Artykuł metodologiczny

Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57272

⸱

2 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

W tym artykule

Podsumowanie

Plastyczność architektury jądrowej jest kontrolowana przez dynamiczne mechanizmy epigenetyczne, w tym niekodujące RNA, metylację DNA, repozycjonowanie nukleosomów, a także skład i modyfikację histonów. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji elementów regulatorowych wspomaganej formaldehydem (FAIRE), który umożliwia określenie dostępności chromatyny w powtarzalny, niedrogi i prosty sposób.

Streszczenie

Odpowiednia ekspresja genów w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe, czyli transkrypcja genów specyficzna dla tkanek i linii, krytycznie zależy od ściśle określonych stanów organizacji chromatyny. Dynamiczna architektura jądra jest kontrolowana przez wiele mechanizmów i kształtuje transkrypcyjne programy wyjściowe. Dlatego ważne jest, aby określić dostępność chromatyny specyficznej dla locus w wiarygodny sposób, który jest najlepiej niezależny od przeciwciał, które mogą być potencjalnie mylącym źródłem zmienności eksperymentalnej. Dostępność chromatyny można mierzyć różnymi metodami, w tym testem izolacji elementów regulatorowych wspomaganym formaldehydem (FAIRE), który pozwala określić ogólną dostępność chromatyny w stosunkowo niewielkiej liczbie komórek. W tym miejscu opisujemy protokół FAIRE, który umożliwia prostą, niezawodną i szybką identyfikację regionów genomu o niskim poziomie obecności białka. W tej metodzie DNA jest kowalencyjnie wiązane z białkami chromatyny przy użyciu formaldehydu jako środka sieciującego i ścinane na małe kawałki. Wolne DNA jest następnie wzbogacane za pomocą ekstrakcji fenol:chloroform. Stosunek wolnego DNA określa się za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) lub sekwencjonowania DNA (DNA-seq) w porównaniu z próbką kontrolną reprezentującą całkowite DNA. Regiony o luźniejszej strukturze chromatyny są wzbogacone w wolną próbkę DNA, co pozwala na identyfikację regionów genomowych o niższym zagęszczeniu chromatyny.

