Artykuł metodologiczny

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57019

⸱

9 kwietnia 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Streszczenie

Bakulowirus był tradycyjnie używany do produkcji rekombinowanego białka i szczepionki. Jednak ostatnio bakulowirus staje się obiecującym wektorem do zastosowania w terapii genowej. W tym przypadku bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidowego DNA bakulowirusa (bakidu) w przylegającej hodowli komórek Sf9. Bakulowirus jest następnie namnażany w komórkach Sf9 w kulturze zawiesinowej bez surowicy, aż do uzyskania pożądanej objętości. Następnie oczyszcza się go z supernatantu hodowli za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. Supernatant wirusa jest ładowany do kolumny heparyny, która wiąże cząsteczki bakulowirusa w supernatancie ze względu na powinowactwo heparyny do glikoproteiny otaczającej bakulowirusa. Kolumnę przemywa się buforem w celu usunięcia zanieczyszczeń, a bakulowirus jest eluowany z kolumny za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli. Eluat rozcieńcza się do stężenia soli izotonicznej, a cząsteczki bakulowirusa zagęszcza się dalej za pomocą ultrawirowania. Stosując tę metodę, bakulowirus może być skoncentrowany do 500-krotnie z 25% odzyskiem zakaźnych cząstek. Chociaż opisany tutaj protokół demonstruje produkcję i oczyszczanie bakulowirusa z kultur o objętości do 1 l, metodę tę można rozszerzyć w hodowli zawiesinowej w układzie zamkniętym w celu wytworzenia wektora klasy klinicznej do zastosowania w terapii genowej.

Wprowadzenie

Baculovirus jest głównie używany do produkcji rekombinowanych białek i szczepionek w komórkach owadów lepidoptera Spodoptera fugiperda (Sf)9 przy użyciu rekombinowanego wirusa polihedrozy jądrowej Autographa californica multicapsid (AcMNPV)1,2,3,4. Ostatnio staje się obiecującym wektorem do zastosowania w terapii genowej5. Wiadomo, że ma szeroki tropizm gospodarza i tkanki, infekuje zarówno komórki w stanie spoczynku, jak i proliferujące, jest niepatogenny i nie integruje się z chromosomem gospodarza4,5,6. Co więcej, bakulowirus może być wytwarzany w hodowli zawiesinowej bez surowicy, która jest skalowalna i pozwala na przetwarzanie w systemie zamkniętym do przyszłej produkcji klinicznej1.

Czystość cząsteczek bakulowirusa jest ważna dla osiągnięcia skutecznej transdukcji przy jednoczesnym zminimalizowaniu cytotoksyczności7,8,9. Bakulowirus może być zagęszczany przez ultrawirowanie lub filtrację o przepływie stycznym (TFF) przy ograniczonym wpływie na jego zakaźność. Jednak procedury te koncentrują nie tylko cząsteczki wirusa, ale także szczątki komórkowe i białka z hodowli Sf9, które mogą być toksyczne in vitro (osobista obserwacja) i mogą wywoływać stan zapalny lub odpowiedź immunologiczną, gdy są stosowane in vivo. Aby tego uniknąć, zwłaszcza w przypadku stosowania wysoce skoncentrowanych zapasów wirusów, zakaźny bakulowirus musi zostać oczyszczony i oddzielony od cząstek skażających.

Opisano kilka metod oczyszczania i koncentracji wektorów bakulowirusa10,11,12. Spośród dostępnych metod, chromatografia powinowactwa heparyny pozwala na jednoetapowy wysoki poziom oczyszczania przy niskim stężeniu białek zanieczyszczających12. Metoda opiera się na identyfikacji siarczanu heparanu jako receptora dla bakulowirusa13,14. Po załadowaniu supernatantu komórek Sf9 do kolumny i związaniu bakulowirusa, kolumnę można przemyć buforem fizjologicznym (izotonicznym) w celu usunięcia niezwiązanych lub luźno związanych cząstek zanieczyszczających. Ponieważ wiązanie z heparyną jest odwracalne, cząsteczki bakulowirusa mogą być eluowane za pomocą buforu o wysokiej zawartości soli, który jest natychmiast rozcieńczany do fizjologicznego (izotonicznego) stężenia soli, aby zapobiec inaktywacji przez szok osmotyczny12. Co więcej, produkcja bakulowirusa, jak również wychwytywanie i elucja z kolumny chromatograficznej, mogą być prowadzone przy użyciu procesu systemu zamkniętego, który jest zgodny z obecnymi dobrymi praktykami wytwarzania (cGMP).

