Artykuł metodologiczny

Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57170

⸱

10 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Genome Institute, Department of Energy, 3Joint BioEnergy Institute, 4Department of Environmental Science Policy and Management, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje szczegółowe protokoły do produkcji urządzeń ekosystemowych (EcoFAB), które umożliwiają badania roślin i interakcji roślina-mikroorganizm w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Streszczenie

Korzystne interakcje między roślinami a mikroorganizmami oferują zrównoważone rozwiązanie biologiczne z potencjałem do zwiększenia niskonakładowej produkcji żywności i bioenergii. Lepsze mechanistyczne zrozumienie tych złożonych interakcji między roślinami a mikroorganizmami będzie miało kluczowe znaczenie dla poprawy produkcji roślinnej, a także dla przeprowadzenia podstawowych badań ekologicznych badających interakcje roślina-gleba-mikroorganizmy. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy opis wytwarzania ekosystemów, przy użyciu powszechnie dostępnych technologii druku 3D, w celu stworzenia kontrolowanych siedlisk laboratoryjnych (EcoFAB) do mechanistycznych badań interakcji roślina-mikroorganizm w określonych warunkach środowiskowych. Opisano dwa rozmiary EcoFAB, które nadają się do badania interakcji mikrobiologicznych z różnymi gatunkami roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon i Panicum virgatum. Te urządzenia przepływowe pozwalają na kontrolowaną manipulację i pobieranie próbek mikrobiomów korzeni, chemii korzeni, a także obrazowanie morfologii korzeni i lokalizacji drobnoustrojów. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat utrzymywania sterylnych warunków wewnątrz EcoFAB i montażu niezależnych systemów oświetlenia LED na EcoFAB. Opisano szczegółowe metody dodawania różnych form pożywek, w tym gleb, piasku i płynnych pożywek wzrostowych w połączeniu z charakterystyką tych systemów za pomocą obrazowania i metabolomiki. Razem systemy te umożliwiają dynamiczne i szczegółowe badanie konsorcjów roślinnych i roślinno-mikrobiologicznych, w tym manipulowanie składem mikrobiomu (w tym mutantów), monitorowanie wzrostu roślin, morfologii korzeni, składu wysięku i lokalizacji mikrobiologicznej w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Przewidujemy, że te szczegółowe protokoły posłużą jako ważny punkt wyjścia dla innych badaczy, najlepiej pomagając w tworzeniu ustandaryzowanych systemów eksperymentalnych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami.

Wprowadzenie

Zastosowanie pożytecznych mikroorganizmów roślinnych w rolnictwie oferuje ogromny potencjał do zwiększenia zrównoważonej produkcji żywności i biopaliw, aby zapewnić rosnącą populację1,2,3,4. Znaczna ilość pracy potwierdza znaczenie mikrobiomów roślinnych w pobieraniu składników odżywczych przez rośliny, tolerancji na stres i odporności na choroby5,6,7,8. Trudno jest jednak zbadać te mechanizmy interakcji roślina-mikroorganizm w ekosystemach terenowych ze względu na złożoność i związaną z tym niepowtarzalność oraz niemożność precyzyjnego kontrolowania składu mikrobiomu i genetyki (np. przy użyciu mutantów mikrobiologicznych)4,9,10.

Jedną ze strategii jest konstruowanie uproszczonych ekosystemów modelowych, aby umożliwić kontrolowane, replikowane eksperymenty laboratoryjne badające interakcje między roślinami a mikroorganizmami w celu generowania spostrzeżeń, które mogą być dalej testowane w terenie10,11,12. Koncepcja ta opiera się na tradycyjnych podejściach wykorzystujących rośliny uprawiane w doniczkach wypełnionych glebą lub na płytach agarowych w szklarniach lub inkubatorach13. Chociaż prawdopodobnie pozostaną one najpowszechniej stosowanymi podejściami, brakuje im możliwości precyzyjnego monitorowania i manipulowania środowiskiem wzrostu roślin. W związku z tym rizoboxy i ryzotrony stanowią znaczne ulepszenie zdolności do badania procesów zachodzących pod ziemią14,15, a także opublikowano pierwsze protokoły analizy metabolitów ryzosfery w glebie16. Niedawno, aby umożliwić analizę o wysokiej przepustowości, zaawansowane urządzenia mikroprzepływowe13,17, takie jak Plant Chip18,19, RootArray20 i RootChip21, zostały opracowane jako wydajne narzędzia do fenotypowania roślin z rozdzielczością przestrzenną w skali mikrometra do monitorowania wczesnych etapów wzrostu małej rośliny modelowej Arabidopsis Thaliana w podłożu przepływającym ciecz. Niedawno opisano dwuwarstwową platformę obrazowania, która umożliwia obrazowanie włośnika pospolitego Arabidopsis thaliana na etapie siewki za pomocą platformy mikroprzepływowej22.

Tutaj znajdują się szczegółowe protokoły budowy kontrolowanych urządzeń laboratoryjnych (EcoFAB), do badania interakcji mikroorganizmów roślinnych i pokazują, że mogą być używane do badania różnych roślin, w tym Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, ekologicznie ważnego dzikiego owsa Avena barbata i rośliny bioenergetycznej Panicum virgatum (Rózga rózgowata). EcoFAB to sterylna platforma do uprawy roślin, która składa się z dwóch podstawowych elementów: urządzenia EcoFAB i sterylnego przezroczystego pojemnika wielkości rośliny. Urządzenie EcoFAB jest wykonane w procesie produkcyjnym polidimetylosiloksanu (PDMS), który polega na odlewaniu warstw PDMS z wydrukowanej w 3D plastikowej formy i sklejaniu warstw PDMS na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu wcześniej opisanych metod24,25. Szczegółowe procedury przepływu pracy EcoFAB, takie jak produkcja urządzenia, sterylizacja, kiełkowanie nasion, przesadzanie sadzonek, inokulacja/kouprawa drobnoustrojów, przygotowanie próbki i analiza, są opisane w tym protokole (Rysunek 1). Opisano dalsze modyfikacje podstawowego przepływu pracy, w tym instalację sterowanych komputerowo lamp LED do uprawy i wykorzystanie stałych podłoży. Opisano wykorzystanie technik obrazowania do badania zmian morfologii korzeni, kolonizacji mikrobiologicznej korzeni oraz obrazowania spektroskopowego mas wysięków korzeniowych. Przewidujemy, że prosty, niedrogi projekt oparty na łatwo dostępnych materiałach, a także przedstawione tutaj szczegółowe protokoły, zamienią platformę EcoFAB w zasób społecznościowy, standaryzujący laboratoryjne badania mikrobiomu roślinnego.

Protokół

Uwaga: Ten protokół obejmuje używanie niebezpiecznych substancji chemicznych, ostrych przedmiotów, urządzeń elektrycznych, gorących przedmiotów i innych zagrożeń, które mogą spowodować obrażenia. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (środki ochrony indywidualnej, np. rękawice odporne chemicznie, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny, długie ubrania, buty z zakrytymi palcami itp.) oraz przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa (szkolenie w zakresie bezpieczeństwa, stosowanie dygestorium itp.).

