Artykuł metodologiczny

Szybkie wzmocnienie sygnału nanosondy poprzez syntezę nanocząstek złota in situ

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57297

⸱

7 marca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Proteomics and Nanobiotechnology, Science for Life Laboratory, KTH Royal Institute of Technology, 2Global Research and Development, Thermo Fisher Scientific IDD

W tym artykule

Podsumowanie

W tej pracy przedstawiono protokół wzmacniania sygnału biodetekcji opartej na nanosondach. Protokół opiera się na redukcji kwasu chloroaurowego na powierzchnię istniejących nanosond, które składają się z nanocząstek złota, srebra, krzemionki lub tlenku żelaza.

Streszczenie

Użycie nanosond, takich jak nanocząstki złota, srebra, krzemionki lub tlenku żelaza, jako odczynników do wykrywania w testach bioanalitycznych może umożliwić wysoką czułość i wygodny odczyt kolorymetryczny. Jednak do wykrywania zwykle potrzebne są duże gęstości nanocząstek. Dostępne protokoły ulepszania oparte na syntezie są albo ograniczone do nanocząstek złota i srebra, albo opierają się na precyzyjnej kontroli enzymatycznej i optymalizacji. W tym miejscu przedstawiamy protokół poprawiający odczyt kolorymetryczny nanosond złota, srebra, krzemionki i tlenku żelaza. Zaobserwowano, że sygnał kolorymetryczny może ulec poprawie nawet 10000-krotnie. Podstawą takich strategii wzmacniania sygnału jest chemiczna redukcja Au3+ do Au0. Istnieje kilka reakcji chemicznych, które umożliwiają redukcję Au3+ do Au0. W protokole zastosowano Gooda iH2O2i możliwe jest faworyzowanie osadzania Au0 na powierzchni istniejących nanosond, ze szkodą dla powstawania nowych nanocząstek złota. Protokół składa się z inkubacji mikromacierzy z roztworem składającym się z kwasu chloroaurowego iH2O2w buforze pH 6 kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego po teście detekcji opartym na nanosondzie. Rozwiązanie uszlachetniające można zastosować do czujników na papierze i szkle. Co więcej, może być stosowany w dostępnych na rynku testach immunologicznych, co wykazano poprzez zastosowanie metody do komercyjnej mikromacierzy alergenowej. Rozwój sygnału wymaga mniej niż 5 minut inkubacji za pomocą roztworu wzmacniającego, a odczyt można ocenić gołym okiem lub za pomocą urządzeń do akwizycji obrazu z niższej półki, takich jak skaner stołowy lub aparat cyfrowy.

Wprowadzenie

Użycie nanomateriałów, takich jak nanocząstki złota (AuNPs) lub nanocząstki tlenku żelaza (IONPs), umożliwiło zastosowanie w biodetekcji z większą czułością i wszechstronnością. 1 Mnogość metod opracowanych do dekoracji powierzchni nanocząstek różnymi ligandami, aby wykorzystać ich wysoki stosunek powierzchni do objętości, umożliwiła zaprojektowanie czujników o zwiększonej czułości. 2 Niemniej jednak, narzędzie do biodetekcji zależy od liczby nanosond wymaganych do uzyskania wykrywalnego sygnału. Na przykład w przypadku AuNP 40 nm, aby uzyskać sygnał za pomocą spektroskopii UV-vis, potrzeba około 90 × 106 nanosond, aby skutecznie wykryć interesujący nas cel. 3 To ograniczenie gęstości nanosondy można obejść poprzez zastosowanie wzmocnienia sygnału. Takie strategie4 mogą być oparte na agregacji lub aglomeracji międzycząsteczkowej, gdzie gęstość początkowych nanosond jest zwiększana poprzez akumulację drugiego zestawu nanosond na pierwszej. 5 Zwiększenie liczby nanocząsteczek w danym miejscu na powierzchni czujnika pozwala na wizualną akwizycję sygnału lub sygnał UV-vis. Jednak czułość testu będzie nierozerwalnie związana ze zdolnością celowania drugiego zestawu nanocząstek w stosunku do początkowego zestawu nanosond. Inne strategie opierają się na barwieniu nanosond złotych i srebrnych. 6,7 Barwienie odbywa się poprzez redukcję jonów srebra na powierzchni nanocząstek, co umożliwia detekcję wizualną lub UV-vis. 8 Te metody wzmacniają sygnał istniejących nanosond złotego lub srebra poprzez wzmacnianie sygnału plazmonu rezonansu powierzchniowego, nie w zależności od drugorzędnych zdarzeń celowania, jak w metodach aglomeracji międzycząsteczkowej. Jednak metody barwienia srebrem zostały opisane tylko przy użyciu złotych lub srebrnych nanosond. 8,9

W 2005 roku, Zayats et al. 10 poinformował o redukcji jonów Au na powierzchni nanosond złota, aby zwiększyć sygnał rezonansu plazmonów powierzchniowych. W tej pracy zależnej od enzymu nadtlenek wodoru był wytwarzany przez katalizę oksydazy glukozowej i wraz z chlorkiem cetylotrimetyloamoniowym pozwalał na redukcję kwasu chloroaurowego.

