Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie białek rekombinowanych w leczeniu bólu przewlekłego

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57071

⸱

11 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule podajemy szczegóły dotyczące metod produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10. Pokazujemy również, jak przetestować skuteczność tego białka w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu bólu zapalnego.

Streszczenie

Przewlekły ból jest trudny do leczenia i pilnie potrzebne są nowe podejścia do leczenia uporczywego bólu. Cytokiny przeciwzapalne są obiecującymi kandydatami do leczenia wyniszczających stanów bólowych ze względu na ich zdolność do regulowania nieprawidłowych interakcji neuroimmunologicznych. Jednak fizjologicznie działają w sieci różnych cytokin, dlatego ich efekt terapeutyczny może nie być optymalny, gdy są stosowane jako samodzielne leki. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy białko fuzyjne cytokin przeciwzapalnych IL4 i IL10. W tym miejscu opisujemy metody produkcji i kontroli jakości rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10 oraz testujemy skuteczność białka fuzyjnego IL4-10 w rozwiązywaniu bólu w mysim modelu uporczywego bólu zapalnego.

Wprowadzenie

Przewlekły ból pozostaje jednym z najbardziej wyniszczających i niedostatecznie leczonych problemów medycznych XXI wieku, dotykając >20% dorosłej populacji1,2. Jednak leczenie mające na celu złagodzenie przewlekłego bólu jest często nieskuteczne lub musi zostać przerwane z powodu poważnych skutków ubocznych3. Co ważne, obecnie dostępne leki zapewniają jedynie ulgę objawową, ale nie modyfikują w znaczący sposób ani nie leczą przewlekłego bólu. Chociaż przewlekły ból wydaje się być zaburzeniem neurologicznym, dowody sugerują udział układu odpornościowego w rozwoju przewlekłego bólu4,5. Co więcej, pojawiają się podejścia do leczenia bólu oparte na odporności. Na przykład cytokiny przeciwzapalne hamują ból w kilku modelach bólu przewlekłego6,7,8. Jednak cytokiny przeciwzapalne mają krótki okres półtrwania, co zmniejsza ich potencjalne działanie hamujące ból. Co więcej, cytokiny przeciwzapalne działają najbardziej optymalnie w porozumieniu ze sobą. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno połączyliśmy cytokiny przeciwzapalne interleukinę-4 (IL4) i interleukinę-10 (IL10) w jedną cząsteczkę. Białko fuzyjne IL4-10 wykazuje większą skuteczność w hamowaniu przewlekłego bólu zapalnego i neuropatycznego w porównaniu z pojedynczymi cytokinami9. Tutaj opisujemy, w jaki sposób takie białko fuzyjne jest produkowane, oczyszczane i jak kontrolowana jest jego jakość.

Białko fuzyjne IL4-10 jest wytwarzane w komórkach ludzkich przez przejściową transfekcję komórek HEK293-F za pomocą wektora ekspresyjnego pUPE przenoszącego sekwencję cDNA kodującą białko fuzyjne IL4-10. Komórki HEK293-F są wybierane tak, aby umożliwić potranslacyjną modyfikację białka, coś, co nie występuje w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. Aby zoptymalizować pokrywanie glikanów kwasem sjalowym, cDNA kodujące beta-galaktozyd-2, 3-sjalotransferazę jest włączane do wektora jako drugi transgen. Białko fuzyjne jest oczyszczane za pomocą oczyszczania białka powinowactwa supernatantu hodowli, ponieważ jest ono silniejsze niż oczyszczanie innymi metodami, np. wykluczeniem wielkości lub chromatografią jonowymienną10,11. Aby oczyścić białko fuzyjne IL4-10, użyliśmy własnych przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL4. Ocena czystości i bioaktywności oczyszczonego białka fuzyjnego IL4-10 jest przeprowadzana w ramach kontroli jakości. Czystość produkowanych partii ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i wysokociśnieniowej chromatografii wykluczającej (HP-SEC). Bioaktywność białka fuzyjnego IL4-10 ocenia się, mierząc jego zdolność do hamowania produkcji czynnika martwicy nowotworów alfa (TNFα) indukowanej lipopolisacharydem (LPS) w posiewach krwi pełnej i porównując ją z kombinacją poszczególnych cytokin.

