie białka, korzystając z literaturowej wartości współczynnika ekstynkcji przy 466 nm (ɛ466 nm = 23 700 M-1 cm-1)33 z buforem elucyjnym jako odniesieniem. Szczegółowe informacje na temat procedury można znaleźć w poprzedniej publikacji26.
    4. Pobrać próbkę "eluatu" dla SDS-PAGE i użyć 1-10 μg białka na pas w przypadku barwienia Coomassie.
      UWAGA: Ilości próbek SDS mogą się różnić w zależności od metody barwienia i wrażliwości barwnika.
    5. Dializować podwielokrotność frakcji eluatu w stosunku do buforu dializacyjnego lub buforu MS za pomocą membrany z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) 5 000-10 000. Przygotować membranę do dializy zgodnie z instrukcjami producenta. Trzykrotnie dializować próbkę o objętości 1 ml w stosunku do 100 ml buforu przez co najmniej 2 godziny. Szczegółowe informacje na temat tej procedury można znaleźć w poprzedniej publikacji34.
    6. W celu przechowywania zamrozić próbkę białka w buforze do dializy w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Podwielokrotności powinny być stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.

4. SDS-PAGE Przygotowanie próbki ekstraktu z całych komórek E. coli

  1. Przenieść zawiesinę komórek odpowiadającą 1 ml OD600 = 1 zawiesina (np. 500 μL OD600=2) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 5000 x g. Odrzucić supernatant przez pipetowanie.
  3. Dodać 80 μl ddH2O i 20 μl 5 x SDS ładującego bufor barwnikowy (Tabela 1) do osadu komórkowego i wymieszać przez pipetowanie.
  4. Denaturację komórek poprzez ogrzewanie do temperatury 95 °C przez 5 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym. Następnie schłodzić próbki do temperatury pokojowej.
  5. Użyj 10 μl dla strony SDS barwionej Coomassie zgodnie z poprzednią publikacją35.
    UWAGA: Ilości próbek SDS mogą się różnić w zależności od metody barwienia i wrażliwości barwnika.

5. Analiza masy nienaruszonych białek za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonej ze spektrometrią mas czasu przelotu z jonizacją elektrorozpylaną (LC-ESI-TOF-MS)

UWAGA: Gradient HPLC, ustawienia i mogą się różnić w zależności od użytej kolumny separacyjnej i instrumentu. Przykładowe wyposażenie znajduje się w tabeli materiałów.

  1. Oznaczyć stężenie białka z próbki dializowanej w buforze MS, jak opisano powyżej (etap 3.2.3.), używając buforu MS (patrz tabela materiałów) jako odniesienia.
  2. Rozcieńczyć próbkę białka do 0,1 mg/ml za pomocą buforu MS do uzyskania końcowej objętości 80 μl, wymieszać przez staranne pipetowanie, przenieść roztwór do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek MS ze szklaną wkładką i zamknąć ją nakrętką. Usunąć pęcherzyki powietrza, przesuwając fiolkę.
  3. Napełnić drugą fiolkę z automatycznym samplerem bez szklanej wkładki (ślepa próba buforowa) 1 ml buforu MS.
  4. Pozwól instrumentowi się rozgrzać. Wykonaj kalibrację przyrządu. Upewnij się, że dostępna jest wystarczająca ilość rozpuszczalników do chromatografii cieczowej (>100 ml).
  5. Zaprogramować liniowy 20-minutowy gradient HPLC od 5% do 80% buforu A (0,1% kwasu mrówkowego w ddH2O) w połączeniu z buforem B (0,1 % kwasu mrówkowego w acetonitrylu).
  6. Uruchom HPLC przy przepływie 0,3 ml/min i poczekaj, aż ciśnienie w kolumnie się ustabilizuje.
  7. Ustawić objętość iniekcji automatycznego podajnika próbek na 5 μl dla metody LC-ESI-TOF-MS, utworzyć listę roboczą dla serii ślepej, a następnie serii próbki i przypisać odpowiednie pozycje fiolek automatycznego podajnika próbek. Uruchom listę roboczą.
  8. Po zakończeniu tworzenia listy roboczej otwórz wygenerowany przykładowy plik danych. Wybierz zakres na wykresie całkowitego prądu jonowego (TIC) do dekonwolucji i zdekonwolucjonizuj widmo MS za pomocą algorytmu dekonwolucji maksymalnej entropii.
    UWAGA: W zależności od warunków eksperymentalnych, dodatkowe gatunki mogą powstać z niedojrzałych adduktów FP lub jonów buforowych.

6. Pomiary czasu życia fluorescencji i widma związane z rozpadem (DAS) GdFP

UWAGA: Dla oprzyrządowania czasowo-rozdzielczej spektroskopii fluorescencyjnej, proszę zapoznać się z Tabelą materiałów dla przykładowego sprzętu. Widma absorbancji, a także wzbudzenia i emisji fluorescencji białek fluorescencyjnych można również rejestrować za pomocą laboratoryjnych spektrofotometrów UV/Vis i fluorescencji.

  1. Pomiar czasu życia fluorescencji GdFP w zależności od długości fali
    1. Przygotować 2 ml roztworu GdFP o stężeniu 1 μM, rozcieńczając go do buforu PBS (Tabela 1) o pH 7. Wlej roztwór do 1 cm kuwety kwarcowej.
    2. Zainstaluj laser 470 nm z impulsem ps do wzbudzenia próbki i długoprzepustowy filtr emisyjny 488 nm oraz wyreguluj siatkę 600 l/mm skorelowanego z czasem i długością fali detektora zliczania pojedynczych fotonów36 (TWCSPC) w celu uzyskania reżimu długości fali 500-700 nm.
    3. Emisja fluorescencji w akwizycji z szybkością zliczania około 200 x 103 fotonów / s, aż około 103 zliczenia zostaną skumulowane w maksimum akwizycji krzywych rozpadu fluorescencji za pomocą oprogramowania do liczenia pojedynczych fotonów.
  2. Pomiar funkcji odpowiedzi instrumentalnej37 (IRF)
    1. Zastąp kuwetę na próbkę kuwetą kwarcową o średnicy 1 cm wypełnioną krzemionką koloidalną o stężeniu 1 g/l (~220 m2/g) w buforze PBS o pH 7,
      UWAGA: Zawiesinę krzemionkową przygotowuje się przy użyciu zawiesiny wodnej o stężeniu 400 g/l.
    2. Wyjmij długoprzepustowy filtr emisyjny 488 nm i włóż szare filtry, aby dostosować szybkość zliczania w detektorze TWCSPC do poniżej 100 x 103 zliczeń/s.
    3. Dostosuj siatkę do akwizycji fotonów 470 nm w kanale 8 16-kanałowego detektora TWCSPC.
    4. Uzyskaj IRF, aż około 10 x 103 zliczenia zostaną skumulowane w maksimum emisji.
    5. Konwertuj krzywe zaniku fluorescencji i IRF na pliki danych ASCII za pomocą programu global fitting38.
    6. Przeprowadzanie dopasowania globalnego zgodnie z modelem sumy trzech składowych wykładniczych z okresami istnienia jako parametrami powiązanymi.
    7. Wykreśl widma związane z zanikiem (DAS) jako rozkłady amplitudy poszczególnych składników rozpadu w zależności od długości fali za pomocą oprogramowania do analizy danych.

