Artykuł metodologiczny

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

35K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57320

⸱

28 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Nuclear Dynamics Programme, The Babraham Institute, Babraham Research Campus, 2IJC Building, Campus ICO-Germans Trias i Pujol, Josep Carreras Leukemia Research Institute, 3Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, 4Bioinformatics Group, The Babraham Institute, Babraham Research Campus, 5Department of Biological Science, Florida State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Streszczenie

Trójwymiarowa organizacja genomu jest powiązana z jego funkcją. Na przykład elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze transkrypcji, kontrolują czasoprzestrzenną ekspresję docelowych genów poprzez kontakt fizyczny, często pokonując znaczne (w niektórych przypadkach setki kilozasad) odległości genomowe i omijając pobliskie geny. Szacuje się, że ludzki genom zawiera około miliona wzmacniaczy, z których zdecydowana większość ma nieznane cele genowe. Przypisanie dystalnych regionów regulatorowych do genów docelowych ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia kontroli ekspresji genów. Opracowaliśmy Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), aby umożliwić wykrywanie w całym genomie dystalnych regionów oddziałujących z promotorem (PIR) dla wszystkich promotorów w jednym eksperymencie. W PCHi-C wysoce złożone biblioteki Hi-C są specjalnie wzbogacane o sekwencje promotorowe poprzez selekcję hybrydową w roztworze z tysiącami przynęt biotynylowanych RNA komplementarnych do końców wszystkich fragmentów restrykcyjnych zawierających promotor. Celem jest następnie obniżenie sekwencji promotorowych i ich częstych partnerów interakcji, takich jak wzmacniacze i inne potencjalne elementy regulatorowe. Po wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu sparowanych końców do każdego fragmentu restrykcyjnego ligowanego promotorem stosuje się test statystyczny w celu zidentyfikowania istotnych PIR na poziomie fragmentu restrykcyjnego. Użyliśmy PCHi-C do wygenerowania atlasu oddziaływań promotorów dalekiego zasięgu w dziesiątkach typów komórek ludzkich i mysich. Te mapy interaktomu promotora przyczyniły się do lepszego zrozumienia kontroli ekspresji genów u ssaków poprzez przypisanie przypuszczalnych regionów regulatorowych do ich genów docelowych i ujawnienie preferencyjnych przestrzennych sieci interakcji promotor-promotor. Informacje te mają również duże znaczenie dla zrozumienia chorób genetycznych człowieka i identyfikacji potencjalnych genów chorobowych poprzez powiązanie niekodujących wariantów sekwencji związanych z chorobą w sekwencjach kontrolnych lub w ich pobliżu z ich genami docelowymi.

Wprowadzenie

Coraz więcej dowodów sugeruje, że trójwymiarowa organizacja genomu odgrywa ważną rolę funkcjonalną w wielu procesach jądrowych, w tym w aktywacji genów1,2,3, repression4,5,6,7,8, recombination9,10, naprawa DNA11, replikacja DNA12,13, oraz starzenie się komórek14. Odległe wzmacniacze znajdują się w bliskiej odległości przestrzennej od promotorów, które regulują15,16,17, co jest niezbędne do prawidłowej czasoprzestrzennej kontroli ekspresji genów. Delecje wzmacniaczy pokazują, że wzmacniacze dystalne są niezbędne do transkrypcji genu docelowego18,19,20,21,22, a "wymuszona pętla chromatyny" pokazuje, że inżynieryjne wiązanie między wzmacniaczem a jego docelowym promotorem w locus Hbb jest wystarczające do napędzania aktywacji transkrypcji23. Co więcej, rearanżacje genomu, które poddają geny kontroli wzmacniaczy ektopowych, mogą skutkować niewłaściwą aktywacją genów i chorobą24,25,26. Razem te przykłady ilustrują, że interakcje promotor-wzmacniacz są niezbędne do kontroli genów i wymagają ścisłej regulacji w celu zapewnienia odpowiedniej ekspresji genów. Szacuje się, że genomy człowieka i myszy zawierają około miliona wzmacniaczy. W przypadku zdecydowanej większości tych wzmacniaczy geny docelowe są nieznane, a "zasady zaangażowania" między promotorami a wzmacniaczami są słabo poznane. Przypisanie wzmacniaczy transkrypcji do ich genów docelowych pozostaje zatem głównym wyzwaniem w rozszyfrowaniu kontroli ekspresji genów u ssaków.

Nasze rozumienie trójwymiarowej architektury genomu zostało zrewolucjonizowane przez wprowadzenie 3C27 (przechwytywanie konformacji chromosomów) i jego wariantów28,29,30,31. Najpotężniejsza z tych technik, Hi-C (wysokoprzepustowe wychwytywanie konformacji chromosomów), ma na celu identyfikację całego zestawu interakcji chromosomowych w populacji komórek. Biblioteki Hi-C, zwykle generowane z milionów komórek, są bardzo złożone z szacunkową liczbą 1011 niezależnych produktów ligacji między ~4 kb fragmentami w ludzkim genomie32. W związku z tym wiarygodna i odtwarzalna identyfikacja interakcji między poszczególnymi fragmentami restrykcyjnymi (takimi jak te zawierające promotor lub wzmacniacz) na podstawie danych Hi-C nie jest możliwa, chyba że biblioteki Hi-C zostaną poddane ultragłębokiemu sekwencjonowaniu, co nie jest ekonomicznie opłacalnym rozwiązaniem dla laboratoriów rutynowo przygotowujących biblioteki Hi-C. Aby obejść tę wadę, opracowaliśmy Promoter Capture Hi-C, aby specjalnie wzbogacić produkty ligacji zawierające promotor z bibliotek Hi-C. Skupiliśmy się na promotorach z dwóch powodów. Po pierwsze, w licznych badaniach wykazano, że kontakty promotor-wzmacniacz mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego poziomu ekspresji genów (patrz odniesienia powyżej), a po drugie, ponieważ promotory są w dużej mierze niezmienne między typami komórek, ten sam system przynęty wychwytującej może być używany do badania obwodów regulacyjnych w wielu typach komórek i warunkach. Nasze podejście opiera się na hybrydyzacji w roztworze bibliotek Hi-C z dziesiątkami tysięcy biotynylowanych RNA 120merów komplementarnych do produktów ligacji Hi-C zawierających promotor, a następnie wychwytywaniu na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną. Powoduje to, że biblioteki PCHi-C mają znacznie mniejszą złożoność w porównaniu z oryginalną biblioteką Hi-C, koncentrując się tylko na identyfikacji fragmentów, które są ligowane do promotorów przy znacznie wysokich częstotliwościach.

Użyliśmy PCHi-C w wielu typach komórek ludzkich i mysich, aby przyczynić się do lepszego zrozumienia kontroli ekspresji genów, odkrywając obszary oddziałujące z promotorem dystalnym dalekiego zasięgu z domniemaną funkcją regulacyjną, a także nielosowe kontakty promotor-promotor w trójwymiarowej przestrzeni jądra. W ramach badań zmapowano setki tysięcy kontaktów promotora-wzmacniacza w wielu typach komórek33,34,35,36,37,38,39, zidentyfikował organizację przestrzennego genomu za pośrednictwem kompleksu represyjnego Polycomb w embrionalnych komórkach macierzystych myszy7, zademonstrował na dużą skalę przebudowę interaktomów promotorów podczas różnicowania komórkowego37,38,39, i połączył niekodujące warianty sekwencji związane z chorobą z promotorami genów35.

PCHi-C to idealnie dopasowana metoda do mapowania całego genomu sekwencji DNA oddziałujących z promotorami. Pokrewne podejścia, takie jak wychwytywanie Hi-C ciągłych regionów genomu (patrz Dyskusja) są metodą z wyboru w celu uzyskania profili interakcji o wysokiej rozdzielczości dla wybranych regionów genomu. PCHi-C i Capture Hi-C są niezwykle podobne z eksperymentalnego punktu widzenia (jedyną różnicą jest wybór systemu przechwytywania), tak więc porady i wytyczne, które dostarczamy, mają zastosowanie do obu podejść. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis PCHi-C. Przedstawiamy uzasadnienie i projekt eksperymentu PCHi-C, przedstawiamy krok po kroku protokół generowania bibliotek PCHi-C i ilustrujemy, w jaki sposób jakość bibliotek PCHi-C może być monitorowana na różnych etapach protokołu w celu uzyskania wysokiej jakości danych.