Na koniec, aby przetestować zdolność białek fuzyjnych IL4-10 do hamowania przewlekłego bólu, opisujemy, jak białko fuzyjne może być testowane jako środek przeciwbólowy w powszechnie stosowanych mysich modelach uporczywego bólu zapalnego12,13,14. Tutaj opisujemy metody modelu bólu zapalnego. Należy jednak pamiętać, że można stosować inne modele bólu (np. modele bólu neuropatycznego), w zależności od pytań badawczych, na które należy odpowiedzieć. Aby ocenić ból w tych modelach, ważne jest, aby użyć różnych miar behawioralnych, które obejmują miary bólu wywołanego i niewywołanego. W tym miejscu opisaliśmy metody oceny zmian w mechanicznie i termicznie wywołanych reakcjach behawioralnych. Wrażliwość mechaniczną na bodźce nieszkodliwe ocenia się za pomocą testu von Freya, natomiast wrażliwość termiczną ocenia się za pomocą testu Hargreavesa. Co ważne, hiperalgezja/allodynia niewywołana jest mierzona za pomocą testu dynamicznego obciążania. Pomiary te są powszechnie akceptowane jako miary bólu i dostarczają ważnych informacji na temat progów bólu i potencjalnego bólu doświadczanego przez zwierzęta15,16,17. Inne miary oceny bólu niewywołanego (np. niezależne od bodźca), takie jak test preferencji warunkowego miejsca, mogą być cenne18. Aby ocenić potencjał leku do hamowania bólu, przeprowadziliśmy dokanałowe podawanie białka fuzyjnego, ponieważ przy tej drodze podania potrzebna jest mniejsza dawka białka, aby dotrzeć do obszarów związanych z bólem i uniknąć skutków ogólnoustrojowych (ubocznych)19,20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i uprzednią zgodą lokalnej komisji etyki eksperymentalnej. Krew pełną pobrano z Mini Donor Service (Mini Donor Dienst, MDD) w Uniwersyteckim Centrum Medycznym w Utrechcie (UMCU) w Holandii. MDD otrzymał pozytywną aprobatę Komisji Etyki Medycznej UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) dla numeru protokołu 07-125/C.

