Artykuł metodologiczny

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

DOI:

10.3791/57271

⸱

10 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farmakologiczne celowanie w receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) ma ogromne znaczenie dla zdrowia ludzkiego, ponieważ dysfunkcyjna sygnalizacja za pośrednictwem GPCR przyczynia się do postępu wielu chorób. Para ligand/receptor CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) wzbudziła duże zainteresowanie kliniczne, na przykład jako potencjalny cel w leczeniu nowotworów i chorób zapalnych. Małe cząsteczki, a także przeciwciała terapeutyczne, które są specyficznie ukierunkowane na CXCR4 i hamują funkcję receptora, są zatem uważane za cenne narzędzia farmakologiczne. W tym miejscu opisano test komórkowy oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia identyfikację związków (np. małych cząsteczek), które znoszą wiązanie CXCL12 z CXCR4. Zasadniczo test opiera się na konkurencji o wiązanie receptora między stałą ilością znakowanego fluorescencyjnie CXCL12, naturalnego agonisty chemokiny dla CXCR4, a nieznakowanymi związkami. W związku z tym w tym teście unika się niepożądanego użycia sond znakowanych radioaktywnie. Ponadto żywe komórki są wykorzystywane jako źródło receptora (CXCR4) zamiast preparatów błon komórkowych. Pozwala to na łatwe dostosowanie testu do formatu płytki, co zwiększa przepustowość. Wykazano, że test ten jest cennym testem odkrywania leków generycznych w celu identyfikacji związków ukierunkowanych na CXCR4. Protokół może być prawdopodobnie dostosowany do innych GPCR, przynajmniej jeśli dostępne są ligandy znakowane fluorescencyjnie lub można je wygenerować. Wcześniejsza wiedza na temat wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, które są indukowane po aktywacji tych GPCR, nie jest wymagana.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) to białka powierzchniowe komórek, które mogą być aktywowane przez ligandy zewnątrzkomórkowe (np. peptydy, hormony białkowe, aminy), regulując w ten sposób wiele procesów fizjologicznych i rozwojowych1. Gdy agonista zajmuje kieszeń wiążącą GPCR, indukowana zmiana konformacyjna w białku receptorowym sprzyja wiązaniu wewnątrzkomórkowych heterotrimerycznych białek G związanych z receptorem, składających się z podjednostek Gα-GDP i Gβγ. Późniejsza wymiana GTP na PKB na podjednostce Gα powoduje dysocjację podjednostek białka G (G α-GTP i Gβγ), która z kolei będzie dalej inicjować dalsze szlaki sygnałowe2,3. Gdy Gα-GTP ulega hydrolizie, ponowne asocjowanie podjednostek Gα-GDP i Gβγ przekształci białko G z powrotem w stan spoczynku3,4. Istnieją różne typy białek G (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), które są kategoryzowane na podstawie podobieństwa sekwencji z podjednostką Gα5. Wszystkie te białka G indukują zdefiniowane wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, które leżą u podstaw biologicznej odpowiedzi na aktywację receptora. Po aktywacji receptora kinazy GPCR (GRK) fosforylują wewnątrzkomórkowy ogon GPCR, sprzyjając w ten sposób interakcji z β-aresztinami. Proces ten prowadzi do zakończenia sygnalizacji białka G, odczulania receptora i internalizacji6. β-aresztiny są również częścią kompleksów wielocząsteczkowych, które wyzwalają kaskady sygnalizacyjne niezależne od sygnalizacji białka G7.