Protokół

1. Utrwalanie formaldehydu

  1. Przygotowanie komórek: Zacznij od minimum 2 x 107 komórek na eksperyment.
    1. W przypadku komórek hodowanych w hodowli należy ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej. W przypadku komórek ex vivo ponownie zawiesić w 1x zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% (obj. / obj.) płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    2. W przypadku komórek przylegających należy usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 30,625 ml świeżej pożywki z 10% (obj./obj.) FBS w temperaturze pokojowej (RT; 20–25 °C).
    3. W przypadku komórek zawiesinowych zebrać i odwirować komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 20 °C przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30,625 ml pożywki z 10% (vol/vol) FBS w temperaturze pokojowej.
    4. W przypadku tkanek stałych należy użyć trypsyny (stężenie końcowe od 0,05% do 2,5%, w zależności od typu komórki) lub homogenizować w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Po tym dodatkowym kroku traktuj komórki jak komórki zawiesinowe.
  2. Dodaj 4,375 ml 16% paraformaldehydu wolnego od metanolu (otwarta ampułka tuż przed użyciem) do końcowego stężenia 2% (obj./obj.). Fix na 10 minut przy RT z delikatnym mieszaniem na rockerze.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną. Przestrzegaj odpowiednich przepisów BHP.
  3. Reakcję gaszenia należy dodać 5 ml świeżo przygotowanej 1 M lodowatej glicyny. Mieszaj przez 5 minut z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj na lodzie przez 15 minut z okazjonalnym odwracaniem.
  4. Umyj i zbierz stałe komórki.
    1. W przypadku przylegających komórek usuń supernatant, dodaj 10 ml lodowatego 1x PBS pH 7,4 na ściankę płytki i usuń. Dodaj 1 ml lodowatego 1x PBS pH 7,4, zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz dwukrotnie, aby zebrać jak najwięcej komórek. Dodaj lodowaty PBS do 50 ml końcowej objętości.
    2. W przypadku komórek zawiesinowych odwirować komórki w temperaturze 760 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 ml lodowatego PBS o pH 7,4.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Osad komórkowy można zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.

2. Liza komórek

  1. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 ml świeżo przygotowanego lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl pH 8, 0,2% (vol/vol) Igepal CA-630, 10 mM NaCl i jedna tabletka koktajlu inhibitorów proteazy) i wymieszać. Inkubować na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu mieszać przez odwrócenie. Odwirować jądra w temperaturze 760 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.

3. Trawienie HindIII

  1. Przemyć jądra komórkowe 1,25-krotnym buforem restrykcyjnym 2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego buforu restrykcyjnego 1,25x 2 i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować jądra w temperaturze 760 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.
  2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1790 μl 1,25x bufora restrykcyjnego 2. Wykonaj 5 porcji, z których każda zawiera 5–10 milionów komórek w 358 μl 1,25-krotnego buforu restrykcyjnego 2.
  3. Dodać 11 μl 10% (wag./obj.) SDS na podwielokrotność i wstrząsać z prędkością 950 obrotów na minutę (obr./min) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w termomikserze. Jeśli pojawią się grudki komórek, rozdziel się przez pipetowanie, unikając pęcherzyków.
  4. Dodać 75 μl 10% Triton X-100 (vol/vol) na porcję i wstrząsać w temperaturze 950 obr./min i 37 °C przez 15 minut w termomikserze. Jeśli pojawią się grudki komórek, rozdziel się przez pipetowanie, unikając pęcherzyków.
  5. Dodać 12 μl ze 100 U/μL HindIII 100 (łącznie 1 200 jednostek) na podwielokrotność i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (O/N), wytrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze.
    1. W celu kontroli trawienia przenieść 25 μl próbki (5 μl z każdej podwielokrotności) do nowej probówki przed dodaniem enzymu (kontrola niestrawiona) i powtórzyć tę samą procedurę po dodaniu enzymu (kontrola strawiona). Inkubuj obie probówki w taki sam sposób, jak w bibliotece Hi-C.
  6. Następnego ranka dodać 5 μl 100 U/μL HindIII (łącznie 500 jednostek) na podwielokrotność i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, wytrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze.
  7. Kontrola trawienia: dla strawionych i niestrawionych kontroli (patrz 3.5.1), przeprowadzić odwrócenie usieciowania (krok 6), ekstrakcję fenolu:chloroformu i wytrącanie DNA (krok 7).
    1. Zaprojektuj parę podkładów, które obejmują witrynę HindIII. W tym samym regionie zaprojektuj kolejną parę podkładów, które nie obejmują miejsca HindIII. Zaprojektuj startery do ilościowego PCR (Q-PCR) przy użyciu Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) i następujących parametrów:
      Wielkość podkładu: Optymalna 20 (Min.: 18, Max.: 27); Podkład Tm: Optymalna 60 (Min.: 57, Max.: 63); Zawartość CG% podkładu: Min.: 20, Maks.: 80; Wielkość amplikonu: RT-PCR ~100 pz (dla konwencjonalnego PCR ~300 pz); Mispriming library: human (humans primers) lub gryzoń i simple (startery myszy).
    2. Wykonać Q-PCR, aby uzyskać 4 średnie Cts (cykl progowy): Ct[D;H], otrzymane z strawionej próbki [D] z parą starterów, które obejmują miejsce HindIII [H]; Ct[D;-], otrzymany z roztrawionej próbki [D] z parą starterów, które nie obejmują miejsca HindIII [-]; Ct[U; H], otrzymany z niestrawionej próbki [U] z parą starterów obejmujących miejsce HindIII; Ct[U;-], otrzymany z niestrawionej próbki [U] z parą starterów, które nie obejmują miejsca HindIII [-]. Oblicz procent trawienia jako: % trawienia = 100-100/2(Ct[D,H]-Ct[D,-]) - (Ct[U,H]-Ct[U,-]).

4. Biotynylacja nawisów fragmentów restrykcyjnych

  1. Przygotuj główną mieszankę biotynylacyjną: 30,6 μl 10x buforu restrykcyjnego 2, 10,2 μlH2O(klasa biologii molekularnej), 7,65 μl 10 mM dCTP, 7,65 μl 10 mM dGTP, 7,65 μl 10 mM dTTP, 191,25 μl 0,4 mM biotyny-14-dATP i 51 μl 5,000 U/ml dużego fragmentu polimerazy DNA I (Klenow).
  2. Dodać 60 μl głównej mieszanki biotynylacji na podwielokrotność, wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 700 obr./min (termomikser) przez 5 s, co 30 s. Po 1 godzinie umieść porcje na lodzie.

5. Podwiązanie w jądrze

  1. Przygotuj główną mieszankę ligacji: 510 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 51 μl 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (100x BSA), 1754,4 μl wody (klasa biologii molekularnej) i 127,5 μl 1 U/μL ligazy DNA T4 (patrz tabela materiałów).
  2. Dodać 479 μl głównej mieszanki ligacyjnej na podwielokrotną mieszaninę i inkubować w temperaturze 16 °C przez 4 godziny, wytrząsając z prędkością 700 obr./min przez 5 s co 2 minuty w termomikserze.
  3. Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej.

6. Odwrócenie usieciowania

  1. Połączyć wszystkie porcje w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (odpowiedniej do wirowania z dużą prędkością).
  2. Dodać 62,5 μl 10 mg/ml RNazy A, wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 300 μl 10 mg/ml proteinazy K, wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Inkubować reakcję O/N (lub co najmniej 4 godziny) w temperaturze 65 °C. Następnego ranka dodać 300 μl 10 mg/ml proteinazy K, wymieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C.

7. Oczyszczanie DNA

  1. Dodać 4337,5 μl buforu TLE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA pH 8,0) i wymieszać.
  2. Dodać 1 objętość (10 ml) fenolu o pH 8,0, wirować przez 10 s i odwirować w temperaturze pokojowej i 20 000 x g przez 3 minuty. Przenieść 9 ml górnej (wodnej) fazy do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Fenol jest niebezpieczną substancją chemiczną. Przestrzegaj odpowiednich przepisów BHP.
  3. Dodać 2 ml buforu TLE do pozostałej fazy wodnej, wirować przez 10 s i odwirować w temperaturze pokojowej i 20 000 x g przez 3 min. Przenieść 2,5 ml fazy wodnej do nowej probówki z kroku 7.2, uzyskując ostateczną objętość 11,5 ml. Wyrzuć probówkę zawierającą dolną (organiczną) fazę.
  4. Dodać 1 objętość (11,5 ml) fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1), wirować przez 10 s i odwirowywać w temperaturze pokojowej i 20 000 x g przez 3 min. Przenieść 11 ml górnej (wodnej) fazy do nowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz krok 7.3. Całkowita objętość próbki wyniesie teraz 13,5 ml.
  5. Dodać 1,35 ml 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 33,75 ml lodowatego 100% etanolu, wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C przez 45 minut lub alternatywnie przez noc w temperaturze -20 °C.
  6. Odwirować w temperaturze 4 °C i 20 000 x g przez 10 minut, usunąć sklarowany sklarant, ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżo przygotowanego etanolu o stężeniu 70% (obj.) i przenieść do nowej probówki.
  7. Wirować w temperaturze 4 °C i na pełnych obrotach przez 3 minuty w wirówce stołowej, a następnie usunąć supernatant.
  8. Ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego etanolu o stężeniu 70% (obj./obj.) i powtórzyć krok 7.7. Suszyć osad w temperaturze 37 °C przez 10 minut i ponownie zawiesić w 650 μl buforu TLE. Określ wydajność DNA, używając testu opartego na fluorescencji do ilościowego oznaczania dwuniciowego DNA.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać poprzez szybkie zamrożenie i przechowywanie próbki w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy lub w temperaturze -20 °C przez krótszy okres czasu.

