W tym artykule podajemy szczegóły dotyczące metod produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10. Pokazujemy również, jak przetestować skuteczność tego białka w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu bólu zapalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie białek rekombinowanych w leczeniu bólu przewlekłego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przewlekły ból jest trudny do leczenia i pilnie potrzebne są nowe podejścia do leczenia uporczywego bólu. Cytokiny przeciwzapalne są obiecującymi kandydatami do leczenia wyniszczających stanów bólowych ze względu na ich zdolność do regulowania nieprawidłowych interakcji neuroimmunologicznych. Jednak fizjologicznie działają w sieci różnych cytokin, dlatego ich efekt terapeutyczny może nie być optymalny, gdy są stosowane jako samodzielne leki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy białko fuzyjne cytokin przeciwzapalnych IL4 i IL10. W tym miejscu opisujemy metody produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10 oraz testujemy skuteczność białka fuzyjnego IL4-10 w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu uporczywego bólu zapalnego.
Wprowadzenie
Przewlekły ból pozostaje jednym z najbardziej wyniszczających i niedostatecznie leczonych problemów medycznych XXI wieku, dotykając >20% dorosłej populacji1,2. Jednak leczenie mające na celu złagodzenie przewlekłego bólu jest często nieskuteczne lub musi zostać przerwane z powodu poważnych skutków ubocznych3. Co ważne, obecnie dostępne leki zapewniają jedynie ulgę objawową, ale nie modyfikują w znaczący sposób ani nie leczą przewlekłego bólu. Chociaż przewlekły ból wydaje się być zaburzeniem neurologicznym, dowody sugerują udział układu odpornościowego w rozwoju przewlekłego bólu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i uprzednią zgodą lokalnej komisji etyki eksperymentalnej. Krew pełną pobrano z Mini Donor Service (Mini Donor Dienst, MDD) w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU) w Holandii. MDD otrzymał pozytywną aprobatę Komisji Etyki Medycznej UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) dla numeru protokołu 07-125/C.
1. Produkcja i charakterystyka białka
- Hodowla komórkowa
Uwaga: Patrz Tabela materiałów dla zastosowanej pożywki hodowlanej.- Rozmrozić komórki HEK293-F w temperaturze 37....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Reprezentatywne zdjęcie żelu SDS-PAGE zawierającego różne frakcje uzyskane podczas oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa przedstawiono na Rysunku 1A. W frakcjach załadowanych (L) oraz przepływowych (FT) widoczne są wszystkie białka obecne w supernatancie komórek HEK293. W frakcji płukania (W) nie stwierdzono obecności białek. W frakcji elucji (E) widoczne są dwa prążki o masach 35 i 37 kDa, odpowiadające dwóm różnym glikoformom biał.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie opisano metody produkcji i charakterystyki rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10 oraz metody testowania jego skuteczności w hamowaniu hiperalgezji zapalnej w mysich modelach uporczywego bólu zapalnego. Produkcja i oczyszczanie białka fuzyjnego IL4-10 odbywa się na małą skalę. Komórki HEK293 są wybierane jako system ekspresji do produkcji białek, ponieważ umożliwiają modyfikacje potranslacyjne, których nie można osiągnąć w prokariotycznych systemach ekspresji. Modyfikacje potranslacyjne są istotne dla.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Część tej pracy została sfinansowana z grantu Uniwersytetu Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu w Utrechcie
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komórki FreeStyle 293-F | Invitrogen | R790-07 | Ludzkie embrionalne komórki nerkowe |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologie | 12338018 | Pożywka hodowlana |
| 293fektyny Odczynnik | Invitrogen | 12347019 | Odczynnik do transfekcji |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life | 51985026 | Reduced Serum Medium do stosowania podczas kationowych transfekcji lipidowych |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| Sepharose aktywowana CNBr 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | wstępnie aktywowane pożywki do sprzęgania przeciwciał lub innych dużych białek |
| Kwas solny dymiący 37% | Merck | 1003171000 | |
| Chlorek sodu | Sigma | S7653-1kg | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | 31437 | |
| Chlorowodorek Trizma | Sigma | T3253-500G | Chlorowodorek TRIS |
| Kwas octowy 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glicyna-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Bufor Tris/Glycine/SDS do elektroforezy SDS |
| Mini-PROTEAN TGX Żele | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS Prefabrykaty żelowe |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot Pakiety transferowe |
| Yarra 3u SEC-2000 kolumna | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | gotowy do użycia Barwnik białkowy Coomassie do żeli poliakrylamidowych |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R& D | DY217B | |
| Człowiek TNF&alfa; Zestaw ELISA | Diaklon | 851570020 | |
| zestaw do oznaczania białek BCA Pierce | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Karagen | Sigma-Aldrich | 22049 | mukopolisacharyd |
| roślinny CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | adiuwant do szczepionki |
| Strzykawka Hamilton | Sigma-Aldrich | 20779 | szklana strzykawka |
| Wybieg dla zwierząt | IITC Life Science | 433 | Wybieg dla zwierząt |
| Stojak siatkowy Von Frey | IITC Life Science | 410 | Stojak siatkowy |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | test dotykowy sondy sensoryczne |
| Test podeszwowy (metoda Hargreavesa) | IITC Life Science | 390G | z podgrzewanym szkłem |
| obciążenia | Bioseb | deficytu postawy | BIO-DWB-AUTO-M Szklane |
| kolumny Econo-Column, 1,5 i 30 cm | Kolumna | chromatograficzna BIO-RAD 7371532 szklana | |
| Rurki do dializy SnakeSkin | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML | Jednorazowa jednostka filtrująca Sartorius | 16555-K | , 0,45 μ |
| M CASY Licznik i analizator komórek | Roche |
Bibliografia
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widesp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