GPCR są jednymi z najbardziej zweryfikowanych celów molekularnych dla interwencji terapeutycznej, ponieważ rozregulowana sygnalizacja za pośrednictwem GPCR, na przykład z powodu mutacji wzmacniających funkcję w genie receptora lub nadekspresji receptora, przyczynia się do etiologii wielu chorób ludzkich8. W związku z tym GPCR reprezentują jedną z najważniejszych klas celów leków badanych przez przemysł farmaceutyczny8,9,10. Godnym uwagi przykładem klinicznie istotnego GPCR jest receptor chemokiny CXC 4 (CXCR4), który może być aktywowany przez jedyny naturalny ligand, ligand chemokiny CXC 12 (CXCL12)11. Ze względu na ustaloną rolę jako głównego koreceptora dla wnikania i zakażenia ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1) w klastrze limfocytów T z dodatnim wynikiem różnicowania 4 (CD4)12, CXCR4 został po raz pierwszy zbadany jako cel leku przeciwwirusowego. Interakcja CXCL12-CXCR4 w szpiku kostnym dodatkowo reguluje zatrzymywanie i naprowadzanie komórek macierzystych i progenitorowych13. Ponadto, biorąc pod uwagę jego udział w wielu aspektach biologii nowotworów (np. przeżywalność komórek nowotworowych, przerzuty, angiogeneza związana z nowotworem)14 i kilka innych chorób ludzkich (np. chorób zapalnych)15, CXCR4 wzbudził znaczne zainteresowanie jako obiecujący cel do odkrycia leku. AMD3100, mała cząsteczka, która jest ukierunkowana na CXCR4, została początkowo odkryta jako kandydat na lek anty-HIV16 i nadal jest jednym z najsilniejszych antagonistów CXCR4 opisanych do tej pory17. Jego rozwój jako leku przeciwwirusowego został jednak przerwany18. Obecnie cząsteczka ta jest stosowana jako środek mobilizujący komórki macierzyste podczas leczenia pacjentów ze szpiczakiem mnogim i chłoniakiem18. Opisano kilka innych chemicznie niepowiązanych małych cząsteczek i leków biologicznych, które hamują funkcję CXCR4 z różną siłą19.

Metody wiązania receptorów są cennymi narzędziami w farmakologii, które pozwalają na identyfikację związków (np. małych cząsteczek), które bezpośrednio oddziałują z interesującym nas GPCR. Aby wykonać badania wiązania, nie ma potrzeby posiadania wcześniejszej wiedzy na temat wewnątrzkomórkowych właściwości sygnalizacyjnych lub funkcjonalności danego GPCR. Chociaż można to uznać za zaletę, oznacza to, że związki, dla których można wykazać wiązanie z receptorem, muszą być dalej charakteryzowane poprzez ocenę ich potencjalnej aktywności agonistycznej lub antagonistycznej. Aktywność tę można ocenić za pomocą testów farmakologicznych lub biologicznych związanych z badanym GPCR. W zależności od ich profilu aktywności, cząsteczki wiążące receptory mogą następnie potencjalnie ewoluować, aby stać się nowymi związkami wiodącymi do badań w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Cząsteczki, które specyficznie wiążą się z receptorem o wysokim powinowactwie, mogą również służyć jako rusztowania do generowania narzędzi terapeutycznych lub diagnostycznych, na przykład poprzez znakowanie radioaktywne w celu nieinwazyjnego obrazowania in vivo komórek nowotworowych20, lub jako potencjalne nośniki do ukierunkowanego dostarczania środków terapeutycznych21. W przypadku CXCR4 wykazano już obrazowanie in vivo komórek nowotworowych przy użyciu modeli mysich, w których znakowane cząsteczki ukierunkowane na CXCR4 umożliwiły wizualizację ksenoprzeszczepów raka u ludzi20,22,23.

W tym raporcie opisujemy szczegółowy protokół testu wiązania konkurencji, który umożliwia identyfikację małych cząsteczek i leków biologicznych, które bezpośrednio zakłócają wiązanie agonisty (CXCL12) z CXCR4. Podstawową zasadą testu jest konkurencja między ustaloną ilością znakowanego fluorescencyjnie liganda (CXCL12AF647, patrz Tabela materiałów i odczynników) a nieznakowanymi związkami w celu wiązania się z białkiem receptorowym17,24. Specyficzny sygnał fluorescencyjny ze znakowanego liganda związanego z pojedynczymi komórkami eksprymującymi CXCR4 jest następnie analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Ten sygnał fluorescencyjny zostanie zmniejszony, gdy nieznakowane małe cząsteczki zakłócą interakcję między CXCL12AF647 i CXCR4. W teście wykorzystuje się niemanipulowane żywe komórki, które endogennie eksprymują CXCR4 (tj. Komórki Jurkata). W związku z tym nie jest wymagane przygotowanie błony komórkowej, co sprawia, że test jest wygodny, szybki i kompatybilny ze zwiększoną przepustowością. Ponieważ stosuje się ligand znakowany fluorescencyjnie, unika się radioaktywności.

