Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57271

⸱

10 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Streszczenie

Farmakologiczne celowanie w receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) ma ogromne znaczenie dla zdrowia ludzkiego, ponieważ dysfunkcyjna sygnalizacja za pośrednictwem GPCR przyczynia się do postępu wielu chorób. Para ligand/receptor CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)/CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) wzbudziła duże zainteresowanie kliniczne, na przykład jako potencjalny cel w leczeniu nowotworów i chorób zapalnych. Małe cząsteczki, a także przeciwciała terapeutyczne, które są specyficznie ukierunkowane na CXCR4 i hamują funkcję receptora, są zatem uważane za cenne narzędzia farmakologiczne. W tym miejscu opisano test komórkowy oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia identyfikację związków (np. małych cząsteczek), które znoszą wiązanie CXCL12 z CXCR4. Zasadniczo test opiera się na konkurencji o wiązanie receptora między stałą ilością znakowanego fluorescencyjnie CXCL12, naturalnego agonisty chemokiny dla CXCR4, a nieznakowanymi związkami. W związku z tym w tym teście unika się niepożądanego użycia sond znakowanych radioaktywnie. Ponadto żywe komórki są wykorzystywane jako źródło receptora (CXCR4) zamiast preparatów błon komórkowych. Pozwala to na łatwe dostosowanie testu do formatu płytki, co zwiększa przepustowość. Wykazano, że test ten jest cennym testem odkrywania leków generycznych w celu identyfikacji związków ukierunkowanych na CXCR4. Protokół może być prawdopodobnie dostosowany do innych GPCR, przynajmniej jeśli dostępne są ligandy znakowane fluorescencyjnie lub można je wygenerować. Wcześniejsza wiedza na temat wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych, które są indukowane po aktywacji tych GPCR, nie jest wymagana.

Wprowadzenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) to białka powierzchniowe komórek, które mogą być aktywowane przez ligandy zewnątrzkomórkowe (np. peptydy, hormony białkowe, aminy), regulując w ten sposób wiele procesów fizjologicznych i rozwojowych1. Gdy agonista zajmuje kieszeń wiążącą GPCR, indukowana zmiana konformacyjna w białku receptorowym sprzyja wiązaniu wewnątrzkomórkowych heterotrimerycznych białek G związanych z receptorem, składających się z podjednostek Gα-GDP i Gβγ. Późniejsza wymiana GTP na PKB na podjednostce Gα powoduje dysocjację podjednostek białka G (G α-GTP i Gβγ), która z kolei będzie dalej inicjować dalsze szlaki sygnałowe2,3. Gdy Gα-GTP ulega hydrolizie, ponowne asocjowanie podjednostek Gα-GDP i Gβγ przekształci białko G z powrotem w stan spoczynku3,4. Istnieją różne typy białek G (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), które są kategoryzowane na podstawie podobieństwa sekwencji z podjednostką Gα5. Wszystkie te białka G indukują zdefiniowane wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, które leżą u podstaw biologicznej odpowiedzi na aktywację receptora. Po aktywacji receptora kinazy GPCR (GRK) fosforylują wewnątrzkomórkowy ogon GPCR, sprzyjając w ten sposób interakcji z β-aresztinami. Proces ten prowadzi do zakończenia sygnalizacji białka G, odczulania receptora i internalizacji6. β-aresztiny są również częścią kompleksów wielocząsteczkowych, które wyzwalają kaskady sygnalizacyjne niezależne od sygnalizacji białka G7.

