Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.
Artykuł metodologiczny
Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedobór tlenu u zwierząt może wynikać z narażenia na niski poziom tlenu w atmosferze lub z uszkodzenia tkanek wewnętrznych, które zakłóca dystrybucję tlenu. Możliwe jest również, że nieprawidłowe zachowanie neuronów wyczuwających tlen może wywołać zachowanie podobne do niedotlenienia w obecności normalnego poziomu tlenu. U D. melanogaster rozwój przy niskim poziomie tlenu powoduje zahamowanie wzrostu i powolne zachowanie w fazach larwalnych. Jednak te ustalone objawy deficytu tlenu w znacznym stopniu pokrywają się z fenotypami wielu mutacji, które regulują wzrost, reakcje na stres lub lokomocję. W rezultacie, obecnie nie ma dostępnego testu, który pozwoliłby zidentyfikować i) niedotlenienie komórkowe wywołane mutacją lub ii) zachowanie podobne do niedotlenienia, gdy jest wywołane nieprawidłowym zachowaniem neuronów.
Ostatnio zidentyfikowaliśmy dwa charakterystyczne zachowania u larw D. melanogaster, które występują przy normalnym poziomie tlenu w odpowiedzi na wewnętrzne wykrycie niedotlenienia. Po pierwsze, na wszystkich etapach takie larwy unikają zakopywania się w pożywieniu, często oddalając się daleko od źródła pożywienia. Po drugie, drążenie tuneli w miękkim podłożu, które zwykle występuje podczas wędrującego trzeciego stadium rozwojowego, jest całkowicie zniesione, jeśli larwy są niedotlenione. Opisany tutaj test ma na celu wykrycie i ilościowe określenie tych zachowań, a tym samym zapewnienie sposobu wykrywania niedotlenienia wywołanego uszkodzeniem wewnętrznym, a nie niskim poziomem tlenu zewnętrznego. Płytki testowe z podłożem agarowym i centralnym korkiem z pasty drożdżowej służą do podtrzymywania zwierząt w okresie larwalnym. Pozycje i stan larw są śledzone codziennie, gdy przechodzą od pierwszego do trzeciego stadium rozwoju. Zakres tunelowania w podłożu agaru podczas fazy wędrówki określa się ilościowo po przepoczwarzeniu za pomocą NIH ImageJ. Test będzie miał wartość w określeniu, kiedy hipoksja jest składnikiem zmutowanego fenotypu, a tym samym zapewni wgląd w możliwe miejsca działania danego genu.
Wprowadzenie
Zaawansowany zestaw molekularnych narzędzi genetycznych dostępnych w D. melanogaster czyni go cennym organizmem do badania ewolucyjnie zachowanych procesów biologicznych. Kluczowe reakcje molekularne na dostępność tlenu okazały się konserwatywne w całej ewolucji, a wcześniejsze badania nad D. melanogaster pozwoliły na poznanie uniwersalnych składników tych szlaków sygnałowych 1,2,3,4,5,6.
W ramach badania mającego na celu zbadanie funkcji neuronów czuciowych u larw D. melanogaster, zidentyfikowaliśmy dwie reakcje behawioralne, które okazały się być aktywowane przez niedotlenienie tkanek przy normalnym poziomie tlenu 7. Jeden z nich, niemożność zakopania się w pożywieniu, jest silnie związany z reakcją na niski poziom tlenu zgłoszony przez Wingrove'a i O'Farrella 8. Drugie zachowanie, niepowodzenie w tunelowaniu w miękkim podłożu podczas późnej fazy wędrówki trzeciego stadium rozwojowego, nie zostało wcześniej zidentyfikowane jako związane z niedotlenieniem. Ustaliliśmy, że wystawienie larw wędrujących dzikich typów na niski poziom tlenu również hamuje tunelowanie podłoża 7, ustalając w ten sposób, że oba te zachowania pochodzą z niedotlenienia - albo wywołanego uszkodzeniem tkanki, albo niskim poziomem poboru tlenu. Tutaj opisujemy test, który opracowaliśmy w celu ilościowego określenia tych dwóch zachowań wywołanych hipoksją, który rozpoczyna się od obserwacji bezpośrednio po wykluciu się larw.
