Artykuł metodologiczny

Izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem w celu pomiaru dostępności chromatyny w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/57272

⸱

2 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plastyczność architektury jądrowej jest kontrolowana przez dynamiczne mechanizmy epigenetyczne, w tym niekodujące RNA, metylację DNA, repozycjonowanie nukleosomów, a także skład i modyfikację histonów. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji elementów regulatorowych wspomaganej formaldehydem (FAIRE), który umożliwia określenie dostępności chromatyny w powtarzalny, niedrogi i prosty sposób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odpowiednia ekspresja genów w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe, czyli transkrypcja genów specyficzna dla tkanek i linii, krytycznie zależy od ściśle określonych stanów organizacji chromatyny. Dynamiczna architektura jądra jest kontrolowana przez wiele mechanizmów i kształtuje transkrypcyjne programy wyjściowe. Dlatego ważne jest, aby określić dostępność chromatyny specyficznej dla locus w wiarygodny sposób, który jest najlepiej niezależny od przeciwciał, które mogą być potencjalnie mylącym źródłem zmienności eksperymentalnej. Dostępność chromatyny można mierzyć różnymi metodami, w tym testem izolacji elementów regulatorowych wspomaganym formaldehydem (FAIRE), który pozwala określić ogólną dostępność chromatyny w stosunkowo niewielkiej liczbie komórek. W tym miejscu opisujemy protokół FAIRE, który umożliwia prostą, niezawodną i szybką identyfikację regionów genomu o niskim poziomie obecności białka. W tej metodzie DNA jest kowalencyjnie wiązane z białkami chromatyny przy użyciu formaldehydu jako środka sieciującego i ścinane na małe kawałki. Wolne DNA jest następnie wzbogacane za pomocą ekstrakcji fenol:chloroform. Stosunek wolnego DNA określa się za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) lub sekwencjonowania DNA (DNA-seq) w porównaniu z próbką kontrolną reprezentującą całkowite DNA. Regiony o luźniejszej strukturze chromatyny są wzbogacone w wolną próbkę DNA, co pozwala na identyfikację regionów genomowych o niższym zagęszczeniu chromatyny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomowe DNA komórek eukariotycznych jest ciasno upakowane w nukleosomach, które muszą zostać usunięte lub przemodelowane, aby umożliwić interakcję innych białek z DNA. Aktywacja transkrypcyjna genu zazwyczaj prowadzi do bardziej otwartej konfiguracji jego struktury nukleosomalnej, szczególnie w klasie +1 nucleosome1, aby ułatwić transkrypcję przez polimerazę RNA. Ponadto regiony regulatorowe, takie jak promotory i wzmacniacze, ulegają dynamicznym zmianom w dostępności chromatyny, aby umożliwić interakcję z modyfikatorami chromatyny lub czynnikami transkrypcyjnymi2. Opracowano kilka podejść w celu identyfikacji tych regionów wolnych od nukleosomów. Należą do nich wrażliwość na nukleazy, takie jak DNase I3 lub nucleaza mikrokokowa4, które mogą uzyskać dostęp do DNA tylko wtedy, gdy nie jest ono ściśle owinięte wokół nukleosomów. Inne metody identyfikacji otwartej chromatyny lub wolnego DNA obejmują integrację elementów retrotranspozycyjnych za pośrednictwem transpozazy (Test dla chromatyny dostępnej dla transpozazy, ATAC)5 lub immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) przy użyciu przeciwciał przeciwko histonom. Metoda FAIRE nie opiera się na zdolności enzymu do dotarcia do DNA lub wiązaniu przeciwciała z określonym białkiem, ale zamiast tego opiera się na oczyszczaniu regionów wolnych od nukleosomów przez ekstrakcję fenolu:chloroformu6,7. W tej metodzie DNA jest kowalencyjnie wiązane z białkami chromatyny przez czynnik sieciujący formaldehyd, a następnie jest ścinane na małe kawałki za pomocą sonikacji. Ciasno upakowane regiony chromatyny będą miały obfite wiązania krzyżowe DNA/białko, podczas gdy regiony DNA bez lub z niewielką liczbą nukleosomów będą miały niewiele lub wcale usieciowanych kompleksów DNA/białka. Ekstrakcja fenolu:chloroform umożliwia oczyszczenie nieusieciowanego wolnego DNA w fazie wodnej, podczas gdy DNA usieciowane z białkami jest wychwytywane w organicznej fazie fenolowej lub interfazie wodno-organicznej wraz z białkami. Kwantyfikacja tego wolnego DNA w porównaniu z odniesieniem całkowitej próbki DNA pozwala na identyfikację regionów wolnych od chromatyny. Metoda FAIRE może być stosowana do charakterystyki poszczególnych regionów genomu, jak opisano tutaj, ale nadaje się również do identyfikacji dostępności chromatyny w całym genomie w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem, jak opisano w różnych modelach8,9,10,11,12,13. Wyniki uzyskane za pomocą FAIRE-seq i innych metod, takich jak ATAC-seq, w dużej mierze się pokrywają14. Metoda FAIRE jest bardzo solidną, tanią i łatwą do wykonania metodą identyfikacji regionów wolnych od nukleosomów. W przeciwieństwie do innych metod, nie wymaga eksperymentów pilotażowych w celu określenia odpowiedniego poziomu trawienia, jaki jest wymagany dla nukleaz (DNase-seq, MNase-seq) lub transpozaz (ATAC-seq) i szczegółowo omówiony w niedawnym przeglądzie15. Jedynymi parametrami, które należy dostosować, są warunki sonikacji, a w niektórych przypadkach czas utrwalenia. Ten artykuł opisuje prosty protokół, który jest schematycznie wyświetlany w Rysunek 1 i który nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu poza sonikatorem. Protokół może być wykonany w stosunkowo krótkim czasie i sprawia, że FAIRE jest łatwą i niezawodną metodą testowania dostępności chromatyny w wielu różnych typach komórek, począwszy od komórek płuc11 do pierwotnych komórek uzyskanych z wątroby myszy16.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dzień 1: Hodowla komórkowa