GPCR są jednymi z najbardziej zweryfikowanych celów molekularnych dla interwencji terapeutycznej, ponieważ rozregulowana sygnalizacja za pośrednictwem GPCR, na przykład z powodu mutacji wzmacniających funkcję w genie receptora lub nadekspresji receptora, przyczynia się do etiologii wielu chorób ludzkich8. W związku z tym GPCR reprezentują jedną z najważniejszych klas celów leków badanych przez przemysł farmaceutyczny8,9,10. Godnym uwagi przykładem klinicznie istotnego GPCR jest receptor chemokiny CXC 4 (CXCR4), który może być aktywowany przez jedyny naturalny ligand, ligand chemokiny CXC 12 (CXCL12)11. Ze względu na ustaloną rolę jako głównego koreceptora dla wnikania i zakażenia ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1) w klastrze limfocytów T z dodatnim wynikiem różnicowania 4 (CD4)12, CXCR4 został po raz pierwszy zbadany jako cel leku przeciwwirusowego. Interakcja CXCL12-CXCR4 w szpiku kostnym dodatkowo reguluje zatrzymywanie i naprowadzanie komórek macierzystych i progenitorowych13. Ponadto, biorąc pod uwagę jego udział w wielu aspektach biologii nowotworów (np. przeżywalność komórek nowotworowych, przerzuty, angiogeneza związana z nowotworem)14 i kilka innych chorób ludzkich (np. chorób zapalnych)15, CXCR4 wzbudził znaczne zainteresowanie jako obiecujący cel do odkrycia leku. AMD3100, mała cząsteczka, która jest ukierunkowana na CXCR4, została początkowo odkryta jako kandydat na lek anty-HIV16 i nadal jest jednym z najsilniejszych antagonistów CXCR4 opisanych do tej pory17. Jego rozwój jako leku przeciwwirusowego został jednak przerwany18. Obecnie cząsteczka ta jest stosowana jako środek mobilizujący komórki macierzyste podczas leczenia pacjentów ze szpiczakiem mnogim i chłoniakiem18. Opisano kilka innych chemicznie niepowiązanych małych cząsteczek i leków biologicznych, które hamują funkcję CXCR4 z różną siłą19.

Metody wiązania receptorów są cennymi narzędziami w farmakologii, które pozwalają na identyfikację związków (np. małych cząsteczek), które bezpośrednio oddziałują z interesującym nas GPCR. Aby wykonać badania wiązania, nie ma potrzeby posiadania wcześniejszej wiedzy na temat wewnątrzkomórkowych właściwości sygnalizacyjnych lub funkcjonalności danego GPCR. Chociaż można to uznać za zaletę, oznacza to, że związki, dla których można wykazać wiązanie z receptorem, muszą być dalej charakteryzowane poprzez ocenę ich potencjalnej aktywności agonistycznej lub antagonistycznej. Aktywność tę można ocenić za pomocą testów farmakologicznych lub biologicznych związanych z badanym GPCR. W zależności od ich profilu aktywności, cząsteczki wiążące receptory mogą następnie potencjalnie ewoluować, aby stać się nowymi związkami wiodącymi do badań w badaniach przedklinicznych i klinicznych. Cząsteczki, które specyficznie wiążą się z receptorem o wysokim powinowactwie, mogą również służyć jako rusztowania do generowania narzędzi terapeutycznych lub diagnostycznych, na przykład poprzez znakowanie radioaktywne w celu nieinwazyjnego obrazowania in vivo komórek nowotworowych20, lub jako potencjalne nośniki do ukierunkowanego dostarczania środków terapeutycznych21. W przypadku CXCR4 wykazano już obrazowanie in vivo komórek nowotworowych przy użyciu modeli mysich, w których znakowane cząsteczki ukierunkowane na CXCR4 umożliwiły wizualizację ksenoprzeszczepów raka u ludzi20,22,23.

W tym raporcie opisujemy szczegółowy protokół testu wiązania konkurencji, który umożliwia identyfikację małych cząsteczek i leków biologicznych, które bezpośrednio zakłócają wiązanie agonisty (CXCL12) z CXCR4. Podstawową zasadą testu jest konkurencja między ustaloną ilością znakowanego fluorescencyjnie liganda (CXCL12AF647, patrz Tabela materiałów i odczynników) a nieznakowanymi związkami w celu wiązania się z białkiem receptorowym17,24. Specyficzny sygnał fluorescencyjny ze znakowanego liganda związanego z pojedynczymi komórkami eksprymującymi CXCR4 jest następnie analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Ten sygnał fluorescencyjny zostanie zmniejszony, gdy nieznakowane małe cząsteczki zakłócą interakcję między CXCL12AF647 i CXCR4. W teście wykorzystuje się niemanipulowane żywe komórki, które endogennie eksprymują CXCR4 (tj. Komórki Jurkata). W związku z tym nie jest wymagane przygotowanie błony komórkowej, co sprawia, że test jest wygodny, szybki i kompatybilny ze zwiększoną przepustowością. Ponieważ stosuje się ligand znakowany fluorescencyjnie, unika się radioaktywności.