Wprowadzenie

Genomowe DNA komórek eukariotycznych jest ciasno upakowane w nukleosomach, które muszą zostać usunięte lub przemodelowane, aby umożliwić interakcję innych białek z DNA. Aktywacja transkrypcyjna genu zazwyczaj prowadzi do bardziej otwartej konfiguracji jego struktury nukleosomalnej, szczególnie w klasie +1 nucleosome1, aby ułatwić transkrypcję przez polimerazę RNA. Ponadto regiony regulatorowe, takie jak promotory i wzmacniacze, ulegają dynamicznym zmianom w dostępności chromatyny, aby umożliwić interakcję z modyfikatorami chromatyny lub czynnikami transkrypcyjnymi2. Opracowano kilka podejść w celu identyfikacji tych regionów wolnych od nukleosomów. Należą do nich wrażliwość na nukleazy, takie jak DNase I3 lub nucleaza mikrokokowa4, które mogą uzyskać dostęp do DNA tylko wtedy, gdy nie jest ono ściśle owinięte wokół nukleosomów. Inne metody identyfikacji otwartej chromatyny lub wolnego DNA obejmują integrację elementów retrotranspozycyjnych za pośrednictwem transpozazy (Test dla chromatyny dostępnej dla transpozazy, ATAC)5 lub immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) przy użyciu przeciwciał przeciwko histonom. Metoda FAIRE nie opiera się na zdolności enzymu do dotarcia do DNA lub wiązaniu przeciwciała z określonym białkiem, ale zamiast tego opiera się na oczyszczaniu regionów wolnych od nukleosomów przez ekstrakcję fenolu:chloroformu6,7. W tej metodzie DNA jest kowalencyjnie wiązane z białkami chromatyny przez czynnik sieciujący formaldehyd, a następnie jest ścinane na małe kawałki za pomocą sonikacji. Ciasno upakowane regiony chromatyny będą miały obfite wiązania krzyżowe DNA/białko, podczas gdy regiony DNA bez lub z niewielką liczbą nukleosomów będą miały niewiele lub wcale usieciowanych kompleksów DNA/białka. Ekstrakcja fenolu:chloroform umożliwia oczyszczenie nieusieciowanego wolnego DNA w fazie wodnej, podczas gdy DNA usieciowane z białkami jest wychwytywane w organicznej fazie fenolowej lub interfazie wodno-organicznej wraz z białkami. Kwantyfikacja tego wolnego DNA w porównaniu z odniesieniem całkowitej próbki DNA pozwala na identyfikację regionów wolnych od chromatyny. Metoda FAIRE może być stosowana do charakterystyki poszczególnych regionów genomu, jak opisano tutaj, ale nadaje się również do identyfikacji dostępności chromatyny w całym genomie w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem, jak opisano w różnych modelach8,9,10,11,12,13. Wyniki uzyskane za pomocą FAIRE-seq i innych metod, takich jak ATAC-seq, w dużej mierze się pokrywają14. Metoda FAIRE jest bardzo solidną, tanią i łatwą do wykonania metodą identyfikacji regionów wolnych od nukleosomów. W przeciwieństwie do innych metod, nie wymaga eksperymentów pilotażowych w celu określenia odpowiedniego poziomu trawienia, jaki jest wymagany dla nukleaz (DNase-seq, MNase-seq) lub transpozaz (ATAC-seq) i szczegółowo omówiony w niedawnym przeglądzie15. Jedynymi parametrami, które należy dostosować, są warunki sonikacji, a w niektórych przypadkach czas utrwalenia. Ten artykuł opisuje prosty protokół, który jest schematycznie wyświetlany w Rysunek 1 i który nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza sonikatorem. Protokół może być wykonany w stosunkowo krótkim czasie i sprawia, że FAIRE jest łatwą i niezawodną metodą testowania dostępności chromatyny w wielu różnych typach komórek, począwszy od komórek płuc11 do pierwotnych komórek uzyskanych z wątroby myszy16.

Protokół

1. Dzień 1: Hodowla komórek

  1. Hodować komórki przeznaczone do analizy do pożądanej liczby. Warunki hodowli i pożywki zależą od badanych typów komórek.
    UWAGA: W zasadzie każda komórka eukariotyczna nadaje się do analizy dostępności chromatyny metodą FAIRE. W tym eksperymencie 4 x 106 komórek HEK-293T wysiewano do jednej szalki 10 cm w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% (v/v) FBS i 1% (w/v) penicyliny/streptomycyny, a następnie inkubowano w 5% CO2 i 37 °C przez 24 h, aż komórki osiągnęły 70 - 80% konfluencji (~ 8 x 106 komórek na szalkę).

2. Dzień 2: sieciowanie formaldehydem i zbieranie komórek

OSTROŻNIE: Formaldehyd jest silnie toksyczny i musi być zawsze używany pod dygestorium. Należy nosić odzież ochronną (rękawiczki i fartuch laboratoryjny). Odpady należy utylizować w odpowiedni sposób.

  1. W wyciągu dodaj formaldehyd bezpośrednio do pożywki hodowlanej komórek, aby osiągnąć stężenie końcowe 1% (v/v) (270 µL 37% (v/v) formaldehydu do 10 mL pożywki hodowlanej komórek). Inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C), ręcznie delikatnie kołysząc płytkami co 2 min.
    UWAGA: Czas sieciowania można dostosować w zależności od typu komórek. Dla większości linii komórkowych 10 min sieciowania jest wystarczające. W przypadku tkanek może być wymagana dłuższa inkubacja, aby umożliwić utrwalenie wszystkich komórek.
  2. Dodaj glicynę do stężenia końcowego 0,125 M, aby zneutralizować formaldehyd (dodaj 500 µL roztworu stokowego glicyny 2,5 M do 10 mL pożywki hodowlanej). Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej, kołysząc co 2 min.
  3. Przemyj komórki 3x lodowatym PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2H2O, 0,24 g/L KH2PO4, pH dostrojone do 7,4 za pomocą HCl lub NaOH). Odessij pożywkę i przemyj bezpośrednio w naczyniu lub kolbie hodowlanej, dodając 10 mL PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie, zachowując szczególną ostrożność w przypadku słabo przylegających komórek, takich jak HEK-293T. Dodawaj PBS ostrożnie przy ściance naczynia, aby uniknąć odrywania się komórek.
  4. Po trzecim przemyciu resuspenduj komórki w 1 mL lodowatego PBS i przenieś do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL na lodzie. W razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby je odczepić.
    UWAGA: Rozpoczynając pracę z ograniczoną ilością materiału, używaj probówek o niskim wiązaniu DNA, aby uniknąć utraty próbki podczas procedury.
  5. Wiruj przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C w chłodzonej wirówce stołowej. Usuń nadsącz poprzez ostrożne odessanie.