Ponieważ CXCL12 jest naturalnym agonistą dla CXCR4, związki małocząsteczkowe, które zakłócają wiązanie CXCL12AF647 w teście, prawdopodobnie będą oddziaływać z miejscem wiązania receptora ortosterycznego (tj. miejscem wiązania zajmowanym przez naturalnego agonistę). Cząsteczki, które oddziaływałyby z miejscami wiązania receptora topograficznie odrębnymi od miejsca wiązania ortosterycznego, pozostają niewykryte, jeśli nie wpływają na wiązanie CXCL12. Na przykład, dodatnie i ujemne modulatory allosteryczne, ważna i wyłaniająca się kategoria cząsteczek ukierunkowanych na GPCR działających na allosteryczne miejsca wiązania25, potencjalnie nie zostaną wykryte w tym teście. Ponadto nie można ustalić, czy związki zidentyfikowane za pomocą tego testu wiązania działają jako antagoniści receptora, czy jako agoniści. W związku z tym konieczne będzie zbadanie zidentyfikowanych związków w dodatkowych testach farmakologicznych lub funkcjonalnych związanych z receptorami. Testy te mogą obejmować (kombinację) testów opartych na fluorescencji lub luminescencji komórkowej w celu wykrycia drugich przekaźników (np. Ca2+, cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP)), testy fenotypowe lub biologiczne oraz testy rekrutacji β-aresztyny, których wybór zależy od specyficznych właściwości sygnalizacyjnych badanego GPCR. W związku z tym opisany w niniejszym dokumencie test wiązania konkurencyjnego służy głównie jako wstępny test przesiewowy, który musi być uzupełniony innymi testami komórkowymi, aby umożliwić dogłębną charakterystykę związków o sile wiązania z receptorem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie hodowli komórkowej

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w punktach 1 i 2 są wykonywane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej.

  1. Hodować komórki w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    UWAGA: W tym teście używane są komórki Jurkat (tj. ludzkie białaczkowe limfocyty T, które endogennie eksprymują CXCR417). Ekspresja CXCR4 na powierzchni komórki powinna być oceniana przez cały okres hodowli komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Opis procedury cytometrii przepływowej i odczynników do określania poziomów ekspresji receptora na powierzchni komórki nie jest jednak objęty zakresem tego protokołu, ale został opisany wcześniej17.
  2. Pozwól komórkom Jurkata rosnąć w zawiesinie, aż osiągną 80-85% zbieżności. Przed przeniesieniem komórek do nowej kolby należy odczekać, aż wszystkie odczynniki osiągną temperaturę pokojową (RT).
  3. Dodać 20 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej (pożywka RPMI-1640, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 2 mM glutamina) do nowej kolby hodowlanej T75.
  4. Dodać 5 ml zawiesiny komórek Jurkat z oryginalnej kolby T75 (zawierającej 25 ml zawiesiny komórek) do nowej kolby hodowlanej T75. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze.

2. Przygotowanie CXCL12, bufora testowego i komórek Jurkata do testu wiązania konkurencji.

  1. Przygotować roztwór podstawowy CXCL12AF647 (20 μg/ml; patrz Tabela Materiałów i Odczynników) rozpuszczając liofilizowany odczynnik (przechowywany w temperaturze -80 °C, w ciemności) w ultraczystej wodzie uzupełnionej 0,01% (objętość/objętość) polisorbatu 20. Porcje jednorazowego użytku z tego roztworu podstawowego należy przechowywać w temperaturze -80 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Przygotować bufor testowy, dodając 40 ml HEPES (1 M, 20 mM stężenie końcowe) do 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS, 10x, bez czerwieni fenolowej i bez wodorowęglanu sodu, 1x stężenie końcowe). Dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 2 l. Dodać 4 g (0,2% wagowo-objętościowo) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i rozpuścić BSA przez mieszanie magnetyczne. Na koniec dostosuj pH do 7,4 (użyj do tego NaOH) i przefiltruj roztwór przez pory 0,2 μm (patrz Tabela materiałów i odczynników) za pomocą kolektora próżniowego.
    UWAGA: Ten bufor testowy będzie używany we wszystkich dalszych krokach protokołu.
  3. Policz liczbę i żywotność komórek. W tym celu należy pobrać próbkę zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć ją w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    UWAGA: Rutynowo używamy automatycznego analizatora żywotności komórek (patrz Tabela materiałów i odczynników) zdolnego do zliczania zawiesin komórek w różnych stężeniach. Do liczenia komórek rozcieńczyć 0,5 ml zawiesiny komórek w 1,5 ml PBS (możliwe są również inne rozcieńczenia, np. 0,1 ml w 1,9 ml PBS). Zastosowanie tej metody, która opiera się na metodzie wykluczania barwnika błękitu trypanowego, zostało opisane wcześniej26. Na rynku dostępnych jest kilka innych urządzeń do zliczania liczby komórek i żywotności, które powinny działać równie dobrze.
  4. Zebrać żądaną liczbę komórek (tj. ~24 x 106 komórek, aby uruchomić test z jedną kompletną 96-dołkową płytką) w sterylnej probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników dla rodzaju użytej wirówki) przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Delikatnie odlać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać świeży bufor do oznaczania (np. 20 ml) i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  6. Ponownie odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Ponownie odlać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w świeżym buforze do oznaczania, aby uzyskać gęstość 5 x 106 komórek/ml.

