Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej języka i rekonstrukcja raka płaskonabłonkowego języka in vitro

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57235

⸱

20 czerwca 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Gene Engineering of the Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazana jest tutaj metoda przygotowania macierzy zewnątrzkomórkowej języka (TEM) z efektywną decelularyzacją. TEM może być stosowany jako funkcjonalne rusztowanie do rekonstrukcji modelu raka płaskonabłonkowego języka (TSCC) w warunkach hodowli statycznej lub z mieszaniem.

Streszczenie

W celu skonstruowania skutecznego i realistycznego modelu raka płaskonabłonkowego języka (TSCC) in vitro, stworzono metody wytwarzania bezkomórkowej matrycy językowej (TEM), która dostarcza funkcjonalnych rusztowań do budowy TSCC. TEM zapewnia niszę in vitro dla wzrostu, różnicowania i migracji komórek. Mikrostruktury natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i kompozycje biochemiczne zatrzymane w matrycy bezkomórkowej zapewniają specyficzne tkankowo nisze do zakotwiczenia komórek. Wytwarzanie TEM można osiągnąć poprzez trawienie dezoksyrybonukleazą (DNazę) w połączeniu z poważną organiczną lub nieorganiczną obróbką wstępną. Protokół ten jest łatwy w obsłudze i zapewnia wysoką wydajność decelularyzacji. TEM wykazał korzystną cytokompatybilność dla komórek TSCC w warunkach hodowli statycznej lub z mieszadłem, co umożliwia budowę modelu TSCC. Wykorzystano również samodzielnie wykonany bioreaktor do utrzymywania trwałych warunków mieszania w hodowli komórkowej. Zrekonstruowane TSCC za pomocą TEM wykazało charakterystykę i właściwości przypominające kliniczną histopatologię TSCC, co sugeruje potencjał w badaniach nad TSCC.

Wprowadzenie

Język pełni różne ważne funkcje, takie jak deglutyzacja, artykulacja i degustacja. Tak więc upośledzenie funkcji języka ma ogromny wpływ na jakość życia pacjentów1. Najczęstszym nowotworem złośliwym w jamie ustnej jest rak płaskonabłonkowy języka (TSCC), który zwykle występuje u osób pijących alkohol lub palących tytoń2.

W ostatnich latach osiągnięto niewielki postęp w podstawowych badaniach nad TSCC. Jednym z największych problemów pozostaje brak skutecznych modeli badań in vitro. W ten sposób macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) okazuje się potencjalnym rozwiązaniem. Ponieważ ECM jest złożoną ramą sieciową składającą się z wysoce zorganizowanych komponentów matrycy, materiały rusztowań o strukturze i składzie podobnym do ECM byłyby kompetentne do badań nad rakiem. Bezkomórkowy ECM może doskonale zapewnić niszę dla komórek tego samego pochodzenia in vitro, co okazuje się najważniejszą zaletą ECM.

ECM może być zachowany dzięki usunięciu składników komórkowych z tkanek poprzez decelularyzację za pomocą detergentów i enzymów. Różne składniki ECM, w tym kolagen, fibronektyna i laminina w matrycy bezkomórkowej, zapewniają natywne mikrośrodowisko podobne do tkanki dla hodowanych komórek, promując przeżycie, proliferację i różnicowanie komórek3. Co więcej, immunogenność do przeszczepu może być zredukowana do minimalnego poziomu przy braku składników komórkowych w ECM.

Do tej pory metody wytwarzania decelularyzowanego ECM były testowane w różnych tkankach i organach, takich jak heart4,5,6,7, liver8,9,10,11, lung12,13,14,15,16,17, and kidney18,19,20. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie znaleziono żadnych odpowiednich badań dotyczących podobnej pracy w języku.

W tym badaniu, zdecelularyzowana macierz zewnątrzkomórkowa języka (TEM) została wyprodukowana zarówno efektywnie, jak i tanio dzięki serii fizycznych, chemicznych i enzymatycznych zabiegów. Następnie TEM został wykorzystany do podsumowania TSCC in vitro, pokazując odpowiednią symulację zachowania i rozwoju TSCC. TEM ma dobrą biokompatybilność, a także zdolność do kierowania komórek do niszy specyficznej dla tkanki, co wskazuje, że TEM może mieć duży potencjał w badaniach TSCC3. Przedstawiony tutaj protokół stanowi wybór dla badaczy zajmujących się patogenezą lub terapiami klinicznymi TSCC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały wykonane zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt, wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, Uniwersytet Sun Yat-sen.