3. Lizy komórek i fragmentacja chromatyny

  1. Resuspenduj osad komórkowy w 1 mL buforu lizującego FAIRE (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptyny, 10 µg/mL aprotininy, 2 mM PMSF), a następnie resuspenduj komórki, ostrożnie pipetując zawiesinę w górę i w dół kilka razy. Inkubuj przez 20 min na lodzie. Na tym etapie, w razie potrzeby, przechowuj próbki w temperaturze -80 °C.
  2. poddaj sieciowane DNA sonikacji w celu pocięcia go do średniej wielkości 200 - 300 bp. Konkretne ustawienia sonikatora muszą zostać określone dla każdego źródła próbek oraz użytego urządzenia do sonikacji. W każdym przypadku należy upewnić się, że DNA zostało skutecznie pocięte. Krok optymalizacji pocięcia DNA opisano w punkcie 5.14. Podczas sonikacji chłodź próbki na lodzie, aby zapobiec ich przegrzaniu.
  3. Centryfuguj próbkę przez 15 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś supernatant do nowej probówki reakcyjnej. Podziel próbki na aliquoty po 100 µL. W razie potrzeby przechowuj próbki w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Protokół można w tym punkcie przerwać.

4. Odwiązanie sieciowania kontrolnego DNA

  1. Pobrać 100 µL aalikwot z kroku 3.4 w celu odwrócenia sieciowania i wykorzystania go jako referencji dla całkowitego DNA. Dodać 10 µL RNazy-A (10 mg/mL) i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 10 µL Proteinazy K (20 mg/mL). Używając programowalnego bloku grzejnego, inkubować przez 4 h w temperaturze 37 °C, a następnie przez 6 h w temperaturze 65 °C, aby przeprowadzić proteolizę białek i odwrócić sieciowanie. Na koniec przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do momentu wznowienia protokołu, a następnie przejść do kroku 5.
    UWAGA: Inne protokoły FAIRE wykorzystują w charakterze referencji próbki chromatyny z komórek, które nie zostały poddane sieciowaniu, co eliminuje potrzebę odwracania tego procesu11. Fakt, że próbki te nie są sieciowane, może prowadzić do różnic w wydajności sonikacji lub stabilności DNA, dlatego stosowanie referencyjnych próbek całkowitego DNA, które przeszły tę samą procedurę co próbki badawcze, jest bardziej dokładne.