Niedawno Wang i in. opisali metodę ulepszania, w której warstwa złota jest wytwarzana na powierzchni istniejących nanosond. 11 Te powiększone nanosondy wykazywały aktywność katalityczną podobną do peroksydazy w stosunku do substratu 3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB), umożliwiając wizualizację jasnoniebieskiego koloru gołym okiem.

Stevens et al. poinformowano o opracowaniu plazmonicznego testu opartego na teście ELISA. 12 Po wykryciu antygenu specyficznego dla prostaty (PSA) za pomocą tradycyjnej strategii ELISA, za pomocą czujnika inkubowano przeciwciało wtórne znakowane katalazą, po czym czujnik zanurzono w roztworze zawierającym nadtlenek wodoru i kwas chloroaurowy. Obecność wtórnego przeciwciała modyfikowanego katalazą (wynik pozytywny) sprzyjałaby spożywaniu nadtlenku wodoru, spowalniając redukcję kwasu chloroaurowego i dając quasi-sferyczne monorozproszone AuNP o czerwonym zabarwieniu. Brak przeciwciała modyfikowanego katalazą (wynik ujemny) pozwolił na utrzymanie stężenia nadtlenku wodoru na niezmienionym poziomie, sprzyjając w ten sposób szybkiej redukcji chloroaury i dając AuNP o źle zdefiniowanej morfologii odpowiedzialnej za niebiesko-fioletowy kolor. Wykazano, że stężenie nadtlenku wodoru, określone przez aktywność katalazy, jest skorelowane ze stężeniem analitu będącego przedmiotem zainteresowania. Potrzeba przeciwciała drugorzędowego modyfikowanego katalazą i kontrola warunków aktywności katalitycznej to dwa czynniki, które utrudniają uniwersalność tej metody. Co więcej, tworzenie się klastrów złota, niezależnych od istniejących AuNP, może wprowadzić kwestie szumu tła do strategii wzmacniania.

Wyżej wymienione techniki, jak również kilka innych13,14,15, umożliwiły biosensorom opartym na nanosondach osiągnięcie granic detekcji na równi z tradycyjnymi technikami.

Tutaj demonstrowana jest nowatorska metoda wzmacniania złota, gdzie sygnał istniejącej nanosondy jest wzmacniany przez wzmocnienie lub wprowadzenie sygnału rezonansu plazmonu powierzchniowego. Po przeprowadzeniu detekcji z użyciem nanocząstek złota, srebra, krzemionki lub tlenku żelaza, czujnik pozostawia się do inkubacji z roztworem mieszaniny nadtlenku wodoru i kwasu chloroaurowego w buforze o pH 6 kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego (MES). Stężenia składników w roztworze wzmacniającym zostały zoptymalizowane tak, aby sprzyjały osadzaniu się Au0 na powierzchni istniejących nanosond. Dla wszystkich badanych typów nanosond, tj. AuNP, nanocząstki srebra (AgNPs), nanocząstki krzemionki (SiNPs) i IONPs, tworzenie źle zdefiniowanej warstwy powodowało lub zwiększało rozpraszanie światła, co skutkowało wykrywalnym lub zwiększonym sygnałem widzialnym. Wzrost sygnału przy 100-krotnym współczynniku wzmocnienia osiągnięto w przypadku nanosond w mikromacierzach papierowych i szklanych, a proces ten trwa mniej niż 5 minut, aby uzyskać sygnał. Akwizycja sygnału może odbywać się gołym okiem, spektroskopią UV-vis lub narzędziami do obrazowania z niższej półki, takimi jak aparat cyfrowy lub skaner stołowy. Co więcej, wykazano, że ten protokół poprawy może być łatwo zastosowany w dostępnym na rynku teście diagnostycznym alergii bez konieczności specjalnej optymalizacji.

Protokół

Próbki ludzkiej surowicy zostały pobrane zgodnie z wymogami prawnymi i etycznymi kraju pobrania, tj. za zgodą komisji etycznej (lub podobnej) i za pisemną zgodą dawcy.

1. Przygotowanie roztworu wzmacniającego:

  1. Przygotuj bufor MES o pH 6 o stężeniu 10 mM, zawieszając sól sodową MES w wodzie dejonizowanej. Dostosować pH do 6 za pomocą 4 M roztworu NaOH.
  2. Przygotować 5 mM roztwór HAuCl4 w 10 mM buforze MES pH 6 (roztwór 1).
  3. Przygotować roztwór 1,027 M H2O2 w 10 mM buforze MES pH 6 (roztwór 2).
    UWAGA: Objętości zarówno roztworu 1, jak i roztworu 2 zależą od liczby i rozmiaru mikromacierzy, które mają zostać ulepszone. Na przykład mikromacierz o wymiarach 10 x 10 mm wymaga 100 μl całkowitej objętości (roztwór 1 + roztwór 2), aby zapewnić, że obszar mikromacierzy styka się z roztworem wzmacniającym. Po rozcieńczeniuH2O2należy zużyć w ciągu około 30-45 dni.