1. Przygotowanie TEM

  1. Wykonuj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i usuń języki za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety.
  2. Zanurz języki w 75% etanolu na 3 minuty, a następnie włóż każdy język do probówki Eppendorfa (EP) o pojemności 1,5 ml z 1 ml 10 mM sterylnego roztworu buforowanego fosforanem (PBS).
    UWAGA: Stężenie PBS we wszystkich kolejnych krokach jest takie samo jak stężenie w tym etapie.
  3. Liza komórek przez rozmrażanie i rozmrażanie: Zamrozić języki w probówkach EP w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, a następnie rozmrażać języki w temperaturze pokojowej przez 45 minut przez 3 cykle.
  4. Załaduj każdy język na kawałek szwu chirurgicznego za pomocą igły chirurgicznej i owiń koniec szwu małym kawałkiem sterylnej folii aluminiowej. Operację należy wykonać w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm zawierającym 75% etanolu w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Odpowiednia długość każdego kawałka szwu chirurgicznego to około 20 cm, a odpowiedni rozmiar każdego kawałka folii aluminiowej to około 0,3cm2 (1 cm × 0,3 cm). Język powinien być załadowany w pobliżu folii aluminiowej.
  5. Opłucz każdy język 3 ml sterylnego PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm przez 30 sekund. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
  6. Umyj języki ultraczystą wodą: Dodaj ampycylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnej ultraczystej wody do końcowego stężenia 90 μg/ml. Włóż języki do butelki zawierającej mieszadło. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Do tej samej butelki można włożyć do 5 języków ze względu na splatanie szwu. Folia aluminiowa znajduje się na końcu szwu w butelce, aby zapobiec zsuwaniu się języka. Języki należy umieścić na wysokości 2 cm od dna butelki, regulując długość szwu pozostałego wewnątrz butelki. Ta uwaga dotyczy również kroków 1.8, 1.10, 1.12 i 1.16.
  7. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 12 godzin.
  8. Umyj języki za pomocą NaCl: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 1 M NaCl do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
  9. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
  10. Liza komórek za pomocą Triton X-100: Dodaj ampycylinę do końcowego stężenia 90 μg/ml do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 2% Triton X-100 w PBS. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
  11. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 48 godzin.
  12. Umyj języki za pomocą CaCl2/MgCl2: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 5 mM CaCl2/MgCl2 do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
  13. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
  14. Trawienie przez DNazę: Dodaj 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do każdej probówki EP. Dodać odpowiednio DNazę do HBSS do końcowego stężenia 300 μM. Przesunąć każdy język do każdej probówki EP, tak aby część szwu znajdowała się na zewnątrz probówki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Upewnij się, że część szwu, która pozostaje wewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również wewnątrz rurki EP w tym kroku i upewnij się, że część szwu, która pozostaje na zewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również poza rurką EP w tym kroku.
  15. Inkubować języki w probówkach EP w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  16. Umyj języki za pomocą PBS: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego PBS do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
  17. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
  18. Przygotowany TEM należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja TSCC