5. Dzień 3: Oczyszczanie DNA metodą fenol:chloroform

  1. Pobrać alikwot z próbki bez odwrócenia procesu sieciowania z kroku 3.4. Dodać 10 µL RNazy-A (10 mg/mL) i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Pobrać alikwot z próbki bez odwrócenia procesu sieciowania z kroku 5.1 oraz próbkę z odwróconym procesem sieciowania z kroku 4.2 i postępować z nimi równolegle. Dodać H2O do uzyskania objętości końcowej 300 µL.
  3. W dygestorium dodać 300 µL mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) i intensywnie wymieszać za pomocą wortexa.
    OSTROŻNIE: Fenol jest substancją żrącą i toksyczną i musi być zawsze używany pod wyciągiem w dygestorium. Należy stosować odzież ochronną (rękawiczki i fartuch laboratoryjny), upewnić się, że probówki reakcyjne są szczelnie zamknięte oraz odpowiednio utylizować odpady.
  4. Wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie przenieść 280 µL górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej. Należy upewnić się, że nie przeniesiono żadnych zanieczyszczeń z interfazy, która zawiera również białka. Pozostałą dolną fazę zutylizować jako odpady rozpuszczalników organicznych.
  6. Powtórzyć kroki od 5.3 do 5.5 i ostrożnie przenieść 270 µL górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej.
  7. W dygestorium dodać 270 µL chloroformu i intensywnie wymieszać za pomocą wortexa.
    UWAGA: Krok ten służy do usunięcia pozostałego w próbce fenolu.
  8. Wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.
  9. Ostrożnie przenieść 250 µL górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej, dbając o to, aby nie przenieść zanieczyszczeń z interfazy. Pozostałą część próbki zutylizować jako odpady rozpuszczalników organicznych.
  10. Dodać 25 µL 5 M NaCl oraz 250 µL izopropanolu. Dodać 5 µL glikogenu (20 mg/mL) jako nośnik DNA. Dobrze wymieszać, odwracając probówki, i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej. Wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C, aby wytrącić DNA.
  11. Przemyć osad DNA za pomocą 400 µL 70% (v/v) etanolu. Wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.
  12. Ostrożnie odessać nadsącz i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 min w temperaturze pokojowej. Resuspendować w 100 µL buforu TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
  13. Inkubować próbkę wolnego DNA bez odwrócenia procesu sieciowania przez 4 h w temperaturze 65 °C w celu usunięcia wiązań sieciujących między cząsteczkami DNA. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C.
  14. Oznaczyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru i poddać alikwot analizie w celu sprawdzenia wielkości fragmentów na żelu agarozowym 2% (w/v). Dostosować czas i intensywność fragmentacji (shearing), w zależności od wyników analizy wielkości DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym, aby uzyskać średnią wielkość 200-300 bp.

6. Oznaczanie wolnego i całkowitego DNA za pomocą ilościowej polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

  1. Stosunek DNA wolnego od nukleosomów (dalej określanego jako wolne DNA) do całkowitego DNA określa się za pomocą qRT-PCR17,18. Próbki można również poddać analizie ilościowej za pomocą hybrydyzacji mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania w celu analizy w skali całego genomu.
  2. Zaprojektuj primery qPCR dla regionów poddawanych badaniu oraz dla kontroli pozytywnych i negatywnych.
    UWAGA: Odpowiednie kontrole pozytywne to primery zlokalizowane w promotorach aktywnych genów gospodarza (housekeeping genes), takich jak ACTB, GAPDH, TPI1 lub TUBA1A (kodujących β-aktynę, GAPDH, TPI lub α-tubulinę). Odpowiednie kontrole negatywne znajdują się w regionach heterochromatyny lub tzw. pustyniach genowych (gene deserts). Inne odpowiednie kontrole negatywne można zaprojektować w regionach genomowych sąsiadujących z badanym locus o dynamicznej regulacji, aby kontrolować lokalne różnice w liczbie kopii (Tabela 1).
  3. Rozcieńcz próbki DNA do końcowego stężenia 10 ng/µL w buforze TE i uwzględnij czynnik rozcieńczenia w końcowych obliczeniach (patrz krok 6.5).
  4. Przygotuj reakcję qPCR w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej, stosując następujący skład mieszaniny reakcyjnej na każdą studzienkę: matrycowe DNA: 20 ng (2 µL), primer forward 200 nM (0,4 µL z roztworu zapasowego 5 µM), primer reverse 200 nM (0,4 µL z roztworu zapasowego 5 µM), gotowa komercyjna mieszanina reakcyjna zawierająca zielony barwnik (5 µL z roztworu zapasowego 2x) oraz H2O do objętości 10 µL.
  5. Przeprowadź reakcję w urządzeniu do qPCR w czasie rzeczywistym, korzystając z trybu kwantyfikacji absolutnej, i wyznacz wartość Ct próbek dla różnych par primerów. Oblicz stosunek odzysku wolnego DNA do całkowitego DNA dla każdego primera, korzystając z poniższego wzoru i uwzględniając czynniki rozcieńczenia z kroku 6.3:
    figure-protocol-1
    Reprezentatywne wyniki oraz przykład obliczeń przedstawiono w Tabeli 2.
  6. Aby skompensować różnice między próbkami, znormalizuj wyniki względem stosunku odzysku kontroli pozytywnej:
    figure-protocol-2