8. Kontrola jakości

  1. Monitoruj integralność biblioteki i ligację za pomocą elektroforezy DNA. Uruchom 200 ng biblioteki na 0,8% agarozie/1x żel TBE. DNA powinno przebiegać jako pasmo o długości ponad 10 kb.
  2. Wykrywanie znanych niezmiennych interakcji krótkiego i dalekiego zasięgu typu komórki za pomocą konwencjonalnego PCR. Użyj 100 ng matrycy DNA na reakcję PCR. Zaprojektuj startery PCR blisko i w kierunku miejsc restrykcji zgodnie z powyższymi instrukcjami (patrz 3.7.1). Sekwencje starterów do kontroli jakości mysich i ludzkich bibliotek Hi-C są wymienione w Tabeli 1.
  3. Kontrola wypełniania i ligacji: Wyciąć pasma żelu zawierające amplikony z kontroli 8.2, DNA z ekstraktem żelowym i użyć DNA jako matrycy dla 4 indywidualnych reakcji PCR z identycznymi kombinacjami starterów.
    1. Oczyść amplikony za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i określ ilościowo stężenie DNA.
    2. Przygotować cztery reakcje trawienia (HindIII [a], NheI [b], HindIII + NheI [c] i bez enzymu [d]) dla każdego amplikonu w końcowej objętości 15 μL: 500 ng amplikonu, 1,5 μL 10x buforu restrykcyjnego 2,1, 0,15 μL 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (100x BSA) i 0,1 μl (10 jednostek) enzymu (HindIII [a], NheI [b], HindIII + NheI [c] lub woda [d]).
    3. Trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadzić reakcje trawienia na 1,5% (wag./obj.) agarozie/1x żelu TBE.

9. Fragmentacja DNA

  1. Przenieść 50,5 μg próbki do nowej probówki i dodać bufor TLE do końcowej objętości 655 μL. Podzielić próbkę na 5 fiolek do sonikacji (patrz Tabela Materiałów), dodając 130 μL biblioteki (10 μg) do każdej fiolki. Ścinanie do wielkości ~400 pz w ultrasonikatorze (patrz Tabela Materiałów) przy użyciu następujących parametrów: współczynnik pracy: 10%; Szczytowa moc w przypadku awarii (W): 140; Cykle na serię: 200; czas: 55 s.
  2. Zebrać soniczną próbkę do świeżej probówki o pojemności 2 ml.

10. Dwustronny wybór rozmiaru koralików SPRI

  1. Dobrze wymieszaj roztwór kulek SPRI (odwracalna immobilizacja w fazie stałej) przez odwrócenie, przenieś 1,85 ml roztworu kulek do nowej probówki i przynieś do RT na 15 minut.
  2. Dodać 350 μl wody (klasa biologii molekularnej) do próbki (końcowa objętość 1 ml).
  3. Dodać 600 μl roztworu kulek SPRI do próbki (całkowita objętość 1,6 ml; stosunek roztworu SPRI do DNA: 0,6 do 1), inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przez 2–3 sekundy w celu pobrania próbki.
  4. Otworzyć pokrywkę, umieścić próbkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut, przenieść klarowny supernatant do nowej probówki i wyrzucić kulki.
  5. Skoncentrować kulki SPRI na drugim etapie wyboru rozmiaru: Przenieś 930 μl kulek SPRI do nowej probówki, umieść na magnetycznym stojaku separacyjnym na 5 minut i wyrzuć przezroczysty supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 310 μl roztworu kulek SPRI.
  6. Dodać 300 μl skoncentrowanych kulek SPRI (krok 10.5) do próbki (całkowita objętość 1,9 ml; stosunek roztworu SPRI do DNA wynosi teraz 0,9 do 1), inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować próbkę w wirówce stołowej przez 2–3 s. Ostrożnie otworzyć pokrywę, umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut, i odrzucić supernatant.
  7. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego 70% etanolu (obj./obj.) do probówki z próbką na stanowisku do separacji magnetycznej, inkubować przez 30 s i odrzucić supernatant. Powtórz dwa razy.
  8. Suszyć kulki w temperaturze 37 °C w termomikserze (otwarta pokrywa probówki) nie dłużej niż 5 minut. Dodać 300 μl buforu TLE do próbki, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Wirować próbkę w wirówce stołowej przez 2–3 sekundy, otworzyć pokrywę i umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki i wyrzucić kulki.

11. Ściąganie biotyny/streptawidyny produktów podwiązywania

  1. Przygotuj: 1x TB bufor (5 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 1 M NaCl; 0,05% Tween 20); 2x bufor NTB (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA; 2 M NaCl); 1x bufor NTB (5 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 1 M NaCl).
  2. Dodać 200 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną (patrz tabela materiałów) do nowej probówki, umieścić ją na stojaku do separacji magnetycznej na 1 minutę i usunąć supernatant.
  3. Przemyć kulki dwukrotnie 500 μl 1x TB buforu.
    1. Dla każdego etapu płukania podczas ściągania biotyny, naprawy końcowej i usuwania biotyny na końcach nieligowanego DNA, etapów ogonowania dATP i ligacji adaptera, ponownie zawiesić kulki w odpowiednim buforze, obracać z prędkością RT i 15 obr./min przez 3 minuty, obracać probówkę w wirówce stołowej przez 2–3 s, umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 3 minuty i usunąć supernatant.
  4. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl 2x bufora NTB. Wymieszać kulki i próbkę (całkowita objętość 600 μl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na obracającym się kole z prędkością 3 obr./min.
  5. Odzyskuj kulki na stojaku do separacji magnetycznej przez 3 minuty i usuń przezroczysty supernatant. Przemyć kulki dwukrotnie w 500 μl 1x buforu NTB, a następnie w 200 μl 1x buforu ligacyjnego. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl 10-krotnego buforu do podwiązywania.

12. Naprawa końcowa i usuwanie biotyny na końcach nieligowanego DNA

  1. Połączyć próbkę (łącznie 50 μl) z 50 μl mieszaniny 2,5 mM dNTP (12,5 μl po 10 mM każdego dNTP), 18,1 μl 3 000 U/ml polimerazy DNA T4, 18,1 μl 10 000 U/ml T4 PNK, 3,7 μl 5 000 U/ml dużego fragmentu polimerazy DNA I (Klenowa), i 360,1 μLH2O.
  2. Mieszać i inkubować w temperaturze 20 °C przez 1 godzinę, wstrząsając 5 s przy 700 obr./min co 2 minuty w termomikserze.
  3. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i umyj kulki dwukrotnie w 500 μl buforu 1x TB.
  4. Umyj koraliki w 500 μL 1x buforu NTB, a następnie jedno pranie w 500 μL 1x TLE .
  5. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i ponownie zawieś kulki w 415 μl 1x bufora TLE.

13. Ogon dATP

  1. Połączyć próbkę (415 μl) z 50 μl 10-krotnego buforu restrykcyjnego 2, 5 μl 10 mM dATP i 30 μl 5 U/μL egzo-minus Klenowa.
  2. Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wstrząsając 5 s przy 700 obr./min co 2 minuty w termomikserze.
  3. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i umyj kulki dwukrotnie w 500 μl buforu 1x TB.
  4. Umyj koraliki w 500 μL 1x bufora NTB.

14. Podwiązanie adaptera

  1. Przemyć kulki w 200 μl 1x buforu reakcyjnego do ligacji (patrz tabela materiałów).
  2. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl 1x buforu reakcyjnego ligacji. Dodać 4 μl ligazy DNA (patrz tabela materiałów) i 16 μl wstępnie wyżarzonych łączników PE 15 μM (wstępnie wyżarzyć adaptery PE przez zmieszanie równych objętości adaptera PE 1 i adaptera PE 2 (oba w temperaturze 30 μM) i inkubować przez kilka minut w temperaturze pokojowej). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  3. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i umyj kulki dwukrotnie w 500 μl buforu 1x TB.
  4. Umyj koraliki w 500 μL 1x bufora NTB. Następnie umyj kulki w 100 μl 1x buforu restrykcyjnego 2, ponownie zawieś kulki w 50 μl 1x buforu restrykcyjnego 2 i przenieś do nowej probówki.

15. Wzmocnienie biblioteki Hi-C

  1. Przygotować główną mieszankę PCR: 100 μL 5x buforu Phusion; 6 μL 25 μM PE PCR starter 1.0; 6 μL 25 μM PE PCR starter 2.0; 14 μL mieszanki dNTP (10 mM każdy); 6 μL polimerazy Phusion; 318 μL H2O.
  2. Wymieszać główną mieszankę PCR z kulkami (łącznie 500 μl), podzielić na 10 porcji po 50 μl i amplifikować metodą PCR w następujących warunkach:
    30s przy 98 °C
    7 cykli: 10 s w temperaturze 98 °C; 30 s w 65 °C; 30 s przy 72 °C
    7 min przy 72 °C
  3. Zebrać reakcje PCR do nowej probówki, odzyskać kulki na magnetycznym stojaku separacyjnym i przenieść supernatant (500 μl) do nowej probówki.
  4. Oczyść DNA biblioteki za pomocą koralików SPRI.
    1. Wymieszać kulki SPRI, przenieść 460 μl kulek do nowej probówki i przynieść, do RT na 15 minut. Dodać 450 μl kulek SPRI do reakcji PCR (końcowa objętość 950 μl), inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wirować próbkę w wirówce stołowej przez 2–3 sekundy w celu pobrania próbki.
    2. Otworzyć pokrywę, umieścić próbkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut i usunąć supernatant.
    3. Trzymając kulki na stojaku do separacji magnetycznej, dodaj 1 ml 70% etanolu (obj./obj.) do probówki z próbką na obszarze wolnym od kulek, pozostaw na 30 s i wyrzuć supernatant.
    4. Powtórz krok 15.4.3 jeszcze dwa razy.
    5. Suszyć kulki w temperaturze 37 °C w termomikserze (otwarta pokrywa probówki) nie dłużej niż 5 minut.
    6. Dodać 51 μl buforu TLE do próbki, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze.
    7. Wirować próbkę w wirówce stołowej przez 2–3 sekundy, otworzyć pokrywę i umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 5 minut. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki i wyrzucić kulki.
    8. Określ ilościowo stężenie biblioteki Hi-C. Po 7 rundach amplifikacji PCR rutynowo uzyskujemy 500–1,500 ng biblioteki Hi-C.