Wyniki

Korzystając z techniki selektywnego wprowadzania ciśnienia, Trp-66 w triadzie chromoforowej ECFP (i Trp-57, jedyna inna reszta Trp w ECFP) może zostać zastąpiona przez 4-amino-Trp, generując w ten sposób przesunięty ku czerwieni GdFP o wyraźnych właściwościach spektralnych. Spektrometria mas musi być użyta do wykazania pożądanej integracji stechiometrycznej niekanonicznego aminokwasu z białkiem, z wynikami pokazanymi na Rysunek 1. Następnie dostarczamy dane z mikroskopii, spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis, a także spektroskopii fluorescencji w stanie ustalonym oraz spektroskopii fluorescencji z rozdzielczością czasu i długości fali, aby scharakteryzować właściwości fluoroforu GdFP z naciskiem na zależność widm od pH.

Aby potwierdzić wymianę dwóch reszt Trp w ECFP przez 4-amino-Trp, przeprowadzana jest analiza spektrometryczna mas. Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne, zdekonwolucyjne widmo ESI-MS GdFP. Podczas gdy ECFP typu dzikiego ma obliczoną masę białka 28 283,9 Da po dojrzewaniu chromoforu, odpowiadająca jej masa GdFP wynosi 28 313,9 Da. Zdekonwolucyjne widmo ESI-MS GdFP wykazuje główny pik masy na poziomie 28 314,1 ± 0,1 Da, co odbiega od wartości teoretycznej o mniej niż 10 ppm. Mieszcząc się w typowym zakresie dokładności dla tego typu analizy25, potwierdza to włączenie ncAA przez SPI (wartość eksperymentalna dla ECFP typu dzikiego: 28 283,7 Da).

Rysunek 2 przedstawia obrazy z mikroskopii obrazowania fluorescencji konfokalnej (CFIM) komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję ECFP, EGFP, EYFP i GdFP po ponownym zawieszeniu bakterii w buforze PBS. Wszystkie obrazy uzyskano pod mikroskopem wyposażonym w obiektyw UV i wzbudzenie laserowe przy mniej więcej tej samej energii dla każdej próbki.

Rysunek 3A pokazuje nakładkę obrazów CFIM bakterii E. coli wyrażających różne FP, w tym GdFP, zawsze monitorowanych z bardzo podobną energią wzbudzenia (długości fal jak w Rysunek 2). Rysunek 3B pokazuje struktury chromoforowe pokazanych wariantów FP. Jeśli chodzi o jasność GdFP w porównaniu do ECFP (fluorescencyjna wydajność kwantowa φ = 0,4), EGFP (φ = 0,6) i EYFP (φ = 0,6), należy zauważyć, że w przypadku GdFP zastosowano szerszy zakres akwizycji światła fluorescencyjnego (30 nm) w przeciwieństwie do 20 nm stosowanego dla wszystkich innych gatunków, w celu dostosowania intensywności obrazów do podobnych wartości. Przy nieco niższym współczynniku ekstynkcji i zmniejszonej wydajności kwantowej w wyniku unikalnych właściwości fotofizycznych, jasność GdFP jest niższa w porównaniu z innymi pokazanymi FP.

Widmo absorpcyjne ECFP (Rysunek 3C) ma dwa charakterystyczne maksima przy 434 nm i 452 nm. Natomiast GdFP charakteryzuje się jednym szerokim pasmem absorpcji przesuniętym ku czerwieni z maksimum przy 466 nm. Absorpcja EGFP jest dalej przesunięta ku czerwieni do 488 nm. Jednak ze względu na znacznie większe przesunięcie Stokesa GdFP (108 nm) w porównaniu do ECFP (41 nm) i EGFP (20 nm), widmo emisyjne GdFP jest najbardziej przesunięte ku czerwieni ze wszystkich trzech badanych tutaj pochodnych GFP (Rysunek 3D). Podczas gdy emisja fluorescencji ECFP wykazuje dwa charakterystyczne maksima przy 475 nm i 505 nm, EGFP ma jedno szerokie główne pasmo emisji osiągające szczyt przy 508 nm (λmax) z lekkim ramieniem przy 540 nm. Fluorescencja GdFP pojawia się przy około 565 nm (λ maks.) (rysunek 3D). Jego widmo emisyjne zawiera niewielki udział ECFP typu dzikiego, który jest również widoczny jako małe ramię przy długości fali 475 nm. Ta mała frakcja ECFP jest syntetyzowana przed indukcją podczas procedury SPI, zgodnie z opisem33.

Rysunek 3E pokazuje zależne od pH zmiany w spektrum absorpcji GdFP. W przypadku zmiany pH z 8 na 5 maksimum emisji przesuwa się nieznacznie w kierunku czerwonym i obserwuje się nieznaczne poszerzenie pasma absorpcji. Jednak zmniejszenie amplitudy absorpcji wynosi tylko około 10 % między pH 8 a pH 5, co wskazuje, że właściwości chromoforu GdFP w stanie podstawowym są bardzo słabo modyfikowane przez pH.

Emisja fluorescencji z rozdzielczością czasową monitorowana przez zliczanie pojedynczych fotonów jest pokazana w Rysunek 4. Krzywe rozpadu monitorowane w kanałach widmowych wyśrodkowanych przy 550 nm i 600 nm (Rysunek 4A) wykazują nieco szybszy rozpad fluorescencji przy 600 nm w porównaniu do rozpadu przy 550 nm. Wyniki globalnego dopasowania krzywych rozpadu fluorescencji z dwoma składowymi wykładniczymi dają dwie spektralnie rozróżnialne składowe rozpadu fluorescencji o stałych czasowych 1,0 ns i 3,3 ns (Rysunek 4C i D).

Emisja fluorescencji GdFP silnie zależy od pH, co jest typowe dla wielu wariantów białek fluorescencyjnych z rodziny GFP. Rysunek 4B porównuje emisję fluorescencji GdFP między pH 5 a pH 8, co wyraźnie pokazuje spadek intensywności fluorescencji przy niższym pH, podczas gdy charakterystyki spektralne pozostają stałe.