2. Przygotowanie nanocząstek:

  1. Przygotować AuNPs 40 nm zgodnie z opisem Bastús i wsp. 16 Krótko wstrzyknąć 1 ml wodnego 25 mM prekursora HAuCl4 do wrzącego roztworu 2,2 mM cytrynianu sodu (149 ml). Poczekaj, aż zaobserwujesz kolor czerwonego wina. Użyj tego roztworu nanocząstek jako nasion do etapów wzrostu nasion.
  2. W temperaturze 90 °C wstrzyknąć 1 ml 60 mM cytrynianu sodu, a następnie 1 ml 25 mM HAuCl4 do roztworu zawierającego nasiona. Po 30 minutach reakcja jest zakończona. Powtórz etap wzrostu nasion pięć razy, aż do uzyskania nanocząstek o długości 40 nm, zgodnie z opisem Bastús i wsp. 16
  3. Zmierzyć absorbancję UV-vis końcowego roztworu nanocząstek w celu określenia wielkości nanocząstek. 17 Alternatywnie, można uzyskać mikrografy elektronów transmisyjnych (TEM) i użyć ich do określenia wielkości nanocząstek.
  4. Przygotować AgNPs 90 nm zgodnie z opisem Rivero i wsp. 18 Krótko dodaj dimetyloaminoboran (DMAB) do energicznie wymieszanego roztworu poli(kwasu akrylowego, soli sodowej) (PAA) i AgNO3. Końcowa objętość roztworu wynosi 50 ml, a końcowe stężenie DMAB, PAA iAgNO3 wynosi odpowiednio 1,6 mM, 10 mM i 3,33 mM.
    UWAGA: Zakupiono IONPy 100 nm modyfikowane grupami karboksylowymi i SiNP 50 nm modyfikowane grupami karboksylowymi.
  5. Funkcjonalizować AuNP przeciwciałami zgodnie z protokołem opisanym przez Puertasa i wsp. 19 Krótko dodając 1 mg COOH-PEG-SH (5000 g·mol−1) do roztworu 1,2x10-9 M AuNPs (10 gęstość optyczna, OD). Doprowadzić pH do 12 za pomocą roztworu 4 M NaOH.
    1. Pozostawić roztwór do inkubacji przez noc, w temperaturze pokojowej (~22 °C), w łagodnych warunkach mieszania.
    2. Usunąć nadmiar PEG, odwirowując roztwór o sile 13800 x g przez 15 minut.
    3. Zawiesić osad w 500 μl wody dejonizowanej.
    4. Inkubować AuNP zmodyfikowane PEG z 5 μmolami chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC) i 7,5 μmol soli sodowej N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS) w 10 mM buforze MES o pH 6 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Usunąć nadmiar EDC i sulfo-NHS przez odwirowanie roztworu o stężeniu 13800 x g przez 5 min.
    6. Zawiesić osad w 500 μl 10 mM buforu MES pH 6 i dodać 100 g·mL-1 przeciwciała. Pozostawić roztwór do inkubacji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Usunąć nadmiar przeciwciała przez dwukrotne odwirowanie roztworu o stężeniu 13800 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 500 μl 10 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,5, 0,3 M NaCl. Pozostawić roztwór do inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    8. Usunąć nieswoiste związane przeciwciało, odwirowując roztwór przy 13800 x g przez 10 minut dwukrotnie i ponownie zawiesić osad w 500 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 mM buforze MES pH 6. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Przepłukać nadmiar BSA, dwukrotnie odwirowując roztwór o sile 13800 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 500 μl 10 mM buforu MES pH 6.
    10. Postępuj zgodnie z krokami od 2.5.1 do 2.5.9 dla modyfikacji 5 M AgNPs, 0,5 mg IONPS i 0,5 mg SiNPs za pomocą przeciwciała, odpowiednio dostosowując ilości EDC i sulfo-NHS.

3. Testy papierowe z przepływem pionowym:

  1. Przygotować mikromacierze, osadzając gradientowe stężenie białka G na membranie z papieru nitrocelulozowego za pomocą drukarki automatycznej. Po wydrukowaniu pozostaw mikromacierze do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej (~22 °C).
  2. Przeprowadzić test przepływu pionowego z membraną umieszczoną w uchwycie filtra. Przelać 8 M roztwór AuNP zmodyfikowanych IgG za pomocą pompy ultrastrzykawkowej z szybkością 1 ml ·min−1. Powtórz ten krok z roztworem 17 AgNP zmodyfikowanych M IgG, 0,1 mg·mL−1 IgG zmodyfikowanych SiNP i 0,1 mg·mL−1 IgG zmodyfikowanych IgG.
  3. Pozostaw mikromacierze do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (~22 °C) przez 30 minut i zeskanuj je w skanerze płaskim w rozdzielczości 4800 dpi. Zapisz obrazy jako 24-bitowe kolorowe pliki TIFF.