1. Produkcja i charakterystyka białka

  1. Hodowla komórkowa
    Uwaga: Patrz Tabela materiałów dla zastosowanej pożywki hodowlanej.
    1. Rozmrozić komórki HEK293-F w temperaturze 37 °C, aż powstanie mała grudka lodu. Rozmrożone komórki natychmiast przenieść do 10 ml lodowatego podłoża (4 °C) i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 minuty (min) przy 500 x g.
    2. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 500 x g przez 4 minuty.
    3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki w temperaturze pokojowej temperatury. Dodać zawiesinę komórek bezpośrednio do kolby o pojemności 125 ml zawierającej 25 ml wstępnie podgrzanej pożywki (37 °C). Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 8% CO2 i wilgotności 95% na wytrząsarce orbitalnej obracającej się z prędkością 125 obr./min.
    4. Subkultura komórek dwa razy w tygodniu. Użyj automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów), aby ocenić liczbę komórek i żywotność komórek. Wysiewać żywe komórki w stężeniu 3 x 105 komórek/ml do kolb Erlenmeyera. Utrzymywać całkowitą objętość pożywki na poziomie 1/5 całkowitej objętości kolb Erlenmeyera do hodowli przez cały czas, aby utrzymać optymalne napowietrzenie.
  2. Transfekcja
    Uwaga: Subkulturuj komórki trzy do czterech razy przed transfekcją i transfekuj je, gdy żywotność komórki wynosi >90%. Żywotność komórek jest oceniana przez zautomatyzowany (wielokanałowy system zliczania komórek w polu elektrycznym) oparty na integralności błony plazmatycznej. Patrz Tabela materiałów dla odczynnika do transfekcji.
    1. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy 500 x g; ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej (37 °C) i rozcieńczyć zawiesinę komórek do ~1,0 x 106 komórek/ml w całkowitej objętości 1 l. Podwielokrotność zawiesiny komórek w 10 podwielokrotnościach po 100 ml w kolbach Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
    2. Rozcieńczyć 1 mg plazmidowego DNA w 33 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM, patrz tabela materiałów) w surowicy przez delikatne mieszanie. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 1,330 μl odczynnika do transfekcji w MEM przez delikatne mieszanie. Inkubować oba roztwory w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać i wymieszać DNA rozcieńczone w MEM z odczynnikiem do transfekcji w MEM i inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać mieszaninę odczynników do transfekcji DNA do komórek (hodowanych w sekcji 1); dodać 6,6 ml mieszaniny do każdej 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml komórek w pożywce hodowlanej. Utrzymuj komórki w wyżej wymienionych warunkach hodowli. Zebrać supernatant kultury zawierający wydzielane białko fuzyjne IL4-10 trzy dni po transfekcji.
    4. Oznaczyć stężenie białka fuzyjnego IL4-10 w supernatancie hodowli, wykonując test ELISA IL10 zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W optymalnych warunkach hodowli można oczekiwać, że stężenie białka fuzyjnego wyniesie od 2,5 do 5 μg/ml.
  3. Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa
    UWAGA: Chromatografię powinowactwa przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Jednak wszystkie frakcje (supernatant hodowli, ładunek, frakcje przepływowe i elucyjne) są utrzymywane na lodzie podczas zabiegu.
    1. Połączyć 10 mg przeciwciała monoklonalnego przeciwko IL4 własnej produkcji z 1 g sefarozy 4B aktywowanej CNBr, zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów). Wlać powoli 2,5 ml sprzężonych kulek sefarozy do szklanej kolumny chromatograficznej (30 cm długości i 1,5 cm średnicy wewnętrznej, patrz tabela materiałów).