3. Test wiążący konkurencję

UWAGA: Rzeczywisty test wiązania konkurencji jest wykonywany w RT i może być wykonywany w warunkach niesterylnych.

  1. Rozcieńczyć badane związki w buforze do oznaczania (patrz 2.2) w celu uzyskania pożądanego stężenia. Przygotować stałe stężenie związku do wstępnego badania przesiewowego (np. 10 μM stężenie końcowe) lub, alternatywnie, serię seryjnych rozcieńczeń stężeń w celu bardziej szczegółowej charakterystyki związków (np. seria rozcieńczeń 1/3, 1/4 lub 1/5, zaczynając od 1 μM, stężenie końcowe). Należy pamiętać, że roztwór związku zostanie ostatecznie 2x rozcieńczony w teście; Dlatego przygotuj 2x stężony roztwór.
  2. Dozuj 100 μl roztworu złożonego (2x stężonego) do przezroczystej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej (patrz Tabela materiałów i odczynników) zgodnie z wcześniej zdefiniowanym układem eksperymentalnym (np. Rysunek 1C).
    UWAGA: Na tym etapie do testu włącza się ujemne i dodatnie próbki kontrolne. W ujemnej próbce kontrolnej dodaje się 100 μl buforu do oznaczania zamiast związku do studzienek płytki 96-dołkowej. W przypadku dodatniej próbki kontrolnej na tym etapie dodaje się również bufor do oznaczania. Zobacz także Rysunek 1C dla typowego układu eksperymentalnego, w którym testowany jest szereg rozcieńczeń kilku związków.
  3. Dodać 50 μl zawiesiny komórek (patrz 2.7; 0,25 x 106 komórek) ze zbiornika odczynnika do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Dodaj 50 μl znakowanego fluorescencyjnie CXCL12 (tj. 100 ng/ml CXCL12AF647 w buforze testowym, 4x zagęszczony, 25 ng/ml stężenie końcowe) z podobnego zbiornika odczynnika do dołków płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: W przypadku ujemnych próbek kontrolnych należy zamiast tego dodać bufor do oznaczania. W związku z tym sygnał fluorescencyjny wykryty w ujemnych próbkach kontrolnych będzie odpowiadał autofluorescencyjnemu sygnałowi tła (Rysunek 1A). W przypadku dodatnich próbek kontrolnych dodać 50 μl/basenik CXCL12AF647. Próbki kontroli pozytywnej dadzą maksymalny wykryty sygnał fluorescencji, ponieważ nie uwzględniono potencjalnego hamowania przez wstępną inkubację ze związkami (Rysunek 1A).
  5. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z granulowanych komórek, odwracając płytkę. Osusz płytkę na chusteczce.
  6. Dodać 200 μl świeżego buforu do oznaczania ze zbiornika odczynnika do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Natychmiast kontynuuj.
  7. Ponownie odwirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez odwrócenie płytki i ponownie wysuszyć ją na chusteczce.
  8. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl 1% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS. Ten krok naprawi komórki.
  9. Natychmiast kontynuować postępowanie z protokołem, dokonując ilościowego oznaczania fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Analiza próbek metodą cytometrii przepływowej

CXCL12AF647 barwione i utrwalone komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Można zastosować kilka rodzajów cytometrów przepływowych, ale muszą one być wyposażone w odpowiedni laser (tj. laser czerwony, zakres wzbudzenia ~630 nm) do wzbudzenia oraz odpowiednie filtry do wykrywania fluoroforów (filtry emisyjne ~660 nm). Muszą one być zdolne do pracy z próbkami w formacie płytki 96-dołkowej. Przykłady odpowiednich urządzeń do cytometrii przepływowej podano w tabeli materiałów i odczynników.