4. Referencyjne komercyjne testy na bazie szkła:

  1. Inkubować dwa szklane szkiełka przez 120 minut w celu wykrycia składników alergenów z 4 różnymi próbkami surowicy ludzkiej w temperaturze pokojowej.
  2. Przepłucz mikromacierze wodą dejonizowaną.
  3. Inkubować jedno szkiełko z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem anty-ludzkim IgE w temperaturze pokojowej (~22°C) przez 30 minut. Inkubować drugą szkiełko z AuNP zmodyfikowanymi przeciwciałami anty-ludzkimi IgE przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przepłucz mikromacierze wodą dejonizowaną.
  5. Zmierz intensywność fluorescencji mikromacierzy, która była inkubowana z fluorescencyjnym przeciwciałem anty-ludzkim IgE za pomocą laserowego aparatu skanującego. Digitalizacja mikromacierzy, która była inkubowana z AuNP zmodyfikowanymi przeciwciałami anty-ludzkimi IgE, za pomocą skanera stołowego do akwizycji sygnału kolorymetrycznego.
  6. Po digitalizacji inkubować mikromacierz z roztworem wzmacniającym w temperaturze pokojowej (~22°C) przez 5 minut.
  7. Opłucz czujnik wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej (~22 °C).
  8. Digitalizacja mikromacierzy za pomocą skanera stołowego o rozdzielczości 4800 dpi w celu akwizycji sygnału kolorymetrycznego. Zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki TIFF w skali szarości.

5. Inkubacja mikromacierzy z roztworem wzmacniającym:

  1. Wstępnie wymieszaj tę samą ilość roztworu 1 i roztworu 2 lub wymieszaj je bezpośrednio na powierzchni czujnika i upewnij się, że obszar zainteresowania na mikromacierzy jest pokryty mieszaniną roztworu.
  2. Pozwól czujnikowi inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem wzmacniającym przez maksymalnie 5 minut. Dłuższy czas inkubacji może skutkować lepszą czułością, a także wyższym stosunkiem szumu do sygnału, szczególnie w przypadku mikromacierzy opartych na papierze.
  3. Umyj mikromacierz, zanurzając ją raz w wodzie dejonizowanej na 5 sekund. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Czas etapu suszenia zależy od materiału, z którego wykonana jest mikromacierz. W przypadku mikromacierzy na bazie papieru etap suszenia trwa około 30 minut. W przypadku mikromacierzy na bazie szkła etap suszenia trwa około 5-10 minut.

6. Analiza obrazowa:

  1. Analizuj intensywność fluorescencji za pomocą narzędzia programowego. Należy wziąć pod uwagę wszystkie wyniki, które są równe lub większe niż 0,3 jednostki standaryzacji Isac (ISU), postępując zgodnie ze wskazówkami użytkowania (DfU) producenta czujnika.
  2. Analizuj intensywność kolorymetryczną za pomocą narzędzia programowego. Odwróć pliki obrazów, zmierz intensywność każdego punktu i oblicz średnią intensywność pikseli. Użyj wartości trzech plamek, aby obliczyć końcową wartość sygnału jako średnią z trzech średnich intensywności pikseli plamki.

Wyniki

Po przeprowadzeniu testu z zastosowaniem nanocząstek jako czynników wykrywających, obszar detekcji sensora może być pokryty nanocząstkami (Rycina 1a). Jeśli liczba nanocząstek jest poniżej granicy wykrywalności wzrokowej, wykrycie analitu zostanie początkowo uznane za negatywne. Stosując przedstawiony tutaj protokół (Rycina 1b), sygnał nanocząstek jest wzmocniony poprzez wprowadzenie niejednoznacznej warstwy Au (Rycina 1c).

Przeprowadzono test immunologiczny oparty na papierze, zaprojektowany w celu wykrycia białka G, aby zademonstrować skuteczność protokołu wzmocnienia (Rycina 2). Cząstki AuNPs, AgNPs, SiNPs oraz IONPs zostały zmodyfikowane przeciwciałami IgG i użyte jako czynniki wykrywające. Mikromacierze papierowe przygotowano tak, aby uzyskać gradient liczby cząsteczek białka G na jedno miejsce.