  1. Hoduj komórki, które mają być analizowane, do pożądanej ilości. Warunki hodowli komórkowej i pożywki zależą od badanych typów komórek.
    UWAGA: W zasadzie każda komórka eukariotyczna jest podatna na analizę dostępności chromatyny przez FAIRE. W tym eksperymencie 4 x 106 komórek HEK-293T wysiewa się w pojedynczym 10-centymetrowym naczyniu w pożywce DMEM uzupełnionej 10% (v/v) FBS i 1% (w/v) penicyliny/streptomycyny i inkubuje w temperaturze 5%CO2 i 37 °C przez 24 godziny, aż komórki osiągną 70 - 80% konfluencji (~ 8 x 106 komórek na szalkę).

2. Dzień 2: Sieciowanie formaldehydu i zbieranie komórek

UWAGA: Formaldehyd jest wysoce toksyczny i zawsze musi być używany pod wyciągiem. Nosić odzież ochronną (rękawice i fartuch laboratoryjny). Odpady należy wyrzucić w odpowiedni sposób.

  1. Dodać formaldehyd bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych w dygestorium, aby osiągnąć końcowe stężenie 1% (v/v) (270 μl 37% (v/v) formaldehydu na 10 ml pożywki do hodowli komórkowych). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) i ręcznie obracać płytki co 2 minuty
    UWAGA: Czas sieciowania można dostosować w zależności od typu ogniwa. W przypadku większości linii komórkowych wystarczające jest 10 minut sieciowania. W przypadku tkanek może być wymagana dłuższa inkubacja, aby umożliwić utrwalenie wszystkich komórek.
  2. Dodać glicynę do końcowego stężenia 0,125 M w celu ugaszenia formaldehydu (dodać 500 μl 2,5 M glicyny do 10 ml pożywki). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ubijać co 2 minuty.
  3. Umyj komórki 3x lodowatym PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2H2O, 0,24 g/L KH2PO4, dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl lub NaOH). Odessać pożywkę i przemyć bezpośrednio w naczyniu lub kolbie do hodowli komórkowej, dodając 10 ml PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie, zachowując szczególną ostrożność w przypadku luźno przylegających komórek, takich jak HEK-293T. Ostrożnie dodaj PBS z boku naczynia, aby uniknąć oderwania komórek.
  4. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórkę w 1 ml lodowatego PBS i przenieść do 1,5 ml probówki reakcyjnej na lodzie. W razie potrzeby użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki.
    UWAGA: Rozpoczynając od ograniczonego materiału, należy używać probówek o niskiej wartości wiążącej DNA, aby uniknąć utraty próbki podczas zabiegu.
  5. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C w schłodzonej wirówce stołowej. Odrzucić supernatant, ostrożnie go zasysając.

