Obiektywny i powtarzalny test uczenia się węchu i dyskryminacji u myszy

Summary

Tutaj szkolimy myszy w zadaniu uczenia asocjacyjnego, aby przetestować rozróżnianie zapachów. Protokół ten pozwala również na badania nad zmianami strukturalnymi w mózgu wywołanymi uczeniem się.

Abstract

Węch jest dominującą modalnością sensoryczną u myszy i wpływa na wiele ważnych zachowań, w tym poszukiwanie pożywienia, wykrywanie drapieżników, kojarzenie się i rodzicielstwo. Co ważne, myszy można wyszkolić w zakresie kojarzenia nowych zapachów z określonymi reakcjami behawioralnymi, aby zapewnić wgląd w funkcję obwodu węchowego. Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę szkolenia myszy w zadaniu uczenia operacyjnego Go/No-Go. W tym podejściu myszy są szkolone w setkach zautomatyzowanych prób dziennie przez 2-4 tygodnie, a następnie mogą być testowane na nowych parach zapachów Go/No-Go w celu oceny dyskryminacji węchowej lub mogą być wykorzystane do badań nad tym, jak uczenie się zapachu zmienia strukturę lub funkcję obwodu węchowego. Dodatkowo, mysia opuszka węchowa (OB) charakteryzuje się ciągłą integracją neuronów urodzonych w wieku dorosłym. Co ciekawe, uczenie się węchowe zwiększa zarówno przeżywalność, jak i połączenia synaptyczne tych neuronów urodzonych w wieku dorosłym. Dlatego protokół ten można łączyć z innymi technikami biochemicznymi, elektrofizjologicznymi i obrazowania w celu zbadania czynników zależnych od uczenia się i aktywności, które pośredniczą w przetrwaniu i plastyczności neuronów.

Introduction

Mysi OB, gdzie informacja o zapachu najpierw dostaje się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), stanowi doskonały model do badania zmian strukturalnych zależnych od doświadczenia. Układ OB stale integruje neurony urodzone w wieku dorosłym w sposób zależny od aktywności. Prekursory neuronów urodzone u dorosłych oddzielają się od progenitorów, które wyściełają strefę podkomorową przylegającą do komór bocznych¹. Po migracji do OB, te neuronalne prekursory albo przeżywają, różnicują się i integrują jako hamujące komórki ziarniste, albo ulegają apoptozie². Na selekcję pod kątem losu komórki ma wpływ aktywność węchowa, w tym uczenie węchowe^3,4,5,6. Po integracji, w komórkach ziarnistych zachodzą zmiany synaptyczne wywołane uczeniem się w ciągu dwutygodniowego okresu krytycznego^7,8. W związku z tym testy uczenia się węchowego są przydatne do zbadania, w jaki sposób plastyczność zależna od doświadczenia wpływa na strukturalną i funkcjonalną reorganizację dojrzałego obwodu mózgu.

Ten protokół oferuje jedno podejście do treningu węchowego za pomocą paradygmatu warunkowania instrumentalnego. W tym zadaniu myszy pozbawione wody są szkolone w kojarzeniu jednego zapachu (zapachu "Go") z nagrodą w postaci wody, a innego zapachu (zapachu "No-Go") z karą przekroczenia limitu czasu próby. Myszy przechodzą przez stopniowaną serię faz treningu w ciągu 2-4 tygodni. Po zakończeniu treningu myszy reagują na zapach Go lub No-Go dyskretnymi, odpowiadającymi im zachowaniami (szukanie nagrody w postaci wody w próbach Go i nie szukanie nagrody w postaci wody w próbach No-Go) (Rysunek 1A). Po zakończeniu treningu myszy mogą być dalej poddawane próbom chemicznie podobnych par zapachów, aby przetestować dyskryminację lub zostać przeniesione do badań sprawdzających, w jaki sposób uczenie się węchu zmienia strukturę lub funkcję OB. Chociaż zadania związane z dyskryminacją zapachów zostały już wcześniej opisane, większość z nich opiera się na pomiarach subiektywnych, takich jak liczba wąchanych zapachów między dwoma substancjami zapachowymi^9,10. Co więcej, konieczność ludzkiego oceniania takich zadań jest również czasochłonna. Zadanie uczenia się węchu Go/No-Go opisane w tym protokole oferuje bezstronny, bezpośredni pomiar dyskryminacji zapachów i uczenia się węchu.

Protocol

Wszystkie myszy były używane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee zgodnie ze standardami NIH. Myszy użyte w tym protokole były wszystkimi dorosłymi myszami (w wieku >6 tygodni) na tle C57BL6/j i obejmowały zarówno samce, jak i samice. Po zadaniach treningowych/etapowych myszy wracają do swojej klatki domowej.