Po przeprowadzeniu testu zaobserwowano, że modyfikowane IgG nanocząstki złota (IgG-AuNPs) były w stanie wykryć aż do 2 × 105 cząsteczek na plamkę (Rycina 2a), modyfikowane IgG nanocząstki srebra (IgG-AgNPs) były w stanie wykryć aż do 2 × 104 cząsteczek na plamkę (Rycina 2c), modyfikowane IgG magnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (IgG-IONPs) były w stanie wykryć aż do 2 × 107 cząsteczek na plamkę (Rycina 2e), natomiast modyfikowane IgG nanocząstki krzemu (IgG-SiNPs) nie były w stanie wytworzyć sygnału wizualnego (Rycina 2g).

Poprzez inkubację mikromacierzy z roztworem wzmocniającym, udało się zwiększyć sygnał 100-krotnie we wszystkich typach wykorzystanych nanocząstek. W przypadku SiNPs roztwór wzmocniający umożliwił zaobserwowanie sygnału tam, gdzie bez tego roztworu nie zaobserwowano żadnego sygnału wizualnego (Rycina 2b, 2d, 2f i 2h).

Oceniono możliwość zastosowania metody w istniejącym komercyjnym testcie immunoenzymatycznym. Wzmocnienie sygnału przeprowadzono w mikromacierzy składników alergenów opartej na szkle. Oceniono zestaw 4 zwalidowanych i scharakteryzowanych próbek surowicy od chorych na alergię za pomocą mikromacierzy (próbki oznaczono jako a, b, c i d). Standardowe wykrywanie fluorometryczne tego testu porównano do barwienia przeciwciałami anty-IgE znakowanymi AuNP, a następnie wzmocnienia sygnału (Rycina 3). Przed wzmocnieniem nie wykryto żadnych plamek na mikromacierzach, gdy wykrywanie prowadzono przy użyciu przeciwciał anty-IgE znakowanych AuNP. Po wzmocnieniu kilka plamek było widocznych gołym okiem, a ich intensywność zarejestrowano poprzez cyfrową analizę obrazu (Rycina 3). W przypadku wykrywania fluorescencyjnego wykryto różnorodne plamki (Rycina 3).

Schemat koniugacji nanopętli z przeciwciałem IgG, powłoką złotą, białkiem G; proces wiązania białek.
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie etapów, które przechodzi mikropłamka od wykrycia analitu do wzmocnienia sygnału. (a) Dwa nanosondy zmodyfikowane przeciwciałami po wykryciu analitu immobilizowanego na mikropłamce, (b) inkubacja mikromacierzy z protokołem wzmocnienia oraz kolejne nasienie i wzrost nanosond zmodyfikowanych przeciwciałami oraz (c) mikropłamka, na której wielkość nanosond zwiększyła się po 5-minutowej inkubacji z roztworem wzmocnienia. Rycina została zmodyfikowana według Dias et al.20 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza plamkowa; seria rozcieńczeń, wykrywanie białek, wiązanie przeciwciał, porównanie wyników eksperymentalnych.
Rycina 2. Cyfrowy obraz mikromacierzy służących do wykrywania białka G. Po lewej stronie każdej mikromacierzy widoczne są mikroplamki przed wzmocnieniem sygnału przeprowadzonym przy użyciu (a) IgG-AuNPs, (c) IgG-AgNPs, (e) IgG-IONPs oraz (g) IgG-SiNPs. Po prawej stronie każdej mikromacierzy przedstawiono mikroplamki po wzmocnieniu sygnału uzyskanym przy użyciu odpowiednio (b) IgG-AuNPs, (d) IgG-AgNPs, (f) IgG-IONPs i (h) IgG-SiNPs. Każdy stężenie białka G naniesiono na mikromacierz w trzech powtórzeniach. Liczbę cząsteczek białka G obliczono na podstawie stężenia białka naniesionego na każdą mikroplamkę. Rycina została zmodyfikowana na podstawie publikacji Dias et al.20 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy zależności fluorescencji od wzmocnienia kolorymetrycznego oraz wyniki mikroskopii; wykrywanie fluorescencyjne, analiza danych.
Rycina 3. Korelacja między intensywnością fluorescencyjną a intensywnością kolorymetryczną uzyskaną w testach przeprowadzonych za pomocą komercyjnego testu diagnostycznego alergii. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) i średnia intensywność kolorymetryczna (MCI) zmierzone podczas wykrywania alergenów w próbkach a, b, c i d. Wstawki przedstawiają dane przekształcone logarytmicznie przy podstawie 10 w przedziałach, w których zaobserwowano liniową korelację między obiema metodami. Intensywność mikropolek obserwowanych podczas wykrywania z wykorzystaniem przeciwciała zmodyfikowanego fluoroforem (Fluorophore-Ab) odpowiada emisji fluorescencji. Jasność mikropolek obserwowanych podczas wykrywania opartego na teście Ab-AuNPs została uzyskana po zdigitalizowaniu mikromacierzy i odwróceniu obrazu za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Mikromacierze są projektowane tak, aby mieć trzy powtórzenia ułożone pionowo oraz kontrolki pozytywne do wykrywania fluorescencyjnego w dolnym prawym rogu. Pozostałe trzy rogi są wykorzystywane do oceny oprogramowania. Obrazy analizowano w skali szarości 16-bitowej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie publikacji Dias et al.20 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

