Artykuł metodologiczny

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

36.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57266

⸱

4 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 2Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Analytic and Translational Genetics Unit, Center for Genomic Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, Stanley Centre for Psychiatric Research, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Tanz Centre for Research in Neurodegenerative Diseases, University of Toronto, 5School of Medicine, Faculty of Health Sciences, Queen's University, 6Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 7CHEO Research Institute, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 8Department of Clinical Neurological Sciences, Western University, 9Division of Neurology, Department of Medicine, Sunnybrook Health Sciences Centre, University of Toronto, 10Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 11Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre, Toronto Western Hospital, 12Department of Clinical Neurological Sciences, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 13Parkwood Institute, St. Joseph's Health Care, 14Department of Medicine, Division of Neurology, McMaster University, 15Division of Neurology, Department of Medicine, Baycrest Health Sciences, 16Canadian Partnership for Stroke Recovery Sunnybrook Site, Sunnybrook Health Science Centre, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Streszczenie

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) szybko rewolucjonizuje sposób prowadzenia badań nad genetycznymi determinantami chorób konstytucyjnych. Technika ta jest bardzo wydajna, ponieważ miliony odczytów sekwencjonowania są generowane w krótkim czasie i przy stosunkowo niskich kosztach. W szczególności ukierunkowany NGS jest w stanie skoncentrować badania na regionach genomu o szczególnym znaczeniu w oparciu o badaną chorobę. Nie tylko jeszcze bardziej obniża to koszty i zwiększa szybkość procesu, ale także zmniejsza obciążenie obliczeniowe, które często towarzyszy NGS. Chociaż celowany NGS jest ograniczony do pewnych regionów genomu, co uniemożliwia identyfikację potencjalnych nowych loci będących przedmiotem zainteresowania, może być doskonałą techniką w obliczu fenotypowo i genetycznie heterogennej choroby, dla której istnieją wcześniej znane powiązania genetyczne. Ze względu na złożony charakter techniki sekwencjonowania ważne jest ścisłe przestrzeganie protokołów i metodologii w celu uzyskania odczytów sekwencjonowania o wysokim zasięgu i jakości. Ponadto, po uzyskaniu odczytów sekwencjonowania, zaawansowany przepływ pracy bioinformatycznej jest wykorzystywany do dokładnego mapowania odczytów do genomu referencyjnego, wywoływania wariantów i zapewnienia, że warianty przechodzą metryki jakości. Warianty muszą być również opatrzone adnotacjami i wyselekcjonowane w oparciu o ich znaczenie kliniczne, które można ustandaryzować, stosując wytyczne American College of Medical Genetics and Genomics dotyczące patogeniczności. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie przedstawią etapy związane z generowaniem i analizą danych NGS z ukierunkowanego panelu sekwencjonowania, przy użyciu panelu chorób neurodegeneracyjnych ONDRISeq jako modelu, w celu identyfikacji wariantów, które mogą mieć znaczenie kliniczne.

Wprowadzenie

Ponieważ definiowanie genetycznych determinantów różnych schorzeń nabiera wyższego priorytetu w badaniach i w klinice, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) okazuje się być wysokowydajnym i opłacalnym narzędziem do osiągnięcia tych celów1,2,3. Przez prawie 40 lat sekwencjonowanie Sangera było złotym standardem w identyfikacji wariantów genetycznych4; Jednak w przypadku chorób o niejednorodności genetycznej lub nieznanej etiologii genetycznej należy ocenić wiele możliwych genów kandydujących, często jednocześnie. W tym kontekście sekwencjonowanie Sangera staje się kosztowne i czasochłonne. Jednak NGS obejmuje masowe równoległe sekwencjonowanie milionów fragmentów DNA, co pozwala na zastosowanie efektywnej kosztowo i czasowo techniki jednoczesnego wykrywania szerokiego zakresu zmienności genetycznej w różnych regionach genomu.

Istnieją trzy rodzaje NGS do sekwencjonowania DNA: 1) sekwencjonowanie całego genomu (WGS), 2) sekwencjonowanie całego eksomu (WES) i 3) sekwencjonowanie ukierunkowane5. WGS ocenia całą zawartość genomu danej osoby, podczas gdy WES obejmuje sekwencjonowanie tylko regionów kodujących białka genome6. Z kolei sekwencjonowanie celowane koncentruje się na określonych regionach genomu w oparciu o stosunkowo niewiele specyficznych genów połączonych wspólnymi mechanizmami patologicznymi lub znanym fenotypem klinicznym. Za pomocą tego podejścia można określić zarówno eksony, jak i introny, lub dowolne międzygenowe regiony genu lub określonej grupy genów. Dlatego sekwencjonowanie celowane może być doskonałym podejściem, gdy istnieje już podstawa genów kandydujących, o których wiadomo, że są związane z chorobą będącą przedmiotem zainteresowania. Ukierunkowanie na określone regiony genomu pozwala na eliminację zbędnej i nieistotnej zmienności genetycznej, która może zaciemniać lub odwracać uwagę od interpretacji klinicznej. Chociaż zarówno WGS, jak i WES generują dużą ilość danych wysokiej jakości, ilość danych może być przytłaczająca. Tak duża ilość danych nie tylko wymaga intensywnej obliczeniowo analizy bioinformatycznej, ale przechowywanie danych może często stwarzać problemy7. To wyzwanie związane z przechowywaniem danych wiąże się również z dodatkowymi kosztami zarówno dla WGS, jak i WES, co często nie jest początkowo brane pod uwagę przy obliczaniu kosztów sekwencjonowania. Ponadto, mimo że maleje, koszt WGS i WES pozostaje stosunkowo wysoki. Sekwencjonowanie celowane może być bardziej opłacalną opcją, szczególnie gdy wymagane jest sekwencjonowanie dużej liczby osób.

Inicjatywa Badawcza Chorób Neurodegeneracyjnych w Ontario (ONDRI) to wieloplatformowe, obejmujące całą prowincję, obserwacyjne badanie kohortowe charakteryzujące pięć chorób neurodegeneracyjnych, w tym: 1) chorobę Alzheimera i łagodne upośledzenie funkcji poznawczych, 2) stwardnienie zanikowe boczne, 3) demencję czołowo-skroniową, 4) chorobę Parkinsona i 5) naczyniowe upośledzenie funkcji poznawczych8. Podgrupa genomiczna ONDRI ma na celu wyjaśnienie, w ramach podstawowej charakterystyki tej kohorty, często pomijanego, ale niezwykle ważnego krajobrazu genetycznego tych fenotypowo i genetycznie heterogenicznych chorób. Choroby neurodegeneracyjne są zatem odpowiednimi kandydatami do metodologii NGS, a w szczególności do sekwencjonowania celowanego.

Specjalnie zaprojektowaliśmy ukierunkowany panel NGS, ONDRISeq, do sekwencjonowania 528 uczestników zaangażowanych w ONDRI dla regionów kodujących białka 80 genów, które wcześniej były powiązane z pięcioma interesującymi chorobami. Dzięki tej metodologii jesteśmy w stanie wykorzystać wysokiej jakości dane NGS w ukierunkowany i wydajny sposób. Konstrukcja i walidacja panelu ONDRISeq z wieloma badaniami zgodności zostały już wcześniej opisane, dla których panel ONDRISeq był w stanie zidentyfikować nowe, rzadkie warianty o możliwym znaczeniu klinicznym w 72,2% z 216 przypadków wykorzystanych do walidacji panelu9. Chociaż technologia NGS rozwinęła się szybko i niezwykle w ostatnich latach, wielu badaczy staje przed wyzwaniem podczas przetwarzania surowych danych w listę użytecznych, opatrzonych adnotacjami wariantów10. Co więcej, interpretacja wariantów może być złożona, zwłaszcza w obliczu wielu rzadkich lub nowatorskich11.

Tutaj opisujemy krok po kroku metodologię docelowego NGS i związany z nim przepływ pracy bioinformatycznej wymagany do resekwencjonowania, wywoływania wariantów i adnotacji wariantów, na przykładzie badania ONDRISeq. Po wygenerowaniu danych NGS surowe pliki sekwencjonowania muszą zostać dostosowane do ludzkiego genomu referencyjnego, aby można było dokładnie wywołać warianty. Warianty muszą być następnie opatrzone adnotacjami, aby przeprowadzić kolejne sprawdzanie wariantów. Wyjaśnimy również, jak wdrażamy standardy i wytyczne American College of Medical Genetics w celu dokładnej klasyfikacji patogenności wariantów.