1. Produkcja urządzeń EcoFAB: Odlewanie warstw PDMS (Rysunek 2 & Rysunek 3)

  1. Zbuduj formy EcoFAB przy użyciu technik druku 3D (pliki projektowe są dostępne pod adresem . Każda forma składa się z trzech części: ramy odlewniczej, wyróżnionej podstawy formy i wkładki, jak pokazano na Rysunek 2. Wydrukuj podstawę formy i włóż ze sztywnych, nieprzezroczystych fotopolimerów za pomocą drukarki 3D z tworzywa sztucznego. Wykorzystaj rozdzielczość co najmniej 100 μm i wydrukuj ramę odlewu za pomocą akrylonitrylu butadienu i styrenu (ABS).
  2. Wymieszaj 40 ml bazy elastomeru siloksanowego z utwardzaczem w jednorazowym pojemniku o pojemności 1 l. W zależności od pożądanego eksperymentu (kroki 2.1 i 2.2) należy stosować różne proporcje (v/v) bazy elastomerowej/utwardzacza (5:1, 15:1 lub 30:1). Przejdź do kroków od 1.3 do 1.8 dla wszystkich rodzajów mieszanin.
    Ostrzeżenie: Nosić rękawice odporne chemicznie, okulary ochronne i inne środki ochrony indywidualnej.
  3. Umieścić pojemnik w komorze próżniowej na co najmniej 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z mieszaniny elastomerów.
  4. Wlej mieszaninę do zmontowanej plastikowej formy wydrukowanej w 3D ( Rysunek 3A) i trzymaj formę na bloku grzewczym w temperaturze 85 °C przez 4 godziny (Rysunek 3B).
    Ostrzeżenie: Nosić środki ochrony indywidualnej, aby uniknąć oparzeń.
  5. Pozostaw formę do ostygnięcia przez 5 minut. Następnie delikatnie wyciągnij wkładkę z formy (Rysunek 3C), a następnie powoli włóż nóż uniwersalny między ramę odlewu a PDMS (zestaloną mieszaninę elastomerów), aby je rozdzielić ( Rysunek 2D).
  6. Wyciśnij podstawę formy z PDMS z ramy odlewu ( Rysunek 3E). Za pomocą noża lub innych narzędzi delikatnie oddziel warstwę PDMS od podstawy formy na krawędziach (Rysunek 3F), a następnie powoli oderwij ją od powierzchni formy (Rysunek 3G).
  7. Utwórz kanały wlotowe i wylotowe na warstwach PDMS, wykonując otwory ~1,6 mm dla portów wlotowych i wylotowych za pomocą igły o rozmiarze 15 (Rysunek 3H, I).
    UWAGA: Standardowa forma ma port wlotowy i wylotowy, podczas gdy forma z szerokim wylotem potrzebuje tylko portu wlotowego (Rysunek 3H, I).
  8. Użyj nożyczek, aby przyciąć krawędzie warstw PDMS.
    UWAGA: Przycięte warstwy PDMS powinny mieć wymiary ≥76 mm x 51 mm dla małych urządzeń EcoFAB oraz ≥102 mm x 83 mm dla dużych urządzeń EcoFAB.

2. Produkcja urządzeń EcoFAB: Chemiczne mocowanie warstw PDMS do szkiełek mikroskopowych (Rysunek 3 & Rysunek 4)

  1. Trwałe łączenie warstw PDMS ze szkiełkami mikroskopowymi
    1. Przepłukać stronę wiążącą warstwy PDMS (wykonanej z mieszaniny elastomeru 15:1 z utwardzaczem) i szkiełko mikroskopowe 7,6 × 5 cm metanolem, a następnie wysuszyć sprężonym powietrzem lub pistoletem do ultraczystego azotu.
      Uwaga: Metanol jest toksyczny. Pracuj pod wyciągiem i noś ochronną osłonę oczu, rękawice i inne środki ochrony osobistej.
    2. Umieść szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS w czyszczarce plazmowej stronami łączącymi skierowanymi do góry (Rysunek 3J). Jeśli myjka plazmowa nie jest dostępna, przejdź do kroku 2.2.
    3. Zamknij komorę i zawór odpowietrzający gaz myjki plazmowej, a następnie włącz podciśnienie i pompuj komorę w dół na 1 min.
    4. Włącz zasilanie generatora plazmy i przełącz poziom częstotliwości radiowej (RF) na "HI" na 1 minutę.
    5. Wyłącz zarówno pompę próżniową, jak i zasilanie plazmy, a następnie odpowietrz komorę do atmosfery.
    6. Wyjmij szkiełko mikroskopowe i warstwę PDMS z komory plazmowej i szybko dociśnij wszystkie cztery krawędzie warstwy PDMS do szkiełka z równomiernym naciskiem (Rysunek 3L). Upewnij się, że środkowy owalny obszar warstwy PDMS (komora korzeniowa) nie dotyka szkiełka.
    7. Umieść szczelne urządzenie EcoFAB na bloku grzewczym o temperaturze 120 °C na 20 minut, aby dodatkowo zabezpieczyć trwałe połączenie między warstwą PDMS a szkiełkiem mikroskopowym.
    8. Pozostaw urządzenie do ostygnięcia przez 5 minut. Odetnij nożem dodatkowe krawędzie warstwy PDMS.
  2. Odwracalne fizyczne uszczelnienie warstw PDMS do szkiełek mikroskopowych
    1. Technika odwracalnego uszczelniania wykorzystuje zestaw niestandardowych zacisków (wydrukowanych na plastikowej drukarce 3D lub obrobionych w metalu, rysunki są pokazane w Rysunek 4).
      1. Umieść szkiełko mikroskopowe w wycięciu na dolnej płytce zaciskowej, a następnie wyrównaj warstwę PDMS (wykonaną z bazy elastomerowej 5:1 z mieszaniną utwardzacza) na wierzchu szkiełka.
      2. Umieść górną płytkę zaciskową na warstwie PDMS. Zabezpiecz górną i dolną płytę razem za pomocą czterech z sześciokątnym, ustawiając tak, aby nakrętki były nakręcone od góry clamp.
    2. Przyklejanie PDMS bezpośrednio do szkiełek mikroskopowych
      1. Umieść warstwę PDMS (wykonaną z mieszanki elastomeru 30:1 z utwardzaczem) na szkiełku mikroskopowym.
      2. Dociśnij warstwę PDMS do slajdu. Miękka, bardzo przyczepna warstwa PDMS (30:1) powinna przylegać do szkiełka, tworząc wodoodporne uszczelnienie bez trwałego wiązania chemicznego lub fizycznego dociskania z zacisku (Rysunek 3L).