3. Liza komórek i fragmentacja chromatyny

  1. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy FAIRE (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8,1, 10 μg/ml leupeptyny, 10 μg/ml aprotyniny, 2 mM PMSF) i ponownie zawiesić komórki, ostrożnie pipetując kilka razy w górę iw dół. Inkubować przez 20 minut na lodzie. Na tym etapie należy przechowywać próbki w temperaturze -80 °C, jeśli jest to konieczne.
  2. Sonizuj usieciowane DNA, aby ściąć je do średniej wielkości 200 - 300 pz. Szczegółowe ustawienia sonikatora muszą być określone dla każdego źródła próbek i używanego urządzenia do sonikacji. W każdym przypadku upewnij się, że DNA jest skutecznie ścinane. Etap optymalizacji ścinania DNA opisano w kroku 5.14. Podczas sonikacji należy schłodzić próbki na lodzie, aby uniknąć podgrzania próbki.
  3. Odwirowywać próbkę przez 15 minut i 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej. Podzielić próbki na podwielokrotności o objętości 100 μl. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W tym momencie protokół może zostać przerwany.

4. De-sieciowanie DNA kontrolnego

  1. Pobrać podwielokrotność 100 μl z kroku 3.4, aby odwrócić usieciowanie krzyżowe i użyć go jako odniesienia dla całkowitego DNA. Dodać 10 μl RNazy-A (10 mg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Dodać 10 μl proteinazy K (20 mg/ml). Za pomocą programowalnego bloku termicznego należy inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przez 6 godzin w temperaturze 65 °C w celu rozszczepienia białek i odwrócenia wiązań krzyżowych. Na koniec należy utrzymać próbki w temperaturze 4 °C do momentu wznowienia protokołu, a następnie przejść do kroku 5.
    UWAGA: Inne protokoły FAIRE wykorzystują próbki chromatyny z komórek, które nie zostały usieciowane jako odniesienie, eliminując w ten sposób potrzebę de-sieciowania11. Fakt, że próbki te nie są usieciowane, może prowadzić do różnic w skuteczności sonikacji lub stabilności DNA, dlatego dokładniejsze jest użycie całkowitych próbek referencyjnych DNA, które zostały poddane tej samej procedurze, co próbki testowe.

