Artykuł metodologiczny

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57084

⸱

12 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Science, Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute, Columbia University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Streszczenie

Oprócz witamin i przeciwutleniaczy zalecanych przez Age-Related Eye Disease Study, nie ma skutecznej terapii na "suche" lub zanikowe zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), które stanowi 90% przypadków. Potrzebne są terapie, aby spowolnić lub opóźnić rozwój atrofii geograficznej (GA), a zrozumienie patologii błony Brucha jest częścią tego procesu. Zmiany w błonie Brucha u człowieka poprzedzają postęp AMD, przyczyniając się do uszkodzenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Biorąc pod uwagę brak wystarczającej liczby modeli zwierzęcych do badania AMD, modele ex vivo starzejącej się ludzkiej błony Brucha służą jako użyteczne narzędzie do badania zachowania komórek RPE z unieśmiertelnionych i pierwotnych linii komórkowych, a także linii RPE pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę, która pozwala określić wpływ zachowania komórek RPE wysianych na pobranych eksplantatach błony Brucha od ludzkich dawców, w tym przyczepienie, apoptozę i proliferację, zdolność do fagocytyzacji zewnętrznych segmentów fotoreceptorów, ustalenie polaryzacji i ekspresję genów. Test ten zapewnia model ex vivo starzejącej się błony Brucha w celu oceny cech funkcjonalnych komórek RPE po wysiewie na starej/uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Wprowadzenie

Związane z wiekiem zmiany strukturalne w błonie Brucha u człowieka, które są spowodowane wieloma czynnikami, w tym stresem nitrozacyjnym i oksydacyjnym, wywierają wiele szkodliwych skutków na funkcję komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i przyczyniają się do patologii zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9. Rozważając terapię zastępczą komórek w przypadku zaawansowanego zaniku AMD lub atrofii geograficznej, leczenie prawdopodobnie będzie wymagało przeszczepu komórek na podłoże atrofii komórek RPE. Zmiany związane z wiekiem w błonie Brucha u człowieka mogą niekorzystnie wpływać na powodzenie przeszczepionych przeszczepów komórek RPE, biorąc pod uwagę uszkodzenie macierzy zewnątrzkomórkowej6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Badanie biologii błony Brucha u człowieka i tego, w jaki sposób zmiany strukturalne w obrębie macierzy przyczyniają się do progresji do AMD, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patologii choroby. W związku z tym istnieje pilna potrzeba, aby badacze zajmujący się obszarem oczu związanym z wiekiem opracowali protokoły opisujące pobieranie ex vivo od starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błony Brucha.

Historycznie rzecz biorąc, trudno było modelować zaburzenia związane z wiekiem, takie jak atrofia geograficzna i błona Brucha u starzejącego się człowieka U zwierząt23. Trudność ta wynika z wielu czynników, w tym długowieczności ludzi w porównaniu z gryzoniami i innymi gatunkami często wykorzystywanymi do modelowania chorób, a także z braku plamki żółtej u większości kręgowców24. Zaletą opisanej w niniejszym dokumencie metody jest to, że komórki mogą być testowane bezpośrednio na błonie Brucha pobranej z oczu pośmiertnych osób w podeszłym wieku i/lub chorych. Ogólnym celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowej metodologii dla modelu ex vivo starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błony Brucha, w tym izolacji eksplantatów błony Brucha od ludzkich dawców oraz wysiewu komórek RPE do dalszych eksperymentów. Model ten może służyć jako odpowiedni model do badania wpływu uszkodzenia macierzy zewnątrzkomórkowej na funkcję i patologię komórek RPE20,25,26,27,28.

Protokół

Poniższy protokół jest wykonywany zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Yale.

1. Pozyskiwanie ludzkich oczu dawcy

  1. Zdobądź ludzkie globy dawców z National Disease Research Interchange (NDRI, Filadelfia, Pensylwania). W zależności od projektu przygotuj nie mniej niż trzy pary oczu dawcy dla każdej grupy eksperymentalnej.
  2. Wyłuszczyć oczy dawcy w ciągu 10 godzin i wysłać w ciągu 48 godzin po śmierci. Następnie przetransportuj oczy do laboratorium w sterylnej pożywce hodowlanej Eagle (DMEM) firmy Dulbecco na lodzie. Wcześniej opisane badania wykazały, że oczy dawcy pobrane i przetransportowane w ten sposób zachowują biologiczne cechy i aktywność błony Brucha25,26,29.