Ponieważ CXCL12 jest naturalnym agonistą dla CXCR4, związki małocząsteczkowe, które zakłócają wiązanie CXCL12AF647 w teście, prawdopodobnie będą oddziaływać z miejscem wiązania receptora ortosterycznego (tj. miejscem wiązania zajmowanym przez naturalnego agonistę). Cząsteczki, które oddziaływałyby z miejscami wiązania receptora topograficznie odrębnymi od miejsca wiązania ortosterycznego, pozostają niewykryte, jeśli nie wpływają na wiązanie CXCL12. Na przykład, dodatnie i ujemne modulatory allosteryczne, ważna i wyłaniająca się kategoria cząsteczek ukierunkowanych na GPCR działających na allosteryczne miejsca wiązania25, potencjalnie nie zostaną wykryte w tym teście. Ponadto nie można ustalić, czy związki zidentyfikowane za pomocą tego testu wiązania działają jako antagoniści receptora, czy jako agoniści. W związku z tym konieczne będzie zbadanie zidentyfikowanych związków w dodatkowych testach farmakologicznych lub funkcjonalnych związanych z receptorami. Testy te mogą obejmować (kombinację) testów opartych na fluorescencji lub luminescencji komórkowej w celu wykrycia drugich przekaźników (np. Ca2+, cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP)), testy fenotypowe lub biologiczne oraz testy rekrutacji β-aresztyny, których wybór zależy od specyficznych właściwości sygnalizacyjnych badanego GPCR. W związku z tym opisany w niniejszym dokumencie test wiązania konkurencyjnego służy głównie jako wstępny test przesiewowy, który musi być uzupełniony innymi testami komórkowymi, aby umożliwić dogłębną charakterystykę związków o sile wiązania z receptorem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Prowadzenie hodowli komórkowych

UWAGA: Wszystkie etapy opisane w punktach 1 i 2 są wykonywane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Hodować komórki w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem.
    UWAGA: W tym badaniu zastosowano komórki Jurkat (t.j. ludzkie leukemiczne limfocyty T, które endogennie wykazują ekspresję CXCR417). Ekspresja CXCR4 na powierzchni komórek powinna być oceniana podczas hodowli komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej. Opis procedury cytometrii przepływowej oraz odczynników służących do oznaczenia poziomów ekspresji receptorów na powierzchni komórek nie mieści się jednak w zakresie niniejszego protokołu, lecz został opisany wcześniej17.
  2. Pozostawić komórki Jurkat w hodowli zawiesinowej do momentu osiągnięcia konfluencji na poziomie 80 - 85%. Przed przeniesieniem komórek do nowej kolby należy doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej (RT).
  3. Do nowej kolby hodowlanej T75 dodać 20 mL świeżej kompletnej pożywki wzrostowej (pożywka RPMI-1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM glutaminy).
  4. Do nowej kolby hodowlanej T75 dodać 5 mL zawiesiny komórek Jurkat z oryginalnej kolby T75 (zawierającej 25 mL zawiesiny komórkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaniem.

2. Przygotowanie CXCL12, buforu do analizy oraz komórek Jurkat do konkurencyjnego testu wiązania.

  1. Przygotować roztwór zapasowy CXCL12AF647 (20 µg/mL; patrz Tabela materiałów i odczynników), rozpuszczając liofilizowany odczynnik (przechowywany w -80 °C, w ciemności) w wodzie ultrapurej z dodatkiem 0,01% (obj. obj.) Polisorbatu 20. Alikwoty do jednorazowego użycia z tego roztworu zapasowego przechowywać w -80 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Przygotować bufor do analizy, dodając 40 mL HEPES (1 M, stężenie końcowe 20 mM) do 20 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS, 10x, bez czerwieni fenolowej i bez wodorowęglanu sodu, stężenie końcowe 1x). Dodać wodę ultrapureą do uzyskania końcowej objętości 2 L. Dodać 4 g (0,2% mas./obj.) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i rozpuścić BSA za pomocą mieszadła magnetycznego. Na koniec dostosować pH do 7,4 (używając NaOH) i przefiltrować roztwór przez pory o rozmiarze 0,2 µm (patrz Tabela materiałów i odczynników) przy użyciu kolektora próżniowego.
    UWAGA: Ten bufor do analizy będzie wykorzystywany we wszystkich kolejnych krokach protokołu.
  3. Policzyć liczbę i żywotność komórek. W tym celu pobrać próbkę zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć ją w soli fosforanowej w buforze (PBS).
    UWAGA: Rutynowo stosujemy automatyczny analizator żywotności komórek (patrz Tabela materiałów i odczynników) zdolny do liczenia zawiesin komórkowych o różnych stężeniach. Do liczenia komórek rozcieńczyć 0,5 mL zawiesiny komórkowej w 1,5 mL PBS (możliwe są również inne rozcieńczenia, np. 0,1 mL w 1,9 mL PBS). Zastosowanie tej metody, opartej na metodzie wykluczania barwnika trypan błękitny, zostało opisane wcześniej26. W sprzedaży dostępne jest kilka innych urządzeń do liczenia liczby i żywotności komórek, które powinny działać równie dobrze.
  4. Zebrać pożądaną liczbę komórek (tj. ~24 x 106 komórek do przeprowadzenia analizy na jednej pełnej płytce 96-dołkowej) w sterylnej probówce 50 mL poprzez wirowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników w celu sprawdzenia rodzaju użytej wirówki) przy 40 x g przez 5 min w temp. pokojowej.
  5. Ostrożnie odlać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać świeży bufor do analizy (np. 20 mL) i resuspenderć komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  6. Ponownie odwirować komórki przy 40 x g przez 5 min w temp. pokojowej.
  7. Ponownie odlać supernatant i resuspenderć osad komórkowy w świeżym buforze do analizy, aby uzyskać gęstość 5 x 106 komórek/mL.