16. Hybrydowe przechwytywanie w rozwiązaniu

UWAGA: Poniższe rozwiązania blokujące i buforowe (SHS1-4) pochodzą z zestawu SureSelect (patrz Tabela Materiałów).

  1. Przenieść 500 ng do 1 μg biblioteki Hi-C do nowej probówki i odparować próbkę na koncentratorze próżniowym (patrz Tabela materiałów; 45 °C; podciśnienie: poziom 30,0, rampa 5) aż do wyschnięcia.
  2. Ponownie zawiesić odparowaną bibliotekę Hi-C, dodając 3,6 μlH2O(klasa biologii molekularnej), 2,5 μl blokera 1, 2,5 μl blokera 2 i 0,6 μl niestandardowego blokera.
  3. Przenieść próbkę do dołka z nowego paska probówki do PCR, zamknąć paskiem z nasadką do PCR i umieścić na lodzie. Oznaczenie jako "D" (dla DNA Hi-C).
  4. Przygotować bufor hybrydyzacyjny: 12,5 μl buforu SHS1; 0,5 μl buforu SHS2; 5 μl buforu SHS3; 6,5 μl buforu SHS4.
  5. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w termomikserze. Przenieść do studzienki z nowym paskiem probówki do PCR, zamknąć paskiem z nasadką do PCR i przechowywać w temperaturze RT. Oznaczyć jako "H" (dla buforu hybrydyzacyjnego).
  6. W studzience nowego paska probówki do PCR wymieszaj 5 μl 100 ng/μl biotynylowanych sond RNA (przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie tuż przed użyciem); 0,5 μl SRNazy B (inhibitora RNazy) i 1,5 μlH2O(klasa biologii molekularnej).
  7. Zamknij pasek probówki do PCR paskiem z nakrętką do PCR i umieść na lodzie. Oznacz jako "R" (dla RNA).
  8. Skonfiguruj maszynę do PCR przy użyciu następujących parametrów:
    5 min w temperaturze 95 °C; 25 h w temperaturze 65 °C; pokrywka podgrzana; 29 μL objętość reakcji PCR.
    UWAGA: Postępuj tak szybko, jak to możliwe podczas wszystkich procedur, gdy maszyna do PCR jest uruchomiona, aby uniknąć parowania próbki.
  9. Umieść pasek probówki "D" PCR w maszynie do PCR, zamknij pokrywę maszyny do PCR i rozpocznij reakcję PCR. Gdy program PCR osiągnie 65 °C, otwórz pokrywę maszyny do PCR i umieść pasek probówki "H" PCR w maszynie do PCR. Zamknij pokrywę maszyny do PCR i inkubuj przez 3 minuty. Otwórz pokrywę maszyny do PCR, umieść pasek probówki "R" PCR na maszynie do PCR i zamknij maszynę do PCR.
  10. Po 2 minutach otwórz pokrywę maszyny do PCR i wszystkie paski probówki do PCR. Przenieść 13 μl studzienki "H" do studzienki "R", a następnie całą objętość studzienki "D" do studzienki "R". Pipetować w górę i w dół 3 razy, aby wymieszać reakcję, zamknąć pasek probówki do PCR, usunąć paski probówki do PCR "H" i "D" i zamknąć pokrywę maszyny do PCR. Inkubować reakcję w temperaturze 65 °C przez 24 godziny.

17. Izolacja produktów ligacji zawierających fragmenty promotora

UWAGA: Następujące kroki są zalecane do wykonania z zestawem adapterów i biblioteką SureSelect (zobacz Tabelę materiałów).

  1. Wstępnie ogrzać 1,5 ml buforu płuczącego 2 na próbkę w temperaturze 65 °C.
  2. Dodać 60 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną (patrz tabela materiałów) do nowej probówki, umieścić na stojaku do separacji magnetycznej na 1 minutę i usunąć supernatant.
  3. Umyj koraliki trzykrotnie 200 μl 1x bufora wiążącego.
    UWAGA: Dla każdego etapu płukania podczas izolacji produktów ligacji zawierających promotor po wychwyceniu, ponownie zawiesić kulki w odpowiednim buforze, obracać przez 3 minuty przy RT i 15 obr./min na obracającym się kole, delikatnie obracać probówkę w wirówce stołowej przez 2–3 sekundy w celu pobrania próbki, umieścić probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na 3 minuty, i usunąć supernatant.
  4. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl 1x bufora wiążącego. Otwórz maszynę do PCR i pasek probówki do PCR (gdy program PCR jest nadal uruchomiony) i przenieś reakcję hybrydyzacji do probówki z kulkami magnetycznymi. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut na obracającym się kole z prędkością 3 obr./min.
  5. Odzyskaj koraliki na stojaku do separacji magnetycznej i usuń przezroczysty supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 500 μl buforu do płukania 1, wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 °C, wytrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze.
  6. Odzyskuj kulki na stojaku do separacji magnetycznej przez 3 minuty i usuń przezroczysty supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 500 μl buforu płuczącego 2, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 65 °C, wytrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze. Powtórz krok 17.5 jeszcze dwa razy.
  7. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i ponownie zawieś kulki w 200 μl 1x bufora restrykcyjnego 2. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 30 μl 1x bufora restrykcyjnego 2.

18. Wzmocnienie biblioteki PCHi-C

  1. Przygotuj mieszankę wzorcową PCR: 60 μl 5x buforu PCR (bufor Phusion), 3,6 μl 25 μM startera PE PCR 1,0, 3,6 μl 25 μM startera PE PCR 2,0, 8,4 μl mieszanki dNTP (10 mM każdy), 3,6 μl polimerazy Phusion i 190,8 μlH2O.
  2. Wymieszaj główną mieszankę PCR z kulkami (łącznie 300 μl), podziel na 6 porcji po 50 μl i amplifikuj PCR, stosując następujące warunki:
    30 s przy 98 °C
    4 cykle: 10 s w 98 °C, 30 s w 65 °C, 30 s w 72 °C
    7 min przy 72 °C
  3. Zbierz wszystkie reakcje PCR w nowej probówce, odzyskaj koraliki na magnesie i przenieś supernatant (300 μl; zawiera bibliotekę PCHi-C) do nowej probówki.
  4. Oczyść bibliotekę PCHi-C za pomocą koralików SPRI, wykonując czynności opisane powyżej w punkcie 15.4.
  5. Określ ilościowo stężenie biblioteki PCHi-C.

Wyniki

Metodę Promoter Capture Hi-C stosowano w celu wzbogacenia bibliotek Hi-C mysich7,34,36,39 i ludzkich33,35,37,38 pod kątem interakcji promotorowych. Podobny protokół (nazwany HiCap) został opisany przez grupę Sandberga40. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg pracy dla metody Promoter Capture Hi-C. W opisanym tutaj protokole biblioteki Hi-C są generowane z wykorzystaniem ligacji wewnątrzjądrowej41, co skutkuje znacznym zmniejszeniem liczby fałszywych produktów ligacji42. W przypadku PCHi-C, wysoce złożone mysie lub ludzkie biblioteki Hi-C poddawane są hybrydyzacji w roztworze i wychwytowi przy użyciu odpowiednio 39 021 biotynilowanych RNA komplementarnych do 22 225 mysich fragmentów restrykcyjnych HindIII zawierających promotory lub 37 608 biotynilowanych RNA celujących w 22 076 ludzkich fragmentów restrykcyjnych HindIII zawierających promotory. Fragmenty restrykcyjne zawierające promotory mogą być celowane przez poszczególne biotynilowane RNA na jednym lub obu końcach (Rysunek 1B). Stwierdziliśmy, że wychwyt obu końców poprawił pokrycie poszczególnych promotorów (Rysunek 1C; surowe odczyty sekwencji) prawie dwukrotnie, zgodnie z oczekiwaniami. Dlatego, whenever possible (i.e., w regionach nierepetytywnych), zalecamy stosowanie biotynilowanych RNA komplementarnych do obu końców fragmentu restrykcyjnego przeznaczonego do wychwytu.

Aby ocenić jakość biblioteki PCHi-C na wczesnym etapie przygotowania, przeprowadzamy dwie kontrole po ligacji i oczyszczaniu DNA, zgodnie z wcześniejszym opisem31. Pierwsza z nich polega na użyciu specyficznych par starterów do amplifikacji produktów ligacji, podobnie jak w metodzie 3C27. Stosujemy pary starterów (Tabela 1) do amplifikacji niezależnych od typu komórek produktów ligacji dalekiego zasięgu, takich jak połączenia między genem Myc a jego znanymi enhancerami zlokalizowanymi około 2 Mb dalej (Rysunek 2A) lub między genami locus Hist1 (oddzielonymi o 1,5 Mb), a także między dwoma obszarami położonymi blisko siebie liniowo („kontrola krótkiego zasięgu”).