2. Zbieranie eksplantatów błony komórkowej człowieka Brucha

  1. Umieść każde oko na gazie o wymiarach 1,5 x 1,5 cala nasączonej pożywką DMEM niezależną od dwutlenku węgla w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i użyj nożyczek z cienkimi ostrzami, aby wykonać nacięcie przez twardówkę 3 mm za rąbkiem i obwodowo rozciągając się w dowolnym kierunku.
  2. Wykonaj nacięcie obwodowe o pełnej grubości (przenikające do ciała szklistego) 1 mm za orą serrata. Usuń i wyrzuć przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę), ciało szkliste i siatkówkę.
  3. Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać cztery promieniste nacięcia między twardówką a naczyniówką, a następnie oderwij twardówkę od obwodu do nerwu wzrokowego, uważając, aby nie rozerwać kompleksu błonowego naczyniówki/Brucha.
  4. Następnie wykonaj nacięcie obwodowe przez przestrzeń nadnaczyniówkową wzdłuż ora serrata i oderwij kompleks błonowo-naczyniówkowy RPE-Bruch z tyłu od twardówki.
  5. Usuń natywne komórki RPE, kąpiąc eksplant w 0,02 M wodorotlenku amonu w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco na polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie myjąc go trzykrotnie w DPBS (Rysunek 1).
  6. Unosić eksplantat kompleksu membranowego Brucha w podłożu wolnym od dwutlenku węgla na nielaminowanej, hydrofobowej membranie politetrafluoroetylenowej o grubości 65 μm z porami 0,2 μm, z podstawową warstwą blaszki każdego eksplantu skierowaną w stronę membrany.
  7. Umieść membranę politetrafluoroetylenową z eksplantatem membranowym Brucha na podłożu ze spiekanego szkła w szklanym systemie uchwytów próżniowych do mikroanalizy.
  8. Spłaszcz zwinięte krawędzie od strony naczyniówki drobnymi kleszczami pokrytymi teflonem, uważając, aby nie dotknąć podstawy lamininy błony Brucha.
  9. Podgrzej 15 ml agarozy (4% w DPBS), a następnie schłodzić do 37 °C. Następnie wlej 15 ml płynnego żelu na kompleks błonowo-naczyniówkowy Brucha od strony naczyniówki, stosując delikatne odsysanie, aby zagwarantować, że eksplant pozostanie płaski. Przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C przez 2-3 minuty w celu zestalenia agarozy, a następnie oderwać membranę z politetrafluoroetylenu.
  10. Umieść eksplant membranowy Brucha (o średnicy 1,5 cala, w zestalonym żelu agarozowym) w naczyniu do hodowli komórek polistyrenowych o wymiarach 60 x 15 mm (z membraną Brucha skierowaną do góry), które zostało wyłożone ciepłą płynną agarozą na dnie naczynia, aby zamocować eksplantat membranowy Brucha na dnie studzienki z warstwą podstawowej lamininy eksplantacji skierowaną do góry.
  11. Agaroza zestala się w ciągu 2-3 minut w temperaturze pokojowej, aby ustabilizować eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym. Przykryj eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym DPBS i przechowuj naczynie w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Rysunek 2A pokazuje izolowane eksplantaty błony Brucha w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 mm.
  12. Jeśli pożądany system hodowli znajduje się na 96-dołkowej płytce, umieść eksplant membranowy Brucha (o średnicy 1,5 cala, ze zestalonym żelem agarozowym) na płaskim arkuszu teflonu stroną z lamininą do góry.
  13. Za pomocą trepanacji wyciąć pięć lub sześć okrągłych guzików o średnicy 6 mm z eksplantatu kompleksu membranowego Brucha i umieścić każdy z nich na 4% agarozie w temperaturze 37 °C w niepoddanym działaniu polistyrenu studzienku na 96-dołkowej płytce. Agaroza zestala się w ciągu 2-3 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić eksplantaty (guziki) błony Brucha na dnie każdej studzienki.
    UWAGA: Rysunek 2B przedstawia trepanowane guziki membranowe Brucha w 96-dołkowej płytce. Zazwyczaj z każdego oka można zebrać 9 - 11 guzików lub eksplantatów.

3. Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na eksplantatach błony ludzkiej Brucha

  1. Po otrzymaniu oczu dawcy oczyść tkankę zewnątrzgałkową za pomocą DPBS. Wykonaj nacięcie obwodowe 5 mm poniżej punktu styku tęczówki i twardówki (pars plana) w przestrzeni podsiatkówkowej. Odrzuć przedni odcinek, ciało szkliste i siatkówkę.
  2. Umyj muszlę oczną, która zawiera membranę Brucha i arkusz RPE, zimnym DPBS. Odciąć komórki RPE za pomocą 5 ml 0,25% trypsyny nie dłużej niż 10 minut dla każdej próbki oka. Ugasić reakcję trypsyny za pomocą 25 ml kompletnej pożywki DMEM z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) ogrzaną w temperaturze 37 °C w probówce o pojemności 50 ml.
  3. Odwirować komórki w temperaturze 200 × g przez 10 minut w temperaturze 24 °C i ponownie zawiesić osad w 5 ml kompletnej pożywki DMEM (z 15% FBS).
  4. Policz komórki i wysiej 15 000 żywotnych komórek RPE na blaszce podstawy każdego z różnych starzejących się eksplantatów błonowych Brucha (guzików) na 96-dołkowej płytce w 200 μl minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) zawierających antybiotyki (100 j.m./ml penicyliny G, 100 mg/ml streptomycyny, 5 mg/ml gentamycyny i 2,5 mg/ml amfoterycyny B). Zakładając średnicę komórki 20 μm, posiewanie o tej gęstości pozwoli komórkom RPE pokryć około 15% powierzchni posiewu.
  5. Umieść komórki na przycisku, dzięki czemu gęstość komórek można następnie stopniowo zwiększać do 100% zbieżności, w zależności od wpływu każdego parametru na zachowanie komórki.
  6. Pozostawić komórki do przyłączenia się do eksplantatu na 24 godziny w wilgotnej atmosferze 95% powietrza/5% CO2 w temperaturze 37 °C. Delikatnie zmienić podłoże za pomocą ciepłego, kompletnego DMEM.

Wyniki

Po prawidłowym wykonaniu niniejszego protokołu można określić wpływ starzejącej się i/lub chorobowo zmienionej ludzkiej błony Brucha na funkcje komórek RPE poprzez ocenę ustanowienia polarności i zewnętrznej bariery krew-siatkówka, spolaryzowanej sekrecji czynników wzrostu i cytokin oraz fagocytozy zewnętrznych odcinków pręcików fotoreceptorów.

Wygenerowaliśmy dane, które wykazują fenotyp chorobowy w przypadku starzejącej się ludzkiej błonyrusa. Na przykład hodowla komórek RPE na eksplantach starzejącej się ludzkiej błonyrusa zmniejsza ponowną adhezję komórek RPE (Rycina 3). Hodowla komórek RPE na starzejącej się ludzkiej błonierusa obniża zdolność tych komórek do fagocytozy zewnętrznych segmentów pręcików (ROS), co stanowi krytyczną funkcję RPE (Rycina 4). Ponadto, komórki apoptotyczne można zidentyfikować i porównać na tych eksplantach przy użyciu metody TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling), zgodnie z opisem w poprzednich pracach26. Wpływ starzejącej się i/lub chorobowo zmienionej ludzkiej błonyrusa na profil ekspresji genów w komórkach RPE można określić za pomocą technologii mikromacierzy. Wykazaliśmy, że ekspresja genów w komórkach RPE ulega zmianie podczas hodowli na ludzkiej błonierusa pochodzącej od osób starszych w porównaniu do eksplantów od osób młodszych (Rycina 5)27. Do analizy statystycznej w każdej grupie wykorzystuje się eksplanty pochodzące od co najmniej 3 - 5 ludzkich dawców.

Schemat procesu sekcji gałki ocznej; etapy przygotowania kompleksu RPE-błona Brucha-naczyniówki.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie izolacji ludzkiej błony Brucha z oczu dawców. Ludzkie błony Brucha są pozyskiwane poprzez usunięcie twardówki, segmentu przedniego, siatkówki, ciała szklistego oraz natywnych komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Błona Brucha w agarozie, układ hodowli komórkowej, schemat eksperymentalny badania tkanki.
Rycina 2. Izolowana ludzka błona Brucha (BM) w naczyniu hodowlanym. (A) Schemat eksplantów ludzkiej błony Brucha (każdy o średnicy 1,5 cala, z zastygłym żelem agarozowym) umieszczonych w polistyrenowym naczyniu do hodowli komórkowej 60 × 15 mm (BM skierowana stroną górną do góry), wypełnionym na dnie ciepłą płynną agarozą. (B) Eksplant ludzkiej błony Brucha, który został wycięty trepanem na kilka okrągłych fragmentów (eksplantów) o średnicy 6 mm, z których każdy został następnie umieszczony na 4% agarozie w temperaturze 37 °C w niepowlekanej polistyrenowej studzience płytki 96-dołkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący względną szybkość przywierania komórek RPE do młodej i starszej błony Brucha (BM), wykazujący istotną różnicę.
Rycina 3. Szybkość ponownego przywierania komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) do młodej i starszej ludzkiej błony Brucha (BM). Pierwotne komórki RPE wysiano na eksplantaty ludzkiej błony Brucha pochodzące z oczu dawców młodych (<50 lat, n = 3) lub starszych (>70 lat, n = 5) na trzy tygodnie. Szybkość przywierania komórek zmierzono za pomocą testu żywotności komórek MTT. Starsze ludzkie błony Brucha obniżyły szybkość przywierania komórek RPE o 24% (młoda BM 100 +/-8,54 S.E. vs starsza BM 76,65 +/-1,44 S.E.). **p <0,05, S.E. = błąd standardowy.