  1. Statyczna budowa modelu TSCC
    1. Wysiewaj 1,0 x 106 pojedynczych komórek TSCC (Cal27) do naczynia hodowlanego o średnicy 3,5 cm. Dodać 3 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole/F12 (DF12) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 90 μg/ml ampicyliny i 90 μg/ml kanamycyny.
    2. Hodować komórki Cal27 w temperaturze 37 °C przez 2 do 3 dni. Upewnij się, że komórki pokrywają co najmniej 60% powierzchni dna naczynia.
    3. Załaduj TEM na monowarstwę Cal27 w naczyniu hodowlanym.
    4. Umieścić naczynie w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 28 dni.
    5. Pożywkę należy odświeżać codziennie podczas procesu hodowli komórkowej. Stężenie CO2 w inkubatorze wynosi 5%.
  2. Konstrukcja modelu TSCC z mieszadłem
    1. Przygotowanie samodzielnie wykonanego minibioreaktora z mieszadłem
      1. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 10 ml.
      2. Wykop otwór (średnica 1 cm) w pobliżu dolnego końca pręta i załaduj do niego mieszadło.
      3. Wykop otwór (średnica 0,5 cm) na środku nakrętki plastikowej butelki z szerokim otworem i przełóż tłoczysko przez nakrętkę.
      4. Przeciąć połowę probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyspawać ją po zewnętrznej stronie nakrętki butelki.
      5. Przymocuj haczyki na ryby do wędki, owijając wędkę żyłkami, które są przywiązane do haczyków.
        UWAGA: Do wędki można przymocować do 4 haczyków na ryby.
      6. Autoklaw samodzielnie wykonany kompleks przed użyciem.
        UWAGA: Nie sterylizuj w autoklawie plastikowej butelki z szeroką szyjką. Używaj nowej sterylnej plastikowej butelki z szerokim otworem podczas hodowli komórek.
  3. Dynamiczna hodowla komórkowa
    1. Zasiew 1,0 x 106 pojedynczych komórek Cal27 w samodzielnie wykonanym minibioreaktorze. Dodaj 150 ml pożywki DF12, która zawiera 10% FBS, 90 μg/ml ampycyliny i 90 μg/ml kanamycyny.
    2. Załaduj TEM do minibioreaktora za pomocą haczyków na ryby przymocowanych do pręta.
    3. Dokręć nakrętkę butelki i umieść minibioreaktor na mieszadle magnetycznym. Aktywować minibioreaktor przy 200 obr./min w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 7 do 14 dni.
      UWAGA: Stężenie CO2 w inkubatorze CO2 wynosi 5%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przygotowania TEM okazał się wydajny i odpowiedni. TEM wykazał doskonałą decelularyzację w porównaniu z natywnymi tkankami języka. Skuteczność decelularyzacji potwierdzono barwieniem hematoksyliną i eozyną (HE) (Rycina 1A-B). Wyniki barwienia HE ujawniły całkowite zaniknięcie barwienia jąder komórkowych w TEM (Rycina 1B). Ponadto ilościowe oznaczenie zawartości DNA w poprzednic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dobrze ugruntowany protokół wytwarzania bezkomórkowego ECM powinien zachować natywny skład ECM, jednocześnie usuwając składniki komórkowe w tkankach prawiecałkowicie 21. Pomimo obecnie zgłaszanych protokołów decelularyzacji, które wymagają perfuzji przez naczynia krwionośne w celu usunięcia materiałów komórkowych przez transport konwekcyjny, zastosowano tutaj mieszanie mechaniczne, znane jako tradycyjna prosta i tania metoda 22,23,24,25,26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie grantów badawczych z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31371390), Programu Państwowego Projektu Rozwoju Zaawansowanych Technologii (2014AA020702) oraz programu Nauki i Technologii Guangdong (2016B030231001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57-BL / 6JYat-sen University Laboratory Animal Center
EtanolGuangzhou Fabryka odczynników chemicznychHB15-GR-2.5L
Chlorek soduSangon Biotech A501218
Chlorek potasuSangon BiotechA100395
Dizasadowy fosforan soduGuangzhou Fabrykaodczynników chemicznychBE14-GR-500G
Fosforan potasu jednozasadowy Sangon BiotechA501211
1,5 ml probówka EPAxygenMCT-150-A
 Thermo Fisher Scientific
3,5 cm naczynie do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific153066
6 cm naczynie do hodowli komórkowychGreiner628160
Triton X-100Sigma-AldrichV900502
Chlorek wapniaSigma-Aldrich746495
Chlorek magnezuSigma-Aldrich449164
DNaseSigma-AldrichD5025
Siarczan magnezuSangon BiotechA601988
GlukozaSigma-Aldrich158968
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761
AmpicylinaSigma-AldrichA9393
KanamycynaSigma-AldrichPHR1487
Szew chirurgicznyShanghai Jinhuan
250 ml butelka z szerokim otworemSHUNIU1407
Mieszadło magnetyczneAS ONE1-4602-32
Inkubator CO2SHEL LABSCO5A
10 ml ProbówkaHunan Pingan
50 mlGreiner227270
Chińska Akademia Nauk Cal27, BankLinia komórkowa raka płaskonabłonkowego języka
Komórka U2OSChińska Akademia Nauk, BankLinia komórkowa kostniakomięsaka ludzkiego
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Pirogronian soduSigma-AldrichP5280
Hepes wolny kwasBBI
Hydroklon FBSSH30084.03
4 ° C lodówkaHaier
Oczyszczacz wodyELGA
HemocytometrBLAU 717805
Sun Zamrażarka ultraniskotemperaturowa wirówkowa Komórek w Szanghaju Komórek w Szanghaju A600264

Bibliografia

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Decelularyzowana macierz zewnątrzkomórkowa językatrawienie DNaząbioreaktor własnej konstrukcjistatyczna hodowla komórkowadynamiczna hodowla komórkowabarwienie H&Ekomórki Cal-27decelularyzacja tkanki
Wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej języka i rekonstrukcja raka płaskonabłonkowego języka in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.