Drugą kontrolę jakości przeprowadza się w celu określenia wydajności inkorporacji biotyny podczas wypełniania nawisów miejsc restrykcyjnych za pomocą biotyny-dATP przy udziale fragmentu Klenow. Prawidłowe wypełnienie przez fragment Klenow i następująca po nim ligacja końców tępych prowadzą do zaniku pierwotnego miejsca restrykcyjnego pomiędzy cząsteczkami DNA w produkcie ligacji, a w przypadku HindIII – do powstania nowego miejsca rozpoznawania NheI (Rysunek 2B). Stosunek produktu ligacji trawionego HindIII do trawionego NheI stanowi bezpośredni odczyt wydajności inkorporacji biotyny. Biblioteka Hi-C słabej jakości wykaże wysoki poziom trawienia przez HindIII, podczas gdy biblioteki wysokiej jakości charakteryzują się niemal całkowitym trawieniem produktów ligacji przez NheI (Rysunek 2B).

Po przygotowaniu biblioteki Hi-C (tj. po wyodrębnieniu produktów ligacji Hi-C o wybranej wielkości za pomocą biotyny i streptawidyny, ligacji adapterów oraz wstępnej PCR), integralność i rozkład wielkości biblioteki Hi-C ocenia się za pomocą Bioanalyzer (Ryc. 2C). Tę samą kontrolę przeprowadza się na koniec przygotowania biblioteki PCHi-C (tj. po przechwytywaniu hybrydyzacyjnym produktów ligacji zawierających promotory oraz PCR po przechwytywaniu). Porównanie profili Bioanalyzer dla Hi-C i PCHi-C wykazuje, że zgodnie z oczekiwaniami biblioteki Hi-C są znacznie bardziej skoncentrowane niż odpowiadające im biblioteki PCHi-C, jednak rozkład wielkości bibliotek jest bardzo podobny, co wskazuje, że etap przechwytywania w PCHi-C nie wprowadza błędu związanego z wielkością fragmentów (Ryc. 2C, D).

Po sekwencjonowaniu par końcowych, odczyty PCHi-C są mapowane, poddawane kontroli jakości i filtrowane przy użyciu rurociągu HiCUP43. Wysokiej jakości biblioteki PCHi-C zawierają od 70% do 90% „par poprawnych” (tj. odczytów sekwencji par końcowych między dwoma fragmentami restrykcyjnymi, które nie sąsiadują ze sobą na liniowej mapie genomowej; Rycina 3A, B). Stosując protokół ligacji w jądrze komórkowym41,42, odsetek par odczytów trans (tj. odczytów sekwencji par końcowych między dwoma fragmentami restrykcyjnymi znajdującymi się na różnych chromosomach) jest zazwyczaj niski, od 5% do 25%, co odzwierciedla istnienie terytoriów chromosomowych i wskazuje na dobrą jakość biblioteki. Bezpośrednie porównanie odsetka „par poprawnych” między bibliotekami Hi-C a odpowiadającymi im bibliotekami PCHi-C35 pokazuje, że we wszystkich przypadkach odsetek par poprawnych jest wyższy w bibliotekach PCHi-C (Rycina 3B). Towarzyszy temu zmniejszenie odsetka niepoprawnych odczytów „wewnętrznych tego samego fragmentu” w PCHi-C (Rycina 3C). Jest to spodziewane, ponieważ etap wychwytu wzbogaca nie tylko produkty ligacji zawierające promotory, ale także końce fragmentów restrykcyjnych, ze względu na położenie oligosów wychwytujących na fragmentach restrykcyjnych (patrz Rycina 1B).

Po filtrowaniu za pomocą HiCUP określamy wydajność wychwytu. Biblioteki PCHi-C zawierają trzy rodzaje poprawnych odczytów sekwencji po filtrowaniu HiCUP:
1.) Promotor: odczyty genomowe (t.j. odczyty między wychwyconym fragmentem promotora a niepromotorowym fragmentem restrykcyjnym HindIII w dowolnym miejscu genomu)
2.) Promotor: odczyty promotorowe (odczyty między dwoma wychwyconymi fragmentami promotora)
3.) Genom: odczyty genomowe (tła produktów ligacji Hi-C, w których żaden z partnerów produktu ligacji nie mapuje do wychwyconego promotora). Są one odrzucane przed dalszymi analizami.

Wysokiej jakości biblioteki PCHi-C charakteryzują się wydajnością wychwytu (suma kategorii 1 i 2 opisanych powyżej) na poziomie 65–90% (Rycina 3D). Bezpośrednie porównanie z bibliotekami Hi-C wykazuje, że PCHi-C prowadzi do około 15-krotnego wzbogacenia produktów ligacji zawierających promotory (Rycina 3D), a w niektórych przypadkach nawet 17-krotnego. Jest to wartość bliska hipotetycznemu maksimum wzbogacenia dla PCHi-C (19,6-krotnego), które zależy od procentowego udziału fragmentów restrykcyjnych genomu objętych systemem wychwytu. Większe wzbogacenie można osiągnąć poprzez zaprojektowanie systemów wychwytu celujących w mniejszą liczbę fragmentów restrykcyjnych44,45,46.

Analiza interaktomów promotorowych wykazuje specyficzność dla typu komórek i linii komórkowej33,34,35, przy czym wyraźne zmiany występują podczas różnicowania komórkowego37,38,39. Ryciny 4 oraz 5 przedstawiają przykłady specyficzności linii oraz dynamiki różnicowania w obrębie konkretnych promotorów. Na przykład ALAD jest konstytutywnie ekspresowany we wszystkich komórkach, jednak jego ekspresja jest zwiększona w erytroblastach47. Promotor ALAD kontaktuje się z kilkoma fragmentami dystalnymi we wszystkich komórkach krwiotwórczych i wchodzi w dodatkowe interakcje specyficznie w erytroblastach (Rycina 4). IL-8 nie wykazuje statystycznie istotnych interakcji w limfocytach B, bardzo niewielką liczbę interakcji w limfocytach T, ale dziesiątki interakcji w komórkach linii mieloidalnej, w tym interakcje specyficzne dla typu komórek w monocytach, neutrofilach i megakariocytach (Rycina 5). Przykłady te pokazują, w jaki sposób metoda PCHi-C może być wykorzystana do odszyfrowania specyficznych dla typu komórek interaktomów oraz identyfikacji regionów oddziałujących z promotorem o potencjale regulacyjnym.