R2 przed wzmocnieniemR2 po wzmocnieniu
IgG-AuNPs8.70E-017.80E-01
IgG-AgNPs9.10E-019.60E-01
IgG-IONPs9.17E-019.30E-01
IgG-SiNPs-8.50E-01

Tabela 1. Wartości R2 dla wykrywania białka G, przed i po wzmocnieniu, przy użyciu różnych zestawów nanoparticle. Wartości R2 uzyskano po skorelowaniu intensywności plamek z stężeniem mierzonego analitu.

Dyskusja

Obecnie techniki wzmacniania sygnału w testach z detekcją opartą na nanosondach są albo oparte na enzymach12, wymagają drugiego zestawu nanocząstek do namierzenia nanosond detekcyjnych21 lub, w przypadku technik barwienia, ograniczają się do stosowania AuNP lub AgNP jako sond detekcyjnych. 22 W tym miejscu opisano prostą, szybką i bezenzymatyczną metodę wzmacniania sygnału w testach opartych na wykrywaniu nanosondami. Dzięki tej metodzie udało się wzmocnić sygnał kolorymetryczny dostarczany przez 4 rodzaje nanosond: AuNPs, AgNPs, IONPs i SiNPs.

Zaobserwowany współczynnik amplifikacji dla każdego zestawu nanosond był 100-krotny, z wyjątkiem SiNP, w przypadku których kwantyfikacja czynnika wzmocnienia nie była możliwa z powodu braku sygnałów przed wzmocnieniem. Ten czynnik wzmacniający sugeruje, że skuteczność protokołu jest podobna we wszystkich typach nanosond. Ponadto, gdy protokół wzmocnienia został przeprowadzony na podkładzie papierowym, na którym wydrukowano serię rozcieńczeń zawiesiny podstawowych AuNPs, zaobserwowano 10000-krotny współczynnik amplifikacji. Przed ulepszeniem widoczne plamy z najmniejszą liczbą AuNP były miejscem, w którym wydrukowano około 10000 nanocząstek, po wzmocnieniu widoczne stały się plamy zawierające mniej niż 10 nanocząstek. 20

Warunki ustanowione dla przedstawionego tutaj protokołu wzmocnienia pozwoliły na wykorzystanie redukcji Au3+ do Au0 w celu poprawy sygnału, przy jednoczesnym utrzymaniu szumu tła do minimum. Wzmocnienie można przeprowadzić zaraz po wykonaniu testu, a także na mikromacierzach, które były przechowywane przez okres do kilku miesięcy po wykonaniu testu. Roztwór wzmacniający składa się z mieszaniny 1:1 roztworu 1 i roztworu 2. Oba roztwory mogą być wcześniej zmieszane lub bezpośrednio zmieszane po pipetowaniu na mikromacierz. Różnica między mieszaniem wstępnym a bezpośrednim wpływa tylko na okres trwałości roztworu wzmacniającego. Po wstępnym zmieszaniu okres przydatności do spożycia wynosi 5-7 dni, wzrastając do 30-45 dni, jeśli nie jest wstępnie zmieszany.

Dalsza analiza wyników wykazała, że metoda ulepszania nie koliduje z analizą ilościową biosensora. Utrzymano liniową korelację pomiędzy obserwowanym natężeniem a stężeniem analitu (tab. 1). Dane uzyskane dla 4 wstępnie scharakteryzowanych próbek klinicznych przy użyciu testu immunologicznego mikromacierzy alergenów na bazie szkła, ze standardową detekcją fluorescencyjną i detekcją kolorymetryczną, wykazały dobrą zgodność między tymi dwiema metodami wykrywania. Porównując średnią intensywność fluorescencji (MFI) i średnią intensywność kolorymetryczną (MCI), uzyskano średnią R2 = 0,79 +/- 0,08, gdy dane są rejestrowane 10 na obu osiach. Eksperyment ten wykazał, że metoda ulepszania może być zastosowana do zestawu komercyjnego, jeśli wykorzystuje nanosondy do wykrywania lub może być przystosowana do wykrywania opartego na nanosondach.

Skuteczność metody wzmacniania opiera się na dwóch krytycznych aspektach. Ważne jest, aby upewnić się, że mieszanina roztworu 1 i roztworu 2 jest jednorodna. Bez jednorodnej mieszaniny czujnik będzie miał kontakt z frakcjami roztworu wzmacniającego, w których roztwór 1 lub 2 jest dominujący w stosunku do drugiego. Zmniejszy to skuteczność redukcji Au3+ do Au0, niszcząc w ten sposób skuteczność wzmocnienia. Ważne jest również, aby cały obszar zainteresowania mikromacierzy miał kontakt z roztworem wzmacniającym w okresie inkubacji.