Reakcje niedotlenienia we wczesnych stadiach larwalnych nie były wcześniej badane, dlatego przeprowadzanie analizy przez całe życie larwalne jest cennym elementem naszego testu. Większość oczywistych objawów niedotlenienia – powolny rozwój, słaby wzrost i ospałość lokomotoryczna – pokrywa się z fenotypami larw wytwarzanymi przez wiele mutacji. Odkryliśmy jednak, że tylko larwy w trzecim stadium rozwojowym z niedotlenieniem wykazują całkowitą niezdolność do tunelowania 7. W ten sposób ustaliliśmy, że nawet larwy bardziej zagrożone pod względem wzrostu i lokomocji niż nasze larwy niedotlenione, nadal wykonywały pewne tunele, podczas gdy larwy niedotlenione nigdy nie drążyły tuneli 7. Innym cennym elementem tego testu jest to, że zapewnia on sposób ustalenia, kiedy hipoksja jest źródłem określonego zestawu fenotypów plejotropowych, a nie jakiegoś innego stresu lub nieprawidłowego funkcjonowania metabolicznego. Jako demonstrację testu, tutaj opisujemy jego zastosowanie w charakterystyce reakcji larw ze zmniejszoną ekspresją tchawicy nienadmuchiwanego, genu, który funkcjonuje w drogach oddechowych larw 9.
Przewidujemy, że ten test będzie wartościowy dla badaczy zajmujących się charakteryzacją fenotypów larw, które charakteryzują się słabym wzrostem i powolnym zachowaniem. W rezultacie można zidentyfikować nowe geny, które wpływają na dystrybucję, wykorzystanie lub reakcje na tlen w całym organizmie. Co więcej, włączenie tego testu do protokołu badań przesiewowych mutantów zapewniłoby bezpośrednią drogę do identyfikacji mutacji, które powodują niedotlenienie. Ten test będzie również cenny w analizie obwodów, które wywołują opisane tutaj wrodzone zachowania wywołane niedotlenieniem. Analiza sieci neuronowych tego typu jest przedmiotem wielu obecnych badań, a prosty układ nerwowy larwy D. melanogaster jest cennym systemem do analizowania zautomatyzowanych zachowań. Neurony czuciowe zaangażowane w percepcję tlenu przez larwy zostały już zidentyfikowane, co stanowi pierwszy krok w kierunku zdefiniowania kompletnych obwodów dla reakcji wywołanych niedotlenieniem 10,11. Użycie naszego testu w połączeniu z selektywnym knockdownem neuronowym za pośrednictwem systemu GAL4-UAS12 to jasna droga do wytyczenia kolejnych elementów sieci neuronowej.
Protokół
1. Przygotowanie larw
- Dwa lub więcej dni przed rozpoczęciem testu, należy ustawić krzyżówki pożądanych kombinacji doświadczalnych i kontrolnych (co najmniej 20 samic i 10 samców każda) w naczyniach do składania jaj, jak opisali Wieschaus i Nusslein-Volhard 13, ale używając 50 ml polipropylenowych zlewek i 6,0 cm jednorazowych szalek Petriego zawierających agar winogronowy i posmarowanych pastą drożdżową tuż przed użyciem. Trzymaj muchy w naczyniach do składania jaj w ciemności w temperaturze pokojowej, aż będą potrzebne.