5. Dzień 3: Fenol:Chloroform Oczyszczanie DNA

  1. Weź nieusieciowaną podwielokrotność z kroku 3.4. Dodać 10 μl RNazy-A (10 mg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Pobrać nieusieciowaną podwielokrotność z kroku 5.1 i odsieciowaną próbkę z kroku 4.2 i postępować równolegle. DodaćH2O, aby osiągnąć końcową objętość 300 μl.
  3. Dodać 300 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do dygestoria i energicznie mieszać.
    UWAGA: Fenol jest i toksyczny i musi być stosowany zawsze pod wyciągiem. Nosić odzież ochronną (rękawice i fartuch laboratoryjny), upewnić się, że probówki reakcyjne są szczelnie zamknięte i odpowiednio zutylizować odpady.
  4. Wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie przenieść 280 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej. Upewnij się, że nie pobierasz żadnych zanieczyszczeń z interfazy, która również zawiera białka. Pozostałą dolną fazę należy wyrzucić jako odpady rozpuszczalnika organicznego.
  6. Powtórzyć kroki od 5.3 do 5.5 i ostrożnie przenieść 270 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej.
  7. Dodać 270 μl chloroformu do dygestorium i energicznie mieszać.
    UWAGA: Ten etap służy do wyeliminowania pozostałego fenolu z próbki.
  8. Wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
  9. Ostrożnie przenieść 250 μl górnej fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej, uważając, aby nie przenieść żadnych zanieczyszczeń z interfazy. Pozostałą próbkę należy wyrzucić jako odpad rozpuszczalnika organicznego.
  10. Dodać 25 μl 5 M NaCl i 250 μl izopropanolu. Dodać 5 μl glikogenu (20 mg/ml) jako nośnik DNA. Dobrze wymieszaj, odwracając probówki i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia DNA.
  11. Przemyć osad DNA 400 μl 70% (v/v) etanolu. Wirować przez 10 minut przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
  12. Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić w 100 μl buforu TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
  13. Inkubować próbkę wolnego DNA nieusieciowaną przez 4 godziny w temperaturze 65 °C w celu usunięcia wiązań krzyżowych między DNA. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  14. Określ ilościowo ilość DNA za pomocą spektrofotometru i uruchom podwielokrotność, aby sprawdzić rozmiar fragmentu na 2% (w/v) żelu agarozowym. Dostosuj czas i intensywność ścinania, w zależności od wyników analizy wielkości DNA metodą elektroforezy w żelu agarozowym, aby uzyskać średnią wielkość 200-300 pz.

6. Oznaczanie wolnego i całkowitego DNA metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

  1. Stosunek DNA wolnego od nukleosomów (zwanego dalej wolnym DNA) do całkowitego DNA jest określany przez qRT-PCR17,18. Próbki można również analizować ilościowo za pomocą hybrydyzacji mikromacierzy lub głębokiego sekwencjonowania w celu oznaczeń całego genomu.
  2. Zaprojektuj startery qPCR dla regionów, które mają być badane oraz dla kontroli dodatnich i ujemnych.
    UWAGA: Odpowiednimi kontrolami pozytywnymi są startery znajdujące się w promotorze aktywnie transkrybowanych genów porządkowych, takich jak ACTB, GAPDH, TPI1 lub TUBA1A (kodujących β-aktynę, GAPDH, TPI lub α-tubulinę). Odpowiednie kontrole ujemne znajdują się w regionach heterochromatyny lub pustyniach genowych. Inne odpowiednie kontrole ujemne można zaprojektować w regionach genomowych sąsiadujących z badanym locus regulowanym dynamicznie w celu kontroli lokalnych różnic w liczbie kopii (Tabela 1).
  3. Rozcieńczyć próbki DNA do końcowego stężenia 10 ng/μl buforem TE i uwzględnić współczynnik rozcieńczenia w końcowych obliczeniach (patrz krok 6.5).
  4. Ustawić reakcję qPCR w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce, z następującą mieszanką reakcyjną na dołek: matryca DNA: 20 ng (2 μL), starter do przodu 200 nM (0,4 μL z zapasu 5 μM), starter odwrotny 200 nM (0,4 μL z 5 μM zapasu), dostępna w handlu gotowa do użycia mieszanina reakcyjna zawierająca zielony barwnik (5 μL z 2x podstawy), iH2Odo 10 μL.
  5. Uruchom w urządzeniu qPCR w czasie rzeczywistym, używając trybu kwantyfikacji bezwzględnej, i oznacz Ct próbek za pomocą różnych par starterów. Obliczyć stosunek odzysku wolnego DNA do całkowitego DNA dla każdego startera, stosując następujący wzór, biorąc pod uwagę współczynniki rozcieńczenia z kroku 6.3:
    figure-protocol-1
    Reprezentatywne wyniki i przykładowe obliczenia przedstawiono w tabeli 2.
  6. Aby skompensować różnice między próbkami, znormalizować do współczynnika odzysku kontroli pozytywnej:
    figure-protocol-2