Aby uzyskać ultraczułe wzmocnienie sygnału, wymagany będzie dłuższy czas inkubacji (około 5 minut) z roztworem wzmacniającym. Aby uniknąć powstawania szumów tła, które mogą zakłócać akwizycję sygnału, powierzchnia mikromacierzy powinna być wcześniej zablokowana (np. BSA, PEG), aby zapobiec szybkiemu, niespecyficznemu osadzaniu się Au0 i w konsekwencji tworzeniu się warstwy złota.

Ograniczeniem metody wzmacniania jest wewnętrzna skuteczność testu. Test wymaga przeprowadzenia kontroli ujemnych i dodatnich, aby zapewnić, że zaobserwowane wzmocnienie sygnału można przypisać wynikom prawdziwie dodatnim. Jeśli występuje niespecyficzna interakcja nanosond z celem, sygnały uzyskane po wzmocnieniu nie będą ważne.

Inne techniki wzmacniania opierają się na agregacji nanocząstek lub barwieniu nanocząstek materiałem, który umożliwia lepszą akwizycję sygnału. Dzięki promowaniu gromadzenia liczby nanocząstek w miejscu detekcji, akwizycja sygnału będzie możliwa zarówno w formie wizualnej, jak i pomiarów UV-Vis. 5 Te techniki wzmacniania sygnału opierają się na dwuetapowym systemie wykrywania, wstępnym wykrywaniu analitu będącego przedmiotem zainteresowania i drugim etapie, w którym reporter musi związać się z początkową konstrukcją detekcji. Takie strategie nie są uniwersalne ze względu na wymóg specyficznej optymalizacji protokołu wzmocnienia dla każdego typu testu.

Techniki wzmacniania barwienia, takie jak barwienie srebrem, podobnie jak przedstawiony tutaj protokół, pozwalają na bezpośrednie wzmocnienie konstrukcji detekcji sygnału. Jednak w przeciwieństwie do przedstawionego tutaj protokołu, wykazano, że barwienie srebrem stosuje się tylko do AuNP lub AgNPs. 6,7,8,9

Możliwość zastosowania tej metody może prawdopodobnie obejmować każdy test, który wykorzystuje AuNP, AgNPs, IONPs lub SiNP jako czynniki wykrywające. Prowadzone są dalsze prace mające na celu zbadanie zastosowania tej metody w czujnikach składających się z innych materiałów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP/2007-2013)/Umowy o grant ERC nr 615458, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych i centrum doskonałości Pronova w zakresie technologii białkowych (VINNOVA - Szwedzka Rządowa Agencja ds. Systemów Innowacji) jest z wdzięcznością uznane.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas chloroaurowySigma-Aldrich254169 ALDRICH
Cytrynian soduSigma-AldrichS4641 SIGMA-ALDRICH
Dimetyloaminoboran Sigma-Aldrich476668 ALDRICH
Poli(kwas akrylowy, sól sodowa) Sigma-Aldrich416037 ALDRICH
Azotan srebraSigma-Aldrich204390 ALDRICH
100 nm nanocząstki magnetyczneAdemtech021111
50 nm nanocząstki krzemionkiCiało140510-10
COOH-PEG-SH RAPP Polymere135000-4-32
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich1.06462  Chlorowodorek EMD MILLIPORE
N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidowySigma-Aldrich03449  SIGMA
Sól sodowa N-hydroksysulfosukcynimidu Sigma-Aldrich56485  ALDRICH
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich95313 SIGMA-ALDRICH
Hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowegoSigma-AldrichM8250 SIGMA
Przeciwciało IgGAbcam
Fosforan sodu Sigma-Aldrich342483  ALDRICH
Chlorek soduSigma-AldrichS7653  SIGMA-ALDRICH
Albumina surowicy bydlęcejVWR 422351S
Białko GThermo Scientific21193
Membrana z papieru nitrocelulozowegoWhatman10402096
Nanoplotter 2.1 drukarka robotycznaGeSIM
XX3001200
PhD2000 Pompa ultrastrzykawkowaHarvard
Skaner płaski CannonScan 9000F Mark IICannon
Anty-ludzkie przeciwciała IgE modyfikowane AuNPs Thermofisher
Skanowanie laserowe LuxScan 10/KCapital Bio
Skaner stołowy Skaner obrazu Epson Expression 1600 proEpson
Szkiełko ImmunoCAP ISAC sIgE 112 Thermofisher81-1011-01
Fluorescencyjne sprzężone przeciwciało anty-ludzkie IgE Thermofisher81-1011-01
Analizator obrazu mikromacierzy Phadia MIA 1.2.4 Rybak
Uchwyt filtra Merck termiczny