3. Analiza wiązania konkurencyjnego

UWAGA: Właściwy konkurencyjny test wiązania przeprowadza się w temperaturze pokojowej i można go wykonać w warunkach niesterylnych.

  1. Rozcieńczyć badane związki w buforze do analizy (patrz 2.2), aby uzyskać pożądane stężenie. Przygotować stałe stężenie związku dla wstępnego przesiewu (np. stężenie końcowe 10 µM) lub alternatywnie serię rozcieńczeń dla bardziej szczegółnej charakterystyki związków (np. serię rozcieńczeń 1/3, 1/4 lub 1/5, zaczynając od stężenia końcowego 1 µM). Należy pamiętać, że roztwór związku zostanie ostatecznie rozcieńczony dwukrotnie w analizie; dlatego należy przygotować roztwór o stężeniu 2x.
  2. Rozdać 10 µL roztworu związku (stężenie 2x) do przezroczystej płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem (patrz Tabela materiałów i odczynników) zgodnie z wcześniej określonym układem eksperymentalnym (np. Rysunek 1C).
    UWAGA: Na tym etapie do analizy włącza się próbki kontroli negatywnej i pozytywnej. W próbce kontroli negatywnej dołków płytki 96-dołkowej dodaje się 10 µL buforu do analizy zamiast związku. W przypadku próbki kontroli pozytywnej na tym etapie również dodaje się bufor do analizy. Patrz również Rysunek 1C w celu uzyskania typowego układu eksperymentalnego, w którym testowana jest seria rozcieńczeń kilku związków.
  3. Dodać 50 µL zawiesiny komórkowej (patrz 2.7; 0,25 x 106 komórek) z rezerwuaru z odczynnikiem do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować płytkę przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności.
  4. Dodać 50 µL fluorescencyjnie znakowanego CXCL12 (tj. 10 ng/mL CXCL12AF647 w buforze do analizy, stężenie 4x, stężenie końcowe 25 ng/mL) z analogicznego rezerwuaru dołków płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: W przypadku próbek kontroli negatywnej dodać zamiast tego bufor do analizy. W związku z tym sygnał fluorescencyjny wykryty w próbkach kontroli negatywnej będzie odpowiadał autofluorescencyjnemu sygnałowi tła (Rysunek 1A). W przypadku próbek kontroli pozytywnej dodać 50 µL/dołek CXCL12AF647. Próbki kontroli pozytywnej dadzą maksymalny wykryty sygnał fluorescencji, ponieważ nie zastosowano potencjalnego hamowania poprzez preinkubację ze związkami (Rysunek 1A).
  5. Odwirować płytkę 96-dołkową przy 40 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz z osadzonych komórek poprzez odwrócenie płytki. Osuszyć płytkę za pomocą chusteczki.
  6. Dodać 20 µL świeżego buforu do analizy z rezerwuaru z odczynnikiem dołków za pomocą pipety wielokanałowej. Niezwłocznie przejść do kolejnego kroku.
  7. Ponownie odwirować płytkę przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz poprzez odwrócenie płytki i ponownie osuszyć ją na chusteczce.
  8. Delikatnie resuspender osad komórkowy w 20 µL 1% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS. Ten krok spowoduje utrwalenie komórek.
  9. Niezwłocznie kontynuować protokół, przechodząc do ilościowego oznaczenia fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.