Widma związane z rozpadem (DAS)39 GdFP (Rysunek 4C i D) charakteryzują się dwoma odrębnymi pasmami emisji. Udział składowej wolnej 3,3 ns jest bardziej wyraźny w zakresie krótkich fal około 550 nm (60 %) z niewielkim udziałem szybszej składowej (40 %). Przy długości fali 600 nm obie składowe mają mniej więcej taką samą amplitudę. Po przejściu z pH 7 (Rysunek 4C) do pH 6 (Rysunek 4D), charakterystyka spektralna DAS prawie się nie zmienia, a stałe czasowe z globalnej procedury dopasowania są również takie same (dokładność stałych czasowych DAS wynosi około ± 0,15 ns). Jednak różnica w bezwzględnych amplitudach dwóch składników DAS jest wyraźnie widoczna, co w pełni odpowiada za zmniejszoną amplitudę emisji fluorescencji przy tym samym przesunięciu pH w Rysunek 4B.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne zdekonwolucyjne widmo ESI-MS GdFP. Widmo ESI-MS GdFP (kolor złoty, powiększony wykres pokazany jako wstawka) pokazuje główny pik na poziomie 28314,1 Da (obliczona wartość 28313,9 Da). Widmo dla ECFP typu dzikiego jest pokazane w kolorze czarnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Obrazy z konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z populacji bakterii wykazujących ekspresję różnych FP. Do akwizycji obrazu wykorzystano następujące ustawienia długości fali: ECFP (λex = 457 nm, detekcja: 461-480 nm), EGFP (λex = 488 nm, detekcja: 495-515 nm), GDFP (λex = 476 nm, detekcja: 560-590 nm), EYFP (λex = 514 nm, detekcja: 520-530 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Właściwości spektralne GdFP. (A) Obraz CFIM mieszaniny komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję ECFP, EGFP i GdFP po ponownym zawieszeniu bakterii w buforze PBS. (B) Struktury chromoforowe GdFP (z 4-amino-Trp zamiast reszty 66), rodzicielskiego ECFP (z Trp w pozycji 66) i EFGP (z Tyr w pozycji 66). (C) Porównanie znormalizowanych widm absorpcyjnych GdFP, ECFP i EGFP, natomiast w (D) znormalizowane widmo emisji fluorescencji ECFP (wzbudzenie przy 430 nm) jest porównywane z widmami emisji fluorescencji EGFP i GdFP (oba wzbudzone przy 450 nm). (E) zależność widm absorpcyjnych od pH (absorpcja znormalizowana przy 280 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Fluorescencja czasowo-rozdzielcza GdFP. (A) Zanik fluorescencji GdFP monitorowany za pomocą zliczania pojedynczych fotonów z rozdzielczością czasową i długości fali w kanałach widmowych wyśrodkowanych przy 550 nm i 600 nm (± 12,5 nm) po wzbudzeniu impulsami laserowymi o długości fali 470 nm. Funkcja odpowiedzi instrumentalnej (IRF) dostarcza informacji o rozdzielczości czasowej używanej konfiguracji. (B) Zmienność widma emisyjnego GdFP w zależności od pH (wzbudzenie przy 460 nm). (C, D) Widma związane z rozpadem (DAS) GdFP przy pH 7 (C) i pH 6 (D) wyznaczone po dekonwolucji rozpadów fluorescencyjnych rozdzielonych w czasie i długości fali oraz globalnym dopasowaniu rozpadów we wszystkich kanałach przez globalny zestaw dwóch funkcji wykładniczych z powiązanymi stałymi czasowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Struktury wewnątrzcząsteczkowego przenoszenia ładunku chromoforów ECFP () i GdFP (złoty). Zwiększenie wielkości układu chromoforowego przez dobrego donora elektronów grupy aminowej w ramach ncAA umożliwia tworzenie większej liczby struktur mezomerycznych w celu uzyskania rezonansowej stabilizacji stanu wzbudzonego. Punkty połączenia z rusztowaniem FP są pokazane jako półkola. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Roztwór podstawowyStężenie, rozpuszczalnikUwaga
20% D-glukozy200 g/l D-glukozy wddH2Osterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
Indolu50 mM w izopropanolu
4-amino-indol50 mM w 20 % etanolu (20 ml etanolu w końcowej objętości 100 ml wypełnione ddH2O)
Protokół IPTG1 M w ddH2O
L-tryptofan15 mM rozpuszczono w ddH2O przy użyciu 1 M HCl (dodawać HCl kroplami, mieszając, aż do rozpuszczenia proszku)
Lizozymu50 mg/ml w ddH2O
DNaza I1 mg/ml w ddH2O
RNaza A1 mg/ml w ddH2O
Wzmacniacz AMP100100 mg/ml ampicyliny w ddH2O
dodecylosiarczan sodu (SDS)200 g/l w ddH2O
siarczan amonu ((NH4)2SO4)1 M w ddH2Osterylizować w autoklawie
diwodorofosforan potasu (KH2PO4)1 M w ddH2Osterylizować w autoklawie
wodorofosforan di-potasu (K2HPO4)1 M w ddH2Osterylizować w autoklawie
siarczan magnezu (MgSO4)1 M w ddH2Osterylizować w autoklawie
D-glukoza1 M w ddH2Osterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
chlorek sodu (NaCl)5 M w ddH2Osterylizować w autoklawie
chlorek wapnia (CaCl2)1 g/Lsterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
chlorek żelaza(II) (FeCl2)1 g/Lsterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
Tiaminy10 g/Lsterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
biotyna10 g/Lsterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
Mieszanka pierwiastków śladowychsiarczan miedzi (CuSO4), chlorek (ZnCl2), chlorek manganu (MnCl2), molibdenian amonu ((NH4)2MoO4); każdy 1 mg/L w ddH2Osterylizować przez filtrację przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm
19 mieszanka aminokwasów1.) Rozpuścić 0,5 g L-fenyloalaniny i 0,5 g L-tyrozyny w 100 ml ddH2O z kroplowym dodatkiem 1 M HCl mieszając aż do rozpuszczenia proszku.
2.) Odważ po 0,5 g każdego z pozostałych L-aminokwasów (z wyjątkiem L-tryptofanu). Zmieszać z 22 ml 1 M KH2PO4 i 48 ml 1 M K2HPO4. Dodaj ddH2O do około 800 ml. Mieszaj, aż roztwór stanie się klarowny.
3.) Dodaj rozpuszczone L-fenyloalaninę i L-tyrozynę z kroku 1.) i ustaw głośność na 1 L za pomocą ddH2O.
4.) Wysterylizuj mieszaninę aminokwasów przez filtrację próżniową za pomocą filtra butelkowego.
i nośnikiKompozycja/Przygotowanie
Bufor barwnika ładującego SDS, 5x skoncentrowany 0,25 M Tris pH 6,8, 50 % v/v glicerolu, 0,25 % w/v błękitu bromfenolowego, 0,5 M didiotriitol (DTT; alternatywnie 5 % β-merkaptoetanolu), 10 % w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS)
Bufor powiązań50 mM diwodorofosforan sodu (NaH2PO4), 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8
Bufor elucyjny50 mM diwodorofosforan sodu (NaH2PO4), 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8
Bufor do dializy50 mM diwodorofosforan sodu (NaH2PO4), 150 mM NaCl, 100 mL/L glicerolu, pH 8
Bufor MS10 mM Tris-HCl, pH 8
nowa minimalna pożywka zawierająca 19 L-aminokwasów z wyjątkiem L-tryptofanu (NMM19)Wymieszaj wszystkie roztwory podstawowe, aby uzyskać następujące stężenia końcowe: 7,5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukozy, 50 mg/L mieszanki 19 aminokwasów, 1 μg/L CaCl2, 1 μg/L FeCl2, 10 μg/L tiaminy, 10 mg/L biotyny, 0,01 mg/L mieszanki pierwiastków śladowych
LB średniSkład: 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, pH 7,0 in ddH2O
Przygotowanie:
1.) Odważ 50 g tryptonu, 25 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl do szklanej butelki o pojemności 1 l.
2.) Dodaj ddH2O do ~800 ml i rozpuść składniki mieszając.
3.) Zmierz pH i dostosuj do pH 7 poprzez kroplowe dodawanie 1 M HCl lub 1 M NaOH, jeśli to konieczne. Dodaj ddH2O do 1 l.
4.) Sterylizuj w autoklawie, następnie sprawdź, czy nie ma utraty objętości i dodaj sterylne ddH2O, aby wyrównać, jeśli to konieczne. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
LB płytki agaroweSkład: 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, 15 g/L agar-agar, pH 7,0 in ddH2O
Przygotowanie:
1.) Odważ 50 g tryptonu, 25 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl, 7,5 g agar-agaru do szklanej butelki o pojemności 1 l.
2.) Dodaj ddH2O do 500 ml i rozpuść składniki podczas mieszania.
3.) Zmierz pH i dostosuj do pH 7 poprzez kroplowe dodawanie 1 M HCl lub 1 M NaOH, jeśli to konieczne. Dodaj ddH2O do 1 l.
4.) Sterylizuj w autoklawie, sprawdź później utratę objętości i dodaj sterylny ddH2O, aby wyrównać, jeśli to konieczne. (Uwaga: Agar LB może być przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu użycia do przygotowania płytek agarowych LB. Ostrożnie rozpuść zestalony agar za pomocą kuchenki mikrofalowej)
5.) Gdy roztwór jest jeszcze ciepły (30-40 °C), dodaj ampicylinę do końcowego stężenia 100 μg/ml
6.) Wlej około 15 ml płynu z kroku 5.) na sterylną 10 cm szalkę Petriego w sterylnych warunkach. Gdy agar zastygnie, płytki można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Skład: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, pH 7. Sterylizuj przez autoklawowanie lub filtrację.