3. Sterylizacja EcoFABów

  1. Opłucz urządzenia EcoFAB ultraczystą wodą.
  2. Umieść jedno urządzenie EcoFAB w pojemniku EcoFAB i dodawaj 70% etanolu, aż urządzenie zostanie zanurzone. Zamknij pokrywę pojemnika i delikatnie potrząśnij, aby zwilżyć wszystkie powierzchnie wewnątrz etanolem. Upewnij się, że komora wzrostu korzeni urządzenia EcoFAB jest wypełniona etanolem, z bardzo małą ilością pęcherzyków powietrza lub bez pęcherzyków powietrza.
  3. Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odlać 70% etanolu i powtórzyć inkubację ze 100% etanolem przez 5 min.
  4. Odcedź etanol i inkubuj wysterylizowany EcoFAB przez 16 godzin w okapie z przepływem laminarnym, aby całkowicie go wysuszyć. Jeśli to możliwe, wysterylizuj system, włączając światło UV w okapie na 1 godz.
    Ostrzeżenie: Podczas pracy z lampami UV należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
  5. Przechowuj wysterylizowane EcoFABy w sterylnym kapturze lub autoklawowanych workach do wykorzystania w przyszłości.

4. EcoFABy z oświetleniem LED do uprawy (Rysunek 5)

  1. Mocowanie taśm LED do pojemników EcoFAB
    1. Zaznacz miejsca na pojemniku EcoFAB na 9 klipsów LED. Zacznij od pierwszego klipsa 120 mm w górę od dołu kontenera wzdłuż krawędzi (Rysunek 5A) i przejdź do wyznaczania miejsc klipów w spirali wokół kontenera, przy czym każdy następny klip spada o 10 mm. Spirala z 9 klipsami, która umożliwia dwukrotne owinięcie taśmy LED o długości 1 m wokół pojemnika.
    2. Przyklej na gorąco klips LED do każdej zaznaczonej pozycji, dodając dwie krople gorącego kleju na pojemnik, wyrównane z położeniem otworów montażowych klipsów. Wciśnij otwory na klipsy w te dwie krople kleju, a następnie dodaj kolejną odrobinę kleju na wierzch otworów. Powtarzaj procedurę dla wszystkich klipów, aż 9 klipów utworzy spiralę (Rysunek 5B).
      Ostrzeżenie: Podczas pracy z gorącym klejem należy nosić rękawice i inne środki ochrony osobistej, aby uniknąć oparzeń.
    3. Przeciągnij taśmę LED przez klipsy w kształcie spirali, tak aby diody LED były skierowane do pojemnika. Pasek powinien okrążyć go dwa razy (Rysunek 5C).
  2. Podłączanie taśm LED do zasilania za pomocą sterownika (Rysunek 5D przedstawia komorę EcoFAB z podświetlanymi światłami, programowanie sterownika opisano w kroku 4.3).
    Ostrzeżenie: Niebezpieczeństwo porażenia prądem: upewnij się, że zasilanie jest odłączone podczas podłączania przewodów.
    1. Podłącz dodatnie i ujemne zaciski zasilacza do zacisków "INPUT: V+" i "INPUT: V-" sterownika za pomocą 2-żyłowego (Rysunek 5E przedstawia schematyczny rysunek konfiguracji sterownika).
    2. Podłącz przewód ujemny od nieosłoniętego końca żeńskiego do nieizolowanego do jednego kanału "OUTPUT" w sterowniku.
      UWAGA: W sterowniku znajduje się pięć kanałów, które są wykorzystywane w tym protokole, dzięki czemu może on obsługiwać do pięciu taśm LED o długości 1 m.
    3. Podłącz wszystkie dodatnie przewody do kompaktowego złącza spawów (jeśli potrzebnych jest więcej niż jeden kanał), a następnie podłącz to złącze do zacisku "OUTPUT V+" sterownika.
    4. Podłącz każdą taśmę LED do żeńskiego końca, aby każda dioda LED miała swój własny kanał do sterowania. W razie potrzeby użyj żeńsko-męskich, aby zwiększyć zasięg.
  3. Zaprogramować sterownik na żądany cykl świetlny zgodnie z instrukcjami producenta,