4. Analiza próbek metodą cytometrii przepływowej

CXCL12AF647 barwione i utrwalone komórki są teraz gotowe do analizy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Można zastosować kilka typów cytometrów przepływowych, jednak muszą być one wyposażone w odpowiedni laser (t. j. laser czerwony, zakres wzbudzenia ~630 nm) do wzbudzenia oraz odpowiednie filtry do detekcji fluoroforów (filtry emisyjne ~60 nm). Urządzenia te muszą umożliwiać analizę próbek w formacie płytek 96-dołkowych. Przykłady odpowiednich urządzeń do cytometrii przepływowej podano w Tabela materiałów i odczynników.

  1. Uruchom urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów i odczynników).
  2. Wybierz następujące parametry komórkowe do wizualizacji w formacie dot blot: rozproszenie przednie (FSC), rozproszenie boczne (SSC) oraz kanał detekcji fluoroforu (CXCL12AF647).
    UWAGA: Dzięki parametrowi FSC komórki są rozróżniane na podstawie ich wielkości, ponieważ wykrywane pochłanianie światła jest proporcjonalne do średnicy komórki. Parametr SSC, mierzący rozproszenie światła pod kątem 90°, dostarcza informacji o ziarnistości komórek.
  3. Wybierz jedną próbkę (np. próbkę kontrolną negatywną), aby przeprowadzić gating zdefiniowanej jednorodnej populacji komórek na podstawie parametrów FSC i SSC.
    1. Wybierz automatyczną iniekcję ~10 µL utrwalonych komórek z tej próbki kontrolnej negatywnej do cytometru przepływowego. Przed iniekcją wybierz opcję „mixing” (mieszanie) i ustaw prędkość przepływu próbki na 1,5 µL/s.
    2. Przeanalizuj tę próbkę, wybierając „Acquire Data”. Parametry FSC i SSC dla tej próbki pojawią się teraz na ekranie.
    3. Wybierz narzędzie do gatowania (gating) w oprogramowaniu. Na podstawie wizualizacji dot blot parametrów FSC i SSC zdefiniuj poprzez gating jednorodną i żywotną populację komórek. W tym celu utwórz wielokąt (za pomocą narzędzia gatingowego oprogramowania), który obejmuje jednorodnie rozmieszczone pojedyncze komórki („zdarzenia”) w oparciu o te dwa wymiary.
      UWAGA: Procedura gatowania ma na celu zdefiniowanie jednorodnej i żywotnej populacji komórek, która zostanie wykorzystana do dalszych analiz. Gatowanie opiera się na założeniu, że większość żywotnych komórek utworzy jednorodną populację w oparciu o parametry FSC i SSC. Dzięki temu krokowi z dalszych analiz można w dużej mierze wykluczyć debris komórkowy, martwe komórki oraz agregaty komórkowe. Ilustracja procesu gatowania przedstawiona jest na Ryc. 1B.
  4. Wybierz analizę 20 0 „zdarzeń” (tj. pojedynczych komórek) na próbkę.
    UWAGA: Oznacza to, że dla każdej próbki ostatecznie przeanalizowanych zostanie 20 0 komórek mieszczących się w zdefiniowanym obszarze bramki (gate). Akwizycja danych dla każdej próbki będzie trwać do momentu przeanalizowania takiej liczby zdarzeń.
  5. Rozpocznij pomiar (wybierz „Record Data”). Urządzenie do cytometrii przepływowej przeanalizuje teraz wszystkie próbki jedna po drugiej, rejestrując średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej z nich. Ta wartość MFI odpowiada średniemu sygnałowi fluorescencyjnemu dla 20 0 komórek mieszczących się w zdefiniowanej bramce.

5. Analiza danych

Do wszystkich dalszych obliczeń należy wykorzystać MFI uzyskaną dla każdej próbki. Analizę danych z cytometrii przepływowej można przeprowadzić za pomocą kilku dostępnych komercyjnie pakietów oprogramowania (patrz Tabela materiałów i odczynników).

