Wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej języka i rekonstrukcja raka płaskonabłonkowego języka in vitro

Język pełni różne ważne funkcje, takie jak deglutyzacja, artykulacja i degustacja. Tak więc upośledzenie funkcji języka ma ogromny wpływ na jakość życia pacjentów¹. Najczęstszym nowotworem złośliwym w jamie ustnej jest rak płaskonabłonkowy języka (TSCC), który zwykle występuje u osób pijących alkohol lub palących tytoń².

W ostatnich latach osiągnięto niewielki postęp w podstawowych badaniach nad TSCC. Jednym z największych problemów pozostaje brak skutecznych modeli badań in vitro. W ten sposób macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) okazuje się potencjalnym rozwiązaniem. Ponieważ ECM jest złożoną ramą sieciową składającą się z wysoce zorganizowanych komponentów matrycy, materiały rusztowań o strukturze i składzie podobnym do ECM byłyby kompetentne do badań nad rakiem. Bezkomórkowy ECM może doskonale zapewnić niszę dla komórek tego samego pochodzenia in vitro, co okazuje się najważniejszą zaletą ECM.

ECM może być zachowany dzięki usunięciu składników komórkowych z tkanek poprzez decelularyzację za pomocą detergentów i enzymów. Różne składniki ECM, w tym kolagen, fibronektyna i laminina w matrycy bezkomórkowej, zapewniają natywne mikrośrodowisko podobne do tkanki dla hodowanych komórek, promując przeżycie, proliferację i różnicowanie komórek³. Co więcej, immunogenność do przeszczepu może być zredukowana do minimalnego poziomu przy braku składników komórkowych w ECM.

Do tej pory metody wytwarzania decelularyzowanego ECM były testowane w różnych tkankach i organach, takich jak heart^4,5,6,7, liver^8,9,10,11, lung^{12,13,14,15,16,17}, and kidney^18,19,20. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie znaleziono żadnych odpowiednich badań dotyczących podobnej pracy w języku.

W tym badaniu, zdecelularyzowana macierz zewnątrzkomórkowa języka (TEM) została wyprodukowana zarówno efektywnie, jak i tanio dzięki serii fizycznych, chemicznych i enzymatycznych zabiegów. Następnie TEM został wykorzystany do podsumowania TSCC in vitro, pokazując odpowiednią symulację zachowania i rozwoju TSCC. TEM ma dobrą biokompatybilność, a także zdolność do kierowania komórek do niszy specyficznej dla tkanki, co wskazuje, że TEM może mieć duży potencjał w badaniach TSCC³. Przedstawiony tutaj protokół stanowi wybór dla badaczy zajmujących się patogenezą lub terapiami klinicznymi TSCC.

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały wykonane zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt, wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, Uniwersytet Sun Yat-sen.