5. Uprawa roślin w EcoFABach

  1. Sterylizacja i kiełkowanie nasion
    UWAGA: Sterylizacja nasion i wszystkie następujące po niej czynności z sadzonkami muszą być wykonywane w sterylnych warunkach. Opisany poniżej proces sterylizacji jest odpowiedni dla nasion Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyon i Panicum virgatum. Nasiona panicum virgatum należy zawiesić w 60% kwasie siarkowym na 1 godzinę przed procesem sterylizacji. Zaleca się przygotowanie 1-2 nasion na urządzenie EcoFAB, biorąc pod uwagę zdolność kiełkowania i jednorodność kiełkowania.
    1. Namocz nasiona w 70% etanolu przez 2 minuty.
    2. Usuń etanol pipetą i trzykrotnie opłucz nasiona sterylną wodą.
    3. Pozostaw nasiona w 10% roztworze wybielacza na 5 minut.
    4. Usuń roztwór wybielacza i dokładnie umyj nasiona sterylną wodą trzy razy.
    5. Dodać sterylną wodę do nasion i inkubować probówkę do mikrowirówki w lodówce o temperaturze 4 °C przez 7 dni.
    6. Równomiernie rozprowadzić nasiona na podłożu 0,5 Murashige & Skoog (MS) z 0,6% fitamelu i uszczelnić płytki taśmą z mikroporami.
    7. Wyhoduj rośliny do korzeni o długości około 5 mm w celu przeniesienia do EcoFABów (Rysunek 6A). W przedstawionych tutaj eksperymentach należy zastosować reżim oświetlenia 16 godzin światła/8 godzin ciemności w komorze wzrostowej o temperaturze 22 °C i inkubować rośliny 2 - 7 dni przed przeniesieniem do EcoFAB (2 dni dla Avena barbata i Brachypodium distachyon, 7 dni dla Arabidopsis thaliana i Panicum virgatum).
  2. Przenoszenie sadzonek do EcoFABów z płynnym podłożem (Rysunek 6)
    1. Za pomocą sterylnej strzykawki lub mikropipety przepłucz komorę korzeniową urządzenia EcoFAB sterylną wodą trzy razy, a następnie napełnij komorę korzeniową interesującym Cię podłożem wzrostowym, na przykład pożywką 0,5 MS (Rysunek 6B, krok 5.1.6).
    2. Ostrożnie włóż pojedynczą sadzonkę do zbiornika roślinnego urządzenia EcoFAB (Rysunek 6C).
      UWAGA: Korzeń powinien być całkowicie zanurzony w komorze korzeniowej, tak aby pęd wystawał ze zbiornika.
    3. Dodaj 3 ml sterylnej wody do pojemnika, unikając urządzenia EcoFAB. Zwiększy to wilgotność i zmniejszy parowanie podłoża z komory korzeniowej.
    4. Zamknij pojemnik i uszczelnij pokrywę taśmą z mikroporami (Rysunek 6D).
    5. Umieść EcoFAB w inkubatorze roślin lub wykorzystaj system oświetlenia EcoFAB w środowisku o kontrolowanej temperaturze, odpowiednim do wzrostu danej rośliny (krok 4). W tym badaniu ustaw komorę na 24 °C.
    6. Okresowo sprawdzaj EcoFAB, aby napełnić pożywkę wzrostową wewnątrz komory wzrostu korzeni i dodać wodę do pojemnika. Wszystkie czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.
      UWAGA: W przypadku wczesnych etapów wzrostu roślin konieczne jest napełnianie komory wzrostu korzeni co 5 do 7 dni. W późniejszych fazach wzrostu konieczne jest uzupełnianie co 2 do 3 dni. W razie potrzeby za pomocą strzykawki lub pipety zebrać roztwór wysięku korzeniowego z komór wzrostu korzeni do probówki mikrowirówkowej i przechowywać go w zamrażarce o temperaturze -80 °C; Zobrazuj również morfologię korzenia za pomocą obrazownika żelowego lub mikroskopu.
  3. Przenoszenie sadzonek do EcoFABów z twardymi podłożami
    1. Użyj komór korzeniowych wykonanych z mieszaniny 5:1 bazy elastomerowej i utwardzacza, jeśli używasz zestawu niestandardowych zacisków, aby przymocować je do szkiełka mikroskopowego (Rysunek 3K, Rysunek 4); lub wybierz warstwę PDMS wykonaną z mieszaniny bazy i utwardzacza w proporcji 30:1, jeśli warstwy PDMS przylegają bezpośrednio do szkiełek (jak opisano w kroku 2.2).
    2. Wysterylizuj komory EcoFAB zgodnie z opisem w kroku 3.
    3. Ostrożnie dodaj wysterylizowaną glebę/piasek do komory korzeniowej, odwróć warstwę PDMS do góry nogami i dodaj podłoże do komory korzeniowej. Unikaj opadania cząstek stałych na obszar, który będzie miał kontakt ze szkiełkiem mikroskopowym, ponieważ zmniejszy to przyczepność.
    4. Umieść szkiełko mikroskopowe na warstwie PDMS i mocno dociśnij wszystkie krawędzie. Ostrożnie obróć urządzenie EcoFAB tak, aby ziemia/piasek nie wypadł z otworu zbiornika.
      UWAGA: W przypadku urządzeń EcoFAB wykonanych z mieszaniny bazy i utwardzacza w proporcji 5:1 należy użyć niestandardowego zacisku do zabezpieczenia uszczelki.
    5. Przepuścić ciekłą pożywkę lub wodę przez kanał wlotowy lub wylotowy urządzenia EcoFAB i przenieść sadzonkę do zbiornika roślinnego, jak opisano w kroku 3.3.
  4. Dodawanie mikroorganizmów do EcoFABów
    1. Przenieś kolonię drobnoustrojów do probówki inkubacyjnej z 8 ml bulionu LB i wyhoduj ją do OD 0,5 (około 12 godzin).
    2. Przenieś roztwór hodowlany do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj go w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 3000 x g w celu osadzenia drobnoustrojów.
    3. Usunąć supernatant i dodać 8 ml pożywki dla roślin użytej w docelowym EcoFAB. Zawiesić osad drobnoustrojów i odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 3000 x g.
    4. Powtórzyć krok 5.4.3 dwukrotnie, aby całkowicie usunąć wszelkie ślady składników odżywczych LB.
    5. Dodaj pożywkę do wzrostu roślin do przemytego granulatu mikrobów, aż jego gęstość optyczna wyniesie około 0,5 przy 600 nm.
    6. Dodać 20 μl roztworu drobnoustroju do komory korzeniowej przez wylot EcoFAB. Szczepy użyte w tej publikacji dotarły do korzeni roślin w ciągu 2-3 dni i zaczęły kolonizować powierzchnię korzeni.
    7. W przypadku chemiluminescencji inżynieryjnej należy pamiętać o umieszczeniu induktora (1 mM IPTG) w pożywce dla wzrostu roślin, aby wywołać ekspresję lucyferazy.

6. Profilowanie metabolitów wysięków korzeniowych z EcoFAB

  1. Przygotowanie próbki do analizy metabolomicznej opartej na LC/MS
    1. Umieść probówki do mikrowirówek z wysiękami korzeniowymi zebranymi z EcoFAB w liofilizatorze i włącz liofilizator, aby usunąć całą wodę z probówek.
    2. Dodaj 300 μl metanolu klasy LC-MS do każdej probówki i poddaj sonifikacji przez 30 min.
      Uwaga: Podczas pracy z metanolem należy nosić środki ochrony indywidualnej.
    3. Umieścić probówki w wirówce i odwirowywać je przy 3000 x g przez 5 minut.
    4. Przenieść roztwory supernatantu do nowych probówek do mikrowirówek i odparować metanol w koncentratorze próżniowym.
    5. Dodać 150 μl metanolu z wewnętrznymi wzorcami LC-MS 1 mM do każdej probówki i inkubować probówki w lodówce o temperaturze 4 °C przez 12 godzin.
    6. Odwirować probówki o sile 3000 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do probówek filtracyjnych o wielkości 0,22 μm.
    7. Odwirować probówki filtracyjne i przenieść przefiltrowane roztwory do fiolek LC/MS o pojemności 2,0 ml z wkładkami o pojemności 200 μl.
    8. Umieścić fiolki w stojaku LC/MS i załadować stojak do automatycznego próbnika LC/MS.
  2. analiza danych
    1. Uzyskaj dostęp do Atlasu Metabolitów i niestandardowych skryptów Pythona26 lub skorzystaj z innego oprogramowania do analizy danych.
    2. Identyfikuj metabolity na podstawie wartości m/z, czasu retencji i wzorców fragmentacji związków przy użyciu biblioteki wzorców metabolitów. 27

7. Obrazowanie spektroskopowe mas korzeni roślin w EcoFAB (Rysunek 7)

UWAGA: Urządzenia EcoFAB wykonane z mieszanki elastomeru 5:1 do utwardzacza z niestandardowymi zaciskami (Rysunek 7A) są używane do tłoczenia korzeni na chipach spektrometrii mas inicjatora nanostruktur (NIMS), 28,29,30, ponieważ warstwy PDMS mogą być odwrotnie połączone z powierzchniami chipów NIMS.