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy metody FAIRE do zmierzenia różnic w dostępności chromatyny genów MHC klasy II w HEK293T komórkach, jak opublikowano19. Geny kodujące MHC klasy II ulegają ekspresji w komórkach prezentujących antygen (APC), konstytutywnie lub w odpowiedzi na sygnalizację cytokin20. Ekspresja genów MHCII jest napędzana przez kompleks aktywatora, który wiąże się ze specyficznymi elementami DNA, zwanymi skrzynkami XY, znajdującymi się w promotorze i wzmacniaczach tych genów21,22. Znajduje to odzwierciedlenie na poziomie chromatyny, co ujawniła nasza analiza FAIRE wybranych regionów w genach MHC klasy II HLA-DPB1 i HLA-DMA. Eksperymenty te wykazały, że chromatyna jest otwarta w regionach obejmujących pola XY, podczas gdy jest bardziej zwarta w ciałach genów (Ryc. 2).

Na przykład, dla obliczeń, w tym konkretnym eksperymencie, rozcieńczyliśmy całkowitą próbkę DNA 10 razy (współczynnik rozcieńczenia 10), a wolna próbka DNA nie została rozcieńczona (współczynnik rozcieńczenia 1) dla qRT-PCR. Wskaźniki Ct uzyskane dla różnych badanych regionów oraz obliczenia mające na celu uzyskanie ostatecznych współczynników odzysku i względnych współczynników odzysku przedstawiono w tabeli 2. Te względne współczynniki odzysku uzyskano przy użyciu promotora ACTB jako kontroli pozytywnej. Zwróć uwagę, że te obliczenia dotyczą jednej z replik użytych do wygenerowania wyników pokazanych na Rysunek 2.