Protokół

Na potrzeby projektu ONDRI uzyskano protokoły etyczne oraz świadomą zgodę na podstawie decyzji komisji etyki badań w następujących placówkach: Baycrest Centre for Geriatric Care (Toronto, Ontario, Kanada); Centre for Addiction and Mental Health (Toronto, Ontario, Kanada); Elizabeth Bruyère Hospital (Ottawa, Ontario, Kanada); Hamilton General Hospital (Hamilton, Ontario, Kanada); London Health Sciences Centre (London, Ontario, Kanada); McMaster (Hamilton, Ontario, Kanada); The Ottawa Hospital (Ottawa, Ontario, Kanada); Parkwood Hospital (London, Ontario, Kanada); St Michael's Hospital (Toronto, Ontario, Kanada); Sunnybrook Health Sciences Centre (Toronto, Ontario, Kanada) oraz University Health Network-Toronto Western Hospital (Toronto, Ontario, Kanada).

1. Izolacja DNA z próbek ludzkiej krwi

  1. Pobrać próbki od uczestników sekwencjonowania zgodnie z odpowiednimi protokołami etycznymi i po uzyskaniu świadomej zgody.
    1. Aby uzyskać wysokiej jakości DNA, pobrać próbki krwi do ekstrakcji.
      UWAGA: DNA można również ekstrahować z śliny lub komórek nabłonka policzka, zapewniając użycie odpowiedniego zestawu do izolacji DNA.
    2. W przypadku ekstrakcji z krwi, aby uzyskać wysoką wydajność DNA, pobrać próbkę do trzech probówek z EDTA K2 o pojemności 4 mL, zapewniając całkowitą objętość próbki wynoszącą ~12 ml.
    3. Wirować próbki krwi przez 20 min przy 750 x g, aby rozdzielić je na górną fazę osocza, cienką środkową fazę leukocytów oraz dolną fazę erytrocytów.
  2. Usunąć osocze z próbki krwi, odpipetowując je z górnej części próbki za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Odpowiednio zutylizować osocze lub rozdzielić je na liczne alikwoty po 500 µL i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz biochemicznych. Należy upewnić się, że dla każdej próbki użyta zostanie nowa, sterylna pipeta.
  3. Wyizolować DNA z próbki krwi za pomocą zestawu do ekstrakcji z krwi12 (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Jeśli pobrano próbkę o objętości opisanej powyżej, do ekstrakcji DNA uzyskanych zostanie ~3 mL leukocytów.
  4. Zmierzyć początkowe stężenie DNA w ng/µL za pomocą spektrofotometru pełnego spektrum13 (Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Przejść bezpośrednio do kroku 2. Alternatywnie DNA można przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania

  1. Przez trzy dni przeprowadź rozcieńczenia seryjne próbek DNA, aby uzyskać końcowe stężenie 5,0 ± 1,0 ng/µL.
    1. Rozcieńcz bufor Tris 1 M o pH 8,5 do stężenia 10 µM za pomocą wody dejonizowanej.
      UWAGA: Objętość rozcieńczenia zależy od liczby próbek DNA, które będą wymagały rozcieńczenia w kolejnych krokach.
    2. Jeśli rozcieńczanie DNA jest wykonywane bezpośrednio po kroku 1.4, przejdź do następnego etapu. Jeśli nie odbywa się to w tym samym dniu, zmierz stężenie DNA w sposób opisany w kroku 1.4.
    3. Na podstawie zmierzonego stężenia rozcieńcz 40 µL DNA do stężenia ~10 ng/µL, używając buforu Tris 10 µM o pH 8,5, i pozostaw próbkę na noc w temperaturze 4 °C.
    4. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru14 odpowiedniego do kwantyfikacji DNA (Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Stężenie próbki powinno być >10 ng/µL ze względu na niższą czułość spektrofotometru użytego wcześniej.
    5. Na podstawie zmierzonego stężenia rozcieńcz 20 µL DNA do stężenia 10 ng/µL, używając buforu Tris 10 µM o pH 8,5, i pozostaw próbkę na noc w temperaturze 4 °C.
    6. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru14, zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Na podstawie zmierzonego stężenia rozcieńcz 10 µL DNA do stężenia 5 ng/µL, używając buforu Tris-HCl 10 µM o pH 8,5, i pozostaw próbkę na noc w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj bibliotekę do sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta, używając odpowiedniego zestawu do wzbogacania celów15 (Tabela materiałów) dla docelowego panelu NGS. Upewnij się, że zestaw do wzbogacania jest odpowiedni dla używanej platformy NGS.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta16 dotyczącymi pleksowości i łączenia (poolingu) bibliotek.
      UWAGA: W przypadku ONDRISeq biblioteki składają się z 12 próbek DNA, łączonych w pary i analizowanych na stacjonarnym urządzeniu NGS (Tabela materiałów). Liczba próbek, które można przeanalizować w jednej reakcji, zależy od użytego zestawu do sekwencjonowania i platformy.
    2. Aby uzyskać dane sekwencjonowania wyższej jakości, wykonaj opcjonalny krok walidacji jakości biblioteki DNA po tagmentacji, opisany w instrukcji producenta zestawu do wzbogacania celów15.
      1. Przeanalizuj każdą bibliotekę w trzech powtórzeniach, aby zapewnić odpowiednią jakość uzysku biblioteki.
    3. W przypadku łączenia bibliotek zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru14, zgodnie z instrukcjami producenta. Wykorzystaj to stężenie do określenia objętości każdej biblioteki DNA do połączenia, aby uzyskać ekvimolarne proporcje zalecane przez używany zestaw do wzbogacania celów.