    2. Zablokuj pozostałe miejsca wiązania kulek, przepuszczając przez kolumnę 50 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej. Przemyć kolumnę 25 ml PBS (pH = 7,4), a następnie 12,5 ml 0,1 M buforu glicyny (pH = 2,5) i 25 ml PBS (pH = 7,4).
    3. Przepuścić 100 ml 10-krotnie stężonego supernatantu HEK293 do hodowli komórkowych przez kolumnę z szybkością przepływu 1 ml/min. Przepłukać kolumnę 50 ml PBS.
    4. Eluować związane białko fuzyjne IL4-10 za pomocą 12,5 ml 0,1 M buforu glicyny (pH = 2,5) przy natężeniu przepływu 1 ml/min i zebrać frakcje 2,5 ml. Dodać 350 μl 1 M buforu Tris (pH = 9) do każdej frakcji, aby doprowadzić pH do 7. Zneutralizowane frakcje dializować przez noc w stosunku do 2 l PBS (pH = 7,4).
      1. Stosować rurki do dializy o suchej średnicy 16 mm i granicy masy cząsteczkowej 3,5 K. Sterylne frakcje dializowane należy przefiltrować za pomocą jednorazowych filtrów o średnicy porów 0,45 μM. Sterylny roztwór białka fuzyjnego IL4-10 przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C.
    5. Oceń czystość eluowanego białka fuzyjnego IL4-10 za pomocą barwionego Coomassie 12% żelu SDS-PAGE i HP-SEC (kolumna 3 μm SEC-2000). Do analizy HP-SEC należy załadować 40 μl białka o stężeniu ~1 mg/ml na kolumnę. Użyć 100 mM buforu fosforanowo-sodowego ze 150 mM chlorku sodu (pH = 6,8) jako fazy ruchomej. Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min.
    6. Oznaczyć stężenie każdej partii oczyszczonego białka fuzyjnego IL4-10 za pomocą testu ELISA IL10 i testu białkowego kwasu bicynchoninowego (zestaw do oznaczania białek BCA, patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołami producenta.
    7. Użyj rekombinowanej ludzkiej IL10, aby utworzyć krzywą wzorcową w teście ELISA. Aby skorygować różnicę wielkości między rekombinowanym białkiem fuzyjnym IL10 (18 kDa) a białkiem fuzyjnym IL4-10 (34 kDa), należy pomnożyć otrzymane stężenie przez współczynnik 1,8.
  4. Bioaktywność białka fuzyjnego IL4-10
    UWAGA: Test krwi pełnej przeprowadza się dla każdej partii wyprodukowanego białka fuzyjnego IL4-10, a aktywność różnych partii jest porównywana w ramach kontroli jakości. Test krwi pełnej przeprowadza się na świeżej krwi ludzkiej pobranej w dniu testu w probówkach z heparyną. Krew została pobrana od zdrowych ochotników w naszym wewnętrznym serwisie dawców. Z próbkami należy obchodzić się jako z potencjalnym zagrożeniem biologicznym.
    1. Przygotować 3-krotne seryjne wstępne rozcieńczenia oczyszczonego białka fuzyjnego IL4-10 w pożywce RPMI (patrz tabela materiałów) w zakresie stężeń 5 - 1,215 ng/ml.
    2. Przygotować wstępne rozcieńczenia LPS (100 ng/ml) i krwi ludzkiej, które rozcieńcza się 4 razy w pożywce RPMI.
    3. Odpipetować wstępne rozcieńczenia białka fuzyjnego IL4-10, LPS i krwi ludzkiej do 48-dołkowej płytki. Do każdego dołka dodać 50 μl białka fuzyjnego IL4-10 (końcowe stężenie 1 - 243 ng / ml), 75 μl pożywki RPMI, 25 μl LPS (końcowe stężenie 10 ng / ml) i 100 μl ludzkiej krwi (ostatecznie rozcieńczonej).
      UWAGA: Całkowita objętość na studzienkę wynosi 250 μL.
    4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 8% CO2 i wilgotności 95% przez 18 godzin.
    5. Ocenić stężenie TNFα w supernatantach hodowlanych za pomocą testu ELISA TNFα, zgodnie z protokołem producenta.
    6. Obliczyć hamowanie odpowiedzi zapalnej przez białko fuzyjne IL4-10 według wzoru: % zahamowania = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
      UWAGA: Tutaj A = poziomy TNFα w kulturach stymulowanych LPS traktowanych białkiem fuzyjnym IL4-10, B = poziomy TNFα w kulturze niestymulowanej i C = poziomy TNFα w kulturze stymulowanej LPS.