1. Przygotowanie TEM

1. Wykonuj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i usuń języki za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych i pęsety.
2. Zanurz języki w 75% etanolu na 3 minuty, a następnie włóż każdy język do probówki Eppendorfa (EP) o pojemności 1,5 ml z 1 ml 10 mM sterylnego roztworu buforowanego fosforanem (PBS).
   UWAGA: Stężenie PBS we wszystkich kolejnych krokach jest takie samo jak stężenie w tym etapie.
3. Liza komórek przez rozmrażanie i rozmrażanie: Zamrozić języki w probówkach EP w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę, a następnie rozmrażać języki w temperaturze pokojowej przez 45 minut przez 3 cykle.
4. Załaduj każdy język na kawałek szwu chirurgicznego za pomocą igły chirurgicznej i owiń koniec szwu małym kawałkiem sterylnej folii aluminiowej. Operację należy wykonać w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm zawierającym 75% etanolu w sterylnych warunkach.
   UWAGA: Odpowiednia długość każdego kawałka szwu chirurgicznego to około 20 cm, a odpowiedni rozmiar każdego kawałka folii aluminiowej to około 0,3^cm2 (1 cm × 0,3 cm). Język powinien być załadowany w pobliżu folii aluminiowej.
5. Opłucz każdy język 3 ml sterylnego PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 3,5 cm lub 6 cm przez 30 sekund. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
6. Umyj języki ultraczystą wodą: Dodaj ampycylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnej ultraczystej wody do końcowego stężenia 90 μg/ml. Włóż języki do butelki zawierającej mieszadło. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
   UWAGA: Do tej samej butelki można włożyć do 5 języków ze względu na splatanie szwu. Folia aluminiowa znajduje się na końcu szwu w butelce, aby zapobiec zsuwaniu się języka. Języki należy umieścić na wysokości 2 cm od dna butelki, regulując długość szwu pozostałego wewnątrz butelki. Ta uwaga dotyczy również kroków 1.8, 1.10, 1.12 i 1.16.
7. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 12 godzin.
8. Umyj języki za pomocą NaCl: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 1 M NaCl do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
9. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
10. Liza komórek za pomocą Triton X-100: Dodaj ampycylinę do końcowego stężenia 90 μg/ml do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 2% Triton X-100 w PBS. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
11. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 48 godzin.
12. Umyj języki za pomocą CaCl₂/MgCl₂: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego 5 mM CaCl₂/MgCl₂ do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
13. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
14. Trawienie przez DNazę: Dodaj 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do każdej probówki EP. Dodać odpowiednio DNazę do HBSS do końcowego stężenia 300 μM. Przesunąć każdy język do każdej probówki EP, tak aby część szwu znajdowała się na zewnątrz probówki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Upewnij się, że część szwu, która pozostaje wewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również wewnątrz rurki EP w tym kroku i upewnij się, że część szwu, która pozostaje na zewnątrz butelek w poprzednich krokach, pozostaje również poza rurką EP w tym kroku.
15. Inkubować języki w probówkach EP w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
16. Umyj języki za pomocą PBS: Dodaj ampicylinę do butelki z szerokim otworem z 250 ml sterylnego PBS do końcowego stężenia 90 μg/ml. Przenieś języki i mieszadło do butelki. Dokręcić nakrętkę butelki tak, aby część szwu pozostała na zewnątrz butelki. Wykonaj tę operację w sterylnych warunkach.
17. Umieść butelkę na mieszadle magnetycznym na 24 godziny.
18. Przygotowany TEM należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja TSCC

1. Statyczna budowa modelu TSCC
   1. Wysiewaj 1,0 x 10⁶ pojedynczych komórek TSCC (Cal27) do naczynia hodowlanego o średnicy 3,5 cm. Dodać 3 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole/F12 (DF12) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 90 μg/ml ampicyliny i 90 μg/ml kanamycyny.
   2. Hodować komórki Cal27 w temperaturze 37 °C przez 2 do 3 dni. Upewnij się, że komórki pokrywają co najmniej 60% powierzchni dna naczynia.
   3. Załaduj TEM na monowarstwę Cal27 w naczyniu hodowlanym.
   4. Umieścić naczynie w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C na 28 dni.
   5. Pożywkę należy odświeżać codziennie podczas procesu hodowli komórkowej. Stężenie CO₂ w inkubatorze wynosi 5%.
2. Konstrukcja modelu TSCC z mieszadłem
   1. Przygotowanie samodzielnie wykonanego minibioreaktora z mieszadłem
      1. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 10 ml.
      2. Wykop otwór (średnica 1 cm) w pobliżu dolnego końca pręta i załaduj do niego mieszadło.
      3. Wykop otwór (średnica 0,5 cm) na środku nakrętki plastikowej butelki z szerokim otworem i przełóż tłoczysko przez nakrętkę.
      4. Przeciąć połowę probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przyspawać ją po zewnętrznej stronie nakrętki butelki.
      5. Przymocuj haczyki na ryby do wędki, owijając wędkę żyłkami, które są przywiązane do haczyków.
         UWAGA: Do wędki można przymocować do 4 haczyków na ryby.
      6. Autoklaw samodzielnie wykonany kompleks przed użyciem.
         UWAGA: Nie sterylizuj w autoklawie plastikowej butelki z szeroką szyjką. Używaj nowej sterylnej plastikowej butelki z szerokim otworem podczas hodowli komórek.
3. Dynamiczna hodowla komórkowa
   1. Zasiew 1,0 x 10⁶ pojedynczych komórek Cal27 w samodzielnie wykonanym minibioreaktorze. Dodaj 150 ml pożywki DF12, która zawiera 10% FBS, 90 μg/ml ampycyliny i 90 μg/ml kanamycyny.
   2. Załaduj TEM do minibioreaktora za pomocą haczyków na ryby przymocowanych do pręta.
   3. Dokręć nakrętkę butelki i umieść minibioreaktor na mieszadle magnetycznym. Aktywować minibioreaktor przy 200 obr./min w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 7 do 14 dni.
      UWAGA: Stężenie CO₂ w inkubatorze CO₂ wynosi 5%.