3. Sekwencjonowanie nowej generacji

  1. Przeprowadź sekwencjonowanie biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta zestawu odczynników do desktopowego instrumentu NGS17,18 (Tabela materiałów).
    1. Przygotuj arkusz próbek (sample sheet) zgodnie z instrukcjami producenta18, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do technologii NGS (Tabela materiałów), który zostanie zaimportowany do procedury pracy (workflow) desktopowego instrumentu NGS.
      UWAGA: Na potrzeby ONDRISeq wybrano opcję aplikacji „other”, żądając jedynie plików FASTQ (Rycina 1). Kolejne kroki będą przetwarzać te pliki FASTQ, aby umożliwić pełną personalizację parametrów wyrównania i jakości. Jednak w przypadku wyboru sekwencjonowania celowanego niektóre instrumenty NGS są w stanie samodzielnie przetworzyć dane sekwencjonowania do plików VCF. W celu zapoznania się z pełnym zakresem opcji można skorzystać z instrukcji producenta18.
    2. W przypadku korzystania z chmurowego środowiska obliczeniowego19 (Tabela materiałów), zaloguj się podczas konfigurowania procesu sekwencjonowania. Należy to zrobić po kliknięciu „Sequencing” na stronie głównej desktopowego instrumentu NGS.
    3. Po denaturacji biblioteki18 zgodnie z instrukcjami producenta, zmierz stężenie biblioteki DNA za pomocą fluorometru14.
    4. Zweryfikuj jakość biblioteki DNA, używając odpowiedniego zautomatyzowanego systemu elektroforezy i zestawu do analizy jakości DNA20 (Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Aby przeliczyć stężenie DNA z ng/µL na nM, zastosuj następujący wzór16
      figure-protocol-1
      UWAGA: Średnia wielkość biblioteki będzie specyficzna dla używanego zestawu do wzbogacania celowanego i może zostać określona na podstawie śladu elektroforetycznego uzyskanego w kroku 3.1.4.
    6. Rozcieńcz bibliotekę sekwencjonującą do końcowego stężenia 6–20 pM, w zależności od potrzeb, i objętości 600 μL, zgodnie z instrukcjami producenta21.
      UWAGA: Dokładne wymagane stężenie zależy od użytego zestawu do sekwencjonowania. Skonsultuj się z producentem zestawu do wzbogacania, aby określić właściwe stężenie załadunkowe.
    7. Rozcieńcz, zdenaturuj i dołącz bibliotekę sekwencjonującą kontroli pozytywnej21, zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Prowadź rejestr każdego procesu sekwencjonowania, zawierający załadowane stężenie biblioteki DNA (pM), procent dodanej kontroli pozytywnej, kod kreskowy kartridża z odczynnikami, aplikację wybraną w kroku 3.1.1, liczbę odczytów indeksów, użyty zestaw do wzbogacania, długość odczytów oraz nazwę arkusza próbek.
      UWAGA: Czas pracy desktopowego instrumentu NGS będzie zależał od urządzenia, zestawu do wzbogacania i wybranych długości odczytów (4–56 h dla sekwenatora użytego w tym eksperymencie22).
  2. Po zakończeniu procesu sekwencjonowania uzyskaj dostęp do „Run Folder”, który zawiera wszystkie wyniki, przechodząc do strony głównej desktopowego instrumentu NGS i klikając „Manage Files”. Przenieś pliki na dysk lokalny w celu późniejszego dostępu. Alternatywnie, na komputerze znajdź pliki w chmurowym środowisku obliczeniowym19, wybierając „Runs” w panelu nawigacyjnym. Wybierz odpowiedni proces sekwencjonowania, aby przejść do strony Podsumowania procesu (Run Summary). Wybierz „Download”, aby pobrać dane z chmury. W wyświetlonym oknie dialogowym wybierz pliki FASTQ jako typ plików do pobrania i kliknij „Download”.
  3. Ze strony Podsumowania procesu w chmurowym środowisku obliczeniowym19,23, przejdź do sekcji „Charts”, aby przeanalizować jakość procesu sekwencjonowania za pomocą różnych wykresów generowanych przez środowisko obliczeniowe. Szczegóły dotyczące każdego generowanego wykresu znajdują się w instrukcjach producenta23.
    1. Na stronie Wykresów procesu (Run Charts) znajdź wykres opisany jako „Data by Cycle”. W sekcji wykresu wybierz „Intensity”, a w sekcji kanału wybierz „All Channels”. Upewnij się, że uzyskany wykres intensywności sygnału jest podobny do wykresów z procesów sekwencjonowania przeprowadzonych w przeszłości z tym samym zestawem do wzbogacania i tym samym desktopowym instrumentem NGS.
      UWAGA: Odzwierciedla to procent intensywności wykazany przez każdą zasadę we wszystkich 150 cyklach. Wykres ten może się znacznie różnić w zależności od użytego zestawu do wzbogacania, dlatego należy go porównywać z poprzednimi procesami sekwencjonowania tego samego panelu.
    2. Wybierz zakładkę „Indexing QC” w panelu nawigacyjnym procesu, aby znaleźć histogram kontroli jakości (QC) indeksowania, który znajduje się po prawej stronie strony. Upewnij się, że we wszystkich próbkach obserwuje się stosunkowo jednorodny rozkład % Reads Identified (PF).
      UWAGA: Jeśli jakiekolwiek próbki mają znacznie niższy % Reads Identified (PF) niż pozostałe, należy odnotować, że jakość danych sekwencjonowania może być obniżona.
  4. Ze strony Podsumowania procesu w chmurowym środowisku obliczeniowym przejdź do metryk jakości, klikając „Metrics” w panelu nawigacyjnym procesu.
    UWAGA: Wartości progowe metryk będą zależeć od używanej platformy sekwencjonowania i zestawu do wzbogacania. Zgodnie z instrukcjami producenta23 można wykorzystać wiele metryk; poniższe kroki wyróżniają trzy z nich, które są wysoce zalecane do kontroli jakości.
    1. W sekcji „DENSITY (K/MM2)” upewnij się, że gęstość klastrów mieści się w zakresie zalecanym przez używany zestaw do wzbogacania (w tym przypadku 1 200–1 400 K/mm2).
    2. W sekcji całkowitego „%≥Q30” upewnij się, że wartość wynosi ≥85%, co odzwierciedla jakość odczytów sekwencjonowania.
      UWAGA: Jeśli wartość jest niższa od progu 85%, należy odnotować, że jakość sekwencjonowania może być niewystarczająca.
    3. W sekcji „ALIGNED (%)” upewnij się, że wartość jest zbliżona do % kontroli pozytywnej, która została dołączona do procesu sekwencjonowania.
      UWAGA: Służy to jako miara kontroli pozytywnej, wskazując, że tylko taki procent całkowitych odczytów został wyrównany do genomu kontroli pozytywnej. Jeśli użyto 1% kontroli pozytywnej, oczekiwano, że Aligned (%) wyniesie ~1–5%.

figure-protocol-2
Rysunek 1: Zrzut ekranu opcji aplikacji do tworzenia arkusza próbek (Tabela materiałów) w oprogramowaniu do technologii NGS. Na potrzeby ONDRISeq stosowana jest aplikacja wyłącznie dla formatu FASTQ. Jeśli jednak użytkownik chce wygenerować inne pliki, np. pliki VCF, zaleca się użycie aplikacji z kategorii ukierunkowanego resekwencjonowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Resekwencjonowanie i wywoływanie wariantów