1. Budowa i ogólne zasady korzystania z Operant Learning Box (Rysunek 1B, C)

1. Zmontuj komorę myszy z podłogą komory. Trzymaj boks treningowy w słabo oświetlonym miejscu o małym natężeniu ruchu, aby uniknąć rozpraszania uwagi.
2. Wywierć każdy port wodny z małym otworem na górze, aby igła o rozmiarze 18 mogła dozować wodę do portu.
3. Napełnij szklaną fiolkę środkiem zapachowym rozpuszczonym w oleju mineralnym (wymienianym co tydzień) i mocno dokręć nakrętkę.
4. Podłącz igłę o rozmiarze 18 do silikonowej rurki. Przebić szklaną nasadkę fiolki igłą o rozmiarze 18 i podłączyć drugi koniec silikonowej rurki do wlotu portów zapachowych.
5. Umieść każdą silikonową rurkę w zaworze zapachowym.
6. Podłącz przewód podciśnieniowy do portów zapachowych.
7. Podłączyć dwie strzykawki o pojemności 10 ml do metalowego pręta mocującego i podłączyć rurkę do strzykawek. Podłącz drugą stronę rurki do igły 18 G. Włóż igłę do wywierconego otworu w otworze nośnym w komorze myszy. Podłącz drugi koniec rurki do zaworu wody.
8. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 10 ml wodą do picia dla gryzoni.
9. Podłączyć przepływomierz powietrza do wlotu powietrza i utrzymywać przepływ powietrza na poziomie 3–5 l/min.
10. Podłącz 2 zawory wodne, 2 zawory zapachowe, 2 porty wodne, port zapachowy i zasilanie do systemu interfejsu USB. Podłącz wszystkie zawory do portów "Wyjście", wszystkie porty zapachowe i wodne do portów "Wejściowych". Podłącz wszystkie urządzenia do wyjść zasilania ze skrzynki interfejsu USB, a na koniec podłącz skrzynkę interfejsu USB do zasilania.
11. Dostosuj ssanie próżniowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego zapachów między próbami.
12. Użyj rurki specyficznej dla zapachu, aby podłączyć fiolki z nazapachem do komory.

2. Przygotowanie myszy: 1–3 dni

1. Podziel myszy na 3 grupy: kontrolne (bez konieczności treningu węchowego), pseudo-wyszkolone (myszy, które losowo otrzymują nagrodę lub karę) i grupy wyszkolone. Wystaw pseudo-wyszkolone myszy na pudełko treningowe i dostarczanie zapachu, ale nie zapewniaj treningu węchowego, ponieważ wynik nagrody i kary jest losowo powiązany z dostarczonym zapachem.
   UWAGA: Grupa pseudo-wyszkolona przejdzie przez paradygmat treningowy w ramach etapów "Pseudotreningu". Wytrenowane myszy ukończą wszystkie etapy treningu. Pseudotrening jest opcjonalny, jeśli celem eksperymentu jest zbadanie różnic behawioralnych w dyskryminacji zapachu lub uczeniu się. Przedstawiony tutaj protokół dodaje tę grupę, jeśli eksperymentator chce zbadać różnice neuronalne przed i po treningu. Pseudowyszkolona grupa kontrolowałaby następnie pasywną ekspozycję na zapach i trening niezwiązany z węchem.
2. Rozpocznij ograniczenie wody u myszy do 40 ml / kg / dzień. Unikaj utraty masy ciała większej niż 20% wyjściowej masy ciała zwierząt, aby uniknąć stresu (Rysunek 2A).
3. Waż myszy codziennie, aby upewnić się, że przekraczają 80% masy wyjściowej. Jeśli mysz spadnie poniżej tego progu, wyjmij ją z badania i zapewnij swobodny dostęp do wody.
4. Utrzymuj wszystkie czynniki środowiskowe na stałym poziomie w całym protokole, w tym temperaturę, hałas i zapachy zabłąkane (w tym zapachy ciała osobistego i perfum/wody kolońskiej/dezodorantu).
   UWAGA: Podobnie jak w przypadku wszystkich testów zachowania zwierząt, niewielkie zmiany środowiskowe mogą znacznie wpłynąć na wyniki.