- Przepis na agar winogronowy – połącz 100 ml mrożonego 100% koncentratu soku winogronowego, 350 ml wody dejoinizowanej, 5 ml octu lodowcowego i 13 g agaru D. melanogaster w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Kuchenka mikrofalowa w 1-2 minutowych seriach, mieszając między seriami, aż agar się rozpuści. Schłodzić roztwór przez kilka minut, a następnie dodać 10 ml 10% (w/v) Nipagenu (p-hydroksybenzoesanu metylu) do 95% etanolu. Wymieszać, a następnie pipetować 7 ml na płytkę do jednorazowych szalek Petriego o średnicy 6,0 cm, pozostawić do zżelowania i wyschnąć w temperaturze pokojowej przez 3-4 godziny. Przechowywać w temperaturze 4 0C w plastikowych torebkach.
- Przepis na pastę drożdżową – 7 g suszonych drożdży, 10 ml wody dejonizowanej, wymieszać szpatułką do uzyskania jednolitej konsystencji.
- Czasowe pobieranie jaj w celu wygenerowania larw doświadczalnych i kontrolnych. Używając nowych, posmarowanych drożdżami talerzy winogronowych, zbieraj jajka w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w ciemności w godzinach porannych. Wyjmij te 4-godzinne płytki zbiorcze i zastąp je świeżymi. Inkubować 4-godzinne płytki zbiorcze przez noc w temperaturze 25 0C do popołudnia następnego dnia, kiedy większość larw się wykluje. Zbierz te pierwsze larwy w stadium rozwojowym i użyj ich do przygotowania eksperymentu.
2. Ustawianie płytek testowych
- Przygotowanie płytek testowych. Do pojedynczego cyklu testu należy przygotować pięć płytek testowych, z których każda zawiera 10 larw doświadczalnych i pięć płytek zawierających 10 larw kontrolnych. Użyj świdra korkowego o średnicy 1,5 cm, aby usunąć środkowy rdzeń agaru z każdej płytki, tworząc otwór na żywność. Do dołka wsypujemy pastę drożdżową (0,8 - 0,9 g) i delikatnie wklepujemy szpatułką, aby usypać kopczyk wypełniający otwór.
- Przygotowanie płytki agarowej – połączyć 700 ml wody dejonizowanej z 16 g agaru D. melanogaster w szklanej zlewce o pojemności 2 litrów i podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 5 minut. Wyjmij z kuchenki mikrofalowej i wymieszaj szklaną pałeczką, aby wprowadzić nierozpuszczony agar do roztworu. Dodaj 17,5 ml 10% (w/v) Nipagen do 95% etanolu, wymieszaj, a następnie kontynuuj ogrzewanie mikrofalowe w 30-sekundowych seriach, a następnie mieszaj, aż cały agar całkowicie się rozpuści. Schłodzić przez minutę lub dwie, a następnie odpipetować 15 ml porcji na 10 cm plastikowe szalki Petriego. Pozwól agarowi się zżelować, przykryj płytki pokrywkami i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez kilka godzin lub na noc. Przechowywać talerze w szczelnie zamkniętych plastikowych torebkach w temperaturze 18 °C.
Uwaga 1: Aby uniknąć tworzenia się kryształów Nipagen na powierzchni płytek z powodu nadmiernego wysuszenia, należy użyć płytek w ciągu kilku dni od przygotowania. W razie potrzeby kryształy można ponownie rozpuścić, upuszczając na nie kilka mikrolitrów 95% alkoholu.
Uwaga 2: partie agaru mogą mieć różne właściwości żelujące. Suche płytki żelowe powinny być twarde w dotyku i wystarczająco sprężyste, aby można było usunąć czysty, nienaruszony krąg agaru podczas używania świdra korkowego do tworzenia otworu na żywność (patrz wyżej). - Umieszczanie larw na płytkach testowych. Użyj mechanicznego nacisku, aby wygiąć końcówkę plastikowej mikroszpatułki i zanurz końcówkę w paście drożdżowej, aby zapewnić "klej" do zbierania larw. Podnieś pojedynczo pierwsze larwy w stadium rozwojowym i umieść je na talerzu agarowym w pobliżu kopca żywności. Przygotować co najmniej pięć powtórzonych płytek po 10 larw zarówno dla genotypów doświadczalnych, jak i kontrolnych. Po zakończeniu nakryj i oznacz każdą płytkę, a następnie umieść płytki (pokrywką do góry) w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (w naszym laboratorium jest to 22 °C).