  1. W ramach wstępnego przetwarzania danych należy wybrać odpowiednie oprogramowanie do mapowania surowych plików FASTQ do ludzkiego genomu referencyjnego oraz do wykrywania wariantów (Tabela materiałów).
  2. Zaimportuj odczyty sekwencjonowania FASTQ do oprogramowania do wstępnego przetwarzania danych.
    UWAGA: Na potrzeby ONDRISeq importuje się i przetwarza w oprogramowaniu 48 plików FASTQ powstałych z jednego cyklu sekwencjonowania 24 próbek. Liczba próbek przetwarzanych jednocześnie może się różnić w zależności od potrzeb badacza i rozmiaru panelu NGS.
    1. W „Obszarze nawigacji” (Navigation Area) kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz „Nowy folder” (New Folder). Nazwij folder w sposób, który jednoznacznie określi przeprowadzony cykl sekwencjonowania.
    2. Z paska narzędzi u góry wybierz „Importuj” (Import). Z wyświetlanej listy rozwijanej platform sekwencjonowania wybierz platformę, na której wykonano sekwencjonowanie.
      UWAGA: Na potrzeby ONDRISeq wybierano „Illumina”. Jednak w przypadku korzystania z innej platformy sekwencjonowania należy zapoznać się z instrukcjami producenta w odniesieniu do pozostałych kroków importowania plików FASTQ24.
    3. W oknie dialogowym przejdź do plików FASTQ z przetwarzanego cyklu sekwencjonowania i zaznacz je. W przypadku korzystania z komputera z wieloma serwerami upewnij się, że importowane pliki są przechowywane na dysku lokalnym i są z niego importowane.
    4. W sekcji „Opcje ogólne” (General options) okna dialogowego zaznacz pole obok opcji „Odczyty sparowane” (Paired reads), jeśli w sekwencjonowaniu zastosowano chemię końców sparowanych.
      UWAGA: W takim przypadku dla każdej próbki powinny zostać zaimportowane dwa pliki FASTQ – jeden dla odczytu w kierunku w przód (forward) i jeden dla odczytu w kierunku wstecznym (reverse).
    5. W sekcji informacji o odczytach sparowanych okna dialogowego wybierz „End-paired (forward-reverse)”, jeśli plik FASTQ z odczytem w przód pojawia się przed odczytem wstecznym na liście plików. Jeśli pliki pojawiają się w odwrotnej kolejności, wybierz „Mate-pair (reverse-forward)”. Ustaw minimalną odległość odczytów sparowanych na 1, a maksymalną na 1000, aby umożliwić wykrywanie niewielkich rearanżacji strukturalnych w sekwencjach próbek.
    6. W sekcji „Opcje Illumina” (Illumina options) okna dialogowego wybierz „Usuń nieudane odczyty” (Remove failed reads), aby usunąć odczyty, które nie przeszły sekwencjonowania. Jeśli urządzenie NGS typu desktop przeprowadziło demultipleksację danych przed eksportem plików FASTQ, nie zaznaczaj pola „Demultipleksacja MiSeq” (MiSeq de-multiplexing).
    7. Z listy rozwijanej „Wynik jakości” (Quality score) wybierz potok (pipeline) NGS wykorzystany do sekwencjonowania. Wybierz „Dalej” (Next) na dole okna dialogowego.
      UWAGA: Wybrany potok wpłynie na format wyników jakości plików FASTQ. Aby uzyskać więcej informacji na temat wyboru odpowiedniego potoku, zapoznaj się z instrukcjami producenta24.
    8. W nowym oknie dialogowym wybierz „Zapisz” (Save) oraz „Twórz podfoldery dla jednostek partii” (Create subfolders per bath unit), aby pliki FASTQ każdej próbki trafiły do osobnych folderów. Wybierz „Dalej” (Next) na dole okna dialogowego.
    9. W nowym oknie dialogowym wybierz folder utworzony w kroku 4.2.1. To tutaj zostaną zaimportowane pliki FASTQ. Wybierz „Zakończ” (Finish) na dole okna dialogowego i poczekaj, aż pliki FASTQ zostaną zaimportowane. Kliknij kartę „Procesy” (Processes), aby sprawdzić status importowania plików.
  3. Zaprojektuj w oprogramowaniu przepływ pracy (workflow) do resekwencjonowania i wykrywania wariantów, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Przepływ ten może się różnić w zależności od potrzeb badacza, ale poniższe kroki obejmują to, co zostało uwzględnione na potrzeby ONDRISeq (Rysunek 2). Kroki w tym przepływie pracy można zastosować do innego oprogramowania do resekwencjonowania NGS i wykrywania wariantów, jeśli jest to odpowiednie. Całe przetwarzanie bioinformatyczne na potrzeby ONDRI jest wykonywane w odniesieniu do ludzkiego genomu referencyjnego GRCH37/hg19, w celu zapewnienia spójności przetwarzania i analizy danych.
    1. Zmapuj odczyty sekwencjonowania do genomu referencyjnego.
      1. Podczas konfiguracji wybierz odpowiedni genom referencyjny, upewniając się, że jest to ten sam genom referencyjny, który jest używany we wszystkich krokach bioinformatycznych.
      2. Z listy rozwijanej trybu maskowania wybierz „Brak maskowania” (No masking), tak aby żadne regiony sekwencji referencyjnej nie były zamaskowane.
      3. Użyj domyślnych opcji mapowania przypisanych przez oprogramowanie. Zapoznaj się z instrukcjami producenta24, aby zweryfikować, czy jest to dopuszczalne w odniesieniu do celów badania.
    2. Uwzględnij w przepływie pracy lokalne wyrównanie (local realignment) do ludzkiego genomu referencyjnego, aby rozwiązać ewentualne błędy mapowania odczytów, szczególnie w obrębie wariantów insercji-delecji.
      1. Użyj domyślnych opcji lokalnego wyrównania przypisanych przez oprogramowanie. Zapoznaj się z instrukcjami producenta24, aby zweryfikować, czy jest to dopuszczalne w odniesieniu do celów badania.
    3. Usuń zmapowane odczyty duplikowane, powstałe w wyniku PCR w protokole NGS, aby zmniejszyć efekt błędu amplifikacji PCR, który może generować wyniki fałszywie dodatnie25.
      1. Ustaw „Maksymalną reprezentację sekwencji mniejszościowej (%)” (Maximum representation of minority sequence (%)) w oknie konfiguracji, w zależności od potrzeb badania.
        UWAGA: Ustawienie łagodne, zastosowane na potrzeby ONDRISeq, wynosi 5%; jednak domyślne ustawienie oprogramowania jest bardziej rygorystyczne i wynosi 20%. Gdy dwa odczyty są bardzo podobne, to ustawienie określa, czy sekwencja z mniejszą liczbą odczytów powinna być uznana za błąd sekwencjonowania wynikający z błędu amplifikacji PCR. Zatem przy ustawieniu 5%, liczba odczytów mniejszościowych musi być ≤ 5% liczby odczytów większościowych, aby zostać skorygowana i uznana za identyczną z odczytem większościowym.
    4. Wyeksportuj statystyki dla regionów docelowych w formie tekstowego pliku podsumowania pokrycia z tracków odczytów wygenerowanych w kroku 4.3.3. W ustawieniach zignoruj dopasowania niespecyficzne oraz zerwane pary. Wybierz miejsce docelowe na dysku lokalnym dla tych plików.
    5. Wyeksportuj plik mapy wyrównania sekwencji w formacie binarnym (BAM) dla każdej próbki z tracków odczytów wygenerowanych w kroku 4.3.3. Zawiera on dane o wyrównaniu sekwencji, jeśli będą one potrzebne w przyszłych analizach. Wybierz miejsce docelowe na dysku lokalnym dla tych plików.
    6. Wybierz metodę detekcji wariantów w celu wywołania wariantów w sekwencji.
      UWAGA: Gdy można założyć ploidalność próbek, zaleca się stosowanie algorytmu detekcji wariantów o stałej ploidalności, tak jak zrobiono to na potrzeby ONDRISeq. Jeśli takie założenie nie jest możliwe, należy odnieść się do instrukcji producenta24, aby określić najlepszy algorytm dla celów badania.
      1. Podczas konfiguracji, w opcjach parametrów wariantów o stałej ploidalności, ustaw ploidalność odpowiednią dla organizmu próbki. Ustaw „wymaganą prawdopodobieństwo wariantu” (required variant probability), czyli prawdopodobieństwo poprawnego wywołania wariantu niezbędne do jego zachowania, na 90.0%.
      2. Zastosuj następujące zalecane ustawienia dla filtrów ogólnych: „Minimalne pokrycie” (Minimum coverage) 10x, „Minimalna liczba” (Minimum count) 2, „Minimalna częstotliwość odczytów” (Minimum read frequency) 20%, „Ignoruj zerwane pary” (Ignore broken pairs), ignoruj dopasowania niespecyficzne na podstawie „Odczytów” (Reads) oraz „Minimalna długość odczytu” (Minimum read length) 20.
        UWAGA: Parametry te oparto na potrzebach ONDRISeq. Zapoznaj się z instrukcjami producenta24, aby upewnić się, że są one odpowiednie dla prowadzonego badania.
      3. Zastosuj następujące zalecane ustawienia dla filtrów szumów: „Filtry jakości baz” (Base quality filters) z wynikiem jakości mapowania „Promień sąsiedztwa” (Neighbourhood radius) 5, wynikiem mapowania „Minimalna jakość centralna” (Minimum central quality) 20 oraz wynikiem mapowania „Minimalna jakość sąsiedztwa” (Minimum neighbourhood quality) 15; „Filtr kierunku odczytu” (Read direction filter) 5.0% oraz „Relatywny filtr kierunku odczytu” (Relative read direction filter) o istotności 1.0%.
        UWAGA: Parametry te oparto na potrzebach ONDRISeq. Zapoznaj się z instrukcjami producenta24, aby upewnić się, że są one odpowiednie dla prowadzonego badania.
    7. Przefiltruj wywołane warianty na podstawie ich nakładania się z regionami docelowymi wybranego panelu, zgodnie ze specyfikacją zawartą w pliku Browser Extensible Data (BED), zachowując tylko warianty występujące w regionach genomicznych wybranych dla docelowego panelu NGS.
      UWAGA: Plik BED będzie unikalny dla wykorzystywanego docelowego panelu NGS, w zależności od regionów genomu, które panel jest w stanie pokryć.
    8. Wyeksportuj raport wariantów w pliku w formacie Variant Calling Format (VCF) z tracku wariantów utworzonego w kroku 4.3.7. Wybierz miejsce docelowe na dysku lokalnym dla tych plików.
    9. Zapisz i zainstaluj przepływ pracy zgodnie z instrukcjami producenta24, aby był on dostępny w „Skrzynce narzędziowej” (Toolbox) oprogramowania. Upewnij się, że przepływ pracy jest nazwany w sposób, który w przyszłości jasno określi, dla którego panelu NGS jest on odpowiedni.
      1. W oknie dialogowym z opcjami „Eksport danych referencyjnych” (Exporting reference data) podczas instalacji ustaw wszystkie opcje na „Pakiet” (Bundle).
      2. W oknie dialogowym z opcjami „Lokalizacja instalacji” (Install location) podczas instalacji kliknij „Zainstaluj przepływ pracy na komputerze lokalnym” (Install the workflow on your local computer).
  4. Uruchom zaimportowane pliki odczytów sekwencjonowania FASTQ w dostosowanym bioinformatycznym przepływie pracy zaprojektowanym w kroku 4.3, zgodnie z instrukcjami producenta24.
    1. Zidentyfikuj przepływ pracy zaprojektowany w kroku 4.3 w „Skrzynce narzędziowej” (Toolbox) oprogramowania i kliknij go dwukrotnie.
    2. W wyświetlonym oknie dialogowym odszukaj foldery z plikami FASTQ zaimportowanymi w kroku 4.2 w „Obszarze nawigacji” (Navigation Area). Zaznacz wszystkie foldery w „Obszarze nawigacji”, a następnie kliknij pole obok opcji „Partia” (Batch). Użyj strzałki skierowanej w prawo, aby przenieść pliki do sekcji „Wybrane elementy” (Selected elements). Kliknij „Dalej” (Next) na dole okna dialogowego.
    3. W oknie dialogowym przejrzyj „Przegląd partii” (Batch overview), aby upewnić się, że wybrano poprawne pliki FASTQ, a następnie kliknij „Dalej” (Next).
    4. Przejrzyj następujące kroki przepływu pracy w oknie dialogowym, aby upewnić się, że podczas projektowania przepływu w kroku 4.3 wybrano poprawne pliki i miejsca eksportu: „Mapuj odczyty do referencji” (Map Reads to Reference); „Usuń duplikowane odczyty zmapowane” (Remove Duplicate Mapped Reads); „Utwórz statystyki dla regionów docelowych” (Create Statistics for Target Regions); „Eksportuj BAM” (Export BAM); „Eksportuj tekst rozdzielony tabulatorami” (Export Tab delimited text); „Filtruj na podstawie nakładania” (Filter Based on Overlap) oraz „Eksportuj VCF” (Export VCF).
    5. W ostatnim kroku okna dialogowego – „Obsługa wyników” (Result handling) – wybierz opcję „Zapisz w folderze wejściowym” (Save in input folder). Kliknij „Zakończ” (Finish) na dole okna dialogowego.
      UWAGA: Oznacza to, że pliki wygenerowane dla każdej próbki zostaną umieszczone w tym samym folderze, w którym znajduje się plik FASTQ w oprogramowaniu do wstępnego przetwarzania danych.