3. Instrukcje dla wszystkich etapów

1. Oprogramowanie do trenowania kodu dla każdego z poniższych etapów. Uruchom oprogramowanie na oprogramowaniu behawioralnym.
   UWAGA: Kodowanie dla wszystkich etapów jest zawarte w dodatkowych plikach kodowania. Dane dla 20 ścieżek są grupowane jako pojedynczy blok, a wydajność myszy jest wyświetlana między blokami. Ponadto każdy etap może być powtarzany na myszy przez określoną liczbę dni, aż zostaną spełnione kryteria ukończenia.
2. Nie trzymaj myszy w pudełku behawioralnym dłużej niż 60 minut dziennie.
3. Oczyść odchody myszy z klatki przed przeniesieniem każdej myszy do klatki. Spryskaj i przetrzyj komorę 70% etanolem, aby zminimalizować rozpraszanie zapachu myszy.

4. Etap szkolenia 1: Kojarzenie nagrody wodnej z centralnym szturchnięciem nosem, 1–3 dni

1. Na tym etapie skojarz myszy z nagrodą wodną po eksploracji portu wodnego.
2. Instrukcje programowania Training Stage 1
   1. Zaprogramuj ten etap tak, aby korzystał tylko z portu doprowadzającego wodę. Niech mysz otrzyma nagrodę w postaci wody za każde szturchnięcie nosa.
      UWAGA: Program wyświetli czas trwania próby i całkowitą liczbę nagród w postaci wody, które otrzymała mysz.
3. Ustaw programowanie pseudoszkolenia Etap 1 tak samo jak Etap szkolenia 1.
4. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Skonfiguruj pole zachowania z portem wodnym pośrodku i bez dostępu do wszystkich portów bocznych. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 1.
5. Uważaj ten etap za zakończony, gdy mysz wykona 100 prób w ciągu 60 minut. Wyjmij mysz z komory po 60 minutach lub 100 zakończonych próbach (Rysunek 2B).
   UWAGA: Ze względu na indywidualne różnice niektóre myszy w naturalny sposób powstrzymują się od eksploracji pudełka.
6. Jeśli potrzebna jest zachęta, ręcznie wlej wodę do portu wodnego. Powtarzaj ten etap do 3 dni.
   UWAGA: Myszy, które są już wyszkolone, można powtarzać dalej, aby utrzymać parzystość i utrzymać je na ograniczeniu płynów. Możliwe jest również awansowanie całej grupy do etapu 2, gdy średnia grupa osiągnie 100 prób/60 minut. Pozwoli to wszystkim myszom kontynuować trening tego samego dnia.

5. Etap szkolenia 2: Kojarzenie nagrody w postaci wody z bocznego portu z centralnym szturchnięciem nosa portu, 1–5 dni

1. Na tym etapie pozwól myszom wsadzić nos w środkowy port, a następnie natychmiast otrzymaj nagrodę w postaci wody w bocznych portach.
2. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Skonfiguruj ten i każdy kolejny etap z 2 portami wodnymi po bokach i portem zapachowym pośrodku. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 2.
3. Instrukcje programowania Training Stage 2
   1. Zapewnij myszy natychmiastową nagrodę w postaci wody po obu stronach po tym, jak nos wbije się w środkowy port dostarczania zapachów. Ustaw parametry wyjściowe dla tego etapu, takie jak czas trwania próby, liczba zainicjowanych prób i liczba nagród w postaci wody otrzymanych w ciągu 5 sekund od szturchnięcia nosem.
4. Ustaw programowanie pseudoszkolenia Etap 2 tak samo jak Etap szkolenia 2.
5. Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut wykona się co najmniej 40 prób, a co najmniej 25% nagród wodnych otrzyma się w ciągu 5 sekund od środkowego szturchnięcia nosa portu. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu (Rysunek 2C).
   UWAGA: Program szkoleniowy oblicza procent otrzymanych nagród wodnych w odpowiednim czasie, aby określić zakończenie tego etapu. Chociaż myszy różnią się szybkością ukończenia tego etapu, większość myszy osiągnie kryteria ukończenia w ciągu 5 dni. Jeśli jednak mysz nie ukończyła tego etapu w ciągu 5 dni, nie przechodź do następnego etapu. Ta mysz zostanie usunięta z kohorty.