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół produkcji, oczyszczania i koncentracji zakaźnego bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa i wirowania. Krótko mówiąc, wytwarzamy bakulowirusa przez transfekcję komórek Sf9 z plazmidowym DNA wirusa bakulowirusa w hodowli adherentnej i dalej rozwijamy zakaźnego bakulowirusa w hodowli zawiesinowej bez surowicy. Oczyszczamy bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny i stosujemy ultrawirowanie jako ostatni etap do silnego skoncentrowania wektora do zastosowania terapii genowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zobacz Rysunek 1 dla ilustracji podsumowującej protokół.

1. Oczyszczanie DNA plazmidu bakulowirusa

  1. Hoduj kulturę bakteryjną zawierającą plazmidowe DNA plazmidu bakulowirusa (bacmid)14 w 200 ml bulionu LB z antybiotykami; kanamycyną (50 μg/ml), tetracykliną (10 μg/ml) i gentamycyną (7 μg/ml), przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 300 obr./min.
  2. Oczyść DNA bakterii z kultury bakteryjnej za pomocą standardowego protokołu lizy alkalicznej15 i rozpuść bakcyd w buforze TE.

2. Produkcja bakulowirusa

  1. Hodowla komórek Sf9 w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy prędkości 135 obr./min i temperaturze 28 °C w poliwęglanowej kolbie Erlenmeyera zawierającej pożywkę do hodowli owadów bez surowicy1,2,3.
    nuta: Jeśli komórki Sf9 zostaną rozmrożone z zamrożonego materiału, odczekaj co najmniej dwa tygodnie, aby komórki odzyskały siły i weszły w wykładniczą fazę wzrostu.
  2. Policz komórki Sf9 zebrane w wykładniczej fazie wzrostu za pomocą hemocytometru po barwieniu błękitem trypanowym. Zasiew 1 x 106 żywotnych komórek Sf9 na studzienkę na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych w 2 ml pożywki. Pozostawić komórkę do przyczepienia się na 1 godzinę w temperaturze 28 °C w inkubatorze.
  3. Zastąp pożywkę wzrostową 1 ml niewzbogaconej pożywki do hodowli owadów Grace's bez surowicy.
  4. Transfekcja DNA bakcydu do komórek Sf9 za pomocą odczynnika do transfekcji komórek owadów.
    1. Zmieszaj 8 μl odczynnika do transfekcji komórek owadów ze 100 μl pożywki dla owadów Grace's Insects.
    2. Rozcieńczyć 2 μg bakimidowego DNA w 100 μl niesuplementowanej pożywki dla owadów i delikatnie wymieszać przez wirowanie.
    3. Połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji komórek owadów i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Dodawaj mieszaninę DNA-lipid kroplami do komórek. Inkubować w temperaturze 28 °C w inkubatorze przez około 5 godzin.
  5. Usunąć mieszaninę transfekcji z komórek i przemyć komórki 2 ml PBS.
  6. Dodać 2 ml pożywki do hodowli owadów i kontynuować hodowlę w temperaturze 28 °C w inkubatorze bez zmiany pożywki.