2. Mysi model uporczywego bólu zapalnego

UWAGA: Ważne jest, aby używać zarówno samców, jak i samic myszy (C57Bl/6), ponieważ umożliwi to identyfikację efektów zależnych od płci. Ogólnie rzecz biorąc, używane myszy są w wieku od 8 do 16 tygodni. Aby określić wymaganą liczbę zwierząt, należy przeprowadzić obliczenia mocy. Narzędzia internetowe do wykonywania takich obliczeń można łatwo znaleźć w Internecie (np. http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).

  1. Indukcja przewlekłego bólu zapalnego
    UWAGA: Wywołaj uporczywy ból zapalny u dorosłych myszy za pomocą doplantacyjnych wstrzyknięć karagenu lub całkowitego adiuwantu Freuda (CFA). Różne testy nie kolidują ze sobą.
    1. Przygotować karagen (2% w/v) rozpuszczając λ-karagen (patrz tabela materiałów) w 0,9% NaCl, przepuszczając roztwór przez igłę o rozmiarze 23, aby upewnić się, że karagen jest prawidłowo rozpuszczony. Świeży roztwór należy przygotować bezpośrednio przed wykonaniem wstrzyknięcia.
    2. Alternatywnie, jeśli stosuje się CFA, należy odpowiednio wymieszać roztwór CFA przed wstrzyknięciem go śródpłaszczyznowo, ponieważ CFA jest emulsją typu woda w oleju zawierającą 1 mg Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) zabitego i wysuszonego na gorąco, 0,85 ml oleju parafinowego i 0,15 ml monooleinianu mannidu (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Szklane strzykawki Hamilton z metalowymi tłokami są zalecane do wstrzykiwania tego związku, ponieważ gumowe tłoki mogą reagować z olejem w adiuwancie.
    3. Iniekcja dopodeszwowa
      1. Utrzymać związek (kroki 2.1.1 lub 2.1.2) w strzykawce w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut przed wstrzyknięciem, aby umożliwić dostosowanie do RT. Wstrzyknąć 20 μl związku (lub rozpuszczalnika jako kontroli) podskórnie w tylną łapę nieznieczulonej myszy za pomocą igły 30G.
      2. Wbić igłę u podstawy kciuka kierując się do pięty i wstrzyknąć związek po wkłuciu igły na około 0,5 cm. Po wstrzyknięciu należy powoli wycofać igłę, lekko obracając strzykawkę, aby uniknąć wycieku roztworu z miejsca wstrzyknięcia.

3. Pomiary bólu

Uwaga: Upewnij się, że badacze przeprowadzający eksperymenty behawioralne są ślepi na leczenie myszy. Ważne jest, aby zaaklimatyzować zwierzęta do środowiska testowego przed wykonaniem jakiegokolwiek pomiaru. Najlepiej, na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów, zwierzęta umieszcza się 1 - 2 razy na 15 - 30 minut w każdym z różnych urządzeń używanych do wykonywania testów. Podczas pracy z samcami i samicami w tym samym eksperymencie oceniaj samce niezależnie od samic. Dokładnie czyść klatki i powierzchnie między różnymi grupami, aby uniknąć potencjalnego niepożądanego wpływu na zachowanie różnych płci. Zmierz wyjściowe opóźnienia wycofania lub progi mechaniczne dwa do trzech razy, aby dokładnie określić progi wyjściowe i określić, czy są one stabilne przed wstrzyknięciem doplantacyjnym jakiegokolwiek związku.