6. Etap szkolenia 3: Kojarzenie nagrody wodnej z określonym zapachem i w określonym oknie czasowym, 1–3 dni

1. Na tym etapie pozwól myszom otrzymać zapach Go (S+) po szturchnięciu nosa w środkowym porcie. Następnie daj nagrodę w postaci wody po wbiciu nosa w boczne otwory wodne w ciągu 5 sekund.
2. Instrukcje programowania Training Stage 3
   1. Dostarcz zapach S+ do środkowego portu zapachowego.
   2. Dostarcz nagrodę w postaci wody, jeśli mysz przesunie boczne porty w ciągu 5 sekund od dostarczenia zapachu.
      UWAGA: Program rozpoczyna się od wymagania jedynie szturchnięcia nosa w środkowy port na 100 ms, aby uzyskać nagrodę w postaci wody. Gdy mysz szturchnie środkowy port przez odpowiednią ilość czasu w 80% prób, czas trwania szturchnięcia nosem wymagany do otrzymania nagrody w wodzie wydłuży się o 50 ms do 400 ms.
   3. Ustaw parametry wyjściowe identyczne jak w etapie 2.
3. Ustaw instrukcje programowania pseudoszkolenia Etap 3 tak samo, jak Etap szkolenia 3. Nie należy jednak podłączać zapachu S+ do kontrolera dostarczania zapachów, aby upewnić się, że zapach S+ nie jest związany z nagrodą za wodę.
4. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Ustaw tę samą konfigurację w kroku 2.
   2. Podłącz zapach S+ do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 3. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu.
5. Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut pojawi się więcej niż 60 nagród (Rysunek 2D).

7. Etap 4A: Kojarzenie zapachu zakazu (S-) z karą za przerwę, 1-2 dni

1. Na tym etapie wprowadź myszy w zapach No-Go (S-). Zapewnij karę przerwy dla myszy, które nieprawidłowo podchodzą do portów wodnych po wyczuciu zapachu no-go.
2. Szkolenie Etap 4A instrukcje programowania
   1. Na początku dostarczaj tylko nawaniacz S+ na tym etapie, identycznie jak w etapie 3. Po tym, jak myszy ukończą 40 prób, rozpocznij losowe dostarczanie zapachów, które obejmują zarówno zapachy S+, jak i S-. Zaprogramuj 2-sekundową karę przekroczenia limitu czasu, jeśli mysz spróbuje szukać nagrody w postaci wody po tym, jak zostanie jej przedstawiony zapach No-Go.
      UWAGA: Aby pomóc w rozróżnieniu Go i No-Go, bocznymi światłami IR można manipulować tak, aby były włączone podczas zapachów Go i wyłączone podczas zapachów No-Go. Światła działają jako drugorzędna wskazówka, aby pomóc myszom w początkowym treningu. Gdy myszy zostaną przeszkolone ze światłami, powinny przejść trening bez świateł, aby potwierdzić, że nauczyły się zadania z zapachami.
   2. Ustaw parametry wyjściowe, takie jak czas trwania próby, liczba zainicjowanych prób, liczba ukończonych prób, % poprawnych i łączna liczba otrzymanych nagród.
3. Ustaw instrukcje programowania pseudotreningu Etapu 4A tak samo, jak w Etapie Szkolenia 4S, z wyjątkiem zapachów S+ i S- wyświetlanych losowo od samego początku. Przyznawaj losowo nagrody za wodę lub kary za przerwę w grze, niezależnie od wykonania zadania.
4. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Ustaw konfigurację pudełka tak samo, jak w poprzednim kroku 3.
   2. Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 4A. Po tym, jak myszy ukończą 40 prób, przełącz program tak, aby losowo dostarczał zapachy. Usuń mysz po zakończeniu tego etapu.
5. Etap ten należy uznać za zakończony, gdy przeprowadzono 40 badań, w których > 60% poprawnych odpowiedzi.

8. Etap 4B: Kojarzenie zapachu zakazu wstępu (S-) z karą za przerwę, 5–11 dni

1. Szkolenie Etap 4B instrukcje programowania
   1. Spraw, aby ten etap był identyczny z etapem 4A, jednak kara za przekroczenie limitu czasu za próbę nagrody w wodzie po S-zapachu wynosi 4 s.
2. Ustaw instrukcje programowania pseudotreningu na etapie 4B identycznie jak w etapie 4A, jednak nagroda wodna i kara za przerwę są dostarczane losowo na próbę.
3. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Ustaw konfigurację skrzynki taką samą jak w poprzednim etapie 4A.
   2. Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage 4B. Uznaj ten etap za zakończony, gdy w ciągu 60 minut zostanie przeprowadzonych >100 prób z dokładnością >85% (Rysunek 2E)
4. Monitoruj maksymalną i minimalną wartość procentową poprawną dla każdej sesji, aby śledzić postępy każdej myszy na tym etapie. Około 85-90% myszy osiąga kryteria ukończenia tego etapu. Wyklucz myszy, które nie ukończą tego etapu, do fazy testowania Go/No-Go.
5. (Opcjonalnie) Pod koniec tego etapu zastosuj trening odwrócenia, w którym substancje zapachowe Go/No-Go są przełączane na platformie fiolki z zapachem. Upewnij się, że myszy nie kojarzą się z innym bodźcem, takim jak dźwięk zaworów związanych z bocznymi portami.