  1. Uruchom urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników).
  2. Wybierz następujące parametry komórkowe, które mają być wizualizowane w formacie kropki: rozproszenie do przodu (FSC), rozproszenie boczne (SSC) i kanał detekcji fluoroforu (CXCL12AF647).
    UWAGA: W przypadku parametru FSC komórki są rozróżniane na podstawie ich wielkości, ponieważ wykrywana absorpcja światła jest proporcjonalna do średnicy ogniwa. Parametr SSC, mierzący rozproszenie światła pod kątem 90°, dostarcza informacji o ziarnistości komórek.
  3. Należy wybrać jedną próbkę (np. próbkę kontroli ujemnej) w celu przeprowadzenia bramkowania określonej jednorodnej populacji komórek w oparciu o parametry FSC i SSC.
    1. Wybierz automatyczne wstrzyknięcie ~100 μl utrwalonych komórek z tej próbki kontroli ujemnej do cytometru przepływowego. Przed wstrzyknięciem należy wybrać opcję "mieszanie" i użyć natężenia przepływu próbki 1,5 μl/s.
    2. Uruchom ten przykład, wybierając opcję "Acquire Data" (Uzyskaj dane). Parametry FSC i SSC dla tej próbki pojawią się teraz na ekranie.
    3. Wybierz narzędzie do bramkowania oprogramowania. Na podstawie wizualizacji fsc i SSC dot blot wstępnie zdefiniuj jednorodną i żywotną populację komórek przez bramkowanie. Aby to zrobić, utwórz wielokąt (za pomocą narzędzia do bramkowania oprogramowania), który zawiera jednorodnie rozmieszczone pojedyncze komórki ("zdarzenia") oparte na tych dwóch wymiarach.
      UWAGA: Procedura bramkowania ma na celu zdefiniowanie jednorodnej i żywotnej populacji komórek, która zostanie wykorzystana do dalszej analizy. Bramkowanie opiera się na założeniu, że większość żywotnych komórek utworzy jednorodną populację komórek w oparciu o parametry FSC i SSC. Wykonując ten krok, można w dużej mierze wykluczyć z dalszej analizy szczątki komórkowe, martwe komórki i agregaty komórkowe. Ilustracja procesu bramkowania znajduje się w Rysunek 1B.
  4. Wybierz tę opcję, aby przeanalizować 20 000 "zdarzeń" (tj. pojedynczych komórek) na próbkę.
    UWAGA: Oznacza to, że dla każdej próbki ostatecznie zostanie przeanalizowanych 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce. Akwizycja danych dla każdej próbki będzie kontynuowana do momentu przeanalizowania tej liczby zdarzeń.
  5. Rozpocznij przebieg (wybierz "Nagraj dane"). Urządzenie do cytometrii przepływowej będzie teraz analizować wszystkie próbki jedna po drugiej, rejestrując średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej próbki. Ten MFI odpowiada średniemu sygnałowi fluorescencyjnemu odpowiadającemu 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce.

5. Analiza danych

Użyj MFI uzyskanego dla każdej próbki, aby wykonać wszystkie dalsze obliczenia. Analiza danych cytometrii przepływowej może być wykonywana za pomocą kilku dostępnych na rynku pakietów oprogramowania (patrz Tabela materiałów i odczynników).