3. Płytki do badań monitorujących
- Codziennie badaj płytki pod mikroskopem preparacyjnym i zapisuj liczbę larw na wierzchu pokarmu lub na powierzchni agaru. Zwróć uwagę na wszelkie widoczne martwe lub umierające larwy. Zwróć uwagę, kiedy i czy tunelowanie w podłożu agaru jest widoczne, gdy larwy przemieszczają się do trzeciego stadium rozwojowego. Zanotuj daty, w których poczwarki zaczynają się formować i odnotuj wszelkie nieprawidłowości poczwarki. Kontynuuj codzienne obserwacje, aż wszystkie larwy umrą lub przepoczwarzą się.
- Ostrożnie usuń poczwarki z talerza za pomocą wygiętej igły do drażnienia i przenieś na talerz winogronowy. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie poczwarek, aby określić, ile z nich zamyka się jako dorosłe osobniki.
4. Przygotowanie płytek testowych do obrazowania
- Ostrożnie wyjmij i wyrzuć wszystkie drożdże z centralnego dołka każdego talerza.
- Delikatnie zalej każdą płytkę wodą z kranu i użyj miękkiego pędzla artystycznego, aby ostrożnie zetrzeć zanieczyszczenia, które zostały wyśledzone na powierzchni agaru. Wymień wodę kilka razy i kontynuuj delikatne szczotkowanie, aż każda płytka będzie całkowicie czysta. Płytki należy ostatecznie spłukać wodą dejonizowaną, przykryć je korkiem i pozostawić na noc w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
nuta: Drążenie tuneli w agarze jest najbardziej intensywne wokół kopca żywności (patrz rysunek 2). W rezultacie krawędź otworu na żywność jest zwykle rozszerzana poza początkową średnicę 1,5 cm. Ponadto kruchość obrobionego agaru w tym regionie może spowodować utratę małych kawałków tunelowanego agaru z obwodu otworu podczas czyszczenia. Zwiększenie stężenia agaru żelowego może pomóc w rozwiązaniu tych problemów, ale możliwe są korekty podczas etapów oznaczania ilościowego obrazu J (patrz poniżej).
5. Kwantyfikacja tunelowania
- Wyobraź sobie płyty. Przygotuj obraz każdej płytki wykonany na czarnym tle, tak aby tunele w agarze były zaznaczone jasnymi białymi liniami.
nuta: Na tym etapie używamy systemu powszechnie używanego do obrazowania żeli DNA (patrz Tabela materiałów i odczynników). Alternatywne systemy obrazowania zdolne do generowania plików TIFF, takie jak aparaty cyfrowe lub aparaty w telefonach komórkowych, można dostosować w celu uzyskania odpowiednich obrazów. - Użyj programu domeny publicznej NIH Image J, aby określić ilościowo tunelowanie larw. Pobierz program ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Więcej informacji na temat programu można znaleźć na stronie http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html.
UWAGA: Inne systemy obrazowania mogą być używane do ilościowego oznaczania tunelowania. Poniższe instrukcje dotyczą obrazu NIH J. - Po otwarciu obrazu pliku tiff płytki tunelowej, użyj narzędzia Owal, aby zdefiniować obszar do oceny ilościowej, który reprezentuje całą powierzchnię agaru, ale przycina plastikową krawędź płytki.
- Zastosuj automatyczny próg, aby uzyskać odwrócony obraz płyty, z tunelami wyświetlanymi jako czarne linie. Użyj narzędzi Próbnik kolorów i Pędzel, aby wybielić wszelkie czarne obszary, które reprezentują uszkodzenie agaru, a nie tunele.