Tabela 1: Roztwór podstawowy i bufor.

Dyskusja

Aby osiągnąć bardzo wysoką skuteczność inkorporacji ncAA, metoda SPI oparta na auksotrofii opiera się na wykorzystaniu metabolicznie zmodyfikowanych komórek gospodarza, które nie są w stanie zsyntetyzować odpowiedniego naturalnego odpowiednika ncAA. W przypadku E. coli takie szczepy są łatwo dostępne. Nawet jednoczesne włączenie wielu ncAA do tego samego białka jest możliwe przy użyciu szczepów multiauksotroficznych. Specyficzny dla pozostałości sposób zastępowania i repertuar chemiczny ograniczony do podobnych analogów chemicznych mogą być postrzegane jako wady. Niemniej jednak można wyprodukować dużą liczbę wariantów białek, ponieważ naturalny bakteryjny aparat translacyjny toleruje wiele analogów aminokwasów. Na przykład ponad 50 ncAA można włączyć do białek za pomocą translacji in vitro, co stanowi około 73% wszystkich kodonów kodu genetycznego, które są dostępne do ponownego przypisania40. Co więcej, SPI może również umożliwić skuteczne wielomiejscowe znakowanie docelowego białka41. Zasadniczo metodologia SPI nie jest ograniczona do E. coli, ale może działać w każdym innym gospodarzu i dla każdego z kanonicznych 20 aminokwasów, pod warunkiem, że dostępne są szczepy auksotroficzne i określone podłoża hodowlane. Na przykład dwa analogi metioniny, azydohomoalanina (Aha) i homopropargliglicyna (Hpg), są dostępne na rynku i stosowane do znakowania białek i proteomów w różnych organizmach. Ponadto Aha może być wytwarzany wewnątrzkomórkowo, a następnie włączany do białka42. Ten ncAA jest szczególnie odpowiedni do bioortogonalnych koniugacji, takich jak chemia kliknięć, opracowana przez Tirrela i współpracowników: Na przykład w tkance roślinnej Arabidopsis thaliana, w larwach Bombyx mori 43, komórkach Drosophila 44, larwach danio pręgowanego45, a także w komórkach ssaków, w tym neuronach46, białka można znakować za pomocą Aha47,48. Podobnie, analogi Trp zostały z powodzeniem włączone do peptydów przeciwdrobnoustrojowych w szczepach Lactococcus lactis auksotroficznychTrp 49. SPI jest również przydatny w dziedzinie ksenobiologii50,51, która bada alternatywy dla podstawowego składu chemicznego życia. Na przykład, w oparciu o wcześniejsze prace nad E. coli52 i B. subtilis53, szczep E. coli został niedawno opracowany przez strategię ewolucyjną z selektywną presją, aby wykorzystać tienopirol zamiast indolu, co spowodowało zastąpienie tryptofanu przez tienopirol-alaninę w kodzie genetycznym w całym proteomie54. Ogólnie rzecz biorąc, kanoniczny aminokwas Trp, który jest kodowany przez pojedynczy tryplet (UGG), stanowi obiecujący cel dla inżynierii białkowej ze względu na bogate aspekty chemii indolu, która oferuje liczne odmiany chemiczne. Niedawno, jako alternatywę dla inkorporacji opartej na SPI, doniesiono o nowatorskiej platformie SCS zdolnej do włączania analogów Trp specyficznie dla danego miejsca zarówno u gospodarzy bakteryjnych, jak i eukariotycznych. To jeszcze bardziej poszerza zestaw narzędzi inżynierii białek opartych na ncAA in vivo, w tym zmianę właściwości spektralnych.