W innym kontekście, dostępność chromatyny została przetestowana w modelu indukowalnej ekspresji genów. W tym przypadku zmierzono gwałtowne zmiany zagęszczenia chromatyny w odpowiedzi na czynnik martwicy nowotworu bodźca prozapalnego (TNF). Komórki HeLa pozostawiono nieleczone lub stymulowano TNF przez 1 godzinę, a następnie FAIRE w celu zmierzenia zagęszczenia chromatyny w regionie promotora kontrolującym ekspresję genu kodującego cytokinę 8 reagującą na TNF interleukinę 8 (IL8). Wyniki te wykazały znacznie zwiększoną dostępność chromatyny w promotorze IL8 komórek stymulowanych TNF (Ryc. 3). Dostępność promotora IL-8 po stymulacji TNF jest jeszcze wyższa niż w promotorze ACTB, co wykazuje dramatyczną przebudowę chromatyny w tym regionie regulatorowym. Ponieważ współczynnik odzysku uzyskany w tym przypadku jest wyższy niż uzyskany w regionie użytym jako kontrola pozytywna (promotor ACTB), względny współczynnik odzysku jest wyższy niż jeden.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy FAIRE. Komórki są sieciowane bezpośrednio w kolbie lub naczyniu do hodowli komórkowej przez dodanie formaldehydu (A). Po wygaszeniu formaldehydu, komórki są trzykrotnie przemywane lodowatym PBS (B) i przenoszone do probówki reakcyjnej, gdzie są ponownie zawieszane w buforze do lizy FAIRE i poddawane sonikacji w celu ścinania DNA (C). Jedna podwielokrotność wyekstrahowanej chromatyny jest odsieciowywana przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C, aby uzyskać całkowite odniesienie DNA (D), a następnie wolny DNA jest ekstrahowany przy użyciu fenolu:chloroformu zarówno z usieciowanych, jak i odusieciowanych podwielokrotności (E). Na koniec DNA jest oznaczane ilościowo i obliczany jest stosunek wolnego do całkowitego DNA (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Oznaczanie dostępności chromatyny w klastrze genu MHC klasy II w komórkach HEK293T. HEK293T komórki zostały przeanalizowane przez FAIRE. Stosunek między wolnym a całkowitym DNA (tj. względny współczynnik odzysku) określono dla promotora genu ACTB jako kontroli pozytywnej, regionu heterochromatyny na Chr. 12 jako kontroli negatywnej oraz regionów regulatorowych i ciał genów genów MHC klasy II HLA-DMA i HLA-DPB1. W górnej części przedstawiono schematyczne przedstawienie locus i pozycji starterów. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe od dwóch kontrprób biologicznych mierzonych w trzech powtórzeniach. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie opublikowanego raportu19. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Zmiany dostępności DNA w promotorze IL8 w odpowiedzi na leczenie TNF. Komórki HeLa stymulowano TNF (20 ng / ml) przez 1 godzinę i analizowano za pomocą FAIRE. Stosunek między wolnym a całkowitym DNA określono dla promotora ACTB (kontrola pozytywna), regionu heterochromatyny na Chr. 12 (kontrola ujemna) i promotora IL8. Słupki błędów reprezentują błędy standardowe średniej (SEM) z trzech kontrprób biologicznych mierzonych w duplikatach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Optymalizacja warunków sonikacji. Chromatynę wyekstrahowaną z komórek 293T sonifikowano za pomocą zogniskowanego sonikatora z odpowiednimi rurkami (Tabela materiałów). Chromatynę sonikowano przez wskazany czas z powtórzeniami 30 s przy następujących ustawieniach: moc szczytowa 150, współczynnik wypełnienia 15, cykle na serię 500, a następnie 30 s: moc szczytowa 2,5, współczynnik wypełnienia 15, cykle na serię 500. Otrzymaną chromatynę zdesieciowano, oczyszczono przez ekstrakcję fenolo-chloroformem i załadowano do 2% żelu agarozowego. Pokazano żel barwiony bromkiem etydyny, a pozycje markerów masy cząsteczkowej są wskazane w bp. W tym eksperymencie optymalną wielkość chromatyny (200 - 300 pz) uzyskano po 20 minutach sonikacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
podkładkolejność
ACTB-Promotor-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-Promotor-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC powiedział:
Rozdział 12 kontrola ujemna-FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 kontrola ujemna – RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA powiedział:
HLA-DMA-XY-Skrzynka-FCATCAGTCACTGGGGAGACG powiedział:
HLA-DMA-XY-Box-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
HLA-DMA-5'-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA powiedział:
HLA-DMA-5'-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT powiedział:
HLA-DMA-3'-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC powiedział:
HLA-DMA-3'-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT powiedział:
HLA-DPB1-XY-Skrzynka-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG powiedział:
HLA-DPB1-XY-Skrzynka-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA powiedział: TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
HLA-DPB1-5'-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
HLA-DPB1-5'-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA powiedział: TGATCCTCAGAGCCTGGACA powiedział:
HLA-DPB1-3'-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
HLA-DPB1-3'-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 Promotor-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 Promotor-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

Tabela 1: Startery do qPCR.

figure-results-5
Tabela 2: Przykładowe obliczenia względnych współczynników odzysku FAIRE. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FAIRE to solidna i niedroga metoda pozwalająca na identyfikację regionów wolnych od nukleosomów. Opiera się na zasadzie, że DNA owinięte wokół nukleosomów można łatwo usieciować z histonami. Ekstrakcja fenol:chloroform służy do oddzielenia nieusieciowanych i wolnych od białka fragmentów DNA od DNA związanego z białkiem, który znajduje się w dolnej fazie fenolu i do pewnego stopnia w interfazie (ryc. 1). Dlatego regiony wolne od nukleosomów są nadreprezentowane we frakcji wolnego DNA w fazie wodnej. W wielu publikacjach opisano szczegółowe protokoły metody FAIRE 23,24,25,26, z których można korzystać w celu uzupełnienia opisanej tu procedury.

Podobnie jak inne metody stosowane do określania struktury chromatyny, metoda FAIRE również w decydującym stopniu zależy od optymalnego ścinania DNA. Jeśli fragmenty są zbyt długie, każdy region wolny od nukleosomów zostanie zamaskowany przez sąsiednie DNA związane z chromatyną. Jeśli fragmenty są zbyt małe, wykrycie za pomocą qPCR lub głębokiego sekwencjonowania staje się bardzo trudne. Z tego powodu sonikacja DNA jest kluczowym parametrem, który musi być kontrolowany i optymalizowany, aby uzyskać fragmenty o długości około 200 - 300 pz, które reprezentują 1 - 2 nukleosomy (ryc. 4).