figure-protocol-3
Rysunek 2: Schemat procesu resekwencjonowania i wywoływania wariantów z plików FASTQ w oprogramowaniu do wstępnego przetwarzania danych (Tabela materiałów) dostosowanym do celów ONDRISeq. Kroki opisane w tym schemacie można zastosować do innego oprogramowania do resekwencjonowania NGS i wywoływania wariantów, zależnie od potrzeb badacza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Adnotacja wariantów

  1. Pobierz i dostosuj skrypt Annotate Variation (ANNOVAR)26, aby przeprowadzić adnotację wariantów w pliku VCF dla każdej próbki.
    1. Pobierz z ANNOVAR następujące bazy danych, aby zostały uwzględnione jako adnotacje: 1) RefSeq27 (aktualizacja z sierpnia 2015 r.); 2) dbSNP13828 (aktualizacja z września 2014 r.); 3) Exome Aggregation Consortium29 (ExAC, wersja 0.3, aktualizacja z listopada 2015 r.); 4) National Heart, Lung, and Blood Institute Exome Sequencing Project European Cohort30 (ESP, aktualizacja z marca 2015 r.); 5) 1000 Genomes Project European Cohort31 (1KGP, aktualizacja z sierpnia 2015 r.); 6) ClinVar32 (aktualizacja z marca 2016 r.); oraz 7) Combined Annotation Dependent Depletion33 (CADD), Sorting Intolerant from Tolerant34 (SIFT) i PolyPhen-235.
      UWAGA: Współrzędne genomowe oraz wszystkie bazy danych referencyjne w programie ANNOVAR odnoszą się do wersji genomu ludzkiego GRCh37/hg19. Ponadto wymienione wersje baz danych są tymi, które zostały użyte na potrzeby ONDRISeq; podczas pobierania baz danych należy użyć najnowszych dostępnych wersji.
    2. W razie potrzeby dostosuj ANNOVAR tak, aby generował pełną listę adnotowanych wariantów, a także zredukowane zestawienie adnotowanych wariantów przy użyciu operacji --filter26.
      UWAGA: Zredukowaną listę można dostosować do potrzeb badacza. Na potrzeby ONDRISeq zredukowana lista adnotowanych wariantów nie obejmuje wariantów występujących dalej niż 15 zasad od najbliższego eksonu ani żadnych wariantów o częstotliwości allelu mniejszościowego (MAF) >3% w którejkolwiek z trzech baz danych: 1) ExAC; 2) ESP; oraz 3) 1KGP. Krok ten jest wysoce zalecany.
    3. W razie potrzeby dostosuj ANNOVAR, aby wyodrębnić konkretne wywołania alleli w zależności od potrzeb badacza26.
      UWAGA: Na potrzeby ONDRISeq program ANNOVAR ocenia wywołania sekwencyjne dokonane dla alleli ryzyka genu APOE rs429358(C>T):p.C130R i rs7412(C>T):p.R176C w celu określenia ogólnego genotypu APOE, dla którego istnieje sześć możliwych kombinacji, w tym: 1) E2/E2; 2) E3/E2; 3) E4/E2; 4) E3/E3; 5) E4/E3; 6) E4/E4. Z tych sześciu możliwych genotypów APOE, E4/E4 jest najczęściej uznawanym genetycznym czynnikiem ryzyka rozwoju późnej postaci choroby Alzheimera36.
  2. Przeszukaj bazy danych mutacji chorobowych (Tabela Materiałów), aby ustalić, czy warianty były wcześniej wiązane z chorobą przy odpowiednich dowodach. Warianty, które nie zostały wcześniej zgłoszone, uznaj za warianty nowe.
    1. Przeanalizuj adnotacje ANNOVAR z bazy ClinVar tak, aby warianty związane z chorobą obejmowały wszystkie zaklasyfikowane jako prawdopodobnie patogenne lub patogenne.
  3. Przetwórz warianty splicingowe za pomocą narzędzi do predykcji in silico Splicing-based Analysis of Variants37 (SPANR) oraz Human Splicing Finder38 (HSF, wersja 3.0).
  4. W przypadku przetwarzania dużej liczby próbek porównaj wywołania wariantów w każdej próbce, aby ustalić, które warianty są wspólne dla różnych próbek. Wykonaj to ręcznie lub za pomocą specjalnie zaprojektowanego skryptu, co pozwoli na wykrycie możliwych artefaktów sekwencjonowania i zdarzeń kontaminacji.
    UWAGA: Na potrzeby ONDRI używa się specjalnego skryptu do adnotowania plików wyjściowych ANNOVAR poprzez ich wzajemne porównywanie. Skrypt wprowadza adnotację dla każdego wariantu z identyfikatorem podmiotu wszystkich innych próbek posiadających ten sam wariant, co określa się mianem historii wariantu w kohorcie badawczej.
  5. Zaklasyfikuj warianty na podstawie wytycznych patogeniczności American College of Medical Genetics (ACMG)39, przypisując każdemu wariantowi jedną z następujących klasyfikacji: 1) patogenny; 2) prawdopodobnie patogenny; 3) wariant o nieznanym znaczeniu; 4) prawdopodobnie łagodny; lub 5) łagodny.
    UWAGA: Na potrzeby ONDRI do półautomatycznej klasyfikacji ACMG używany jest autorski skrypt w języku Python. Choć nie był on stosowany w tym badaniu, InterVar40 jest narzędziem o podobnej konstrukcji, które można wykorzystać w analogiczny sposób.
  6. Wykonaj sekwencjonowanie metodą Sangera dla wszystkich wariantów o pokryciu sekwencjonowania <30x i/lub wariantów zidentyfikowanych u > 10% kohorty badawczej, aby potwierdzić, że nie są one artefaktami sekwencjonowania41.

Wyniki

Opisane tutaj metodologie zastosowano do 528 próbek DNA uczestników zarejestrowanych w ONDRI. Próbki analizowano za pomocą panelu ONDRISeq w 22 seriach po 24 próbki w każdej serii. Ogólnie stwierdzono, że dane z sekwencjonowania są wysokiej jakości, ze średnim pokryciem próbki 78 ± 13x, a wszystkie poszczególne serie wykazały średnie pokrycie próbki >30x. Ponadto, średnio 94% wszystkich regionów docelowych miało pokrycie co najmniej 20x (Tabela 1).