Oprócz zastosowania auksotroficznych gospodarzy ekspresyjnych, protokół SPI wymaga ścisłych warunków fermentacji, zarówno pod względem czasu ekspresji docelowej, jak i składu pożywki, w celu osiągnięcia wysokiej wydajności inkorporacji ncAA i docelowej wydajności białka56. Uprawa prowadzona jest przy użyciu chemicznie zdefiniowanych pożywek minimalnych, które zasadniczo zawierają oprócz głównych soli źródła azotu (sól amonowa) i węgla (D-glukoza), witamin i pierwiastków śladowych. Chociaż nie jest to ściśle wymagane przy braku dalszych auksotrofii, pozostałe aminokwasy (20-n, jeśli n aminokwasów ma zostać zastąpionych) są powszechnie dodawane w celu pobudzenia wzrostu bakterii57. W początkowej fazie wzrostu, przed indukcją ekspresji białka docelowego, n aminokwasy kanoniczne, które mają zostać zastąpione, są dodawane w stężeniach ograniczających. Wzrost komórek postępuje do momentu wyczerpania docelowych aminokwasów egzogennych, jak eksperymentalnie wskazuje stacjonarny OD600. Następnie pożywkę hodowlaną zastępuje się świeżą pożywką, która nie ma zubożonego aminokwasu i zawiera ncAA w obfitych stężeniach. W celu rybosomalnej inkorporacji analogów tryptofanu, jak pokazano w tym protokole, podawany jest analog indolu, który ulega wewnątrzkomórkowej konwersji do odpowiedniej pochodnej tryptofanu przez syntazę tryptofanu58. Następnie indukowana jest ekspresja białka docelowego. Na tym etapie komórki zbliżają się do końca wzrostu logarytmicznego, jako równowagi między całkowitą liczbą komórek a dopasowaniem. Ponieważ obecność i włączenie aminokwasu kanonicznego doprowadziłoby do produkcji białka typu dzikiego, ważne jest, aby upewnić się, że niezbędny aminokwas jest całkowicie wyczerpany przed indukcją. Podobnie, obowiązkowe jest zbadanie skuteczności włączenia ncAA do białka docelowego, zwykle za pomocą spektrometrii mas. W przypadku znacznej obecności aminokwasu kanonicznego należy dostosować warunki uprawy, np. poprzez zmianę stężenia aminokwasu egzogennego (aminokwasów) egzogennego w początkowej fazie wzrostu lub w czasie trwania tej ostatniej. W przypadku niskiej aktywności aaRS w stosunku do ncAA można przeprowadzić nadekspresję endogennego enzymu lub koekspresję innego aaRS, który jest bardziej aktywny w stosunku do ncAA59.

Kanoniczny aminokwas Trp ma trzy niezwykłe cechy: (i) jego naturalna obfitość w białka jest niska; (ii) jego właściwości biofizyczne i chemiczne są unikalne (np. jest zwykle dominującym źródłem wewnętrznej fluorescencji białek i peptydów) oraz (iii) przyczynia się do różnorodnych interakcji i funkcji biochemicznych, w tym interakcji π-stacking, wiązania H i kationów π. Wszystkie te cechy ulegają radykalnej zmianie po podstawieniu Trp → 4-amino-Trp w GdFP. Bez wątpienia projekt "złotej" klasy avGFP jest niezwykłym przykładem inżynierii białek autofluorescencyjnych dostosowanych do potrzeb klienta. Dzięki różnym właściwościom spektralnym, FP można dostroić do określonych okien spektralnych poprzez mutagenezę i włączenie ncAA. W przypadku GdFP odbywa się to poprzez prostą wymianę chemiczną H →NH2 w układzie pierścienia indolowego zawartego w triadzie chromoforowej ECFP. Rysunek 5 przedstawia efekty włączenia ncAA do chromoforu. Wprowadzenie grupy oddającej elektrony pochodzącej z 4-amino-indolu (wewnątrzkomórkowo przekształconej w 4-amino-Trp) umożliwia powstanie różnorodnych struktur mezomerycznych, które mogą wyjaśniać ustabilizowany stan wzbudzony. Spektroskopowo, jego powiększone przesunięcie Stokesa i emisja fluorescencji przesunięta ku czerwieni wynikają z tych odrębnych właściwości rozszerzonego układu sprzężonego. Jak wspomniano wcześniej, zwiększony wewnątrzcząsteczkowy transfer ładunku w chromoforze GdFP jest z natury wrażliwy na pH (Rysunek 4B) i towarzyszy mu większa zmiana momentu dipolowego między stanem uziemienia S0 a stanem wzbudzonym S1 w stosunku do ECFP33. Jako alternatywne grupy oddają elektrony, analogi tryptofanu z pierścieniem indolowym podstawionym grupami hydroksylowymi, jak podano w badaniu porównawczym z modelowym białkiem barstar41.

Widma absorpcyjne i fluorescencyjne GdFP są poszerzone w porównaniu z ECFP i EGFP (ryc. 3C i D). Jednorodne poszerzenie pasm absorpcji i fluorescencji jest na ogół spowodowane modami drgań w chromoforze i dodatkowo sprzęganiem chromoforu z dalszymi modami drgań obecnymi w białku60. Sprzężenie z lokalnym środowiskiem białkowym jest wspierane przez ładunki zlokalizowane na chromoforze. Ponieważ niejednorodność strukturalna białka prowadzi do lokalnych wariacji widma wibracyjnego, takie sprzężenie między widmami wibracyjnymi chromoforu a resztą białka jest wspierane przez delokalizację ładunku i stany mezomeryczne, jak pokazano na rysunku 5. To sprzężenie wspiera również duże przesunięcie Stokesa i nieuchronnie zmniejsza wydajność kwantową fluorescencji. W porównaniu z innymi FP przesuniętymi ku czerwieni, GdFP wykazuje nawet lepszą stabilność białek i niską tendencję do agregacji 33,61,62. Różni się nie tylko kolorem od innych wariantów FP, ale także wykazuje znacznie zwiększoną stabilność termiczną i ulepszone składanie kooperacyjne33. Jego intensywność fluorescencji jest zachowana w co najmniej 90% po podgrzaniu do 60 °C, podczas gdy fluorescencja ECFP jest zmniejszona do około 30%. W białkach aminokwasy aromatyczne często przyczyniają się do tworzenia sieci oddziałujących na siebie łańcuchów bocznych, które zwykle działają stabilizująco na trzeciorzędową strukturę białka. avGFP zawiera taką sieć łańcucha bocznego, która składa się z samego chromoforu, a także Phe-165, His-148 i Tyr-145. Te łańcuchy boczne są nie tylko dość sztywne w strukturze GdFP33, ale co ważne, tworzą hydrofobowe kontakty z chromoforem. Najbardziej widoczną nową cechą zidentyfikowaną w GdFP jest to, że aminowany chromofor jest bardziej proksymalny do Phe-165. Ta interakcja jest cechą nieobserwowaną w innych znanych avGFP. Ponieważ dwie reszty są oddalone od siebie o 3,2-4,5 A, mogą również występować interakcje aminoaromatyczne. Wraz ze stabilizacją rezonansową chromoforu wywołaną aminacją, najprawdopodobniej stabilizują one tę hydrofobową sieć aminokwasów w sposób współpracujący. Bardziej efektywne wewnątrzcząsteczkowe przenoszenie ładunku może być wspierane przez te oddziaływania w stanie wzbudzonym w porównaniu ze stanem podstawowym chromoforu, co przynajmniej częściowo odpowiada za przesunięcie Stokesa o 108 nm 33,62.