- W menu rozwijanym Analizuj wybierz pozycję Ustaw skalę | Kliknij, aby usunąć skalę, a następnie w oknie Ustaw miary (również w obszarze Analizuj) zaznacz opcję Obszar i Ogranicz do progu.
- Naciśnij Cntrl + M, aby wyświetlić obszar (tunele) w pikselach.
- Skopiuj i wklej wartość piksela dla każdej płyty do programu arkusza kalkulacyjnego (takiego jak Excel), który umożliwi analizę ilościową.
- Centralny otwór jest zwykle poszerzany z powodu intensywnego drążenia tuneli w tym regionie. Aby określić ilościowo brakujące tunelowanie, odznacz opcję "Ogranicz do progu" i użyj narzędzia Różdżka, aby zdefiniować centralny otwór. Naciśnij Cntrl + M, aby uzyskać wartość pikseli tego obszaru. Odejmij od tej wartości wartość pikseli otworu o średnicy 1,5 cm i dodaj różnicę do wartości tunelowania uzyskanej w kroku 5.6.
- W przypadku niektórych płytek w centralnym otworze może brakować kawałka tunelizowanego agaru, który zawiera obszar nietunelizowanego agaru przylegający do otworu. Podczas określania ilościowego środkowego otworu dla tych płyt należy użyć narzędzi Próbnik kolorów i Pędzel malarski, aby dodać pasek w poprzek brakującego obszaru, aby zdefiniować obszar tunelowany i wykluczyć obszar nietunelowany z oceny ilościowej.
Uwaga 1: Jeżeli doświadczalne larwy przeprowadzają jakiekolwiek tunelowanie, ta ocena ilościowa pozwala na obliczenie średnich wartości tunelowania dla zestawów płytek oraz statystyczne porównanie wartości kontrolnych i doświadczalnych.
Wyniki
Aby zademonstrować wartość tego testu, wykorzystaliśmy go do zbadania potencjalnej hipoksji u larw z upośledzoną funkcją genu uninflatable (uif) w tchawicach. uif koduje duże białko transbłonowe, które jest silnie eksponowane na powierzchni apikalnej komórek tchawicowych larw. Wcześniej zauważono, że mutanty uif wykazują aberracyjne zachowania, które mogły wskazywać na hipoksję tkanek spowodowaną dysfunkcją tchawic 9. Specyficznie wyciszyliśmy ekspresję uif w tchawicach larwalnych przy użyciu systemu Gal4-UAS. Wykorzystano dwie linie Gal4: i) breathless (btl)-Gal4, która jest silnie eksponowana w tchawicach od początku ich rozwoju embrionalnego oraz ii) cut(ue)-Gal4, w której ekspresja rozpoczyna się w niewielkim tylnym regionie głównych grzbietowych pni tchawic pod koniec embriogenezy i utrzymuje się w tym regionie przez cały okres życia larwy 7. Linia UAS-uif RNAi została pozyskana z Vienna Drosophila Research Center (VDRC ID #1050).
Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, dla każdego z czterech krzyżowań przygotowano pięć powtórzeń płytek z nowo wyklutymi larwami pierwszego stadium rozwojowego w następujący sposób.