Średnio 95,6% odczytów zmapowano do sekwencji referencyjnej, a we wszystkich przebiegach ONDRISeq zmapowano >90% odczytów (Tabela 1). Spośród zmapowanych odczytów 92,0% posiadało wynik Phred ≥Q30, przy czym tylko w jednym przebiegu <80% zmapowanych odczytów spełniało ten parametr jakości. Niemniej jednak, przebieg ten nadal wykazał średnie pokrycie 79x, a 93% regionów docelowych było pokrytych co najmniej 20x.

ParametrŚrednia (±sd)Najlepsza wydajnośćNajsłabsza wydajność
Gęstość klastrów (x103/mm2)1424 (±269)13471835
Całkowita liczba odczytów (106)43.1 (±6.0)48.747.4
zmapowane odczyty (106)40.1 (±6.0)47.125.7
Odsetek zmapowanych odczytów (%)95.6 (±1.3)96.892.6
Wskaźnik jakości Phred ≥Q30 (%)92.0 (±6.0)9268.3
Pokrycie próbki (x)78 (±13)9951

Tabela 1: Metryki jakości sekwencjonowania dla 22 przebiegów na ONDRISeq.

Studium przypadku: Identyfikacja rzadkich wariantów u pacjenta z PD.

Aby zademonstrować użyteczność naszego ukierunkowanego schematu pracy NGS, przedstawiamy przykład 68-letniego pacjenta płci męskiej z chorobą Parkinsona. Próbkę DNA poddano analizie na stacjonarnym urządzeniu NGS (Tabela materiałów) przy użyciu panelu ONDRISeq wraz z 23 innymi próbkami ONDRI. Wynik analizy wykazał gęstość klastrów na poziomie 1,555 x 103/mm2. Próbka konkretnego pacjenta wykazała średnie pokrycie 76x, przy czym 93,9% regionów docelowych zostało pokrytych co najmniej 20x.

Po przeprowadzeniu wywołania i adnotacji wariantów za pomocą niestandardowego przepływu bioinformatycznego, u pacjenta stwierdzono obecność 1351 wariantów w obrębie egzonów oraz otaczających je obszarów o długości 250 bp w 80 genach objętych panelem ONDRISeq. Jednakże potok ANNOVAR pozwolił na zmniejszenie liczby wariantów poprzez uwzględnienie ontologii sekwencji wariantów oraz MAF, zgodnie z powyższym opisem. W wyniku tego procesu uzyskano listę siedmiu wariantów, które poddano ręcznej kurateli (Rycina 3). Z tych siedmiu wariantów dwa zidentyfikowano jako potencjalnie istotne klinicznie. Proces ten jest dostosowany do potrzeb ONDRI i polegał na wyłonieniu wariantów względnie rzadkich w ogólnej populacji oraz niesynonimicznych w ontologii, co powoduje zmianę w białku. W procesie tym wykorzystano również informacje o tym, czy wariant był wcześniej powiązany z chorobą, predykcje in silico dotyczące szkodliwości dla białka oraz klasyfikację patogeniczności wariantów według ACMG.

Pierwszym wariantem zidentyfikowanym z zredukowanej listy był wariant heterozygotyczny, a mianowicie LRRK2:c.T3939A, prowadzący do wariantu nonsensownego p.C1313*. LRRK2 koduje białko kinazę 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę, która wykazuje zarówno aktywność GTP-azy, jak i kinazy42. Co więcej, wiadomo, że mutacje w tym genie należą do głównych przyczyn rodzinnej postaci choroby Parkinsona43. Wariant ten wprowadza przedwczesny kodon stop w obrębie LRRK2, co skutkuje utratą pozostałości aminokwasowych 1314–2527. Uniemożliwia to translację domen białka: Ras of complex proteins (Roc), C-terminal of Roc (COR) oraz domeny kinazy białkowej, które odpowiadają odpowiednio za funkcjonowanie jako atypowa GTP-aza Rho, białko wiążące GTP i kinaza białkowa; analiza in silico generowana przez CADD (CADD Phred = 36) przewidziała, że wariant ten jest szkodliwy. Wariant ten jest również rzadki, z MAF wynoszącym odpowiednio 0,004% w ExAC i 0,01% w ESP, oraz nie występuje w bazie danych 1000G. Dodatkowo, jest to jedyny pacjent spośród wszystkich 528 zsekwencjonowanych osób, który jest nosicielem tego wariantu; jest on nowym odkryciem, ponieważ nie został wcześniej opisany w bazach danych mutacji chorobowych (Tabela materiałów). Pewność identyfikacji wariantu została potwierdzona głębokim pokryciem wynoszącym 109x. Na koniec wariant oceniono pod kątem patogeniczności zgodnie ze standardami i wytycznymi AMCG i zaklasyfikowano go jako patogeniczny.

Pacjent był również nosicielem drugiego wariantu heterozygotycznego, NR4A2:c.C755A, skutkującego zmianą typu missense p.P252Q. Białko kodowane przez NR4A2 (Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 2) jest czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w generowanie neuronów dopaminergicznych44, a mutacje w tym genie były wcześniej wiązane z chorobą Parkinsona45. Przewidziano, że podstawienie niepolarnej proliny polarną glutaminą będzie szkodliwe na podstawie analizy predykcyjnej in silico przeprowadzonej za pomocą CADD (CADD Phred = 21.1), jednak nie wykazały tego analizy SIFT ani PolyPhen-2. Wariant ten jest rzadki, z MAF wynoszącym 0,004% w ExAC oraz brakiem występowania w ESP i 1000G. Wariant zidentyfikowano również u uczestnika projektu ONDRI z diagnozą naczyniowych zaburzeń poznawczych, ale nie został on wcześniej opisany w bazach danych mutacji chorobowych. Pokrycie tego wariantu wynosiło zaledwie 18x, jednak w celu potwierdzenia jego poprawności w sekwencji zostanie wykonane sekwencjonowanie metodą Sangera. Ostatecznie, w ocenie zgodnie ze standardami i wytycznymi ACMG dotyczącymi patogeniczności, wariant ten uznano za o niepewnym znaczeniu.

Panel ONDRISeq oraz potok bioinformatyczny pozwalają również na określenie genotypu APOE każdej próbki. W przypadku tego pacjenta stwierdzono genotyp APOE E3/E3.

figure-results-1
Rysunek 3: Przykład ograniczonych wyników z programu ANNOVAR wyświetlający ręcznie wyselekcjonowane, adnotowane warianty. Ograniczone wyniki ANNOVAR z badania przypadku 68-letniego pacjenta płci męskiej z chorobą Parkinsona. Adnotowane warianty zostały wyselekcjonowane w celu zidentyfikowania tych, które z największym prawdopodobieństwem mają znaczenie kliniczne, co zaznaczono czerwonymi ramkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Na ścieżce od ekstrakcji próbki DNA do identyfikacji wariantów, które mogą być interesujące przy rozważaniu diagnozy pacjenta, progresji choroby i możliwych opcji leczenia, ważne jest, aby rozpoznać różnorodny charakter metodologii wymaganej zarówno do sekwencjonowania, jak i prawidłowego przetwarzania danych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przykładem wykorzystania ukierunkowanego NGS i późniejszej analizy bioinformatycznej niezbędnej do identyfikacji rzadkich wariantów o potencjalnym znaczeniu klinicznym. W szczególności przedstawiamy podejście przyjęte przez podgrupę ONDRI genomics podczas korzystania z niestandardowego panelu NGS zaprojektowanego przez ONDRISeq.

Uznaje się, że metody te zostały opracowane w oparciu o konkretną platformę NGS i że istnieją inne platformy sekwencjonowania i zestawy do wzbogacania celów, które można zastosować. Jednak platforma NGS i instrument stacjonarny (Tabela materiałów) zostały wybrane na podstawie ich wczesnej aprobaty amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA)46. Autoryzacja ta odzwierciedla wysokiej jakości sekwencjonowanie, które można wykonać za pomocą wybranych protokołów NGS, oraz niezawodność, jaką można przypisać odczytom sekwencjonowania.