    nuta: Jeśli bakcyd zawiera białko fluorescencyjne, jego ekspresję można wykryć w komórkach 48 godzin po transfekcji. Bakulowirus jest wytwarzany przez transfekowane komórki Sf9 i wydzielany do pożywki hodowlanej, która następnie infekuje nietransfekowane komórki. Cała populacja komórek zostaje zakażona bakulowirusem w ciągu 5 dni i wykazuje oznaki infekcji wirusowej, zwanej również efektem cytopatycznym. Należą do nich zwiększona średnica komórek, wakuole/granulki w cytoplazmie, zatrzymanie wzrostu komórek oraz martwe lub zlizowane komórki są obecne w hodowli komórkowej. Jeśli jednak skuteczność transfekcji lub infekcji nie jest optymalna, hodowla może nie wykazywać oczywistego efektu cytopatycznego. Efekt cytopatyczny można uwidocznić za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami w powiększeniu 200 - 400X. Komórkę zakażoną bakulowirusem można wykryć poprzez barwienie przeciwciałem anty-gp6411.
  7. Pobrać supernatant bakulowirusa 5 dni po transfekcji i oznaczyć jako zapas wirusa P1.
  8. Przechowywać supernatant bakulowirusa, który jest wrażliwy na światło, w ciemności z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas (do 90 dni) lub w temperaturze -80 °C przez długi czas.
  9. Nasiona 6 × 106 komórek Sf9 na 10-centymetrowej płytce poddanej działaniu kultur tkankowych w 10 ml pożywki do hodowli owadów. Dodać 1 ml początkowego supernatantu bakulowirusa (P1) do komórek.
  10. Zebrać supernatant bakulowirusa (P2) w 5dniu po zakażeniu.
  11. Zasiać 50 ml komórek Sf9 (3 x 106 komórek/ml) w hodowli zawiesinowej w pożywce do hodowli owadów w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z poliwęglanu i umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Dodać 2 ml bulionu P2 do komórek i wstrząsać z prędkością 135 obr./min, utrzymując stałą temperaturę 28 °C.
    nuta: Trzy lub cztery dni po zakażeniu cała populacja komórek Sf9 wykaże efekt cytopatyczny , co wskazuje na produkcję bakulowirusa o wysokim mianie.
  12. Sekwencyjnie amplifikować supernatanty bakulowirusa, aż do uzyskania pożądanej objętości (P3, P4, ....) poprzez zwiększanie od 10 do 50 razy objętości hodowli komórkowej w każdej kolejnej infekcji.
    nuta: P3 totrzecia runda infekcji, w której od 500 ml do 1 l hodowli komórek Sf9 można zainfekować 10 do 20 ml supernatantu bakulowirusa P2; P4 toczwarta runda infekcji, w której 5 do 10 l hodowli komórek Sf9 może zostać zakażonych 100 do 200 ml supernatantu bakulatowirusa P3 i tak dalej. Zazwyczaj komórki Sf9 wysiewa się w ilości 3 × 106 komórek/ml w pożywkach do hodowli owadów bez surowicy.
  13. Odwirować supernatant bakulowirusa w temperaturze 1 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych i poddać supernatant bakulowirusa działaniu nukleazy w ilości 50 jednostek/ml (250 jednostek/μl podstawy) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu roztrawienia genomowego DNA i RNA. Przefiltrować supernatanty przez jednostkę filtracyjną 0,45 μm.

3. Przygotowanie systemu chromatograficznego

  1. Przygotować układ chromatograficzny, kolejno przepłukując próbkę i linie buforowe sterylną wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, wodą i buforem do przemywania (20 mM bufor fosforanu sodu zawierający 150 mM chlorku sodu, pH 7,0) przy liniowym natężeniu przepływu 50 ml/min.
  2. Przygotować kolumnę o pojemności 50 μm heparyny (10 × 10 cm, 7,9 ml objętości kolumny (CV)) przez sekwencyjnie uruchamiany bufor do czyszczenia kolumny (5 CV sterylny 20 mM bufor fosforanu sodu 5 CV zawierający 2 M chlorek sodu, pH 7,0) i bufor płuczący 5 CV przy liniowym natężeniu przepływu 7 ml/min.