Wyniki

Wykorzystaliśmy metodę FAIRE do pomiaru różnic w dostępności chromatyny genów MHC klasy II w komórkach HEK293T, zgodnie z opublikowanymi danymi19. Geny kodujące MHC klasy II są ekspresowane w komórkach prezentujących antygen (APCs), albo konstytutywnie, albo w odpowiedzi na sygnalizację cytokinową20. Ekspresja genów MHCII jest sterowana przez kompleks aktywatora, który wiąże się ze specyficznymi elementami DNA, zwanymi pudełkami XY, znajdującymi się w promotorach i enhancerach tych genów21,22. Odzwierciedla się to na poziomie chromatyny, co wykazała nasza analiza FAIRE wybranych regionów w genach MHC klasy II HLA-DPB1 i HLA-DMA. Eksperymenty te wykazały, że chromatyna jest otwarta w regionach obejmujących pudełka XY, podczas gdy w obrębie samych genów jest ona bardziej zwarta (Rycina 2).

Przykład obliczeń dla tego konkretnego eksperymentu: całkowitą próbkę DNA rozcieńczono 10-krotnie (czynnik rozcieńczenia 10), natomiast próbka wolnego DNA nie była rozcieńczana (czynnik rozcieńczenia 1) przed analizą qRT-PCR. Wartości Ct uzyskane dla różnych badanych regionów oraz obliczenia służące do wyznaczenia końcowych współczynników odzysku i względnych współczynników odzysku przedstawiono w Tabeli 2. Względne współczynniki odzysku wyznaczono z wykorzystaniem promotora ACTB jako kontroli pozytywnej. Należy zauważyć, że obliczenia te dotyczą jednego z powtórzeń wykorzystanych do wygenerowania wyników przedstawionych na Rysunku 2.