Schemat wychwytywania konformacji chromosomów; procesy obejmują sieciowanie, trawienie restrykcyjne, ligację.
Rysunek 1: Teoria metody Promoter Capture Hi-C i projektowanie przynęt do wychwytywania. (A) Schematyczny przebieg procesu PCHi-C. Ligacji Hi-C w jądrze komórkowym41,42 (I) towarzyszy hybrydyzacja w roztworze z biotynylowanymi przynętami RNA (II) celującymi w fragmenty restrykcyjne wszystkich ludzkich (przedstawionych tutaj) lub mysich promotorów genów (III). (B) Projektowanie przynęt dla PCHi-C. Biotynylowane przynęty RNA do wychwytywania (czerwone zakrzywione linie) są projektowane przeciwko końcom fragmentów restrykcyjnych zawierających promotor (szare; należy zauważyć, że same sekwencje promotorowe (czerwone) są celem przynęt RNA tylko wtedy, gdy znajdują się na końcach fragmentów restrykcyjnych). Produkty ligacji składające się z fragmentów restrykcyjnych zawierających promotor (szare) oraz ich oddziałujących fragmentów restrykcyjnych (żółte i zielone) są izolowane poprzez hybrydyzację opartą na komplementarności sekwencji między przynętą RNA a celem DNA, a następnie poprzez wytrącanie biotyna-streptawidyna, jak pokazano w A. (C) Porównanie wydajności wychwytywania PCHi-C dla fragmentów restrykcyjnych zawierających promotor, będących celem jednej sondy-przynęty RNA w porównaniu do dwóch sond-przynęt RNA (patrz schemat w B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Przebieg edycji genów i analiza; metoda uzupełniania DNA, elektroforeza żelowa, profile z Bioanalizatora.
Rycina 2: Kontrole jakości PCHi-C przed sekwencjonowaniem. (A) Po lewej: schemat przestrzennego sąsiedztwa promotora i PIR, skutkujący powstaniem produktu ligacji Hi-C składającego się z fragmentu restrykcyjnego zawierającego promotor (szary; sekwencja promotora na czerwono) oraz fragmentu restrykcyjnego PIR (żółty). Po prawej: elektroforeza żelowa DNA ukazująca przykłady produktów ligacji Hi-C amplifikowanych przy użyciu specyficznych par starterów (zgodnie z schematem po lewej). (B) Po lewej: reprezentatywne przykłady trawień restrykcyjnych produktów ligacji Hi-C (produktów PCR pokazanych w A) za pomocą HindIII, NheI oraz HindIII/NheI. Po prawej: schemat sekwencji DNA po ligacji Hi-C w przypadku nieudanego (góra) lub udanego (dół) uzupełnienia końców restrykcyjnych przez fragment Klenowa z dNTP i następującej po nim ligacji. (C) Reprezentatywny profil bioanalizatora biblioteki Hi-C (rozcieńczenie 1/5). (D) Reprezentatywny profil bioanalizatora biblioteki PCHi-C (brak rozcieńczenia). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe i kołowe porównujące interakcje PCHi-C i Hi-C w analizie danych sekwencjonowania genów.
Rycina 3: Kontrole jakości PCHi-C po sekwencjonowaniu. (A) Porównanie procentowej liczby prawidłowych par odczytów sekwencji po przetwarzaniu w programie HiCUP43 w bibliotekach PCHi-C w stosunku do odpowiadających im bibliotek Hi-C (dane z Javierre et al., 201635). (B) Reprezentatywny wynik PCHi-C z programu HiCUP przedstawiający prawidłowe pary odczytów oraz inne kategorie sekwencji, które są odrzucane przed dalszymi analizami (dane z Javierre et al., 201635). (C) Porównanie procentowej liczby odczytów typu „same fragment internal” po przetwarzaniu w programie HiCUP w PCHi-C w stosunku do odpowiadających im bibliotek Hi-C (dane z Javierre et al., 201635). (D) Porównanie procentowej liczby odczytów sekwencji obejmujących wyłapane fragmenty promotorów (efektywność wychwytu) w PCHi-C w stosunku do odpowiadających im bibliotek Hi-C (dane z Javierre et al., 201635). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram oddziaływań chromosomalnych; mapowanie genów; analiza typów komórek; genomiczne cechy strukturalne.
Rysunek 4: ALAD Profil PCHi-C w ludzkich komórkach krwiotwórczych. Interakcje promotorowe typów komórek mieloidalnych przedstawiono jako niebieskie łuki, a interakcje promotorowe typów komórek limfoidalnych jako łuki fioletowe. Interakcje specyficzne dla erytroblastów zaznaczono czerwonymi strzałkami (dane z Javierre i wsp., 201635). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat ekspresji genomicznej, wykres regulacji genów w komórkach odpornościowych, analiza różnicowania typów komórek.
Rycina 5: IL8 Profil PCHi-C w ludzkich komórkach krwiotwórczych. Interakcje promotorów w typach komórek mieloidalnych przedstawiono w formie niebieskich łuków, a interakcje promotorów w typach komórek limfoidalnych w formie fioletowych łuków. Interakcje specyficzne dla monocytów zaznaczono zielonymi strzałkami, interakcje specyficzne dla neutrofili czerwonymi strzałkami, a interakcję specyficzną dla megakariocytów brązową strzałką (dane z Javierre i wsp., 201635). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Człowiek
NazwaSekwencja ChromosomNiciStart GRCh38/hg38Koniec GRCh38/hg38Kombinacje starterów do badania interakcji 3C oraz wbudowania biotyny
hs AHF64 Dekker GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC11+116803960116803991stosować w połączeniu z hs AHF66 Dekker 
hs AHF66 DekkerCTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC11+116810219116810248stosować w połączeniu z hs AHF64 Dekker 
locus hs MYCGGAGAACCGGTAATGGCAAA8-127733814127733833stosować w połączeniu z hs MYC +1820 lub hs MYC -538
hs MYC +1820AAAATGCCCATTTCCTTCTCC8+129554527129554547stosować w połączeniu z locus hs MYC
hs MYC -538TGCCTGATGGATAGTGCTTTC8-127195696127195716stosować w połączeniu z locus hs MYC
hs HIST1 FAAGCAGGAAAAGGCATAGCA6+2620717426207193stosować w połączeniu z hs HIST1 R
hs HIST1 RTCTTGGGTTGTGGGACTTTC6+2777157527771594stosować w połączeniu z hs HIST1 F
Mysz
SekwencjaChromosomNićUruchom GRCm38/mm10Koniec GRCm38/mm10Kombinacje starterów do badania oddziaływań 3C oraz wbudowania biotyny
TCATGAGTTCCCCACATCTTTG8+8484109084841111stosować w połączeniu z mm Calr2
CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT8+8484851984848541stosować w połączeniu z mm Calr1
TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC6+125163098125163123stosować w połączeniu z Gapdh4 Dekker
GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT6+125163774125163799stosować w połączeniu z Gapdh3 Dekker
GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT6+5221282952212850stosować w połączeniu z mm Hoxa13
CAGGCATTATTTGCTGAGAACG6-5225349052253511stosować w połączeniu z mm Hoxa7
GGGTAATGGTGTCACTAACTGG13+2357128423571305stosować w połączeniu z mm Hist1h3e lub mm Hist1h4i
GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG13+2356654123566561stosować w połączeniu z mm Hist1h2ae
TTGGGCCAAAGCCTATATGA13+2204308522043104stosować w połączeniu z mm Hist1h2ae

Tabela 1: Sekwencje starterów do kontroli jakości bibliotek Hi-C człowieka i myszy.

Dyskusja

Modułowa konstrukcja Promoter Capture Hi-C

Promoter Capture Hi-C został zaprojektowany w celu wzbogacenia bibliotek Hi-C dla interakcji z udziałem promotorów. Interakcje te obejmują tylko podzbiór produktów ligacji obecnych w bibliotece Hi-C.

Capture Hi-C można łatwo zmodyfikować w celu wzbogacenia bibliotek Hi-C dla dowolnego regionu genomowego lub regionów zainteresowania poprzez zmianę systemu przechwytywania. Regiony wychwytywania mogą być ciągłymi segmentami genomu 44,45,46,48, wzmacniaczami, które zostały zidentyfikowane w PCHi-C ("Reverse Capture Hi-C'35") lub miejscach nadwrażliwych na DNazę I49. Rozmiar systemu przechwytywania można dostosować w zależności od zakresu eksperymentalnego. Na przykład Dryden i wsp. Celuj w 519 fragmentów przynęty w trzech pustyniach genowych związanych z rakiem piersi44. System wychwytywania Martina i wsp. jest ukierunkowany zarówno na ciągłe segmenty genomu ("przechwytywanie regionów": łącznie 211 regionów genomu; 2 131 fragmentów restrykcyjnych), jak i wybrane promotory (3 857 promotorów genów)45.

Biblioteki SureSelect są dostępne w różnych zakresach rozmiarów: od 1 kb do 499 kb (5 190–4 806), od 500 kb do 2,9 MB (5 190–4 816) i od 3 Mb do 5,9 Mb (5 190–4 831). Ponieważ każdy pojedynczy biotyna-RNA ma długość 120 nukleotydów, te systemy wychwytywania mieszczą maksymalnie 4 158, 24 166 i 49 166 indywidualnych sond wychwytujących. Odpowiada to odpowiednio 2 079, 12 083 i 24 583 ukierunkowanym fragmentom restrykcyjnym (należy zauważyć, że liczby dla fragmentów ograniczających są dolnymi granicami opartymi na założeniu, że dla każdego fragmentu restrykcji można zaprojektować dwie indywidualne sondy przechwytujące — w rzeczywistości ze względu na powtarzające się sekwencje nie będzie tak w przypadku każdego fragmentu restrykcji (zob. również rysunek 1B, C), co skutkuje większą liczbą możliwych do namierzenia fragmentów ograniczających dla stałej liczby dostępnych sond przechwytujących).

Opisany tutaj protokół opiera się na wykorzystaniu enzymu restrykcyjnego z miejscem rozpoznawania 6 pz w celu odkrycia interakcji dalekiego zasięgu. Możliwe jest również użycie enzymu restrykcyjnego z miejscem rozpoznawania 4 pz w celu uzyskania większej rozdzielczości bardziej proksymalnych interakcji40,49.

Ograniczenia PCHi-C

Jednym z nieodłącznych ograniczeń wszystkich testów wychwytywania konformacji chromosomów jest to, że ich rozdzielczość jest określana przez enzym restrykcyjny używany do generowania biblioteki. Interakcje zachodzące między elementami DNA znajdującymi się na tym samym fragmencie restrykcyjnym są niewidoczne dla testów typu C. Co więcej, w PCHi-C w niektórych przypadkach więcej niż jedno miejsce rozpoczęcia transkrypcji może znajdować się na tym samym fragmencie restrykcyjnym zawierającym promotor, a PIR w niektórych przypadkach zawierają zarówno aktywne, jak i represyjne znaczniki histonów, co utrudnia określenie, które elementy regulatorowe pośredniczą w interakcjach, oraz przewidywanie regulacyjnego wyniku interakcji promotora. Stosowanie enzymów restrykcyjnych z miejscami rozpoznawania 4 pz łagodzi ten problem, ale odbywa się kosztem znacznie zwiększonej złożoności biblioteki Hi-C (biblioteki Hi-C wygenerowane za pomocą enzymów ograniczających miejsce rozpoznawania 4 pz są co najmniej 100 razy bardziej złożone niż biblioteki Hi-C wygenerowane za pomocą enzymów restrykcyjnych miejsca rozpoznawania 6 pz) i związanych z tym kosztów sekwencjonowania nowej generacji.

Innym ograniczeniem jest to, że obecny protokół PCHi-C wymaga milionów komórek jako materiału wyjściowego, co uniemożliwia analizę interakcji promotorów w rzadkich typach komórek. Zmodyfikowana wersja PCHi-C, umożliwiająca badanie kontaktów promotora w populacjach komórek liczących od 10 000 do 100 000 komórek (na przykład komórek we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego lub hematopoetycznych komórek macierzystych), byłaby zatem cennym uzupełnieniem zestawu narzędzi Capture Hi-C.