  1. Aby określić procentowe zahamowanie sygnału wiązania fluorescencyjnego w wyniku wstępnej inkubacji związku, należy zastosować następujący wzór:
    figure-protocol-1
    gdzie:
    MFIExp = MFI próbki doświadczalnej (= poddanej działaniu związku)
    MIFPC = MIF kontroli dodatniej
    MIFNC = MIF kontroli ujemnej
  2. Aby określić wartość IC50 związku (tj. stężenie związku, które może zmniejszyć sygnał wiązania fluorescencyjnego o 50%), zastosuj następujący wzór:
    figure-protocol-2
    gdzie:
    Logconc.2 = logarytm stężenia związku, który powoduje zahamowanie różnicy między wartością MIF PC a NC
    o mniej niż 50% Logconc.1 = logarytm stężenia związku, który powoduje zahamowanie różnicy między wartością MIF PC a NC
    o więcej niż 50% UWAGA: Alternatywnie, w przypadku związków wysoce aktywnych, można wygenerować krzywą dawka-odpowiedź obejmującą kilka logarytmów wielkości w oparciu o MFI odpowiadający każdemu badanemu stężeniu związku. Stosując dopasowanie krzywej regresji nieliniowej za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów i odczynników), można następnie wywnioskować wartości IC50 z wygenerowanych krzywych. Przykład takiego podejścia do analizy jest pokazany w Rysunek 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny przebieg testu wiązania jest przedstawiony w Rysunek 1A. Ilustracja rodzaju danych cytometrii przepływowej uzyskanych dla różnych typów próbek w standardowym eksperymencie (tj. kontrola ujemna, kontrola pozytywna i próbka eksperymentalna) jest przedstawiona w Rysunek 1B, a możliwy układ płytki do przeprowadzenia testu w formacie płytki 96-dołkowej jest podany w Rysunek 1C. Inkubacja komórek Jurkat, które...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z innymi typami testów wiązania (tj. Eksperymenty z wiązaniem saturacyjnym i wiązaniem kinetycznym), testy wiązania konkurencyjnego najlepiej nadają się do celów przesiewowych. Rzeczywiście, umożliwiają one ocenę dużych partii nieznakowanych związków, na przykład małych cząsteczek, poprzez ocenę ich zdolności do zakłócania wiązania określonej ilości znakowanego liganda receptorowego. Związki, które wiążą się z innymi miejscami receptorowymi niż znakowany ligand, mogą pozostać niewykryte w teście. Ch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fonteynowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte przez KU Leuven (grant nr 1). PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant nr G.485.08) oraz Fondation Dormeur Vaduz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD FACSCanto IIBecton DickinsonNie dotyczyUrządzenie do cytometrii przepływowej
BD FACSDIVA Oprogramowanie
BD FACSArrayBecton DickinsonNie dotyczyUrządzenie do cytometrii przepływowej
BD FACSArray System Software
Graphpad PrismGraphpadpakiet oprogramowania używany do analizy regresji nieliniowej na rysunku 2 i rysunku 3
FlowJoFlowJo jest teraz spółką zależną należącą w całości do BD.
Vi-CELLBeckman CoulterNie dotyczyanalizator żywotności komórek
Sigma 3-18 KSSigmaNie dotyczyWirówka
AMD3100SigmaA5602-5mgspecyficzny dla CXCR4 antagonista
MaravirocPfizerlek antyretrowirusowy, antagonista CCR5, dostępny do badań w Selleckchem (kat#S2003), Sigma (kat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01fluorescencyjnie znakowany CXCL12, CXCL12AF647
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Life Technologie)15630-056
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Komórki JurkatZbiornik
PPSigmaBR703411
Filtr szybkiego przepływu: 0,2 i mikro; m aPESThermo Scientific566-0020
Płytka do mikromiareczkowania Sterilin, 96-dołkowa, dno U, przezroczystaThermo Scientific611U96
Probówki Falcon, 50mlGreiner Bio-One227 261
Kolba do hodowli tkankowych (T75)Corning353024
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)14065-049 odczynnika ATCC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
  3. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
  4. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  5. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  6. Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
  7. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  8. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  9. Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
  10. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  11. Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  12. Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
  13. Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
  14. Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
  15. Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  16. Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  19. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  20. Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
  21. Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
  22. Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
  23. De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
  24. Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  25. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  26. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  27. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  28. Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
  29. Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  30. Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  31. Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
  32. Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
  33. Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza cytometrycznawi zanie CXCR4konkurencja CXCL12odkrywanie lek w GPCRanaliza ywych kom rekwi zanie liganda fluorescencyjnegoanaliza wi zania konkurencyjnegokom rki Jurkatantagonista AMD3100kontrola Maraviroc

Powiązane artykuły