4. Oczyszczanie wektora bakulowirusa

  1. Skonfigurować system chromatograficzny w następujący sposób:
    1. Użyj portu wlotowego ładowania próbki do załadowania supernatantu bakulowirusa.
    2. Użyj portu wlotowego bufora A1 do załadowania bufora myjącego. Przygotuj butelkę z co najmniej 500 ml buforu do płukania i umieść linię buforową do płukania w butelce.
    3. Użyć portu wlotowego buforu A2 do załadowania buforu elucyjnego (20 mM fosforanu sodu z 1,5 M chlorku sodu, pH 8,0). Przygotować butelkę z co najmniej 500 ml buforu elucyjnego i umieścić w niej przewód buforu elucyjnego.
    4. Włożyć kilka stożkowych probówek o pojemności 50 ml do kolektora frakcji, aby zebrać supernatant bakulowirusa przechodzącego przez kolumnę, bufor do przemywania i eluowany bakulowirus.
  2. Zrównoważyć kolumnę z heparyną z pięcioma objętościami kolumny (CV) o pojemności 7,9 ml buforu do przemywania (40 ml) przy liniowym natężeniu przepływu 7,0 ml/min.
  3. Załadować 250 ml supernatantu bakulowirusa do kolumny heparyny za pomocą pompy do pobierania próbek (port wlotowy próbki) systemu chromatograficznego przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min.
  4. Przepuścić 10 CV (80 ml) buforu płuczącego przez kolumnę z heparyną przy liniowym natężeniu przepływu 2,0 ml/min, aż krzywa absorbancji ultrafioletu (UV) (280 nm) powróci do wartości wyjściowej i stanie się stabilna.
  5. Eluować cząstki bakulowirusa z kolumny heparyny o pojemności 7,9 ml za pomocą 5 CV (40 ml) buforu elucyjnego przy liniowym natężeniu przepływu 4,0 ml/min. Uważaj na ostry pik elucji białka na chromatogramie, gdy cząstki bakulowirusa dysocjują od kolumny heparyny.
  6. Po elucji natychmiast rozcieńczyć wymyty supernatant bakulowirusa 10-krotnie, używając 20 mM buforu fosforanu sodu w wodzie, aby zapobiec inaktywacji cząstek bakulowirusa w wyniku wstrząsu osmotycznego podczas późniejszego wirowania.
  7. Przechowywać 100 μl każdej z frakcji, łącznie z przepływem kolumny zebranym podczas ładowania supernatantu bakulowirusa, buforu do przemywania i eluatu. Zakażon te frakcje bakulowirusa HT1080 w celu oceny procesu oczyszczania (patrz punkt 6).
  8. Oczyść kolumnę za pomocą bufora do czyszczenia kolumny i buforu do mycia. Na koniec przepłukać kolumnę sterylnym 20% etanolem o natężeniu 5 CV w wodzie przy liniowym natężeniu przepływu 7,0 ml/min i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Oczyścić układ chromatograficzny wodą, 1 N wodorotlenkiem sodu, ponownie wodą i 20% etanolem w wodzie przy liniowym natężeniu przepływu 50,0 ml/min i przechowywać system w 20%
    10. etanolu.

5. Stężenie bakulowirusa

  1. Wstępnie wysterylizuj probówki wirówkowe za pomocą autoklawu. Dodać równą objętość supernatantu bakulowirusa do każdej probówki ultrawirówki w kapturze do hodowli tkankowej. Zmierzyć masę probówki za pomocą wagi i wyregulować wagę zawartości probówek ultrawirówek za pomocą sterylnego PBS.
  2. Umieść każdą z probówek ultrawirówek w przeciwległym wiadrze wirnika SW 32 Ti.
  3. Uruchomić ultrawirówkę przy 80 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Otwórz probówki ultrawirówkowe w okapie do hodowli tkanek i asepcie zasysaj płyn bez usuwania osadu bakulowirusa.
  5. Zawiesić osad z każdej probówki, energicznie pipetując w górę iw dół za pomocą 200 μl PBS zawierającego 0,5% (w/vol) BSA.
  6. Przenieść skoncentrowany bakulowirus do kriowioliów (50 do 100 μl na fiolkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Miareczkowanie bakulowirusa