Eksperyment 1
1) Kontrola 1 - cut(ue)-Gal4 x Canton-S (+)
2) Próba 1 - cut(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Eksperyment 2
3) Kontrola 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+)
4) Grupa doświadczalna 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Zachowanie larw cut(ue)-Gal4>UAS-uif RNAi z Eksperymentu 1 było porównywalne z zachowaniem zwierząt kontrolnych cut(ue)-Gal4> + pod względem kopania w pożywce, drążenia tuneli i przeżywalności do stadium poczwarki (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, obniżenie ekspresji uif w całym układzie tchawkowym od wczesnego etapu rozwoju (Eksperyment 2) wywołało wyraźnie odmienne reakcje. Larwy btl-Gal4>UAS-uif RNAi wykazywały obie behawioralne manifestacje hipoksji tkanek – zmniejszone kopanie w pożywce oraz całkowity brak drążenia tuneli w podłożu w późniejszym okresie życia larwalnego (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Larwy eksperymentalne były również zauważalnie mniejsze, cieńsze i bardziej ociężałe niż grupa kontrolna (Rysunek 3) oraz wykazywały wysoką śmiertelność w trakcie trwania testu. Jak omówiono powyżej, zahamowany wzrost, ociężałość i śmierć organizmu są znanymi objawami hipoksji larwalnej. Ponadto większość larw eksperymentalnych nie podjęła próby przejścia w stadium poczwarki i pozostała w stadium trzeciego zaskóczenia długo po tym, jak larwy kontrolne się przepoczwarkowały. Niektóre larwy przeżyły ponad 15 dni, zanim ostatecznie zdechły bez przejścia w stadium poczwarki (Rysunek 1A). Nieliczne larwy eksperymentalne próbowały się przepoczwarkować, lecz we wszystkich przypadkach powstały nieprawidłowe poczwarki, z których nie wykluły się żywotne osobniki dorosłe.
Rysunek 1. Ilościowe określenie wgryzania się w pożywkę i rozwoju larwalnego.
(A) Procent żywych larw poza kopcami pożywki dla czterech badanych genotypów. Przedstawiono średnie dla pięciu płytek testowych użytych dla każdego genotypu. Do 3. dnia po wykluciu ~70% larw btl-Gal4>UAS uif RNAi znajdowało się poza pożywką, podczas gdy dla pozostałych trzech genotypów nie stwierdzono żadnych larw poza pożywką ani na powierzchni agaru. Larwy btl-Gal4>UAS uif RNAi giną powoli między 4. a 20. dniem, przy czym ~15% z nich pozostaje żywych 15 dni po wykluciu. Czarna strzałka wzdłuż osi x tutaj oraz w (B) wskazuje dzień, do którego wszystkie larwy trzech pozostałych genotypów przepoczwarzyły się.
(B) Procent martwych larw widocznych poza pożywką dla czterech genotypów. Przedstawiono średnie dla pięciu płytek testowych dla każdego genotypu. Martwe larwy btl-Gal4>UAS uif RNAi gromadzą się w czasie, przy czym większość ginie poza pożywką. Pozostałe genotypy przeżywają do stadium poczwarki
(C) Procent przeżywalności do stadium poczwarki dla czterech badanych genotypów. Przedstawiono średnie dla pięciu płytek testowych dla każdego genotypu. Nie wytworzono żadnych prawidłowych poczwarek genotypu btl-Gal4>UAS uif RNAi. Słupki błędów na całym rysunku reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Ilościowe określenie drążenia tuneli przez larwy.
(A) Przykłady płytek testowych dla wszystkich czterech badanych genotypów po przygotowaniu do ilościowej analizy tunelowania. Zauważalny jest całkowity brak tunelowania u larw btl-Gal4>UAS uif RNAi. Płytki testowe to szalki Petriego o średnicy 10 cm.
(B) Ilościowe określenie tunelowania uzyskane za pomocą programu Image J dla czterech genotypów. Średnie wartości pikseli dla pięciu płytek testowych dla każdego genotypu. U larw btl-Gal4>UAS uif RNAi nie zaobserwowano tunelowania. Słupki błędu = SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3. Porównanie larw btl-Gal4>UAS uif RNAi oraz btl-Gal4> +
Larwy w podobnym wieku (6. dzień po wykluciu) dla genotypów btl-Gal4>UAS uif RNAi (A) oraz btl-Gal4> + (B). Czerwone strzałki wskazują grzbietowe tchawki pnia. Obie larwy przedstawiono w tym samym powiększeniu. Pasek skali = 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przedstawiliśmy tutaj prosty test przeznaczony do wykrywania niedotlenienia tkanek u larw D. melanogaster . Rozpoznanie opiera się na zmniejszonym zakopywaniu się w kopcach pokarmowych we wczesnym okresie życia larwalnego i braku drążenia tuneli pod koniec życia larw. Stłoczenie larw może powodować przedwczesną migrację z dala od źródła pożywienia, a zatem jednym z krytycznych aspektów testu jest to, że niewielka liczba larw jest testowana w obecności dużego nadmiaru pokarmu. Włączenie fungicydu metylo-p benzoesanu hydroksylowego (Nipagen) do płytek agarowych jest również niezbędne, aby zapobiec rozwojowi pleśni podczas testu.