Wykres słupkowy fagocytozy FITC-ROS porównujący poziomy fluorescencji komórek BM młodych i starszych.
Rycina 4. Fagocytoza komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) zależy od wieku ludzkiej błony Blocha (BM). Pierwotne komórki RPE hodowane na starszych eksplantach ludzkiej błony Blocha wykazywały obniżoną zdolność do fagocytozy zewnętrznych odcinków pręcików (ROS) (młoda BM 873 +/-9,3 S.E., n = 5 vs starsza BM 608 +/-25,4 S.E., n = 5). ***p <0,01, S.E. = błąd standardowy.

Porównanie liczby genów w błonie Brucha; analiza wykresu rozrzutu w badaniach nad starzeniem.
Rycina 5. Liczba genów komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) wykazujących ekspresję w każdej próbce hodowanej na eksplantach młodej lub starszej ludzkiej błony Brucha. Odnotowano większy rozrzut liczby genów wykazujących ekspresję w pierwotnych komórkach RPE wysianych na starszą w porównaniu z młodszą ludzką błoną Brucha (odpowiednio 6201 ± 388 vs. 6439 ± 80); w każdej grupie wiekowej przebadano pięć eksplantów. Przedstawiono za pełną zgodą wszystkich autorów pracy Cai, H et al.27. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Starzejąca się ludzka błona Brucha (macierz zewnątrzkomórkowa) przyczynia się do postępu choroby AMD, a zatem istnieje potrzeba zrozumienia, w jaki sposób ta zmieniona matryca przyczynia się do dysfunkcji komórek RPE. Biorąc pod uwagę brak wystarczającej liczby modeli zwierzęcych do badania zmian związanych z wiekiem w AMD, systemy modelowe ex vivo , które naśladują skutki choroby, mogą służyć jako cenne narzędzie do zrozumienia patofizjologii. Metodologia opisana w tym manuskrypcie może być stosowana do konsekwentnego izolowania eksplantatów błonowych ludzkiego Brucha i hodowli komórek RPE, w tym pierwotnych, unieśmiertelnionych lub pochodzących z komórek macierzystych linii komórkowych RPE.

Jak wspomniano wcześniej, eksplantaty błonowe ludzkiego Brucha pochodzą z NDRI. Z NDRI ustala się protokół, który określa kryteria określone dla akceptowalnych oczu dawcy. Na przykład dawcy nie mogą mieć stwierdzonych chorób siatkówki oka, oczy/kule są pobierane w ciągu 10 godzin po śmierci, a kule docierają do laboratorium w ciągu 48 godzin po śmierci (w postaci nocnej dostawy paczki na lodzie). Należy określić odpowiedni przedział wiekowy i liczbę oczu potrzebnych do analizy statystycznej badania, np. pięć par globusów od dawców w wieku od 20 do 49 lat oraz pięć par globusów od dawców w wieku od 50 do 89 lat.

Dostępność kulek ocznych jest różna, zazwyczaj każdego miesiąca dostępnych jest średnio dziesięć par globlerów. Do zestawu okulistów dołączone są podstawowe, zanonimizowane informacje o dawcy: wiek, rasa, godzina zgonu, przyczyna zgonu i krótka historia medyczna (lista chorób lub chorób współistniejących).

Co najważniejsze, zbieranie eksplantatów błony Brucha u człowieka wymaga usunięcia przedniego odcinka oka i ciała szklistego, co pozwala na wyizolowanie kompleksu błonowo-naczyniówkowego RPE-Bruch. Po wyizolowaniu błony Brucha komórki RPE można wysiać na bezkomórkowe eksplantaty w różnych stężeniach i hodować do dalszych eksperymentów. Przygotowanie i postępowanie proceduralne opisane w niniejszym dokumencie ma kluczowe znaczenie, zwracając uwagę na orientację izolowanej błony Brucha, aby upewnić się, że powierzchnia laminalna jest skierowana do góry, jednocześnie nie dotykając powierzchni mechanicznie, aby uniknąć uszkodzenia struktury powierzchni macierzy zewnątrzkomórkowej.