Bibliografia

  1. Holzinger, M., Le Goff, A., Cosnier, S. Nanomaterials for biosensing applications: a review. Front. Chem. 2, 1(2014).
  2. Conde, J., Dias, J. T., Grazú, V., Moros, M., Baptista, P. V., de la Fuente, J. M. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Front. Chem. 2, 48(2014).
  3. Sato, K., Onoguchi, M., Sato, Y., Hosokawa, K., Maeda, M. Non-cross-linking gold nanoparticle aggregation for sensitive detection of single-nucleotide polymorphisms: Optimization of the particle diameter. Anal. Biochem. 350 (1), 162-164 (2006).
  4. Cao, X., Ye, Y., Liu, S. Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing. Anal. Biochem. 417 (1), 1-16 (2011).
  5. Fraire, J. C., Motrich, R. D., Coronado, E. A. Design of a novel plasmonic nanoconjugated analytical tool for ultrasensitive antigen quantification. Nanoscale. 8 (39), 17169-17180 (2016).
  6. Taton, T. A. Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes. Science. 289 (5485), 1757-1760 (2000).
  7. Cao, C., Gontard, L. C., Thuy Tram, L. L., Wolff, A., Bang, D. D. Dual Enlargement of Gold Nanoparticles: From Mechanism to Scanometric Detection of Pathogenic Bacteria. Small. 7 (12), 1701-1708 (2011).
  8. Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B. Low cost, portable detection of gold nanoparticle-labeled microfluidic immunoassay with camera cell phone. Electrophoresis. 30 (4), 579-582 (2009).
  9. Zhang, M., Wittstock, G., Shao, Y., Girault, H. H. Scanning electrochemical microscopy as a readout tool for protein electrophoresis. Anal. Chem. 79 (13), 4833-4839 (2007).
  10. Zayats, M., Baron, R., Popov, I., Willner, I. Biocatalytic Growth of Au Nanoparticles: From Mechanistic Aspects to Biosensors Design. Nano Lett. 5 (1), 21-25 (2005).
  11. Wang, S., Chen, Z., Choo, J., Chen, L. Naked-eye sensitive ELISA-like assay based on gold-enhanced peroxidase-like immunogold activity. Anal. Bioanal. Chem. 408 (4), 1015-1022 (2016).
  12. de la Rica, R., Stevens, M. M. Plasmonic ELISA for the ultrasensitive detection of disease biomarkers with the naked eye. Nat. Nanotechnol. 7 (12), 821-824 (2012).
  13. Liu, D., Yang, J., et al. Glucose Oxidase-Catalyzed Growth of Gold Nanoparticles Enables Quantitative Detection of Attomolar Cancer Biomarkers. Anal. Chem. 86 (12), 5800-5806 (2014).
  14. Qu, W., Liu, Y., Liu, D., Wang, Z., Jiang, X. Copper-mediated amplification allows readout of immunoassays by the naked eye. Angew. Chem. Int. Edit. 50 (15), 3442-3445 (2011).
  15. Wang, X., Niessner, R., Knopp, D. Controlled growth of immunogold for amplified optical detection of aflatoxin B1. Analyst. 140 (5), 1453-1458 (2015).
  16. Bastús, N. G. N., Comenge, J. J., Puntes, V. V. Kinetically controlled seeded growth synthesis of citrate-stabilized gold nanoparticles of up to 200 nm: size focusing versus Ostwald ripening. Langmuir. 27 (17), 11098-11105 (2011).
  17. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra. Anal. Chem. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  18. Rivero, P. J., Goicoechea, J., Urrutia, A., Arregui, F. J. Effect of both protective and reducing agents in the synthesis of multicolor silver nanoparticles. Nanoscale Res. Lett. 8 (1), 101(2013).
  19. Puertas, S., Batalla, P., et al. Taking Advantage of Unspecific Interactions to Produce Highly Active Magnetic Nanoparticle-Antibody Conjugates. ACS Nano. 5 (6), 1-8 (2011).
  20. Dias, J. T., Svedberg, G., Nystrand, M., Andersson-Svahn, H., Gantelius, J. Rapid signal enhancement method for nanoprobe-based biosensing. Sci. Rep. 7 (1), 6837(2017).
  21. Shen, G., Zhang, S., Hu, X. Signal enhancement in a lateral flow immunoassay based on dual gold nanoparticle conjugates. Clin. Biochem. 46 (16-17), 1734-1738 (2013).
  22. Gupta, S., Huda, S., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays. Anal. Chem. 79 (10), 3810-3820 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wzmacnianie sygnału nanocząsteczekwzmacnianie odczytu kolorymetrycznegotraktowanie kwasem chloroaurowymreakcja z nadtlenkiem wodoruinkubacja w buforze MESpapierowe czujniki szklaneamplifikacja sygnału w immunoanaliziemetoda detekcji nanosondąprotokół wzmacniania sygnału
Szybkie wzmocnienie sygnału nanosondy poprzez syntezę nanocząstek złota in situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.