  1. Sterylizuj powierzchnię chipa NIMS światłem UV przez 1 godzinę.
  2. Wybierz z inkubatora EcoFAB z rosnącą rośliną i umieść go w sterylnym kapturze.
  3. Otwórz pojemnik EcoFAB i zdejmij górną płytę clamp.
  4. Podnieś warstwę PDMS razem z rośliną w środku i ostrożnie przymocuj warstwę PDMS z rośliną do chipa NIMS ( Rysunek 7B, D, E).
    UWAGA: Gdy korzeń dotknie powierzchni chipa NIMS, nie należy go przesuwać. Zapobiega to "rozmazywaniu" metabolitów w korzeniach.
  5. Delikatnie dociśnij korzenie przez warstwę PDMS, aż korzenie całkowicie zetkną się z powierzchnią NIMS. Pozostaw korzenie na powierzchni NIMS na 20 minut.
  6. Zdejmij warstwę PDMS, w tym roślinę, z chipa NIMS, ponownie unikając przesuwania korzenia po powierzchni NIMS. W razie potrzeby przywróć roślinę do zacisku.
  7. Przymocuj chip NIMS do niestandardowej płytki MALDI i załaduj płytkę do spektrometru MALDI w celu obrazowania masowego (Rysunek 7C).
  8. Użyj programu OpenMSI, aby wygenerować obraz NIMS metabolitów korzeniowych (Rysunek 7D-G)31.

Wyniki

Każdy system EcoFAB składa się z urządzenia EcoFAB oraz przezroczystego plastikowego pojemnika o rozmiarze dostosowanym do rośliny. Jedno urządzenie EcoFAB posiada rezerwuar dla rośliny, komorę wzrostu korzeni, wlot przepływu o średnicy 1,6 mm oraz wylot o średnicy 1,6 mm w przypadku standardowego urządzenia EcoFAB (Rysunek 2D & Rycina 3H) lub wylot 10 mm dla urządzenia EcoFAB z szerokim wylotem (Rycina 2F & Rycina 3I). Zbiornik dla roślin ma kształt trapezu z otworem górnym o szerokości 6 mm i otworem dolnym o szerokości 3 mm; taka konstrukcja zmniejsza ryzyko wycieku przepływu podczas wtryskiwania cieczy, a także zapewnia wystarczającą przestrzeń do wzrostu rośliny. Komora wzrostu korzeni ma kształt owalny i głębokość 2 mm, aby dopasować się do systemów korzeniowych wielu roślin modelowych, co przedstawiono w Rysunek 2C i EZarówno kanał wlotowy, jak i wylotowy standardowego urządzenia EcoFAB można połączyć za pomocą rurek z PTFE, co umożliwia dopływ roztworów odżywczych do komory wzrostu korzeni bez konieczności otwierania pojemnika EcoFAB. Urządzenie EcoFAB z szerokim wylotem znacznie zmniejsza opór przepływu na wylocie i jest preferowane podczas hodowli roślin o grubych systemach korzeniowych lub w przypadku okresowego zbierania eksudatów korzeniowych po wykształceniu przez rośliny złożonych systemów korzeniowych.

Formy odlewnicze do wytwarzania warstw PDMS w urządzeniach EcoFAB są projektowane w oprogramowaniu do projektowania, a następnie drukowane w 3D z sztywnych, nieprzezroczystych fotopolimerów, jak pokazano na Rycini 2 i Rycini 3. Rośliny wewnątrz urządzeń EcoFAB mogą być bezpośrednio obserwowane pod mikroskopem z dużym dystansem roboczym, co zapewnia zachowanie sterylnego środowiska wzrostu (Rycina 8A, Plik uzupełniający 1). Urządzenia EcoFAB z roślinami mogą również zostać umieszczone na stoliku mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia obrazowanie oddziaływań między roślinami a mikroorganizmami z wyższą rozdzielczością (Rycina 8B, Plik uzupełniający 2). W tym środowisku nie jest zachowana sterylność, dlatego obrazowanie o wysokiej rozdzielczości nadaje się wyłącznie do pomiarów końcowych.

Układy EcoFAB zostały zaprojektowane w celu umożliwienia systematycznych badań roślin, takich jak ich morfologia, metabolizm i społeczności mikrobiologiczne na różnych etapach wzrostu w obrębie ich cykli życiowych. W niniejszej pracy sprawdzono przydatność EcoFAB jako ogólnej platformy do badania różnorodnych gatunków roślin. Rysunek 8C-E przedstawia 7-dniowe Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon oraz Panicum virgatum rosnące w układach EcoFAB. Stwierdzono, że wszystkie trzy gatunki roślin dobrze rosną w EcoFAB przez ponad miesiąc. Zarówno dwuliścienna Arabidopsis thaliana, jak i jednoliścienna Brachypodium distachyon dotrwały w układach EcoFAB do etapów reprodukcyjnych.

Odwracalny system uszczelniania umożliwia zastosowanie podłoży stałych (np. gleby) w EcoFABs (krok 2.2). To podejście do odwracalnego uszczelniania pozwala na umieszczenie podłoży stałych w komorach wzrostu korzeni, a także na pobieranie próbek ze specyficznych regionów ryzosfery korzeniowej. Rycina 8F-H przedstawia grupę 14-dniowych Brachypodium distachyon rosnących w medium hydroponicznym, a także w piasku i glebie uzupełnionych odpowiednio medium hydroponicznym (piasek) i wodą (gleba). Cienka warstwa podłoża stałego w komorach wzrostu korzeni pozwala na przenikanie światła, co umożliwia obrazowanie mikroskopowe systemów korzeniowych.

Morfologia korzenia jest definiowana jako konfiguracja przestrzenna i rozmieszczenie systemu korzeniowego rośliny i została uznana za istotną odpowiedź fizjologiczną na różnorodne środowiska wzrostu, takie jak dostępność składników odżywczych lub wody32,33,34. EcoFABs zapewniają wygodne podejście do badania morfologii roślin w czasie lub w różnych warunkach odżywczych. Rysunek 9A-F przedstawia przykład wykorzystania EcoFABs do śledzenia morfologii korzeni Brachypodium distachyon w ciągu pierwszych trzech tygodni. Siewka Brachypodium distachyon została przeniesiona do urządzenia EcoFAB, a struktura jej korzeni była rejestrowana przez kamerę wewnątrz obrazownika żeli BIO-RAD. Programy do przetwarzania obrazów, takie jak Image J, python i matlab, mogą być dalej stosowane do ilościowego określania zmian morfologii korzeni w czasie lub w różnych środowiskach pożywkowych. Kwantyfikacja całkowitej powierzchni korzeni w ciągu trzech tygodni wykazała stopniowy wzrost w fazie wczesnej (<1 tydzień), po którym nastąpił liniowy trend wzrostu do końca trzeciego tygodnia, jak pokazano na Rysunku 9G.