  1. Test von Freya: mechaniczna wrażliwość na nieszkodliwe bodźce
    1. Umieść zwierzęta pojedynczo w akrylowych klatkach na stojaku z siatki drucianej i pozwól myszom zaaklimatyzować się przez co najmniej 15 minut przed pomiarami.
    2. Oceń czułość mechaniczną, mierząc próg wycofania łapy w odpowiedzi na skalibrowaną serię włosów von Freya w zakresie od 0,02 do 4 g. Rozważ każdy ruch łapy z dala od nałożonych włosów jako pozytywną reakcję wycofania. Przyłóż włókna prostopadle do powierzchni łapy z wystarczającą siłą, aby spowodować lekkie zgięcie na skórze i przytrzymaj przez ~3 s. Upewnij się, że włosy nie skręcają się podczas aplikacji na łapę.
    3. Oblicz 50% próg wycofania łapy za pomocą metody góra-dół15,21.
      UWAGA: Pierwszy filament do nałożenia to 0,4 g (można użyć innych filamentów początkowych w zależności od progów, które te myszy wyświetlają na linii bazowej). Brak reakcji na filament wskazuje, że następny grubszy filament jest używany w następnej stymulacji, podczas gdy pozytywna odpowiedź wskazuje na użycie następnego cieńszego filamentu. Liczba prezentacji włosów zależy od pierwszej odpowiedzi różnicowej; Następnie wykonywanych jest 5 kolejnych aplikacji. Oblicz próg 50% zgodnie z metodami opisanymi wcześniej15,21.
  2. Czułość termiczna: Test Hargreavesa
    1. Umieścić zwierzęta w klatkach na wstępnie ogrzanej (30 °C) szklanej płytce i pozwolić myszom na aklimatyzację przez co najmniej 15 minut przed pomiarami, czekając, aż zwierzęta usiądą nieruchomo.
    2. Określić czasy opóźnienia odprowadzania ciepła poprzez podgrzanie łapy zwierząt za pomocą skupionej wiązki światła widzialnego za pomocą aparatu Hargreavesa (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Intensywność wiązki jest ustawiona na 12%, ponieważ przy tym eksperymentalnie określonym ustawieniu intensywności wiązka światła wywołuje reakcję wycofania w średnim czasie 8 s na linii wyjściowej na myszach C57Bl/6. Ustawienie intensywności powinno być określone dla każdego indywidualnego obciążenia maszyny i myszy. Maksymalne czasy odcięcia wynoszące 20 s lub więcej są stosowane w celu uniknięcia obrażeń zwierząt.
    3. Zmierz czasy opóźnienia wypłaty ~ 4 razy na zwierzę. Średnia wszystkich zmierzonych odpowiedzi. Mierz każdą łapę niezależnie, z zachowaniem co najmniej 1-minutowych odstępów między kolejnymi pomiarami w tej samej łapie.
  3. Deficyty postawy: dynamiczna próba obciążenia
    1. Przed badaniem należy zmierzyć masę ciała każdego zwierzęcia, ponieważ analiza obciążenia wymaga masy ciała każdego zwierzęcia jako parametru wejściowego.
    2. Umieść zwierzęta pojedynczo w dynamicznym systemie nośnym z przyrządowaniem podłogowym, zamontowanym na pokrywie podtrzymującej kamerę, która będzie rejestrować ruchy myszy. Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się przez 0,5 do 1 minuty przed nagrywaniem przez 5 minut.
      UWAGA: W tym teście tylko jedno swobodnie poruszające się zwierzę może być oceniane na raz.
    3. Dostosuj ustawienia, aby wykonać obciążanie i przeanalizować dane.
      UWAGA: W tych eksperymentach używamy następujących parametrów: (i) Niski próg wagowy wynoszący 0,6 g: jest to minimalna waga niezbędna do aktywacji jednego z ogniw czujnika. (ii) Wysoki próg wagowy wynoszący 1 g: liczba ta wskazuje wagę potrzebną do pełnej aktywacji jednego ogniwa. (iii) Próg powierzchniowy 2 komórek: liczba ta wskazuje liczbę komórek sąsiadujących ze sobą, które należy aktywować, aby zostały wzięte pod uwagę. (iv) Minimalna liczba obrazów to 5: przechwycenie każdego zdjęcia zajmuje 0,1 s. Liczba wskazuje minimalną liczbę klatek, w których mysz się nie porusza. W związku z tym wartość 5 oznacza, że postawa myszy musi być stabilna przez >0,5 s, aby uzyskać pomiar, który jest brany pod uwagę do analizy.
    4. Przeprowadź analizę każdego filmu, odtwarzając go ponownie i upewnij się, że każda kończyna jest poprawnie rozpoznawana przez oprogramowanie w ramach czasowych wskazanych przez oprogramowanie.
      UWAGA: Należy zatwierdzić co najmniej 1 minutę zarejestrowanego czasu. Oprogramowanie do dynamicznego przenoszenia ciężaru oblicza i podaje następujące parametry: (i) Ciężar przenoszony przez każdą pojedynczą łapę w gramach i jako procent masy całego ciała. (ii) Ciężar przenoszony przez połączoną przednią łapę lub połączone tylne łapy, w gramach i jako procent masy całego ciała. (iii) Stosunek obciążenia lewej/prawej łapy lub obciążenia przedniej/tylnej. (iv) Powierzchnia każdej łapy lub połączonych łap przednich/tylnych, które aktywowały podkładkę wrażliwą na nacisk. (v) średnia i odchylenie standardowe dla każdego parametru. (vi) Czas trwania różnych pozycji (wyprostowanie, 3 łapy, lub 4 łapy) podczas całego eksperymentu. (vii) Czas (s) każda łapa niesie ze sobą ciężar podczas całego eksperymentu.