W racjonalnym projektowaniu właściwości fluoroforu przewiduje się, że wzrost rozmiaru zdelokalizowanego układu π spowoduje przesunięcie ku czerwieni długości fali wzbudzenia. Ta praktyczna zasada jest przestrzegana przez szereg aminokwasów w pozycji 66 prowadzących do neutralnych chromoforów: Phe (λmax = 355 nm) < His (λma x = 386 nm) < Tyr (λmax = 395 nm) < Trp (λmax = 436 nm)63. W naturze to rozszerzenie sprzężonego systemu wiązań π chromoforu zostało osiągnięte za pomocą różnych strategii. W przypadku DsRed z Discosoma striata jest on rozszerzany przez integrację dodatkowego aminokwasu, przesuwając w ten sposób λmax do 573 nm64. Chromofor asFP595 (λmax = 595 nm) z Anemonia sulcata został rozszerzony o grupę imino, powiększając jego układ π65. Ponieważ chromofor GdFP i innych avFP ma ten sam rozmiar, inna zasada musi pociągać za sobą długość fali emisji w zakresie ekspandowanych chromoforów DsRed i asFP595. Głębokie przesunięcie Stokesa o 108 nm przypisuje się odrębnej strukturze chromoforu GdFP, która ujawnia nową zasadę fotofizyczną w projektowaniu białek autofluorescencyjnych. Wstępne obliczenia (przedstawione w 62) wykazały, że moment dipolowy chromoforu w stanie wzbudzonym GdFP jest znacznie większy niż w stanie podstawowym, w przeciwieństwie do odpowiednich wartości ECFP. Podczas gdy moment dipolowy GdFP wzrasta z ~3 D (Debye) w stanie S0 do ~15 D w S1, zmiana dla chromoforu ECFP była raczej umiarkowana (z ~4 D do ~6 D). Tak więc unikalna złota fluorescencja GdFP jest spowodowana znacznym wewnątrzcząsteczkowym przenoszeniem ładunku w obrębie chromoforu, co zwiększa różnorodność możliwych struktur mezomerycznych (patrz ryc. 5), które pozwalają na stabilizację rezonansową. Zmniejsza to poziom energii, z którego następuje emisja. W wyniku głębokiej zmiany momentu dipolowego po wzbudzeniu, separacja ładunków wewnątrzcząsteczkowych jest główną przyczyną zmian potencjału elektrostatycznego środowiska chromoforowego. Otaczająca matryca białkowa z kolei dostosowuje się do zmian w rozkładzie ładunku po wzbudzeniu chromoforu. Następująca po tym relaksacja strukturalna obniża poziom energii wzbudzonego chromoforu, który przesuwa widmo fluorescencji na czerwony ze względu na swój charakter przenoszenia ładunku. Z tego samego powodu, w wyniku dużego przesunięcia Stokesa i zwiększonych wskaźników procesów bezpromieniowych, wydajność kwantowa fluorescencji GdFP jest zmniejszona w porównaniu z ECFP33.