Główną motywacją do skonstruowania systemu EcoFAB jest badanie interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Jak opisano w kroku 5.4, mikroorganizmy są przenoszone do komór wzrostu korzeni urządzeń EcoFAB poprzez kanał wlotowy. Rysunek 10 pokazuje, że do systemów korzeniowych roślin w urządzeniu EcoFAB wprowadzono Pseudomonas simea (wcześniej fluorescens) WCS417 (WCS417), czyli ryzobakterie wspomagające wzrost roślin z etykietami chemiluminescencyjnymi, w stężeniu 106 komórek na roślinę. Sygnał WCS417 wykryto za pomocą obrazownika żeli, co wskazało na wyraźny rozkład przestrzenny mikroorganizmów WCS417 w komorach wzrostu korzeni. Zarówno w płynnej pożywce MS z dodatkiem stałego podłoża piaszczystego, jak i bez niego, mikroorganizmy WCS417 skolonizowały powierzchnie całych systemów korzeniowych, przy czym koncentrowały się wokół obszarów wierzchołków korzeni, co prawdopodobnie wynika z aktywnej produkcji składników odżywczych przez wierzchołki korzeni (Rysunek 10G&H)35. Z drugiej strony, mikroorganizmy WCS417 w podłożu glebowym gromadziły się wokół obszaru zbiornika rośliny, a nie w wierzchołkach korzeni (Rysunek 10I). Ponieważ mikroorganizmy wprowadzono przez kanał wylotowy, były one również w stanie przemieszczać się w podłożu glebowym, ale nie gromadziły się na korzeniach, co obserwowano w pożywce płynnej z piaskiem lub bez niego. Może to wskazywać, że gleba stanowi wystarczające źródło składników odżywczych, a mikroorganizmy migrowały do zbiornika rośliny w poszukiwaniu optymalnych warunków do oddychania.

W celu analizy profilu metabolitów wydzielin korzeniowych roślin, a także pobierania i uwalniania metabolitów w interakcjach roślina-mikrob, pobierano roztwory wydzielin z komór wzrostu korzeni na różnych etapach wzrostu roślin w EcoFABs. Zgodnie z opisem w kroku 6, próbki wydzielin są następnie ekstrahowane do analizy LC-MS. Zastosowanie tej metody pozwoliło na wykrycie szeregu metabolitów wydzielanych przez roślinę i konsumowanych przez mikroby; obecnie trwa badanie profilowania metabolitów wydzielin korzeniowych z kolonizacją mikrobów oraz bez niej.

Schemat konfiguracji kiełkowania dla EcoFAB, przenoszenie roślin, dodawanie drobnoustrojów, monitorowanie wzrostu korzeni.
Rysunek 1: Przepływ pracy w systemie EcoFAB. Rośliny są kiełkowane na płytce, a następnie przenoszone do wysterylizowanego systemu EcoFAB, do którego można dodać drobnoustroje. Pobieranie prób nieniszczących: można pobierać i obrazować wysięki korzeniowe oraz wizualizować morfologię korzeni. Pobieranie prób niszczących umożliwia szczegółową analizę parametrów drobnoustrojów, korzeni i pędów.

Schematy projektowe komponentów obudowy z wymiarami i szczegółami montażu.
Rysunek 2: Komponenty form drukowanych w technologii 3D do wytwarzania urządzenia EcoFAB. (A) Widoki z góry i pod kątem ramy odlewniczej. (B) Widoki z góry i pod kątem wkładki. (C) Widoki z góry i pod kątem standardowej podstawy formy. (E) Widoki z góry i pod kątem podstawy formy z szerokim wylotem. (D, F) Zmontowane formy do wytwarzania odpowiednio standardowych i szerokowylotowych urządzeń EcoFAB. Wymiary owalu wynoszą 51 mm x 34 mm dla małej formy EcoFAB oraz 76 mm x 62 mm dla dużej formy EcoFAB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Sekwencja wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego, obejmująca przygotowanie formy, odlewanie, utwardzanie i wyjmowanie z formy.
Rysunek 3: Wytwarzanie urządzenia EcoFAB. (A) Wlewanie mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza do formy. (B) Podgrzewanie formy z mieszaniną w temperaturze 85 °C przez 4 h. (C) Wyjmowanie wkładki z formy. (D) Oddzielanie PDMS od ramy odlewniczej. (E) Wypychanie podstawy formy z ramy odlewniczej. (F) Użycie noża do oddzielenia PDMS od formy wzdłuż krawędzi. (G) Powolne odklejanie warstwy PDMS od podstawy formy. (H) Wykonywanie otworów dla kanałów wlotowych i wylotowych w standardowej warstwie PDMS. (I) Wykonywanie otworu dla kanału wlotowego w warstwie PDMS z szerokim wylotem. (J) Warstwa PDMS (wykonana z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 15:1) oraz szkiełko przedmiotowe są płukane i przenoszone do urządzenia do czyszczenia plazmowego w celu połączenia. (K) Użycie zacisków do przymocowania warstwy PDMS (wykonanej z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 5:1) do szkiełka przedmiotowego. (L) Dociskanie warstwy PDMS (wykonanej z mieszaniny bazy elastomerowej i utwardzacza w stosunku 30:1) bezpośrednio do szkiełka przedmiotowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy formy do produkcji z specyfikacją wymiarową, widok z góry oraz widok izometryczny (A, B, C).
Rysunek 4: Projekt niestandardowych zacisków. (A) Widoki z góry i pod kątem górnej płyty zaciskowej. (B) Widoki z góry i pod kątem dolnej płyty zaciskowej. (C) Widoki z góry i pod kątem złożonego zacisku z czterema zestawami śrub imbusowych z łbem cylindrycznym. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Montaż kostki LED z wymiarami; konfiguracja oświetlenia; schemat zasilacza 24V; eksperyment z oświetleniem.
Rycina 5: Instalacja lamp LED do uprawy. (A) Wyznaczanie miejsc dla 9 uchwytów LED w spirali wokół pojemnika EcoFAB. (B) Uchwyty LED przymocowane do pojemnika EcoFAB. (C) Przewlekanie paska LED przez uchwyty. (D) Podłączenie paska LED do kontrolera zasilanego z zasilacza 24V. (E) Schemat połączeń przewodów z kontrolerem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment kiełkowania roślin z nasionami na agarze, zestaw z strzykawką, przenoszenie siewek, uszczelnianie pojemnika.
Rycina 6: Przenoszenie siewek do EcoFABs. (A) Rośliny Brachypodium distachyon hodowane przez 2 dni na płytce z podłożem 0,5 MS. (B) Wypełnianie komory korzeniowej podłożem do wzrostu roślin. (C) Użycie pęsety do ostrożnego wprowadzenia korzenia do zbiornika roślinnego. (D) Uszczelnianie pojemnika EcoFAB taśmą micropore po dodaniu 3 mL wody na dno pojemnika. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost roślin w układzie mikroprzepływowym; analiza za pomocą spektrometrii mas. Schemat przedstawiający dane m/z.
Rysunek 7: Obrazowanie NIMS korzeni roślin w EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon rosnący w sterylnym EcoFAB. (B) Mocowanie warstwy PDMS z rośliną na chipie NIMS przez 20 min. (C) Użycie taśmy miedzianej do przymocowania chipa NIMS do niestandardowej płytki MALDI i załadowanie go do spektrometru mas MALDI. (D-G) jedna 7-dniowa i jedna 20-dniowa roślina Brachypodium distachyon wykorzystana do obrazowania NIMS (D, E) oraz odpowiadające im obrazy NIMS (F, G). Dominujące jony zaznaczono kolorami czerwonym, zielonym i niebieskim. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment wzrostu roślin; układ hydroponiczny z kukurydzą; etapy kiełkowania nasion; rozwój korzeni.
Rysunek 8: Ogólne zastosowania EcoFABs. (A) Bezpośrednia rejestracja wzrostu korzeni Brachypodium distachyon w EcoFAB z wykorzystaniem mikroskopu z dużym dystansem roboczym. (B) Bezpośrednia obserwacja oddziaływań korzeń-mikrob z wykorzystaniem mikroskopu o wysokiej rozdzielczości. (C-E) 7-dniowe Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) oraz Panicum virgatum (E) w pożywce hydroponicznej 0.5 MS, (F-H) 14-dniowe Brachypodium distachyon hodowane w hydroponice 0.5 MS (F), w piasku (G) oraz w podłożu glebowym (H), dostarczanych odpowiednio pożywką 0.5 MS i wodą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Etapy wzrostu korzeni Brachypodium (A-F) i wykres zwiększającej się powierzchni (G), skala 1 cm, pokazujący wpływ wieku.
Rycina 9: Wykorzystanie EcoFABs do badania morfologii korzeni. (A-F) Rozwój korzeni Brachypodium distachyon rosnącego w EcoFABs wypełnionych pożywką 0.5 MS podczas pierwszych trzech tygodni: (A) 2 dni, (B) 4 dni, (C) 7 dni, (D) 11 dni, (E) 14 dni, (F) 21 dni wzrostu. (G) Średnie powierzchnie korzeni zostały oszacowane za pomocą oprogramowania ImageJ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu kiełkowania z etapami wzrostu nasion w kąpieli wodnej; analiza mikroskopowa rozwoju korzeni.
Rycina 10: Wykorzystanie EcoFABs do badania interakcji korzeń-mikrob. (A, B, C) Grupa 15-dniowych Brachypodium distachyon kolonizowanych przez Pseudomonas fluorescens WCS417 w różnych formach podłoża: ciekłym roztworze pożywki MS, piasku oraz gleby. (D, E, F) Zdjęcia w jasnym polu ich systemów korzeniowych. (G, H, I) Odpowiadające im obrazy chemiluminescencyjne tych systemów korzeniowych po 14 dniach współhodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1. Wykorzystanie systemu EcoFAB do rejestracji wzrostu korzeni. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Wykorzystanie EcoFAB do obrazowania oddziaływań między korzeniami a mikroorganizmami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły wykorzystania produkcji ekosystemów do tworzenia EcoFAB zapewniają zasoby społecznościowe do systematycznych badań biologii roślin w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Postępy w druku 3D zapewniają szeroko dostępne technologie konstruowania i iteracyjnego udoskonalania projektów EcoFAB. Stwierdzono, że przedstawiona tutaj komora korzeniowa dobrze nadaje się do obrazowania mikroskopowego i utrzymywania sterylności, umożliwiając kontrolowane dodawanie drobnoustrojów w celu zbadania interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Platforma EcoFAB jest kompatybilna z różnymi gatunkami roślin. Ważne jest, aby rozpoznać fizjologiczne skutki uprawy roślin w wąskiej komorze korzeniowej, tak że konieczne będą dodatkowe eksperymenty w celu uogólnienia wyników na rośliny rosnące w środowisku naturalnym.