  1. Aby określić procentowe zahamowanie sygnału wiązania fluorescencyjnego w wyniku preinkubacji z związkiem, należy zastosować następujący wzór:
    Równanie wyników cytometrii przepływowej dla analizy mediany intensywności fluorescencji (MFI), metoda obliczeniowa.
    Gdzie:
    MFIEksperyment = MFI próbki eksperymentalnej (= traktowanej związkiem)
    MFIPC = MFI kontroli pozytywnej
    MFINC = MFI kontroli negatywnej
  2. Aby wyznaczyć IC50 wartość związku (t.j. stężenie związku, które może zredukować sygnał wiązania fluorescencyjnego o 50%), zastosuj następujący wzór:
    Wzór na logarytmiczne stężenie dla analizy MFI; równanie opisujące pomiar fluorescencji.
    Gdzie:
    Dziennikstęż.2 = logarytm stężenia związku, który powoduje hamowanie mniejsze niż 50% różnicy między wartością MFI dla kontroli pozytywnej (PC) i kontroli negatywnej (NC)
    Dziennikstęż.1 = logarytm stężenia związku, który powoduje ponad 50% inhibicję różnicy między wartością MFI dla PC a NC
    UWAGA: Alternatywnie, w przypadku związków o wysokiej aktywności, na podstawie MFI odpowiadającego każdemu z badanych stężeń związku można wygenerować krzywą zależności dawka-odpowiedź obejmującą kilka rzędów wielkości. Poprzez zastosowanie nieliniowej regresji dopasowania krzywej z użyciem odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów i odczynników), IC50 wartości można następnie odczytać z wygenerowanych krzywych. Przykład takiego podejścia analitycznego przedstawiono w Rycina 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat badania wiązania przedstawiono na Ryc. 1A. Ilustracja rodzaju danych z cytometrii przepływowej uzyskanych dla różnych typów próbek w standardowym eksperymencie (t.j. kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej i próbki eksperymentalnej) znajduje się na Ryc. 1B, a możliwy układ płytki do przeprowadzenia badania w formacie 96-dołkowym przedstawiono na Ryc. 1C. Inkubacja komórek Jur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z innymi typami testów wiązania (tj. Eksperymenty z wiązaniem saturacyjnym i wiązaniem kinetycznym), testy wiązania konkurencyjnego najlepiej nadają się do celów przesiewowych. Rzeczywiście, umożliwiają one ocenę dużych partii nieznakowanych związków, na przykład małych cząsteczek, poprzez ocenę ich zdolności do zakłócania wiązania określonej ilości znakowanego liganda receptorowego. Związki, które wiążą się z innymi miejscami receptorowymi niż znakowany ligand, mogą pozostać niewykryte w teście. Ch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fonteynowi za doskonałą pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte przez KU Leuven (grant nr 1). PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant nr G.485.08) oraz Fondation Dormeur Vaduz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD FACSCanto IIBecton DickinsonNie dotyczyUrządzenie do cytometrii przepływowej
BD FACSDIVA Oprogramowanie
BD FACSArrayBecton DickinsonNie dotyczyUrządzenie do cytometrii przepływowej
BD FACSArray System Software
Graphpad PrismGraphpadpakiet oprogramowania używany do analizy regresji nieliniowej na rysunku 2 i rysunku 3
FlowJoFlowJo jest teraz spółką zależną należącą w całości do BD.
Vi-CELLBeckman CoulterNie dotyczyanalizator żywotności komórek
Sigma 3-18 KSSigmaNie dotyczyWirówka
AMD3100SigmaA5602-5mgspecyficzny dla CXCR4 antagonista
MaravirocPfizerlek antyretrowirusowy, antagonista CCR5, dostępny do badań w Selleckchem (kat#S2003), Sigma (kat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01fluorescencyjnie znakowany CXCL12, CXCL12AF647
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Life Technologie)15630-056
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Komórki JurkatZbiornik
PPSigmaBR703411
Filtr szybkiego przepływu: 0,2 i mikro; m aPESThermo Scientific566-0020
Płytka do mikromiareczkowania Sterilin, 96-dołkowa, dno U, przezroczystaThermo Scientific611U96
Probówki Falcon, 50mlGreiner Bio-One227 261
Kolba do hodowli tkankowych (T75)Corning353024
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)14065-049 odczynnika ATCC

Bibliografia

  1. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  2. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
  3. Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
  4. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  5. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  6. Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
  7. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  8. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  9. Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
  10. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  11. Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  12. Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
  13. Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
  14. Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
  15. Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  16. Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  19. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  20. Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
  21. Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
  22. Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
  23. De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
  24. Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  25. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  26. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  27. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  28. Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
  29. Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  30. Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  31. Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
  32. Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
  33. Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza cytometrycznawi zanie CXCR4konkurencja CXCL12odkrywanie lek w GPCRanaliza ywych kom rekwi zanie liganda fluorescencyjnegoanaliza wi zania konkurencyjnegokom rki Jurkatantagonista AMD3100kontrola Maraviroc
Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.