Kolejnym parametrem, który może mieć wpływ na końcowy wynik, jest sieciowanie próbki. Chociaż opisana tutaj procedura utrwalania jest ważna dla większości linii komórkowych, badacz musi dokładnie ocenić ten etap dla konkretnej badanej próbki, zwłaszcza w przypadku stosowania tkanek, gdzie może być konieczne dłuższe czas utrwalania, aby formaldehyd mógł dotrzeć do komórek we wszystkich próbkach tkanki.

W przeciwieństwie do innych metod, takich jak DNaza I lub nadwrażliwość nukleazy mikrokokowej, ChIP lub ATAC, FAIRE nie opiera się na aktywności enzymatycznej ani specyficznych przeciwciałach, a zatem nie wymaga miareczkowania ani optymalizacji warunków reakcji. To sprawia, że FAIRE jest idealną metodą pomiaru dostępności chromatyny dla laboratoriów z niewielkim doświadczeniem w dziedzinie chromatyny. Ponadto eksperymenty pilotażowe są wymagane tylko w celu optymalizacji etapu ścinania DNA i czasu sieciowania, gdy jest to konieczne.

Metoda została początkowo opracowana na drożdżach6, ale została również rozszerzona na komórki ssaków. DNA oczyszczone metodą FAIRE może być wykorzystane do głębokiego sekwencjonowania, co pozwala na scharakteryzowanie statusu chromatyny w całym genomie. Okazało się to już przydatne w wielu badaniach 8,9,10,11,12,13,19,27,28.

Wyniki eksperymentów FAIRE-seq wykazują dużą zbieżność z wynikami uzyskanymi innymi metodami, takimi jak DNase I-seq14, chociaż pojawiają się pewne różnice. Wynika to z różnic metodologicznych, ponieważ na przykład zrelaksowane lub przebudowane nukleosomy mogą nadal utrudniać rozszczepienie przez DNazę I, podczas gdy te regiony DNA byłyby mniej podatne na wytwarzanie wiązań krzyżowych DNA/białko, a zatem zostałyby określone jako regiony wolne od nukleosomów za pomocą FAIRE9. Ponadto obecność białek niehistonowych, takich jak polimerazy RNA lub białka czytnika znaków epigenetycznych, może skutkować wiązaniami krzyżowymi DNA/białka, a zatem będzie interpretowana jako regiony upakowane białkami w eksperymentach FAIRE. Ograniczenia te są nieodłącznie związane z każdą metodą stosowaną do określania stanu chromatyny, co rodzi potrzebę użycia kombinacji różnych metod w celu uzyskania kompleksowego wglądu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Tilmanowi Borggrefe (Uniwersytet w Giessen) za uprzejme udostępnienie urządzenia do sonikacji. Prace M.L.S. są wspierane przez granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System (ECCPS, EXC 147/2), Deutsche Krebshilfe (111447) oraz programu IMPRS-HLR Towarzystwa Maxa-Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1Carl RothA156.1
Glikogen, 20 mg / mlThermo FisherR0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, RoxThermo FisherAB1162B
Proteinaza K, 20 mg / mlThermo FisherEO0491
RNaza A, 10 mg / mlThermo FisherEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma78830
milliTUBE 1 ml AFA FiberCovaris520130
Uchwyt milliTUBE 1mlCovaris500371
Covaris S220 Skoncentrowany ultrasonografCovaris
StepOnePlus System PCR w czasie rzeczywistymStosowane biosistemy4376600

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza FAIREsieciowanie formaldehydemfragmentacja DNAekstrakcja fenolowo chloroformowailo ciowy PCRsekwencjonowanie DNAprotok sonikacjilizy kom rekelektroforeza w elu

Powiązane artykuły