9. Zadanie testowe Go/No-Go: 1 dzień, 20 minut na mysz dziennie

1. Potraktuj to jako ostatni etap określania dokładności identyfikacji skojarzeń zapachowych i uczenia się rozróżniania par zapachów.
   UWAGA: Nowatorskie substancje zapachowe są wykorzystywane do S+/S- w celu sprawdzenia, ile czasu zajmuje zwierzętom nauczenie się nowych skojarzeń. Strukturalnie podobne pary odorantów są używane w celu zwiększenia trudności zadania. Przykłady obejmują 1-butanol kontra 1-pentanol, octan izoamylu kontra maślan izoamylu i + karwon kontra - karwon.
2. Instrukcje programowania
   1. Pozwól oprogramowaniu treningowemu wykryć długość szturchnięcia nosa. Zaprogramuj 300 ms szturchnięcie nosa w środkowym porcie zapachowym, aby wykonać zadanie.
   2. Ustaw parametry wyjściowe identyczne jak stage 4B, z wyjątkiem tego, że nie używaj żadnych wskazówek świetlnych.
3. Konfiguracja pudełka i konfiguracja myszy
   1. Ustaw konfigurację pudełka taką samą jak w poprzednim etapie 4B.
   2. Podłącz zarówno S+, jak i S- odor do kontrolera dostarczania zapachów. Umieść mysz w komorze. Zamknij komorę myszy i rozpocznij program Stage Go/No-Go. Wystaw myszy, które nauczyły się zadania uczenia węchowego, na nowe pary chemicznie podobnych zapachów.
      UWAGA: Myszy typu dzikiego z odpowiednią dyskryminacją zapachu osiągają >85% dokładności z nowymi substancjami zapachowymi po około 10-20 blokach lub 200-400 próbach (Rysunek 3A).

Results

Gdy myszy nauczą się zadania uczenia węchu, mogą teraz kojarzyć nowe pary zapachów z nagrodą i karą. Te wyszkolone myszy zwykle rozpoczynają z około 50% dokładnością w zadaniu Go/No-Go. Procent poprawności można wykreślić za pomocą bloku próbnego jako krzywą uczenia się dla nowych par zapachów (Rysunek 3A). W ciągu 10 prób blokowych, które większości myszy zajmuje mniej niż 30 minut, myszy są w stanie prawidłowo rozróżnić zapachy z dokładnością większą...

Discussion

Układ węchowy gryzoni stanowi unikalny model do badania plastyczności zależnej od sensoryki. Tutaj przedstawiamy paradygmat uczenia się węchowego, aby wyszkolić myszy w kojarzeniu par zapachów z nagrodą lub karą. Dzięki temu zadaniu uczenia się, dalsze zmiany w obwodach mogą być badane w kolejnych eksperymentach (elektrofizjologia, obrazowanie neuronów in vivo itp.). Po zakończeniu myszy nauczą się wykonywać proste zadanie związane ze wskazówkami zapachowymi, aby skojarzyć nagrodę w postaci wody z jedny...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szklana fiolka	Qorpak	GLC-01016
Rurka silikonowa	Thermo Scientific	86000030
18 igieł	BD	305196
1-butanol	Sigma Aldrich	437603
Komora dla myszy	Med Associates	ENV-307W
Podłoga komory	Med Associates	ENV-307W-GFW
Port wodny	Med Associates	ENV-313W	Potrzebujesz dwóch
bodźców zapachowych	Med Associates	ENV-275	Zawierają 2 zawory do dostarczania zapachów bramy
Odor Port	Med Associates	ENV-375W-NPP
USB Interface	Med Associates	DIG-703A-USB
Komputer stacjonarny z systemem Windows 2000, XP, Vista lub 7
Przepływomierz	VWR	97004-952
Oprogramowanie behawioralne	Med Associates	SOF-735	To oprogramowanie, które uruchamia każdy etap szkolenia, zostało teraz zastąpione przez Oprogramowanie do przesyłania danych Med-PC V
	Med Associates	SOF-731	To oprogramowanie formatuje dane do
oprogramowania szkoleniowego	Med Associates	DIG-703A-USB	To oprogramowanie służy do programowania każdego etapu szkolenia
Zawór wodny	Neptune Research	225P012-11	Ten zawór służy do zasuwy dopływu wody. Potrzebujesz dwóch
zaworów zapachowych	Neptune Research	360P012-42	Ten zawór służy do zasuwania dostarczania zapachów. Potrzebujesz dwojga