Chociaż uzyskanie dokładnych odczytów sekwencjonowania z głębokością pokrycia jest bardzo ważne, przetwarzanie bioinformatyczne wymagane do końcowej analizy rzadkich wariantów jest niezbędne i może być intensywne obliczeniowo. Ze względu na wiele źródeł błędów, które mogą wystąpić w procesie sekwencjonowania, solidny potok bioinformatyczny musi korygować różne niedokładności, które można wprowadzić. Mogą one wynikać z niewspółosiowości w procesie mapowania, stronniczości amplifikacji wprowadzonej przez amplifikację PCR w przygotowaniu biblioteki oraz technologii wytwarzającej artefakty sekwencjonowania47. Bez względu na oprogramowanie używane do mapowania odczytu i wywoływania wariantów, istnieją typowe sposoby redukcji tych błędów, w tym lokalne wyrównanie, usunięcie zduplikowanych zmapowanych odczytów i ustawienie odpowiednich parametrów kontroli jakości podczas wywoływania wariantów. Ponadto parametry wybrane podczas wywoływania wariantów mogą się różnić w zależności od tego, co jest najbardziej odpowiednie dla danego badania11. Minimalne pokrycie i wynik jakości wariantu i otaczających nukleotydów, które zostały w nim zastosowane, zostały wybrane tak, aby stworzyć równowagę między odpowiednią swoistością a czułością. Parametry te zostały zweryfikowane dla panelu ONDRISeq w oparciu o zgodność wywoływania wariantów z trzema oddzielnymi technikami genetycznymi, jak opisano wcześniej, w tym: 1) genotypowaniem opartym na chipach; 2) test dyskryminacji allelicznej; oraz 3) Sekwencjonowanie Sangera9.

Po dokładnym wywołaniu wariantów, w celu określenia tych o potencjalnym znaczeniu klinicznym, niezbędne są adnotacje i kuracja. Ze względu na otwartą dostęp, ANNOVAR jest doskonałym narzędziem zarówno do adnotacji, jak i wstępnej selekcji lub eliminacji wariantów. Oprócz tego, że ANNOVAR jest łatwo dostępny, może być stosowany do dowolnego pliku VCF, bez względu na używaną platformę sekwencjonowania, i można go dostosować do potrzeb badania26.

Po adnotacji warianty muszą być interpretowane w celu określenia, czy należy je uznać za mające znaczenie kliniczne. Proces ten staje się nie tylko złożony, ale często jest podatny na subiektywizm i błędy ludzkie. Z tego powodu ACMG ustaliło wytyczne dotyczące oceny dowodów na patogenność dowolnego wariantu. Stosujemy niesynonimiczne, rzadkie podejście do ręcznego sprawdzania oparte na wariantach, które jest konstruowane na podstawie tych wytycznych i zabezpieczane przez indywidualną ocenę każdego wariantu, który jest w stanie przejść przez potok, za pomocą niestandardowo zaprojektowanego skryptu języka Python, który klasyfikuje warianty na podstawie wytycznych. W ten sposób każdemu wariantowi przypisuje się ranking patogenny, prawdopodobnie chorobotwórczy, o niepewnym znaczeniu, prawdopodobnym łagodnym lub łagodnym, a my jesteśmy w stanie dodać standaryzację i przejrzystość do procesu selekcji wariantów. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że specyfika kuracji wariantów, wykraczająca poza proces bioinformatyczny, zostanie zindywidualizowana w oparciu o potrzeby badań, a zatem wykraczała poza zakres prezentowanych metodologii.

Chociaż przedstawione tutaj metody są specyficzne dla ONDRI, opisane kroki można przełożyć na dużą liczbę chorób konstytucyjnych będących przedmiotem zainteresowania. Wraz ze wzrostem liczby asocjacji genów dla wielu fenotypów, ukierunkowany NGS pozwala na podejście oparte na hipotezach, które może wykorzystać wcześniejsze badania przeprowadzone w tej dziedzinie. Istnieją jednak ograniczenia dotyczące ukierunkowanego NGS i przedstawionej metodologii. Skupiając się tylko na określonych regionach genomu, obszary odkryć są ograniczone do nowych alleli będących przedmiotem zainteresowania. W związku z tym nie zostaną zidentyfikowane nowe geny lub inne loci genomowe poza tymi, które są objęte celami sekwencjonowania, które mogłyby zostać ujawnione za pomocą metod WGS lub WES. Istnieją również regiony w genomie, które mogą być trudne do dokładnego sekwencjonowania za pomocą podejść NGS, w tym te o wysokim stopniu powtarzania sekwencji48 lub te, które są bogate w zawartość GC49. Na szczęście, w przypadku korzystania z ukierunkowanego NGS, istnieje a priori wysoki stopień zaznajomienia się z sekwencjonowanymi regionami genomu i tym, czy mogą one stanowić wyzwanie techniczne. Wreszcie, wykrywanie wariantów numerów kopii na podstawie danych NGS nie jest obecnie ustandaryzowane50. Jednak bioinformatyczne rozwiązania tych problemów mogą pojawić się na horyzoncie; Nowe narzędzia obliczeniowe mogą pomóc w analizie tych dodatkowych form zmienności u pacjentów z ONDRI.

Pomimo swoich ograniczeń, ukierunkowany NGS jest w stanie uzyskać wysokiej jakości dane w ramach podejścia opartego na hipotezach, pozostając jednocześnie tańszym niż jego odpowiedniki WGS i WES. Metodologia ta jest nie tylko odpowiednia dla efektywnych i ukierunkowanych badań, ale także wykładniczo rośnie kliniczne wdrożenie celowanego NGS. Technologia ta jest wykorzystywana do udzielania odpowiedzi na wiele różnych pytań dotyczących szlaków molekularnych różnych chorób. Jest również rozwijany w celu uzyskania dokładnego narzędzia diagnostycznego przy stosunkowo niskich kosztach w przeciwieństwie do WES i WGS. Nawet w porównaniu ze złotym standardem sekwencjonowania Sangera, ukierunkowany NGS może konkurować pod względem efektywności czasowej i kosztowej. Z tych powodów ważne jest, aby naukowiec lub klinicysta, który otrzymuje i wykorzystuje dane NGS, na przykład dostarczone jako tekst w raporcie laboratoryjnym lub klinicznym, rozumiał złożoną "czarną skrzynkę", która leży u podstaw wyników. Przedstawione tu metody powinny pomóc użytkownikom zrozumieć proces leżący u podstaw generowania i interpretacji danych NGS.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim uczestnikom ONDRI za zgodę i współpracę z naszym badaniem. Dziękujemy badaczom ONDRI (www.ONDRI.ca/people), w tym naszemu głównemu badaczowi (MJS) oraz komitetom zarządzającym ONDRI: komitetowi wykonawczemu, komitetowi sterującemu, komitetowi publikacji, komitetowi rekrutacyjnemu, platformom oceny i zespołowi zarządzania projektem. Dziękujemy również Regionalnemu Centrum Genomiki w Londynie za ich wiedzę techniczną. AAD jest wspierane przez Alzheimer Society of London i stypendium Middlesex Masters Graduate Research Scholarship. SMKF jest wspierany przez ALS Canada Tim E. Noël Postdoctoral Fellowship.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4 ml probówki EDTA K2Fisher Scientific02-689-4
1 M Tris BufferBio Basic Canada Inc.SD8141
Gentra Puregene Zestawdo krwi Qiagen1583891,000 ml. Jest to zestaw do ekstrakcji krwi, o którym mowa w kroku 1.3.
Spektrofotometr NanoDrop-1000Thermo Fisher ScientificND-2000zastąpiony przez spektrofotometr NanoDrop-2000. Jest to spektrofotometr o pełnym spektrum, o którym mowa w krokach 1.4 i 2.1.2.
Fluorometr Qubit 2.0InvitrogenQ32866Jest to fluorometr odpowiedni do oznaczania ilościowego DNA, o którym mowa w krokach 2.1.4, 2.1.6, 2.2.3 i 3.1.3.
Nextera Rapid Custom Zestaw wzbogacający do przechwytywaniaIllumina, Inc.FC-140-1009Specjalnie zaprojektowany dla panelu ONDRISeq, sekwencjonujący eksony 80 genów, w wyniku czego uzyskuje się 971 388 par zasad sekwencji w odczytach sparowanych końców o długości 150 zasad; 288 próbek w zestawie. Jest to zestaw do wzbogacania celów, o którym mowa w krokach 2.2, 2.2.2, 2.2.3, 3.1.5, 3.1.6, 3.4.1 i w dyskusji.
2100 BioAnalyzerAgilent TechnologiesG2939BAJest to zautomatyzowany system elektroforezy, o którym mowa w kroku 3.1.4.
Zestaw odczynników DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626110 próbek w zestawie; Jest to zestaw do analizy jakości DNA, o którym mowa w kroku 3.1.4.
Zestaw odczynników MiSeq v3Illumina, Inc.MS-102-3003Zestaw na 600 cykli; Jest to zestaw odczynników do instrumentów biurkowych NGS, o którym mowa w kroku 3.1.
Osobisty sekwenator genomu MiSeqIllumina, Inc.SY-410-1003Jest to instrument biurkowy NGS, o którym mowa w krokach 2.2.1, 3.1, 3.1.1, 3.1.2, 3.1.8, 3.2, 4.2.6, Reprezentatywne wyniki i Dyskusja.
Kierownik eksperymentówIllumina, Inc.Jest to oprogramowanie w technologii NGS, o którym mowa w kroku 3.1.1 i Rysunek 1. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html
BaseSpaceIllumina, Inc.SW-410-1000Jest to środowisko obliczeniowe oparte na chmurze, o którym mowa w krokach 3.1.2, 3.2, 3.3, 3.3.1, 3.3.2, 3.4, 3.4.1, 3.4.2 i 3.4.3. https://basespace.illumina.com/
CLC Genomics Workbench 10.1.1Qiagen832000Dostępne są również opcje open source do wstępnego przetwarzania danych, które mogą modelować przepływ pracy używany w tym protokole. Jest to oprogramowanie używane do wstępnego przetwarzania danych, o którym mowa w kroku 4 i w Rysunek 2. 
adnotacjihttp://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/
RefSeqNarodowe Centrum Informacjihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
dbSNP138Narodowe Centrum Informacjihttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi?view+summary=view+summary&build_id=138
Exome Aggregation Consortium BroadInstitutehttp://exac.broadinstitute.org/
National Heart, Lung, and Blood Institute Projekt sekwencjonowania egzomu European CohortUniversity of Washington oraz Broad Institutehttp://evs.gs.washington.edu/EVS/
ClinVar National Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
Połączone zubożenie zależne od adnotacjiUniwersytet Waszyngtoński i Hudson-Alpha Institute for Biotechnologyhttp://cadd.gs.washington.edu/
Sorting Intolerant from TolerantJ. Craig Venter Instutitehttp://sift.jcvi.org/
PolyPhen-2Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical Schoolhttp://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/
Ludzki gen Baza danych mutacjiQiagen834050Jest to baza danych mutacji chorobowych, o której mowa w kroku 5.2 i reprezentatywnych wynikach. https://portal.biobase-international.com/cgi-bin/portal/login.cgi?redirect_url=/hgmd/pro/start.php
Analiza wariantów oparta na splicinguLaboratorium Freya, Uniwersytet w Torontohttp://tools.genes.toronto.edu/
Human Splicing FinderAix Marseille Universitéhttp://www.umd.be/HSF3/HSF.shtml
Inne materiały
Wirówka
Jednorazowe pipety transferowe
Zmienność Biotechnologicznej Biotechnologicznej