Należy również zauważyć, że w przypadku korzystania z systemów eksplantacji błonowych Brucha istnieją pewne zmienne, które mogą wpływać na wyniki dalszych eksperymentów, takie jak tło genomowe indywidualnego dawcy, wiek błony Brucha lub czas pośmiertny błony Brucha oraz lokalizacja błony Brucha, tj. centralna lub obwodowa część eksplantatów błonowych Brucha. Podobnie jak w przypadku każdego innego badania tkanek ludzkich, należy zrekrutować odpowiednią liczbę próbek oka dawcy, aby uzyskać niezbędną moc statystyczną i w razie potrzeby dopasować wiek oka dawcy. Ustalenie ścisłych kryteriów przyjmowania oczu z banków oczu jest krytycznym parametrem. Przyjmuj tylko oczy, które są wyłuszczone w czasie krótszym niż 10 godzin po śmierci i które można pobrać za pomocą błony Brucha w ciągu 24 - 48 godzin po śmierci. Miejsce nerwu wzrokowego może być używane jako marker orientacji i używać tych samych lokalizacji dla grup eksperymentalnych i kontrolnych. Podejmując te środki, można zminimalizować zmienność eksperymentalną.

Podsumowując, zrozumienie kompleksu błona-naczyniówka RPE-Bruch i tego, jak wpływa na niego wiek i choroba, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego wkładu w patofizjologię AMD. Systemy modelowe, które wykorzystują techniki ex vivo, są cennym narzędziem do badania tych efektów przy użyciu tkanki ludzkiej. W niniejszym artykule opisujemy metodologię, która wykorzystuje eksplantaty ludzkiego dawcy jako odpowiedni model ex vivo starzejącej się błony Brucha. Technika ta pozwala na wykorzystanie starzejącej się i / lub chorej ludzkiej błony Brucha jako narzędzia badawczego do zbadania, w jaki sposób zmiany strukturalne w macierzy mogą wpływać na nakładanie się komórek RPE, w tym przyczepianie, proliferację i ekspresję genów25,27. Pomyślne opracowanie podobnych systemów modelowych ex vivo pogłębi naszą wiedzę na temat AMD i ułatwi opracowanie nowych opcji terapeutycznych.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma żadnych ujawnień komercyjnych do zadeklarowania.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez Research to Prevent Blindness, Nowy Jork, www.rpbusa.org, oraz Greater New York Center for Retinal Degenerative Disease Foundation Fighting Blindness, www.blindness.org. Autorzy pragną podziękować dr Luannie Bartholomew za krytyczną recenzję tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie kule dawcyNational Disease Research Interchange, NDRI
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995-065
Media niezależne od dwutlenku węglaThermo Fisher Scientific18045-088
60-milimetrowa polistyrenowa szalka PetriegoCorning Inc.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco, PBSThermo Fisher Scientific14190144
Hydrofobowa 65 &mikro; membrana politetrafluoroetylenowa o grubości M i 0,2 &mikro; m poresMerck MilliporeJGWP04700
Fisherbrand szklany system uchwytów filtrów próżniowych do mikroanalizy Thermo Fisher Scientific09-753-102
AgarozaSigma-AldrichA2576-5G
35 & razy; 10mm naczynie hodowlaneVWR International25373-041
TrephineAccutomeAM0570 60
96 dołkówCorning Inc.3595
Minimalne niezbędne nośniki (MEM) Thermo Fisher Scientific11095-080 
Penicylina GSigma-AldrichP3032-1MU
StreptomycynaSigma-AldrichS6501
GentamycynaSigma-AldrichG1914
Amfoterycyna BSigma-Aldrich1397-89-3
Roztwór wodorotlenku amonuSigma-Aldrich1336-21-6
 
351007

Bibliografia

  1. Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).
  2. Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).
  3. Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. Cell therapy for basement membrane-linked diseases. Matrix Biol. , (2016).
  4. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  5. Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula. Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).
  6. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).
  7. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).
  8. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  9. Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis. Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).
  10. Caldwell, R. B. Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats. Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).
  11. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  12. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  13. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).
  14. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  15. Ho, T. C., Del Priore, L. V. Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).
  16. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).
  17. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro. Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).
  18. Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).
  19. Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).
  20. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).
  21. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  22. Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).
  23. Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases. J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).
  24. Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).
  25. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  26. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).
  27. Cai, H., Del Priore, L. V. Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium. Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).
  28. Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium. Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10(2015).
  29. Sun, K., et al. Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Kultura komórek RPEoczy ludzkich dawcówizolacja tkanekadhezja komórektest fagocytozyanaliza ekspresji genówtkanka starzała
Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.