Zastosowanie sterylnych komór i światła LED do uprawy umożliwia równoległe badanie wpływu różnych warunków oświetleniowych, w tym długości fali, intensywności i czasu trwania, na wzrost roślin i związane z nimi parametry fizjologiczne. Odwracalne komory korzeniowe pozwalają na stosowanie substratów stałych, a także na przestrzenne pobieranie próbek stałych do analizy biochemicznej i genetycznej. Zastosowania podłoży stałych, takich jak gleba, piasek i kulki kwarcowe, dają możliwości wykorzystania EcoFAB do budowy ekosystemów laboratoryjnych o bardziej ekologicznym znaczeniu. Jednak wszystkie przedstawione tutaj systemy wykorzystują nasycone ciecze (kultury hydroponiczne), które nie są dokładnym odzwierciedleniem większości gleb i ważne będzie dalsze udoskonalanie tych projektów, aby utrzymać kieszenie powietrzne w glebie, tak aby lepiej reprezentowały naturalne gleby.

Opisano użycie zarówno prostych kamer, jak i mikroskopów do obrazowania rozwoju morfologii systemu korzeniowego zarówno na poziomie masowym, jak i komórkowym. Ta przydatność do monitorowania morfologii korzeni, obrazowania i kwantyfikacji będzie prawdopodobnie pomocna w zrozumieniu mechanizmów regulacyjnych sygnałów fizjologicznych i molekularnych roślin wyzwalanych przez adaptacje genotypowe roślin do warunków wzrostu. Ograniczeniem w badaniu fizjologicznego rozwoju korzeni jest jednak obecne poziome rozmieszczenie urządzenia EcoFAB. W środowisku naturalnym reakcja grawitropowa korzeni prowadzi do przeważającego pionowego rozwoju systemu korzeniowego. W związku z tym prezentowany tutaj system poziomy prawdopodobnie różni się pod pewnymi względami od środowiska naturalnego, a wytworzenie systemów EcoFAB z pionowym umieszczeniem komory korzeniowej jest pożądanym celem dla przyszłych wersji EcoFAB. Mimo że obecne urządzenia EcoFAB są umieszczone poziomo, możliwa jest analiza parametrów morfologii korzeni w różnych warunkach lub w odpowiedzi na drobnoustroje. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości można zastosować do uchwycenia dynamiki kolonizacji korzeni pojedynczych izolatów lub zbiorowisk, dostarczając informacji o tym, które części roślin są skolonizowane w różnych warunkach wystarczającej i niedoboru składników odżywczych. Oczekuje się, że takie badania dostarczą ważnych nowych informacji na temat tego, w jaki sposób budowane są mikrobiomy roślin i jak ta dynamika zmienia się w czasie, na przykład w miarę rozwoju korzeni.

Urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają obrazowanie bardzo młodych roślin, a zwykle ilość pobranych metabolitów nie jest wystarczająca do analizy LCMS. Systemy glebowe, takie jak ryzotrony, umożliwiają obrazowanie morfologii korzeni, gdy rośliny są przekształcane za pomocą konstruktu chemiluminescencyjnego (Glo-root) lub metod opartych na NMR 33,34. Ekstrakcja metabolitów z tych układów jest czasochłonna ze względu na dużą objętość próbek. EcoFAB są połączeniem obu: produkcja jest podobna do urządzeń mikroprzepływowych. EcoFABy zostały zaprojektowane tak, aby były proste i niedrogie w rozmnażaniu, ale wielkość komory można dostosować do uprawy roślin o małych lub dużych systemach korzeniowych, aż do ich etapów reprodukcyjnych. Możliwe są jednoczesne obserwacje zmian morfologicznych korzeni i wysięku korzeniowego. System jest sterylny, co umożliwia kontrolowane dodawanie określonych drobnoustrojów.