Wreszcie, podobnie jak wszystkie metody, które opierają się na utrwalaniu formaldehydu, PCHi-C rejestruje tylko te interakcje, które są "zamrożone" w momencie utrwalenia. W związku z tym, aby zbadać kinetykę i dynamikę oddziaływań promotorów, potrzebne są metody takie jak mikroskopia żywych komórek o wysokiej rozdzielczości wraz z PCHi-C.

Metody analizy przestrzennej organizacji chromosomów w wysokiej rozdzielczości

Ogromna złożoność bibliotek interakcji chromosomowych uniemożliwia wiarygodną identyfikację produktów interakcji między dwoma określonymi fragmentami restrykcyjnymi z istotnością statystyczną. Aby obejść ten problem, przechwytywanie sekwencji zostało wykorzystane do wzbogacenia bibliotek Hi-C 33,34,40,44 lub 3C50,51 dla określonych interakcji. Główną zaletą korzystania z bibliotek Hi-C w porównaniu z bibliotekami 3C na etapie wzbogacania jest to, że Hi-C, w przeciwieństwie do 3C, zawiera etap wzbogacania dla oryginalnych produktów ligacji. W konsekwencji odsetek prawidłowych odczytów w bibliotekach PCHi-C jest około 10-krotnie wyższy niż w bibliotekach Capture-C50, które zawierały około 5–8% prawidłowych odczytów po filtrowaniu HiCUP. Sahlen i in. bezpośrednio porównali Capture-C z HiCap, który podobnie jak PCHi-C używa bibliotek Hi-C do wzbogacania przechwytywania, w przeciwieństwie do Capture-C, który używa bibliotek 3C. Zgodnie z naszymi ustaleniami odkryli, że biblioteki Capture-C składają się głównie z nieligowanych fragmentów40. Ponadto biblioteki HiCap miały większą złożoność niż biblioteki Capture-C40.

Wariant Capture-C, zwany Capture-C52 nowej generacji (NG Capture-C) wykorzystuje jeden oligo na koniec fragmentu restrykcyjnego, jak wcześniej ustalono w PCHi-C 33,34, zamiast nakładających się sond używanych w oryginalnym protokole Capture-C50. Zwiększa to nieznacznie odsetek prawidłowych odczytów w porównaniu z Capture-C, ale NG Capture-C wykorzystuje dwie sekwencyjne rundy wzbogacania przechwytywania i stosunkowo dużą liczbę cykli PCR (łącznie od 20 do 24 cykli, w porównaniu do 11 cykli zwykle dla PCHi-C), co nieuchronnie skutkuje większą liczbą duplikatów sekwencji i mniejszą złożonością biblioteki. W eksperymentach próbnych podczas optymalizacji PCHi-C stwierdziliśmy, że odsetek unikalnych (tj. nie zduplikowanych) par odczytu wynosił tylko około 15%, gdy użyliśmy 19 cykli PCR (13 cykli przed wychwytywaniem + 6 cykli po przechwyceniu; dane nie pokazane), jednak optymalizacja do mniejszej liczby cykli PCR zwykle daje 75-90% unikalnych par odczytu. W związku z tym zmniejszenie liczby cykli PCR znacznie zwiększa ilość informacyjnych danych sekwencyjnych.

Najnowsza metoda łączy ChIP z Hi-C, aby skupić się na interakcjach chromosomowych, w których pośredniczy określone białko będące przedmiotem zainteresowania (HiChIP53). W porównaniu z ChIA-PET54, który opiera się na podobnym przesłaniu, dane HiChIP zawierają większą liczbę odczytów sekwencji informacyjnych, co pozwala na wywołanie interakcji o wyższym poziomie ufności53. Bardzo interesujące będzie bezpośrednie porównanie odpowiednich zestawów danych HiChIP i Capture Hi-C, gdy staną się one dostępne (na przykład HiChIP przy użyciu przeciwciała przeciwko jednostce kohezyny Smc1a53 z Capture Hi-C dla wszystkich fragmentów restrykcyjnych związanych z Smc1a) obok siebie. Jedną z nieodłącznych różnic między tymi dwoma podejściami jest to, że Capture Hi-C nie opiera się na immunoprecypitacji chromatyny, a zatem jest zdolny do badania interakcji chromosomowych niezależnie od zajętości białka. Umożliwia to porównanie organizacji genomu 3D w obecności lub braku wiązania określonego czynnika, co zostało wykorzystane do identyfikacji PRC1 jako kluczowego regulatora architektury przestrzennej genomu myszy ESC7.

PCHi-C i GWAS

Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) wykazały, że ponad 95% wariantów sekwencji związanych z chorobą znajduje się w niekodujących regionach genomu, często w dużej odległości od genów kodujących białka55. Warianty GWAS często znajdują się w bliskim sąsiedztwie miejsc nadwrażliwych na DNazę I, co jest cechą charakterystyczną sekwencji o potencjalnej aktywności regulatorowej. PCHi-C i Capture Hi-C były szeroko stosowane do łączenia promotorów z loci ryzyka GWAS związanymi z rakiem piersi44, rakiem jelita grubego48 i chorobą autoimmunologiczną 35,45,46. Badanie PCHi-C na 17 różnych typach ludzkich komórek krwiotwórczych wykazało, że SNP związane z chorobą autoimmunologiczną były wzbogacone w PIR w komórkach limfoidalnych, podczas gdy warianty sekwencji związane z cechami specyficznymi dla płytek krwi i czerwonych krwinek stwierdzono głównie odpowiednio w makrofagach i erytroblastach35,56. W związku z tym specyficzne dla typu tkanki interakcje promotorowe odkryte przez PCHi-C mogą pomóc w zrozumieniu funkcji niekodujących wariantów sekwencji związanych z chorobą i zidentyfikowaniu nowych potencjalnych genów chorobowych do interwencji terapeutycznej.

Charakterystyka regionów oddziałujących na siebie z promotorem

Istnieje kilka linii dowodowych łączących interakcje promotorów z kontrolą ekspresji genów. Po pierwsze, kilka badań PCHi-C wykazało, że regiony genomu oddziałujące z promotorami genów o (wysokiej) ekspresji są wzbogacone w znaczniki związane z aktywnością wzmacniającą, takie jak acetylacja H3K27 i wiązanie p300 33,34,37. Znaleźliśmy pozytywną korelację między poziomem ekspresji genów a liczbą oddziałujących wzmacniaczy, co sugeruje, że addytywne działanie wzmacniaczy powoduje zwiększenie poziomu ekspresji genów34,35. Po drugie, naturalnie występujące loci ilościowych cech ekspresji (eQTL) są wzbogacone w PIR, które są połączone z tymi samymi genami, na których ekspresję wpływają eQTL35. Po trzecie, integrując dane TRIP57 i PCHi-C, Cairns i in. odkryli, że geny reporterowe TRIP mapujące do PIR w mysich ESC wykazują silniejszą ekspresję genów reporterowych niż geny reporterowe w miejscach integracji w regionach nieoddziałujących z promotorem58, co wskazuje, że PIRR posiadają transkrypcyjną aktywność regulacyjną. Łącznie odkrycia te sugerują, że interaktomy promotorowe odkryte przez PCHi-C w różnych typach komórek mysich i ludzkich obejmują kluczowe moduły regulacyjne do kontroli ekspresji genów.

Warto zauważyć, że wzmacniacze stanowią tylko niewielki ułamek (~20%) wszystkich PIR-ów odkrytych przez PCHi-C33,34. Inne PIR mogą pełnić rolę strukturalną lub topologiczną, a nie bezpośrednie transkrypcyjne funkcje regulacyjne. Istnieją jednak również dowody na to, że PCHi-C może odkrywać elementy DNA o funkcji regulacyjnej, które nie zawierają klasycznych znamion wzmacniacza. W ludzkiej linii komórek limfoidalnych stwierdzono, że promotor BRD7 oddziałuje z regionem pozbawionym śladów wzmacniacza, który okazał się mieć aktywność wzmacniającą w testach genów reporterowych33. Elementy regulacyjne o podobnych cechach mogą być liczniejsze niż obecnie się uważa. Na przykład badanie przesiewowe regulatorowe DNA oparte na CRISPR zidentyfikowało nieoznaczone elementy regulatorowe (URE), które kontrolują ekspresję genów, ale są pozbawione znaczników wzmacniających59.

W innych przypadkach wykazano, że PIR zawierają znaczniki chromatyny związane z represją transkrypcji. PIR i oddziałujące promotory związane przez PRC1 w mysich ESC były zaangażowane w rozległą sieć przestrzenną stłumionych genów noszących represyjny znak H3K27me37. W ludzkich komórkach limfoblastoidalnych odległy element oddziałujący z promotorem BCL6 tłumił ekspresję genu reporterowegotransgenu 33, co sugeruje, że może on działać w celu tłumienia transkrypcji BCL6 w swoim natywnym kontekście.