Ten protokół przygotowania TEM okazuje się skuteczny i odpowiedni. TEM wykazał doskonałą decelularyzację w porównaniu z rodzimymi tkankami języka. Skuteczność decelularyzacji potwierdzono za pomocą barwienia hematoksyliną-eozyną (HE) (Rysunek 1A-B). Wyniki barwienia HE ujawniły całkowity zanik barwienia jądrowego w TEM (Rysunek 1B). Co więcej, kwantyfikacja zawartości DNA z poprzednich prac wykazała, że DNA zostało prawie całkowicie usunięte z TEM3. Protokół ten wykazał również rzadkie uszkodzenie integralności tkanki podczas usuwania składników komórki (Rysunek 1B).

3D rekonstrukcja TSCC przy użyciu TEM i samodzielnie wykonanego minibioreaktora (Rysunek 2A-B) przyniosła zadowalające wyniki. Barwienie HE wykazało, że komórki Cal27 w TEM wykazywały typowe cechy patologiczne TSCC (Rysunek 2C-D). Komórki w mieszanych warunkach hodowli wykazywały migrację pojedynczych komórek ( Rysunek 2C) lub migrację zbiorową (Rysunek 2D) w różnych obszarach zmian. W warunkach hodowli statycznej komórki Cal27 również tworzyły struktury inwazyjne w TEM, ale trwało to dłużej (Rysunek 2E). Co więcej, ludzka linia komórkowa kostniakomięsaka U2OS została również wprowadzona do tego samego systemu hodowli z mieszaniem. Chociaż komórki U2OS mogły żyć w pożywce hodowlanej, nie znaleziono ich w TEM (Rysunek 2F). TEM wykazał różną biokompatybilność dla różnych typów komórek nowotworowych, co sugeruje, że różne komórki nowotworowe mogą potrzebować różnych mikrośrodowisk do rozwoju.

Rysunek 1: Przygotowanie TEM. (a) Barwienie języków ojczystych od myszy. Pasek skali = 100 μm. (B) Barwienie HE bezkomórkowego TEM od myszy. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rekonstrukcja TSCC przez TEM. (A) Przegląd samodzielnie wykonanego minibioreaktora. (B) Widok pozycji obciążenia TEM minibioreaktora własnej produkcji. (C) Barwienie HE 14-dniowego mieszanego TSCC za pomocą TEM. Zjawiska inwazji pojedynczych komórek są oznaczone czarnymi strzałkami. Podziałka = 50 μm. (D) Barwienie HE 14-dniowego TSCC z mieszaniem za pomocą TEM. Zjawiska inwazji zbiorowej są oznaczone czarnymi strzałkami. Podziałka = 50 μm. (E) Barwienie HE 28-dniowego statycznie hodowanego TSCC za pomocą TEM. Zjawiska inwazji pojedynczych komórek są oznaczone czarnymi strzałkami. Podziałka = 100 μm. (F) Barwienie HE 14-dniowych mieszanych komórek U2OS z mieszaniem za pomocą TEM. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.