  1. Dzień przed zakażeniem należy policzyć komórki HT1080 za pomocą hemocytometru po wybarwieniu komórek błękitem trypanowym. Wysiew 1 x 105 komórek HT1080 na studzienkę na płytce 6-dołkowej w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Wysiewaj kilka dodatkowych dołków, aby móc określić dokładną liczbę komórek obecnych w momencie infekcji. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Komórki HT1080 są używane do miareczkowania, ponieważ wyrażają wyższy poziom siarczanu heparanu w porównaniu z innymi liniami komórkowymi16. Ponieważ komórki HT1080 przylegają, miareczkowanie jest prostsze i mniej czasochłonne w porównaniu z tradycyjnym miareczkowaniem opartym na Sf9.
  2. W dniu infekcji określ liczbę komórek w studzience, licząc komórki z dołków. Zakażone komórki należy dodać rozcieńczonego pierwotnego bakulowirusa, który został odłożony na bok przed oczyszczeniem kolumny, oraz z próbkami z frakcji przepływowej, płuczącej i elucyjnej. Dla każdej próbki należy określić rozcieńczenie i objętość empirycznie na podstawie zakaźnych cząstek bakulowirusa i zainfekować każdą studzienkę w trzech egzemplarzach.
  3. Dwa dni po zakażeniu przeanalizuj komórki pod kątem ekspresji interesującego genu. Komórki mogą być analizowane za pomocą cytometru przepływowego, jeśli wyrażają białko fluorescencyjne (np. GFP)17.
  4. Obliczyć miana (jednostka infekcyjna na ml) na podstawie liczby komórek obecnych w czasie zakażenia, współczynnika rozcieńczenia i zawartości procentowej białka fluorescencyjnego w komórkach, stosując wzór: (liczba komórek podczas zakażenia × procent komórek dodatnich × białko fluorescencyjne współczynnik rozcieńczenia)/objętość bakulowirusa w ml.
    nuta: Na przykład, jeśli całkowita liczba komórek w basenie w momencie infekcji wynosi 1,2 × 105, procent białka fluorescencyjnego wynosi 5%, współczynnik rozcieńczenia wynosi 100, a objętość dodanego rozcieńczonego bakulowirusa wynosi 10 μl, miano wynosi 6 × 107 jednostek zakaźnych (IU)/ml.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół znajduje się na schemacie blokowym (Rysunek 1). Kroki obejmują przejściową transfekcję komórek Sf9 DNA bacmid w celu produkcji bakulowirusa w kulturze przylegającej na płytce, następującą amplifikację w bezserwatkowej kulturze zawiesinowej, obróbkę nukleazą oraz klarowanie poprzez wirowanie i filtrację, a następnie oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny z późniejszą koncentracją metodą ultrawirowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje wytwarzanie bakulowirusa w komórkach Sf9 w hodowli zawiesinowej i oczyszczaniu bakulowirusa za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Parametry stosowane w tym protokole maksymalizują wydajność i minimalizują inaktywację zakaźnego bakulowirusa. Przedstawiony tutaj protokół wykazuje znacznie lepszy odzysk cząstek bakulowirusa w porównaniu z wyzdrowieniami osiągniętymiprzez inne 9.