EkoLAB zaprojektowano tak, aby umożliwić kontrolowane wprowadzanie i pobieranie próbek drobnoustrojów i metabolitów. W szczególności stwierdzono, że próbki pobrane z komór wzrostu korzeni są wystarczające do profilowania metabolitów metodą spektroskopii mas. Integracja obrazowania za pomocą spektrometrii mas (np. technika NIMS przedstawiona tutaj) zapewnia nieniszczące podejście do badania rozkładu przestrzennego metabolitów w systemach korzeniowych. Technika ta będzie prawdopodobnie pomocna w przyszłych eksperymentach ze śledzeniem stabilnych izotopów i mapowaniem lokalizacji drobnoustrojów do określonych metabolitów36. Chociaż protokół ten skupia się na pojedynczych izolatach, ten sam projekt z pewnością może być stosowany w przypadku bardziej złożonych społeczności. Objętości próbek i biomasa w ramach EcoFAB są prawdopodobnie więcej niż wystarczające do dalszej integracji z technologiami sekwencjonowania DNA, które będą ważne dla scharakteryzowania i monitorowania struktury społeczności drobnoustrojów i ekspresji genów.

Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami, z naciskiem na proste i dostępne metody, które mogą być łatwo wdrażane i rozszerzane przez naukowców na całym świecie. Obecne wysiłki mają na celu wykazanie odtwarzalności między laboratoriami i integracji systemu kontroli temperatury, tak aby każdy EcoFAB miał niezależnie kontrolowane światło i temperaturę. Kolejnym krokiem naprzód w rozwoju systemu będzie integracja automatycznego pobierania próbek i ponownego napełniania komór korzeniowych EcoFAB oraz opracowanie powtarzalnych protokołów tworzenia odpowiednich mikrobiomów roślin w ramach EcoFAB.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez program Laboratory Directed Research and Development (LDRD) Lawrence Berkeley National Laboratory, wspierany przez Biuro Nauki, Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy nr DE-AC02-05CH11231 oraz nagrodę DE-SC0014079 przyznaną przez Biuro Naukowe Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych dla Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley. Prace w Odlewni Molekularnej były wspierane w ramach umowy nr U.S. Department of Energy (U.S. Department of Energy). DE-AC02-05CH11231. Dziękujemy również Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjaminowi P. Bowenowi i Benjaminowi J. Cole'owi z Lawrence Berkeley National Laboratory za całą ich pomoc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukowane w 3D niestandardoweSTL formy LBNLdostępne tutaj www.eco-fab.org; Opisane tutaj formy EcoFABs zostały wydrukowane przez FATHOM: http://studiofathom.com
Dow sylgard 184 zestaw przezroczysty elastomeru silikonowegoEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0,5 KG
Spray do kurzu pneumatycznegoVWR75780-350każdy odkurzacz do sprężonego gazu powinien działać
igła o rozmiarze 15VWR89166-240
Strzykawka 5 ml z końcówką Luer-Lok VWRBD309646
3" x2" szkiełko mikroskopoweVWR48382-179
1,75" x 2,56" x 3,56" Pudełko EcoFABAmazonB005GAQ25Q
4" x 3 i frac14; ” Szkiełko mikroskopoweTed Pella260231
4,87 "x 4,87" x 5,50" Pudełko EcoFABAmazonB00P9QVOS2
Środek do czyszczenia plazmyHarrick PlasmaPDC-001
Drukowany w 3D niestandardowy zaciskLBNLPliki STL dostępne w laboratorium Trenta Northena
Sterylny kapturAirClean SystemsStacje robocze PCR serii AC600
Rurka strzykawki z PTFESigma-AldrichZ117315-1EA
EtanolVWR89125-172
Wybielacz
Murashige i Skoog (MS) Baza soli makroskładnikowychFitotechnologie LaboratoriaM502
Murashige i Skoog (MS) Baza soli mikroelementowychFitotechnologie LaboratoriaM554
GlebaHummert InternationalPro-Mix PGX
PhytagelSigma-Aldrich71010-52-1
Arabidopsis thalianaLehle SeedsWT-24 Col-4 Columbia dziki typ
Brachypodium distachyonLBNLStandardowa linia Bd-21Dostępne w laboratorium Johna Vogela
Panicum virgatumFundacja Szlachecka Samuela RobertsaTaśma mikroporowa Alamo switchgrass
VWR56222-182
Metanol klasy LC-MSVWRJT9830-3
LiofilizatorLABCONCOFreeZone 2.5 Plus
Koncentrator SpeedVACThermo ScientificSavant™ SPD111 Filtr odśrodkowy SpeedVac
Ultrafree-MC GV-0,22 i mikro; mMilliporeUFC30GV00
System chromatografii cieczowejAgilentAgilent 1290 LC system
Q Exactive spektrometr masowyThermo ScientificQ Exactive™ Hybrydowy układ Quadrupole-Orbitrap MS
NIMS i niestandardowa płytka MALDILBNLSzczegółowy protokół można znaleźć pod adresem: doi:10.1038/nprot.2008.110
Spektrometr masowy MALDIAB SciexTOF/TOF 5800 MALDI MS
Nanopowlekana taśma oświetleniowa LED do uprawyWorld LightingHH-SRB60F010-2835
ZasilaczLED World LightingMD45W24VA, LV100-24N-UNV-J
Kontroler TC420AmazonB0197U7R8Q
Silikonowe klipsy LEDAmazonB00N9X1GI0
Pistolet do klejenia na gorącoAmazonB006IY359K
połączeniowy LED żeński na goły LEDOświetlenie Świata LEDHH-F05
Przedłużacz złącza żeńskiego na męskiWorld LightingHH-MF1
20AWG 2-żyłowyLED World Lighting6102051TFT4
WAGO 221-415 ŁącznikLED World Lighting221-415
pliki LED LED łączenia

Bibliografia

  1. Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
  2. Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
  3. Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
  4. Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
  5. Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
  6. van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378(2016).
  7. Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
  8. Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
  9. Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
  10. Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
  11. Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
  12. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793(2017).
  13. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
  14. Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
  15. Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
  16. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  17. Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
  18. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
  19. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703(2011).
  20. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  21. Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  22. Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
  23. Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
  24. Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537(1999).
  25. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  26. Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
  27. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  28. Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
  29. Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
  30. Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
  31. Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
  32. López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
  33. Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
  34. Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597(2015).
  35. Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
  36. Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Technologia druku 3Dformowanie warstwy PDMSmetoda sterylizacji plazmowejobrazowanie komory korzeniowejkontrolowane warunki środowiskoweanaliza składu mikrobiomumonitorowanie wzrostu roślinmetody profilowania metabolitów
Protokoły wytwarzania ekosystemów (EcoFAB) do budowy ekosystemów laboratoryjnych przeznaczonych do badania interakcji między roślinami a mikroorganizmami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.