4. Dokanałowe wstrzyknięcie białka fuzyjnego IL4-10 w celu analgezji

UWAGA: Upewnij się, że wentylacja pomieszczenia jest otwarta, aby zapewnić prawidłowy przepływ powietrza. W celu zbadania skuteczności białka fuzyjnego IL4-10 (1 μg/mysz; 5 μl całkowitej objętości wstrzyknięcia) należy je przetestować w porównaniu z iniekcjami nośnika i wstrzyknięciami kombinacji poszczególnych cytokin (IL4 + IL10, 0,5 μg + 0,5 μg/mysz, 5 μl całkowitej objętości wstrzyknięcia).

  1. Znieczulić mysz 3 - 4% izofluranem o natężeniu przepływu tlenu 2 l/min w komorze indukcyjnej. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, ściskając łapę, aby upewnić się, że zwierzę nie reaguje.
  2. Umieść mysz na stole z głową umieszczoną w stożku nosowym aparatu i utrzymuj sedację myszy 1,5 - 2% izofluranem o natężeniu przepływu tlenu 2 l/min podczas wykonywania wstrzyknięcia dooponowego.
  3. Uzupełnij związki do wstrzykiwań do czystej szklanej strzykawki Hamilton o pojemności 25 μl podłączonej do igły o rozmiarze 27.
  4. Trzymaj mysz mocno za grzbiet za żebrami i lekko unieś mysz. Umieść igłę pionowo między kręgami lędźwiowymi L5 i L6 i ostrożnie wprowadź ją przez skórę dokładnie pośrodku kręgów lędźwiowych. Umieść igłę w przestrzeni międzykręgowej.
    UWAGA: Odnalezienie przestrzeni międzykręgowej może wymagać pewnego "poszukiwania" poprzez przesuwanie igły wzdłuż osi rostralnej brzusznej, lekko dociskając igłę, aż do momentu wyczucia utraty oporu tkanki kostnej.
    1. Potwierdź prawidłowe kierowanie, sprawdzając, czy nastąpiło machnięcie ogonem. Wstrzyknąć powoli 5 μl związku, odczekać kilka sekund, a następnie powoli wycofać igłę. Jeśli zaobserwuje się tylko jeden ruch łapą, prawdopodobnie igła nie jest prawidłowo umieszczona.
  5. Po wstrzyknięciu należy dokładnie sprawdzić mysz przez pierwsze 30 minut po wyzdrowieniu ze znieczulenia, aby upewnić się, że nie ma żadnych upośledzeń motorycznych/paraliżu.
    UWAGA: Zachowania bólowe można zmierzyć (zgodnie z opisem w sekcji 3) 15 minut po wyzdrowieniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne zdjęcie żelu SDS-PAGE zawierającego różne frakcje uzyskane podczas oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa przedstawiono na Rysunku 1A. W frakcjach załadowanych (L) oraz przepływowych (FT) widoczne są wszystkie białka obecne w supernatancie komórek HEK293. W frakcji płukania (W) nie stwierdzono obecności białek. W frakcji elucji (E) widoczne są dwa prążki o masach 35 i 37 kDa, odpowiadające dwóm różnym glikoformom biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisano metody produkcji i charakterystyki rekombinowanego białka fuzyjnego IL4-10 oraz metody testowania jego skuteczności w hamowaniu hiperalgezji zapalnej w mysich modelach uporczywego bólu zapalnego. Produkcja i oczyszczanie białka fuzyjnego IL4-10 odbywa się na małą skalę. Komórki HEK293 są wybierane jako system ekspresji do produkcji białek, ponieważ umożliwiają modyfikacje potranslacyjne, których nie można osiągnąć w prokariotycznych systemach ekspresji. Modyfikacje potranslacyjne są istotne dla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Część tej pracy została sfinansowana z grantu Uniwersytetu Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu w Utrechcie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki FreeStyle 293-FInvitrogenR790-07Ludzkie embrionalne komórki nerkowe 
GIBCO FreeStyle 293 Expression MediumLife technologie12338018Pożywka hodowlana
293fektyny OdczynnikInvitrogen12347019Odczynnik do transfekcji
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAXLife51985026Reduced Serum Medium do stosowania podczas kationowych transfekcji lipidowych 