Stwierdzamy, że płytki agarowe mogą być źródłem zmienności w teście. Zazwyczaj larwy o tym samym genotypie, z różnych partii rodziców lub z różnych kolekcji larw, wykazują stosunkowo ograniczoną zmienność w swoim zachowaniu w teście. W przeciwieństwie do tego, płytki agarowe wykonane w różnych dniach lub z różnymi partiami agaru mogą dawać różnice w tunelowaniu. Jednym z warunków jest zatem, że wszystkie larwy kontrolne i doświadczalne powinny być badane przy użyciu płytek agarowych z tej samej partii. Agar od różnych producentów, a nawet przesyłki od tego samego producenta mogą różnić się siłą żelowania, dlatego może być konieczne dostosowanie stężenia agaru w górę z 2,2% użytych tutaj, aby uzyskać optymalny żel. Odkryliśmy, że larwy typu dzikiego mogą łatwo zakopać się w 3% żelach agarowych.
Aby zademonstrować wartość tego testu, wykorzystaliśmy go do zbadania potencjalnego niedotlenienia tkanek u larw z stłumioną funkcją nienadmuchiwania tchawicy. Nasze odkrycia stanowią silne wsparcie dla hipotezy, że utrata ekspresji tego genu w tchawicy może powodować niedotlenienie: larwy RNAi btl-Gal4 >UAS-uif wykazały niezdolność do zakopywania się w pożywieniu i całkowity brak tunelowania podłoża podczas trzeciego stadium rozwojowego. W naszych wcześniejszych badaniach innych genotypów zaobserwowaliśmy, że utrata pożywienia spowodowana niedotlenieniem nie jest tak pełna, jak utrata tunelowania podłoża, a badane tutaj larwy RNAi btl-Gal4>UAS-uif zachowywały się podobnie. Nieudany komponent tunelowy tego testu stanowi zatem najsilniejsze wskazanie na niedotlenienie.
Chociaż larwy btl-Gal4>uif RNAi wykazywały cechy behawioralne diagnostyczne niedotlenienia, cut(ue)-Gal4>UAS-uif RNAi nie wykazywały tych nieprawidłowości. Czynniki btl i cut(ue) Gal4 ulegają ekspresji na różnych etapach i w różnych wzorcach w tchawicy larwalnej. Sterownik btl-Gal4 ulega ekspresji w całym układzie tchawicy, począwszy od jego rozwoju w embriogenezie i będzie kontynuowany przez życie larwalne. W przeciwieństwie do tego, ekspresja Gal4 z czynnika nacięcia(ue)-Gal4 rozpoczyna się dopiero pod koniec życia embrionalnego, po morfogenezie tchawicy i jest ograniczona do skrajnych tylnych odcinków pni grzbietowych, głównych naczyń podłużnych układu tchawicy. knockdown uif z tą linią Gal4 może zatem nie zmniejszać ekspresji UIF wystarczająco wcześnie lub wystarczająco szeroko, aby wytworzyć pewien progowy poziom niedotlenienia wymagany do wyzwolenia zachowań mierzonych w tym teście.