Wysoka wydajność kwantowa i małe przesunięcie Stokesa ECFP i EGFP są zwykle przypisywane sztywnemu środowisku białkowemu chromoforu, które zmniejsza stopnie swobody, a w konsekwencji wewnętrzną konwersję, aby sprzyjać radiacyjnej relaksacji stanu wzbudzonego66. W związku z tym molekularna konstrukcja sztywno osadzonych chromoforów ze zmniejszonym sprzężeniem z pozostałą matrycą białkową może służyć jako przewodnik do produkcji bardziej przesuniętych ku czerwieni pochodnych GFP o wysokiej wydajności kwantowej fluorescencji. W związku z tym, dla dalszych podejść inżynieryjnych do produkcji białek autofluorescencyjnych z przesunięciem ku czerwieni, wysoce pożądane jest powiększenie układu π-elektronów i sztywna struktura chromoforowa ze słabym sprzężeniem ze środowiskiem białkowym. Takie modyfikacje można również wprowadzić bezpośrednio do chromoforów opartych na GFP lub poprzez umieszczenie pożądanych ncAA w pobliżu chromoforu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Ujednolicenie Koncepcji w Katalizie") dla T.F. i N.B. oraz przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (Program BMBF "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) dla F.-J.S.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
4-aminoindolSigma-Aldrich525022
acetonitrylVWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA do LC-MS, wymagany stopień LC-MS 83642LC-MS
agar-agarCarl Roth5210
molibdenian amonu ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
sól sodowa ampicylinyCarl RothK029
biotynaSigma-AldrichB4501
błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126
chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC5670
krzemionka koloidalnaSigma-AldrichLudox HS-40, 420816
Coomassie Brillant Blue R 250Carl Roth3862
siarczan miedzi (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-glukozaCarl Roth6780
wodorofosforan di-sodowy (Na2HPO4)Carl RothX987
wodorofosforan di-potasu (K2HPO4)Carl RothP749.1
1,4-ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908
DNase ISigma-AldrichD5025
etanolCarl Roth9065.1
kwas mrówkowyVWRHiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany stopień LC-MS 84865LC-MS
glicerolCarl Roth3783
imidazolCarl RothX998
indolSigma-AldrichI3408
chlorek żelaza(II) (FeCl2)Sigma-Aldrich
izopropanolCarl RothAE73.1
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI6758
lizozymSigma-AldrichL6876
chlorek magnezu (MgCl2)Carl RothKK36.1
siarczan magnezu (MgSO4)Carl Roth8283.2
chlorek manganu (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-merkaptoetanolCarl Roth4227.3
chlorek potasu (KCl)Carl Roth6781.3
diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNaza ACarl Roth7156
chlorek sodu (NaCl)Carl RothP029
diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)Carl RothT879
dodecylosiarczan sodu (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
tiaminaSigma-AldrichT4625
Tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris)CarlRoth5429
Chlorowodorek Tris (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
tryptonCarl Roth8952
Carl Roth2363
chlorek (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
aminokwasy
L-alaninaSigma-AldrichA7627
L-argininaSigma-AldrichA5006
L-asparaginaSigma-AldrichA8381
Kwas L-asparaginowySigma-AldrichA0884
L-cysteinaSigma-AldrichC7352
Kwas L-glutaminowySigma-AldrichG2128
L-glutaminaSigma-AldrichG3126
L-glicynaSigma-AldrichG7126
L-histydynaSigma-AldrichH8000
L-izoleucynaSigma-AldrichI2752
L-leucynaSigma-AldrichL8000
L-lizynaSigma-AldrichL5501
L-metioninaSigma-AldrichM9625
L-prolinaSigma-AldrichP0380
L-fenyloalaninaSigma-AldrichP2126
L-serynaSigma-AldrichS4500
L-treoninaSigma-AldrichT8625
L-tryptofanSigma-AldrichT0254
L-tyrozynaSigma-AldrichT3754
L-walinaSigma-AldrichV0500
NazwaFirma>Numer katalogowy>Komentarze
Materiały laboratoryjne
0,45 µ m filtr strzykawkowy z membraną PVDFCarl RothCCY1.1
1,5 ml probówki do mikrowirówekEppendorf30120086
stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 50 mlFisher Scientific14-432-22
Strzykawka Luer-Lock 5 mlCarl RothEP96.1
membrana dializacyjna, odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) 5,000Spectrum Branże medyczneMembrana dializowa Spectra/Por MWCO 5000, kolumna 133198
Immobilizowana chromatografia powinowactwa jonów metali (IMAC) 1 ml, seria Ni-NTAMacherey NagelProtoino, 745410.5
szalki Petriego (polistyren, sterylne)Carl RothTA19
pQE-80L wektor plazmidowyQiagennie jest już dostępnyzastąpiony przez N-końcowy pQE Zestaw wektorów Nr kat./ID:  32915
odczynnik do ekstrakcji białek BugBusterEMB Millipore70921-4
probówki z polistyrenu okrągłodennego, 14 mlFisher ScientificCorning Falcon, 14-959-1B
Trp-auksotroficzny E. coli szczepATCC ATCC49980Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; zobacz tekst główny, aby zapoznać się z alternatywami
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt do spektrometrii mas
mass do LC-ESI-TOF-MSAgilentAgilent 6530 Accurate-Mass QTOFw połączeniu z
oprogramowaniem do analizy danych spektrometrii masOprogramowanieanalizy jakościowej Agilent MassHunter v. B.06.00
Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do LC-ESI-TOF-MSSigma-AldrichSupelco Discovery BIO Kolumna HPLC C5 o szerokich porach, 3 i mikro; m wielkość cząstek, 10 cm x 2,1 mm
Fiolki autosamplera HPLC 1,5 mlSigma-AldrichSupelco 854165ze stożkowymi szklanymi wkładkami 0,1 mL, nakrętkami i przegrodą
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Wyposażenie ogólne
Wirówka stołowa do probówek Eppendorf 1,5 mlEppendorf Wirówka chłodząca Eppendorf5427 R
do probówek Falcon 50 mlEppendorf5810 R
do rozbijania komórek bakteryjnychMicrofluidicsLM z " Z” typ komorowa
pompa perystaltyczna do systemu LCGE HealthcareP-1
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)GE HealthcareÄ Wytrząsarka orbitalna KTA pure 25 L
do hodowli bakteriiInfors HTMinitron
Spektrofotometr UV/VisBiochromULTROSPEC 2100
homogenizator ultradźwiękowy do rozbijania komórek bakteryjnychOmnilabBandelin SONOPULS HD 3200, 5650182z końcówką sonifiera MS72
NazwaCompany Numer katalogowyKomentarze
Sprzęt do spektroskopii fluorescencyjnej
ps-pulsed laser 470 nmPicoquant GmbHPDL-470
oprogramowanie do akwizycji pojedynczych fotonów skorelowane w czasie i długości fal (TWSPC)Picoquant GmbHSymPhoTime 64
Skorelowany z czasem i długością fal detektor zliczania pojedynczych fotonów (TWSPC)Picoquant GmbHPML-16C16 kanałów spektralnych, do wyboru za pomocą ustawień siatki
Oprogramowanie do liczenia pojedynczych fotonówPicoquant GmbHSPCM 9.75
Globalne oprogramowanie do dopasowaniaPicoquant GmbHSPC2Glo(R)
oprogramowanie do analizy danych zaniku fluorescencjiPicoquant GmbHFluoFit
oprogramowanie do analizy danychOriginLab Inc.Origin 9.2
SchottNG1 do NG11(400 - 650 nm, transmisja 50 %, 20%, 10 %, 5 %)
Filtr spalinowy długoprzepustowy 488 nmAHF AnalysentechnikAHF-488
Thorlabs GmbHCV10Q1400długość ścieżki 1 cm
380024 Ekstrakt drożdżowy , systemu Infinity LC do Wysokociśnieniowy mikrofluidyzator Seria Program Zestaw filtrów o neutralnej gęstości Kuweta kwarcowa