Bibliografia

  1. Metzker, M. L. Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet. 11 (1), 31-46 (2010).
  2. Mardis, E. R. Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet. 9, 387-402 (2008).
  3. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  4. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  5. Farhan, S. M. K., Hegele, R. A. Exome Sequencing: New Insights into Lipoprotein Disorders. Current Cardiology Reports. 16 (7), (2014).
  6. Choi, M., et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (45), 19096-19101 (2009).
  7. Mardis, E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016. Nat Protoc. 12 (2), 213-218 (2017).
  8. Farhan, S. M., et al. The Ontario Neurodegenerative Disease Research Initiative (ONDRI). Can J Neurol Sci. 44 (2), 196-202 (2017).
  9. Farhan, S. M. K., et al. The ONDRISeq panel: custom-designed next-generation sequencing of genes related to neurodegeneration. NPJ Genom Med. (16032), 1-11 (2016).
  10. El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: four stages of data processing and computational challenges. PLoS Comput Biol. 9 (12), e1003345(2013).
  11. Yohe, S., Thyagarajan, B. Review of Clinical Next-Generation Sequencing. Arch Pathol Lab Med. , (2017).
  12. Qiagen. Gentra Puregene Handbook. , 4th edn, (2014).
  13. NanoDrop Technologies, Inc. Spectrophotometer V3.5 User's Manual. , (2007).
  14. Invitrogen by Life Technologies. Qubit 2.0 Fluorometer User Manual. Vol. Q32866. , (2010).
  15. Illumina, Inc. Nextera Rapid Capture Enrichment Guide. , Vol. 15037436 v01 (2016).
  16. Illumina, Inc. Nextera Rapid Capture Enrichment Reference Guide. , Vol. 15037436 v01 (2016).
  17. Rev. B. Illumina, Inc. MiSeq Reagent Kit v3 Reagent Preparation Guide. , Vol. 15044932 Rev. B (2013).
  18. Illumina, Inc. MiSeq System Guide. , Vol. 15027617 v01 (2015).
  19. BaseSpace Sequence Hub. , https://basespace.illumina.com/dashboard (2017).
  20. Rev. B. Agilent Technologies. Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide. , Vol. G2938-90321 (2013).
  21. Illumina, Inc. MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide. , Vol. 15039740 v01 (2016).
  22. Illumina, Inc. System Specification Sheet: MiSeq System. , (2016).
  23. BaseSpace Sequence Hub Help Center. , Available from: https://help.basespace.illumina.com/ (2017).
  24. Qiagen. Genomics Workbench 10.1.1 User Manual. , (2017).
  25. Ebbert, M. T., et al. Evaluating the necessity of PCR duplicate removal from next-generation sequencing data and a comparison of approaches. BMC Bioinformatics. 17, Suppl 7. 239(2016).
  26. Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164(2010).
  27. Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D733-D745 (2016).
  28. Kitts, A., Phan, L., Ward, M., Bradley Holmes, J. The Database of Short Genetic Variation (dbSNP). , National Center for Biotechnology Information. Bethesda, MD. (2013).
  29. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  30. Exome Variant Server, NHLBI GO Exome Sequencing Project (ESP). , http://evs.gs.washington.edu/EVS/ (2017).
  31. Auton, A., et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  32. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  33. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  34. Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm. Nat Protoc. 4 (7), 1073-1081 (2009).
  35. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  36. Bertram, L., McQueen, M. B., Mullin, K., Blacker, D., Tanzi, R. E. Systematic meta-analyses of Alzheimer disease genetic association studies: the AlzGene database. Nat Genet. 39 (1), 17-23 (2007).
  37. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), (2015).
  38. Desmet, F. O., et al. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acids Res. 37 (9), e67(2009).
  39. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  40. Li, Q., Wang, K. InterVar: Clinical Interpretation of Genetic Variants by the 2015 ACMG-AMP Guidelines. Am J Hum Genet. 100 (2), 267-280 (2017).
  41. Yang, Z. L., Sun, G. L. High-frequency, low-coverage "false positives" mutations may be true in GS Junior sequencing studies. Scientific Reports. 7, (2017).
  42. Gandhi, P. N., Wang, X., Zhu, X., Chen, S. G., Wilson-Delfosse, A. L. The Roc domain of leucine-rich repeat kinase 2 is sufficient for interaction with microtubules. J Neurosci Res. 86 (8), 1711-1720 (2008).
  43. Goldwurm, S., et al. The G6055A (G2019S) mutation in LRRK2 is frequent in both early and late onset Parkinson's disease and originates from a common ancestor. J Med Genet. 42 (11), e65(2005).
  44. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
  45. Grimes, D. A., et al. Translated mutation in the Nurr1 gene as a cause for Parkinson's disease. Mov Disord. 21 (7), 906-909 (2006).
  46. Collins, F. S., Hamburg, M. A. First FDA authorization for next-generation sequencer. N Engl J Med. 369 (25), 2369-2371 (2013).
  47. Van der Auwera, G. A., et al. From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline. Curr Protoc Bioinformatics. 43, 11-33 (2013).
  48. Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nat Rev Genet. 13 (1), 36-46 (2011).
  49. Shin, S., Park, J. Characterization of sequence-specific errors in various next-generation sequencing systems. Mol Biosyst. 12 (3), 914-922 (2016).
  50. Povysil, G., et al. panelcn.MOPS: Copy-number detection in targeted NGS panel data for clinical diagnostics. Hum Mutat. 38 (7), 889-897 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Panel ONDRISeqwywo ywanie wariant wpliki FASTQmapowanie do genomu referencyjnegowska niki jako ciznaczenie kliniczne
Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.