Innąbrację PIR wzbogaconą o obecność białka izolatora chromatyny CTCF w ludzkich ESC i NEC37 mogą reprezentować jeszcze inną klasę PIR. Podsumowując, wyniki te sugerują, że PIR zawierają zbiór czynności regulacyjnych genów, które nie zostały jeszcze scharakteryzowane funkcjonalnie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Waleriji Małeszewej za krytyczne przeczytanie manuskryptu i fachową pomoc przy rysunku 1. Prace te były wspierane przez Radę ds. Badań Medycznych w Wielkiej Brytanii (MR/L007150/1) oraz Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi w Wielkiej Brytanii (BB/J004480/1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% (vol/vol) roztwór paraformaldehyduAgar ScientificR1026
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Płodowa surowica bydlęca (FBS) sterylna filtrowanaSigma F9665
Końcówki do filtrów o niskiej retencji StarlabS1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 i S1182-1830
10x PBS pH 7.4Life Technologies70011-036
Woda klasy biologii molekularnejSigma-AldrichW4502
1 M Tris-HCl pH 8.0Life Technologies15568-025
IGEPAL CA-630 Sigma-AldrichI8896
5 M NaCl Life Technologies24740-011
Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA) Roche Diagnostics11873580001
Bufor restrykcyjny 2 (10x NEBuffer 2)Probówka New England BiolabsB7002
DNA LoBind, 1,5 ml Eppendorf0030 108.051
Probówka DNA LoBind, 2 mlEppendorf30108078
20% (wt/vol) SDS   Bio-Rad Laboratories161-0418
20% (obj./obj.) Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
HindIII, 100 U/uLNew England BiolabsR0104
10 mM dCTP Life Technologies18253-013
10 mM dGTPLife Technologies18254-011
10 mM dTTP Life Technologies18255-018
0,4 mM Biotyna-14-dATPLife Technologies19524-016
Polimeraza DNA I duży fragment (Klenow) 5000 jednostek/mlNew England BiolabsM0210
10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4 New England BiolabsB0202
100x 10mg/ml Albumina surowicy bydlęcej New England BiolabsB9001
Ligaza DNA T4, 1 U/μ L Invitrogen15224-025
RNase A Roche10109142001
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR Roche3115836001
20 000 razy; g 50 ml probówka wirówkowaVWR525-0156
0,5 M EDTA pH 8,0 Life Technologies15575-020
Fenol pH 8,0 SigmaP4557
Fenol: Chloroform: Alkohol izoamylowy 25:24:1 SigmaP3803
Octan sodu pH 5,2 SigmaS7899
Quant-iT PicoGreen InvitrogenP7589
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
QIAquick PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28104
Bufor restrykcyjny 2.1 (10x NEBuffer 2.1)New England BiolabsB7202
NheI, 100U/uLNew England BiolabsR0131
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm fiolki i nbsp;Covaris520045Do sonikacji
Koraliki SPRI (Agencourt AMPure XP) Beckman CoulterA63881
Koraliki Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen65001
tween 20 SigmaP9416
10 mM dATP Life Technologies18252-015
Polimeraza DNA T4 3000 jednostek/mlNew England BiolabsM0203
T4 PNK 10000 jednostek/mlNew England BiolabsM0201
Klenow exo minus 5000 jednostek/ml New England BiolabsM0212
Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji New England BiolabsB6058
NEB DNA Szybka ligaza Adapter PE New England BiolabsM2200
1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC
AGGAATGCCGAG-3')		Adapter Illumina
PE 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3')		Zestaw Illumina
NEB Phusion PCR Starter do PCR PE New England BiolabsM0530
1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTCTTTCCCTAC
ACGACGCTCTTCCGATCT-3')		Starter Illumina
PE PCR 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GATCGGTCTCGGCATTCCT
GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3') 		Paski Illumina
PCR Agilent Technologies410022 i 401425
SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE pełny zestaw adapterów Agilent Technologies931108
SureSelect niestandardowa biblioteka 3-5,9 Mb Agilent Technologies5190-4831niestandardowy system myszy lub ludzkiego PCHi-C
Dynabeads Koraliki MyOne Streptavidin T1 Invitrogen65601
E220  wysokowydajny skoncentrowany ultradźwiękiCorvarisE220

Bibliografia

  1. Osborne, C. S., et al. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nature Genetics. 36, 1065-1071 (2004).
  2. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nature Genetics. 42, 53-61 (2010).
  3. de Wit, E., et al. The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors. Nature. 501, 227-231 (2013).
  4. Bantignies, F., et al. Polycomb-dependent regulatory contacts between distant Hox loci in Drosophila. Cell. 144, 214-226 (2011).
  5. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome. Science. 341, 1237973(2013).
  6. Denholtz, M., et al. Long-range chromatin contacts in embryonic stem cells reveal a role for pluripotency factors and polycomb proteins in genome organization. Cell Stem Cell. 13, 602-616 (2013).
  7. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47, 1179-1186 (2015).
  8. Kundu, S., et al. Polycomb Repressive Complex 1 generates discrete compacted domains that change during differentiation. Molecular Cell. 65, 432-446 (2017).
  9. Skok, J. A., Gisler, R., Novatchkova, M., Farmer, D., de Laat, W., Busslinger, M. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature Immunology. 8, 378-387 (2007).
  10. Zhang, Y., et al. Spatial organization of the mouse genome and its role in recurrent chromosomal translocations. Cell. 148, 908-921 (2012).
  11. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24, 353-361 (2017).
  12. Ryba, T., et al. Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types. Genome Research. 20, 761-770 (2010).
  13. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515, 402-405 (2014).
  14. Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Reports. 10, 471-483 (2015).
  15. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32, 623-626 (2002).
  16. Tolhuis, B., Palstra, R. J., Splinter, E., Grosveld, F., de Laat, W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Molecular Cell. 10, 1453-1465 (2002).
  17. Amano, T., Sagai, T., Tanabe, H., Mizushina, Y., Nakazawa, H., Shiroishi, T. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16, 47-57 (2009).
  18. Zuniga, A., et al. Mouse limb deformity mutations disrupt a global control region within the large regulatory landscape required for Gremlin expression. Genes & Development. 18, 1553-1564 (2004).
  19. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132, 797-803 (2005).
  20. D'Haene, B., et al. Disease-causing 7.4 kb cis-regulatory deletion disrupting conserved non-coding sequences and their interaction with the FOXL2 promotor: implications for mutation screening. PLoS Genet. 5, e1000522(2009).
  21. Sur, I. K., et al. Mice lacking a Myc enhancer that includes human SNP rs6983267 are resistant to intestinal tumors. Science. 338, 1360-1363 (2012).
  22. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20, 1130-1137 (2014).
  23. Deng, W., et al. Controlling long-range genomic interactions at a native locus by targeted tethering of a looping factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
  24. Groschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157, 369-381 (2014).
  25. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  26. Franke, M., et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 538, 265-269 (2016).
  27. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  28. Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38, 1348-1354 (2006).
  29. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature Genetics. 38, 1341-1347 (2006).
  30. Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16, 1299-1309 (2006).
  31. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  32. Belton, J. M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58, 268-276 (2012).
  33. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47, 598-606 (2015).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Res. 25, 582-597 (2015).
  35. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167, 1369-1384 (2016).
  36. Wilson, N. K., et al. Integrated genome-scale analysis of the transcriptional regulatory landscape in a blood stem/progenitor cell model. Blood. 127, e12-e23 (2016).
  37. Freire-Pritchett, P., et al. Global reorganisation of cis-regulatory units upon lineage commitment of human embryonic stem cells. Elife. 6, (2017).
  38. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49, 1522-1528 (2017).
  39. Siersbaek, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66, 420-435 (2017).
  40. Sahlen, P., et al. Genome-wide mapping of promoter-anchored interactions with close to single-enhancer resolution. Genome Biology. 16, 156(2015).
  41. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  42. Nagano, T., Varnai, C., Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Wingett, S. W., Fraser, P. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  43. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Res. 4, 1310(2015).
  44. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24, 1854-1868 (2014).
  45. Martin, P., et al. Capture Hi-C reveals novel candidate genes and complex long-range interactions with related autoimmune risk loci. Nature Communications. 6, 10069(2015).
  46. McGovern, A., et al. Capture Hi-C identifies a novel causal gene, IL20RA, in the pan-autoimmune genetic susceptibility region 6q23. Genome Biol.ogy. 17, 212(2016).
  47. Hodge, D., et al. A global role for EKLF in definitive and primitive erythropoiesis. Blood. 107, 3359-3370 (2006).
  48. Jager, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  49. Joshi, O., et al. Dynamic reorganization of extremely long-range promoter-promoter Interactions between two states of pluripotency. Cell Stem Cell. 17, 748-757 (2015).
  50. Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46, 205-212 (2014).
  51. Kolovos, P., et al. Targeted Chromatin Capture (T2C): A novel high-resolution high-throughput method to detect genomic interactions and regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 7, 10(2014).
  52. Davies, J. O., et al. Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity. Nature Methods. 13, 74-80 (2016).
  53. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  54. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature. 462, 58-64 (2009).
  55. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337, 1190-1195 (2012).
  56. Petersen, R., et al. Platelet function is modified by common sequence variation in megakaryocyte super enhancers. Nat. Commun. 8, 16058(2017).
  57. Akhtar, W., et al. Chromatin position effects assayed by thousands of reporters integrated in parallel. Cell. 154, 914-927 (2013).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17, 127(2016).
  59. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34, 167-174 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biblioteka Hi-Cselekcja hybrydyzacyjna w roztworzebiotynilowane przynęty RNAanaliza fragmentów restrykcyjnychzastosowanie testów statystycznychregiony oddziałujące z promotorematlas typów komórek
Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.