Wcześniejsze badanie wykazało, że larwy w trzecim stadium rozwojowym wystawione na niski (10%) poziom tlenu wykazują zmniejszony wzrost i opóźniony początek poczwarzenia 14. Badane tutaj larwy RNAi btl-Gal4>UAS-uif rozwinęły się do trzeciego stadium rozwojowego, ale wpływ na ich wzrost i tempo przepoczwarzenia był wyraźniejszy: były znacznie mniejsze niż w grupie kontrolnej z bardzo małą ilością tkanki tłuszczowej pod naskórkiem (ryc. 3) i tylko niewielka część (~10%) podjęła próbę przepoczwarzenia. Różnice te sugerują, że larwy RNAi btl-Gal4>UAS-uif doświadczyły większego stopnia niedotlenienia, albo dlatego, że knockdown uif w tchawicy był obecny przez całe ich życie larwalne, albo dlatego, że powodowało to poważniejszy niedobór tlenu w trzecim stadium rozwojowym. W tym momencie nie jest jasne, w jaki sposób utrata funkcji uif w tchawicy może uniemożliwić transport tlenu. Tchawice larw RNAi > UAS-uif były łatwo widoczne przez naskórek (ryc. 3), co wskazuje, że zawierały powietrze i nie były uszkodzone do tego stopnia, aby wnikanie płynu upośledzało funkcję. Formalnie możliwe jest zatem, że uszkodzenie tchawicy powstałe w wyniku utraty funkcji uif nie wywołuje niedotlenienia, ale raczej inny defekt, który hamuje tunelowanie. Dla badanych wcześniej genotypów ustaliliśmy, że niepowodzenie tunelowania wiąże się z podwyższonym poziomem mRNALDH 7, kanonicznego wskaźnika glikolizy i niedotlenienia u larw 15 w późnym trzecim stadium rozwojowym. Tak więc ostateczne potwierdzenie niedotlenienia larw RNAi btl-Gal4>UAS-uif (i larw badanych w przyszłym zastosowaniu tego testu) wymagałoby RT-PCR do oceny poziomów mRNA LDH lub użycia dostępnego na rynku wskaźnika do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu tlenu (na przykład patrz 16).
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Karen M. Qiang została laureatką nagrody George J. Schroepfer Research Award na Uniwersytecie Rice w 2016 roku. Fanli Zhou jest stypendystką Teaching Fellowship na Uniwersytecie Rice. Z wdzięcznością wyrażamy uznanie dla usług Bloomington Drosophila Stock Center, Harvard TRiP facility, Vienna Drosophila Resource Center.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| Drożdże odwodnione | |||
| Mrożony koncentrat soku winogronowego | Welch's | Dostępne w większości dużych supermarketów | |
| Lodowaty kwas octowy | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Metylo-para-hydroksybenzoesan | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml zlewki | |||
| Jednorazowe szalki Petriego 6,0 cm | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm jednorazowe plastikowe szalki Petriego | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Mikroszpatułki plastikowe | Corning Incorporated | 3012 | |
| Wygięta igła do drażnienia | Nasco | S08848MH | |
| Mikroskop | Dowolny mikroskop z 10-30X Powiększenie |
Bibliografia
- O'Farrell, P. H. Conserved responses to oxygen deprivation. J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).
- Lavista-Llanos, S., et al. Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar. Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).
- Reiling, J. H., Hafen, E. The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster. Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).
- Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates. J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).
- Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective. Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).
- Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade. Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).
- Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae. PLOS ONE. 11, e0160233(2016).
- Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster. Cell. 98 (1), 105-114 (1999).
- Zhang, L., Ward, R. E. Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster. Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).
- Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster. J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).
- Morton, D. B. Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae. Fly. 5 (2), 119-125 (2011).
- Brand, A., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).
- Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster. J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).
- Li, Y., et al. Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster. PLoS genetics. 9 (1), e1003230(2013).
- Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark. Scient. Rep. 5 (9061), (2015).
Przedruki i uprawnienia