Ze względu na szeroki zakres gospodarzy i tropiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest częściowo wspierana przez fundusze Start-Up z Cincinnati Children's Research Foundation (CCRF) dla M.N. oraz Innovative Core Grant (ICG) wspierany przez National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1 TR001425. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akta Avant 150GE Healthcare28976337System chromatograficzny
POROS Heparyna 50 &mikro; m KolumnaThermoFisher Scientific4333414Kolumna heparyny
UltrawirówkaBeckman-CoulterPozycja niekatalogowaKoncentrat wirusa z dużą prędkością
Poliallomer Probówka do ultrawirówkiBeckman-Coulter326823Koncentratuje wirusa przy dużej prędkości
Inkubator z wytrząsarką orbitalną MaxQ 8000 ThermoFisher Scientific pozycjaniekatalogowaShaker do hodowli zawiesinowych
250 ml Kolby ErlenmeyeraThermoFisher Scientific238071Kolba do hodowli zawiesinowych
1 L Kolby ErlenmeyeraThermoFisher Scientific238072Kolba do hodowli zawiesinowych
Mikroskop (Olympus CKX41)OlympusPozycja niekatalogowaMonitorowanie i liczenie komórek 
Wirówka stołowaThermoFisher Scientific75253839/433607Do klarowania supernatantu Baculovirus
50 ml Probówka stożkowaThermoFisher Scientific14-959-49ADo pobierania 6-dołkowej płytki supernatantu Baculovirus
ThermoFisher Scientific07-200-80Płytka 10 cm poddana działaniu kultur tkankowych
ThermoFisher Scientific08-772EPłytka poddana hodowli tkankowej
Stericup-HV, 0,45  &mikro; m, PVDFEMD-MilliporeSCHVU05REJednostka filtracyjna
KanamycynaThermoFisher Scientific15160-054
TetracyklinaSigma-AldrichT7660
GentamycynaThermoFisher Scientific15750-060
Zestaw wektorów Bac-to-BacThermoFisher Scientific10360-014System ekspresji bakulowirusa
DH10B-T1R  Właściwa komórkaThermoFisher Scientific12331-013Właściwa komórka dla buforu bacmid
TEIn-housePozycja niekatalogowa10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0.
Zestaw do plazmidu MaxiprepThermoFisher ScientificK2100-06Do oczyszczania bakterii
Komórki Sf9ThermoFisher Scientific11496-015Komórki owadzie
Grace' s Pożywka do hodowli komórek owadówThermoFisher Scientific11605-094Pożywka do transfekcji
PBSThermoFisher Scientific20012227Mycie komórek, rozcieńczanie próbek
HyClone SFX-Pożywka komórkowa owadówGE HealthcareSH30278.02Pożywka do wzrostu komórek owadów bez surowicy
Nukleaza benzonazySigma-AldrichE1014Enzym do degradacji DNA i RNA
Plazmid bakulowirusa (bacmid) DNAPozycjaniekatalogowaBacmid do produkcji bakulowirusa
Cellfectin II ThermoFisher Scientific10362Odczynnik do transfekcji komórek owadów
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4737Stabilizuje Baculovirus
CryovialThomas Scientific1222C24Do przechowywania Baculovirus
HT1080 linia komórkowaATCCCCL-121Linia komórkowa fibroblastów
DMEMSigma-AldrichD6429Wzrost Pożywka dla linii komórkowych
Bufor do płukaniaPozycjaniekatalogowa20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 150 mmol/l chlorku sodu
Bufor elucyjnyPozycja niekatalogowa20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 1,5 mol/l chlorku sodu
Bufor do czyszczenia kolumnyPozycjaniekatalogowa20 mmol/l Bufor fosforanowy zawierający 2,0 mol/l chlorku
soduSterylna wodaIn-housePozycja pozakatalogowaDo czyszczenia Akta Avant
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich1.09137Do czyszczenia Akta Avant
EtanolSigma-AldrichE7073Do czyszczenia Akta Avant
wewnętrzna

Bibliografia

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja bakulowirus wchromatografia powinowactwa do heparynyzag szczanie przez ultrawirowaniehodowla kom rek Sf9oczyszczanie wirusawektor terapii genowejoczyszczanie bakulowirus whodowla kom rek owadziechelucja z kolumny z heparynkoncentracja wirusa

Powiązane artykuły