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x)Life technologies52400-025
Sepharose aktywowana CNBr 4BGE Healthcare17-0430-01wstępnie aktywowane pożywki do sprzęgania przeciwciał lub innych dużych białek
Kwas solny dymiący 37% Merck1003171000
Chlorek soduSigmaS7653-1kg
Wodorowęglan sodu Sigma31437
Chlorowodorek TrizmaSigmaT3253-500GChlorowodorek TRIS 
Kwas octowy 100%                                                         Merck1.00063.1000 
Glicyna-HCl                                                                               SigmaG2879                         
PBS                                                                                                     Pharmacie, UMCUSól fizjologiczna buforowana fosforanami
10X TGSBIO-RAD161-0772Bufor Tris/Glycine/SDS do elektroforezy SDS
Mini-PROTEAN TGX ŻeleBIO-RAD456-104612% SDS Prefabrykaty żelowe
Trans-Blot Turbo Transfer PackBIO-RAD170-4157Western blot Pakiety transferowe
Yarra 3u SEC-2000 kolumnaPhenomenex
InstantBlue Protein StainExpedeonISB1Lgotowy do użycia Barwnik białkowy Coomassie do żeli poliakrylamidowych
Human IL-10 DuoSet ELISAR& DDY217B
Człowiek TNF&alfa; Zestaw ELISADiaklon851570020
zestaw do oznaczania białek BCA PierceThermoFisher Scientific23227
KaragenSigma-Aldrich22049mukopolisacharyd
roślinny CFASigma-AldrichF5881adiuwant do szczepionki
Strzykawka HamiltonSigma-Aldrich20779szklana strzykawka
Wybieg dla zwierzątIITC Life Science433Wybieg dla zwierząt
Stojak siatkowy Von FreyIITC Life Science410Stojak siatkowy
von Frey hairs Stoelting58011test dotykowy sondy sensoryczne
Test podeszwowy (metoda Hargreavesa)IITC Life Science390Gz podgrzewanym szkłem
obciążeniaBiosebdeficytu postawyBIO-DWB-AUTO-M Szklane
kolumny Econo-Column, 1,5 i 30 cmKolumnachromatograficzna BIO-RAD 7371532 szklana   
Rurki do dializy SnakeSkin Thermo Scientific88242
Minisart NML Jednorazowa jednostka filtrująca Sartorius16555-K, 0,45 μ
M CASY Licznik i analizator komórekRoche
Test podeszwowy Test dynamicznego Test Filtr strzykawkowy

Bibliografia

  1. Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
  2. Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102(2008).
  3. Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
  4. Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
  5. Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
  6. Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
  7. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  8. Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
  9. Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
  10. Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
  11. Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
  12. Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
  13. Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
  14. Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  17. Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
  18. He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
  19. Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
  20. Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682(2013).
  21. Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
  22. Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

rekombinowane białko fuzyjnebiałko fuzyjne IL4-10oczyszczanie białekchromatografia powinowactwaanaliza SDS-PAGEtest ELISAtest Von Freyaparat Hargreavesadynamiczne obciążenie kończynmodele przewlekłego bólu
Opracowanie białek rekombinowanych w leczeniu bólu przewlekłego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.