W innym kontekście badano dostępność chromatyny w modelu indukowalnej ekspresji genów. W tym przypadku zmierzono szybkie zmiany kondensacji chromatyny w odpowiedzi na bodziec prozapalny w postaci czynnika martwicy nowotworu (TNF). Komórki HeLa pozostawiono bez obróbki lub stymulowano TNF przez 1 h, po czym przeprowadzono analizę FAIRE w celu pomiaru kondensacji chromatyny w regionie promotora kontrolującego ekspresję genu kodującego cytokinę interleukinę 8 (IL8) reagującą na TNF. Wyniki te wykazały znaczny wzrost dostępności chromatyny w obrębie promotora IL8 w komórkach stymulowanych TNF (Rycina 3). Dostępność w obrębie promotora IL-8 po stymulacji TNF jest nawet wyższa niż ta stwierdzona w promotorze ACTB, co wskazuje na gwałtowny remodeling chromatyny w tym regionie regulatorowym. Ponieważ stosunek odzysku uzyskany w tym przypadku jest wyższy niż ten uzyskany w regionie wykorzystanym jako kontrola pozytywna (promotor ACTB), względny stosunek odzysku jest większy niż jeden.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat postępowania FAIRE. Komórki są sieciowane bezpośrednio w kolbie lub naczyniu hodowlanym poprzez dodanie formaldehydu (A). Po zneutralizowaniu formaldehydu komórki są trzykrotnie płukane lodowatym PBS (B), a następnie przenoszone do probówki reakcyjnej, gdzie zostają resuspendowane w buforze lizującym FAIRE i poddane sonikacji w celu fragmentacji DNA (C). Jedną porcję wyekstrahowanej chromatyny odsieciowuje się poprzez ogrzewanie w 65 °C, aby uzyskać referencyjną całkowitą ilość DNA (D), a następnie wolne DNA jest ekstrahowane za pomocą fenolu i chloroformu zarówno z porcji sieciowanej, jak i odsieciowanej (E). Na koniec DNA jest ilościowo oznaczane, a następnie oblicza się stosunek wolnego do całkowitego DNA (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Określanie dostępności chromatyny w klastrze genów MHC klasy II w komórkach HEK293T. Komórki HEK293T analizowano metodą FAIRE. Stosunek wolnego do całkowitego DNA (t.j. względny stopień odzysku) określono dla promotora genu ACTB jako kontroli pozytywnej, regionu heterochromatyny na Chr. 12 jako kontroli negatywnej oraz regionów regulacyjnych i ciał genów MHC klasy II HLA-DMA i HLA-DPB1. Górna część przedstawia schematyczny rysunek locus i położeń starterów. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe z dwóch powtórzeń biologicznych mierzonych w trzech powtórzeniach technicznych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie opublikowanego raportu19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Zmiany dostępności DNA w obrębie promotora IL8 w odpowiedzi na traktowanie TNF. Komórki HeLa stymulowano TNF (20 ng/mL) przez 1 h, a następnie analizowano metodą FAIRE. Wyznaczono stosunek wolnego do całkowitego DNA dla promotora ACTB (kontrola pozytywna), regionu heterochromatyny na Chr. 12 (kontrola negatywna) oraz promotora IL8. Słupki błędów reprezentują błędy standardowe średniej (SEM) z trzech powtórzeń biologicznych mierzonych w duplikatach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Optymalizacja warunków sonikacji. Chromatynę wyekstrahowaną z komórek 293T poddano sonikacji przy użyciu sonikatora skupionego z odpowiednimi probówkami (Tabela materiałów). Chromatynę sonikowano przez wskazany czas, powtarzając cykle 30 s z następującymi ustawieniami: moc szczytowa 150, współczynnik wypełnienia (duty factor) 15, liczba cykli w serii 500, a następnie 30 s: moc szczytowa 2,5, współczynnik wypełnienia 15, liczba cykli w serii 500. Otrzymaną chromatynę poddano dekroslinkowaniu, oczyszczono metodą ekstrakcji fenol:chloroform i naniesiono na żel agarozowy 2%. Przedstawiono żel barwiony bromkiem etydyny; pozycje markerów masy cząsteczkowej są podane w bp. W tym eksperymencie optymalną wielkość chromatyny (200 - 300 bp) uzyskano po 20 min sonikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

StarterSekwencja
ACTB-Promoter-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-Promoter-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Kontrola negatywna Chr. 12-FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Kontrola negatywna Chr. 12- RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
HLA-DMA-XY-Box-FCATCAGTCACTGGGGAGACG
HLA-DMA-XY-Box-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5’-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
HLA-DMA-5’-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT
HLA-DMA-3’-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC
HLA-DMA-3’-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT
HLA-DPB1-XY-Box-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG
HLA-DPB1-XY-Box-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5’-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5’-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA
HLA-DPB1-3’-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3’-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
Promotor IL8-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
Promotor IL8-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabela 1: Primery do qPCR.

figure-results-5
Tabela 2: Przykładowe obliczenia względnych współczynników odzysku FAIRE. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

FAIRE to solidna i niedroga metoda pozwalająca na identyfikację regionów wolnych od nukleosomów. Opiera się na zasadzie, że DNA owinięte wokół nukleosomów można łatwo usieciować z histonami. Ekstrakcja fenol:chloroform służy do oddzielenia nieusieciowanych i wolnych od białka fragmentów DNA od DNA związanego z białkiem, który znajduje się w dolnej fazie fenolu i do pewnego stopnia w interfazie (ryc. 1). Dlatego regiony wolne od nukleosomów są nadreprezentowane we frakcji wolnego DNA w fazie wodnej. W wielu publikacjach opisano szczegółowe protokoły metody FAIRE 23,24,25,26, z których można korzystać w celu uzupełnienia opisanej tu procedury.