Bibliografia

  1. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan, Aequorea. J Cell Compar Physl. 59 (3), 223-239 (1962).
  2. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  3. Andresen, M., et al. Structure and mechanism of the reversible photoswitch of a fluorescent protein. P Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13070-13074 (2005).
  4. Andresen, M., et al. Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa. P Natl Acad Sci USA. 104 (32), 13005-13009 (2007).
  5. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
  6. Kremers, G. -. J., Gilbert, S. G., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Piston, D. W. Fluorescent proteins at a glance. J Cell Sci. 124 (Pt 2), 157-160 (2011).
  7. Shimomura, O. Structure of the chromophore of aequorea 0. shimomura green fluorescent protein. FEBS Lett. 104 (2), 220-222 (1979).
  8. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  9. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 4 (9), 741-746 (2007).
  10. Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angew Chem Int Edit. 51 (43), 10724-10738 (2012).
  11. Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes. Curr Protein Pept Sc. 9 (4), 338-369 (2008).
  12. Wang, L., Xie, J., Deniz, A. A., Schultz, P. G. Unnatural amino acid mutagenesis of green fluorescent protein. J Org Chem. 68 (1), 174-176 (2003).
  13. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  14. Sharma, N., Furter, R., Kast, P., Tirrell, D. A. Efficient introduction of aryl bromide functionality into proteins in vivo. FEBS Lett. 467 (1), 37-40 (2000).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  16. Twine, S. M., Murphy, L., Phillips, R. S., Callis, P., Cash, M. T., Szabo, A. G. The Photophysical Properties of 6-Azaindole. J Phys Chem B. 107 (2), 637-645 (2003).
  17. Lepthien, S., Hoesl, M. G., Merkel, L., Budisa, N. Azatryptophans endow proteins with intrinsic blue fluorescence. P Natl Acad Sci USA. 105 (42), 16095-16100 (2008).
  18. Budisa, N., et al. Probing the role of tryptophans in Aequorea victoria green fluorescent proteins with an expanded genetic code. Biol Chem. 385 (2), 191-202 (2004).
  19. Ross, J. B., et al. Spectral enhancement of proteins: biological incorporation and fluorescence characterization of 5-hydroxytryptophan in bacteriophage lambda cI repressor. P Natl Acad Sci USA. 89 (24), 12023-12027 (1992).
  20. Soumillion, P., Jespers, L., Vervoort, J., Fastrez, J. Biosynthetic incorporation of 7-azatryptophan into the phage lambda lysozyme: Estimation of tryptophan accessibility, effect on enzymatic activity and protein stability. Protein Eng Des Sel. 8 (5), 451-456 (1995).
  21. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  22. Bridges, B. A., Mottershead, R. P., Rothwell, M. A., Green, M. H. L. Repair-deficient bacterial strains suitable for mutagenicity screening: tests with the fungicide captain. Chem Biol Interact. 5 (2), 77-84 (1972).
  23. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  24. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  25. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. , (2017).
  26. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to the Spectrophotometer. J Vis Exp. , (2017).
  27. Goedhart, J., et al. Structure-guided evolution of cyan fluorescent proteins towards a quantum yield of 93%. Nat Commun. 3, 751 (2012).
  28. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  29. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Eng. 12 (3), 157-162 (1995).
  30. Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. P Natl Acad Sci USA. 35 (1), 1-10 (1949).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
  32. Wang, Y. -. S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Mol Biosyst. 7 (3), 714-717 (2011).
  33. Bae, J. H., et al. Expansion of the genetic code enables design of a novel "gold" class of green fluorescent proteins. J Mol Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  34. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2017).
  36. Petrásek, Z., et al. Excitation energy transfer from phycobiliprotein to chlorophyll d in intact cells of Acaryochloris marina studied by time- and wavelength-resolved fluorescence spectroscopy. Photoch Photobio Sci. 4 (12), 1016-1022 (2005).
  37. Kolber, Z. S., Barkley, M. D. Comparison of approaches to the instrumental response function in fluorescence decay measurements. Anal Biochem. 152 (1), 6-21 (1986).
  38. Pelet, S., Previte, M. J. R., Laiho, L. H., So, P. T. C. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  39. Loefroth, J. E. Time-resolved emission spectra, decay-associated spectra, and species-associated spectra. J Phys Chem. 90 (6), 1160-1168 (1986).
  40. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -. W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), e972 (2007).
  41. Budisa, N., et al. Global replacement of tryptophan with aminotryptophans generates non-invasive protein-based optical pH sensors. Angew Chem Int Edit. 41 (21), 4066-4069 (2002).
  42. Ma, Y., Biava, H., Contestabile, R., Budisa, N., di Salvo, M. L. Coupling bioorthogonal chemistries with artificial metabolism: intracellular biosynthesis of azidohomoalanine and its incorporation into recombinant proteins. Molecules. 19 (1), 1004-1022 (2014).
  43. Teramoto, H., Kojima, K. Incorporation of Methionine Analogues Into Bombyx mori Silk Fibroin for Click Modifications. Macromol Biosci. 15 (5), 719-727 (2015).
  44. Deal, R. B., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Genome-wide kinetics of nucleosome turnover determined by metabolic labeling of histones. Science. 328 (5982), 1161-1164 (2010).
  45. Hinz, F. I., Dieterich, D. C., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Non-canonical amino acid labeling in vivo to visualize and affinity purify newly synthesized proteins in larval zebrafish. ACS Chem Neurosci. 3 (1), 40-49 (2012).
  46. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
  47. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). P Natl Acad Sci USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  48. Glenn, W. S., et al. Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging (BONCAT) Enables Time-Resolved Analysis of Protein Synthesis in Native Plant Tissue. Plant Physiol. 173 (3), 1543-1553 (2017).
  49. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  50. Acevedo-Rocha, C. G., Budisa, N. Xenomicrobiology: a roadmap for genetic code engineering. Microb Biotechnol. 9 (5), 666-676 (2016).
  51. Agostini, F., Völler, J. -. S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with Unnatural Amino Acids: Enzymology Meets Xenobiology. Angew Chem Int Edit. 56 (33), 9680-9703 (2017).
  52. Bacher, J. M., Ellington, A. D. Selection and characterization of Escherichia coli variants capable of growth on an otherwise toxic tryptophan analogue. J Bacteriol. 183 (18), 5414-5425 (2001).
  53. Wong, J. T. Membership mutation of the genetic code: loss of fitness by tryptophan. Pc Natl Acad Sci USA. 80 (20), 6303-6306 (1983).
  54. Hoesl, M. G., et al. Chemical Evolution of a Bacterial Proteome. Angew Chem Int Edit. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  55. Italia, J. S., et al. An orthogonalized platform for genetic code expansion in both bacteria and eukaryotes. Nat Chem Biol. 13 (4), 446-450 (2017).
  56. Völler, J. -. S., Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Tech. 106, 55-59 (2017).
  57. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  58. Völler, J. -. S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Curr Opin Biotech. 48, 1-7 (2017).
  59. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  60. Somsen, O. J., van Grondelle, R., van Amerongen, H. Spectral broadening of interacting pigments: polarized absorption by photosynthetic proteins. Biophys J. 71 (4), 1934-1951 (1996).
  61. Kurschus, F. C., Pal, P. P., Bäumler, P., Jenne, D. E., Wiltschi, B., Budisa, N. Gold fluorescent annexin A5 as a novel apoptosis detection tool. Cytom Part A. 75 (7), 626-633 (2009).
  62. Lepthien, S., Wiltschi, B., Bolic, B., Budisa, N. In vivo engineering of proteins with nitrogen-containing tryptophan analogs. Appl Microbiol Biot. 73 (4), 740-754 (2006).
  63. Wachter, R. M., Elsliger, M. -. A., Kallio, K., Hanson, G. T., Remington, S. J. Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein. Structure. 6 (10), 1267-1277 (1998).
  64. Verkhusha, V. V., Lukyanov, K. A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol. 22 (3), 289-296 (2004).
  65. Martynov, V. I., Savitsky, A. P., Martynova, N. Y., Savitsky, P. A., Lukyanov, K. A., Lukyanov, S. A. Alternative cyclization in GFP-like proteins family. The formation and structure of the chromophore of a purple chromoprotein from Anemonia sulcata. J Biol Chem. 276 (24), 21012-21016 (2001).
  66. Piatkevich, K. D., Malashkevich, V. N., Morozova, K. S., Nemkovich, N. A., Almo, S. C., Verkhusha, V. V. Extended Stokes shift in fluorescent proteins: chromophore-protein interactions in a near-infrared TagRFP675 variant. Sci Rep. 3 (1), 1847 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

S owa kluczowe selektywne w czanie ci nieniaaminokwasy niekanoniczneprodukcja bia ek rekombinowanychbia ko fluorescencyjnespektrometria masfluorescencjain ynieria bia kowaauksotroficzne E colipo ywka NMM19ECFP

Powiązane artykuły