Podobnie jak inne metody stosowane do określania struktury chromatyny, metoda FAIRE również w decydującym stopniu zależy od optymalnego ścinania DNA. Jeśli fragmenty są zbyt długie, każdy region wolny od nukleosomów zostanie zamaskowany przez sąsiednie DNA związane z chromatyną. Jeśli fragmenty są zbyt małe, wykrycie za pomocą qPCR lub głębokiego sekwencjonowania staje się bardzo trudne. Z tego powodu sonikacja DNA jest kluczowym parametrem, który musi być kontrolowany i optymalizowany, aby uzyskać fragmenty o długości około 200 - 300 pz, które reprezentują 1 - 2 nukleosomy (ryc. 4).

Kolejnym parametrem, który może mieć wpływ na końcowy wynik, jest sieciowanie próbki. Chociaż opisana tutaj procedura utrwalania jest ważna dla większości linii komórkowych, badacz musi dokładnie ocenić ten etap dla konkretnej badanej próbki, zwłaszcza w przypadku stosowania tkanek, gdzie może być konieczne dłuższe czas utrwalania, aby formaldehyd mógł dotrzeć do komórek we wszystkich próbkach tkanki.

W przeciwieństwie do innych metod, takich jak DNaza I lub nadwrażliwość nukleazy mikrokokowej, ChIP lub ATAC, FAIRE nie opiera się na aktywności enzymatycznej ani specyficznych przeciwciałach, a zatem nie wymaga miareczkowania ani optymalizacji warunków reakcji. To sprawia, że FAIRE jest idealną metodą pomiaru dostępności chromatyny dla laboratoriów z niewielkim doświadczeniem w dziedzinie chromatyny. Ponadto eksperymenty pilotażowe są wymagane tylko w celu optymalizacji etapu ścinania DNA i czasu sieciowania, gdy jest to konieczne.

Metoda została początkowo opracowana na drożdżach6, ale została również rozszerzona na komórki ssaków. DNA oczyszczone metodą FAIRE może być wykorzystane do głębokiego sekwencjonowania, co pozwala na scharakteryzowanie statusu chromatyny w całym genomie. Okazało się to już przydatne w wielu badaniach 8,9,10,11,12,13,19,27,28.

Wyniki eksperymentów FAIRE-seq wykazują dużą zbieżność z wynikami uzyskanymi innymi metodami, takimi jak DNase I-seq14, chociaż pojawiają się pewne różnice. Wynika to z różnic metodologicznych, ponieważ na przykład zrelaksowane lub przebudowane nukleosomy mogą nadal utrudniać rozszczepienie przez DNazę I, podczas gdy te regiony DNA byłyby mniej podatne na wytwarzanie wiązań krzyżowych DNA/białko, a zatem zostałyby określone jako regiony wolne od nukleosomów za pomocą FAIRE9. Ponadto obecność białek niehistonowych, takich jak polimerazy RNA lub białka czytnika znaków epigenetycznych, może skutkować wiązaniami krzyżowymi DNA/białka, a zatem będzie interpretowana jako regiony upakowane białkami w eksperymentach FAIRE. Ograniczenia te są nieodłącznie związane z każdą metodą stosowaną do określania stanu chromatyny, co rodzi potrzebę użycia kombinacji różnych metod w celu uzyskania kompleksowego wglądu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Tilmanowi Borggrefe (Uniwersytet w Giessen) za uprzejme udostępnienie urządzenia do sonikacji. Prace M.L.S. są wspierane przez granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) oraz programu IMPRS-HLR Towarzystwa Maxa-Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1Carl RothA156.1
Glikogen, 20 mg / mlThermo FisherR0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, RoxThermo FisherAB1162B
Proteinaza K, 20 mg / mlThermo FisherEO0491
RNaza A, 10 mg / mlThermo FisherEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma78830
milliTUBE 1 ml AFA FiberCovaris520130
Uchwyt milliTUBE 1mlCovaris500371
Covaris S220 Skoncentrowany ultrasonografCovaris
StepOnePlus System PCR w czasie rzeczywistymStosowane biosistemy4376600

Bibliografia

  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza FAIREsieciowanie formaldehydemfragmentacja DNAekstrakcja fenolowo chloroformowailo ciowy PCRsekwencjonowanie DNAprotok sonikacjilizy kom rekelektroforeza w elu
Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.