Artykuł metodologiczny

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

147.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57324

⸱

9 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University, 3Department of Genetics, Cell Biology, and Development, University of Minnesota

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Streszczenie

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne tych amfifilów. W szczególności liposomy kwasów tłuszczowych wzmacniają dynamiczny charakter, ze względu na stosunkowo wysoką rozpuszczalność amfifilów jednołańcuchowych. Podobnie liposomy zawierające wolne kwasy tłuszczowe są bardziej wrażliwe na sól i kationy dwuwartościowe, ze względu na silne oddziaływania między grupami głównymi kwasu karboksylowego a jonami metali. Poniżej przedstawiono techniki otrzymywania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się w części lub w całości z amfifilów jednołańcuchowych (np. kwasów oleinowych).

Wprowadzenie

Liposomy lub pęcherzyki - kompartmenty ograniczone dwuwarstwowymi błonami składającymi się z amfifilowych lipidów - znalazły zastosowanie w licznych zastosowaniach biomedycznych jako nośniki dla farmaceutyków, modeli błon komórkowych i do rozwoju komórek syntetycznych. My i inni wykorzystaliśmy również liposomy jako modele prymitywnych błon komórkowych we wczesnym okresie życia. 1,2,3,4 Zazwyczaj w takich systemach stosujemy jednołańcuchowe amfifile zawierające tylko jeden ogon węglowodorów lipidowych (np. kwas oleinowy), ponieważ cząsteczki te są łatwiejsze do syntezy bez korzystania z kodowanych enzymów białkowych, które wykorzystują nowoczesne komórki.

Liposomy składające się z jednołańcuchowych lipidów są podobne do tych utworzonych z diacylofosfolipidów (np. 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny, lub POPC) w tym, że granica składa się z dwuwarstwowych błon. Liposomy utworzone z dowolnej klasy lipidów mogą zachować rozpuszczony ładunek i mogą być zmniejszane i oczyszczane różnymi technikami. Kilka istotnych różnic wynika z unikalnych właściwości chemicznych lipidów jednołańcuchowych. Pęcherzyki utworzone przez fosfolipidy są stabilne w szerokim zakresie pH, podczas gdy pęcherzyki kwasów tłuszczowych są stabilne tylko przy pH obojętnym do łagodnie zasadowego (ok. 7 - 9), co wymaga pewnego buforu pH do przygotowania pęcherzyków. W większości przypadków bufor ten może również zawierać specyficzne rozpuszczalne cząsteczki do enkapsulacji pęcherzyków, które mogą być materiałami funkcjonalnymi (np. RNA) do podzielonych na przedziały reakcji biochemicznych lub prostymi barwnikami fluorescencyjnymi (np. kalceiną) do charakterystyki pęcherzyków.

Obecność tylko jednego łańcucha węglowodorowego wytwarza membranę, która jest zarówno bardziej przepuszczalna dla substancji rozpuszczonych, jak i bardziej dynamiczna. Dodatkowo grupa głowy kwasu karboksylowego obecna w kwasach tłuszczowych powoduje, że pęcherzyki są bardziej wrażliwe na obecność soli i kationów dwuwartościowych (np. Mg2+). Magnez jest jednym z najważniejszych dwuwartościowych kationów katalizujących reakcje biochemiczne w protokomórkach do badań nad pochodzeniem życia. We wczesnym okresie życia, przed ewolucją wyrafinowanych enzymów białkowych, RNA mogło być dominującym polimerem, ze względu na jego podwójną zdolność do samoreplikacji i przeprowadzania katalizy. Jednym z reprezentatywnych przykładów reakcji związanej z RNA wymagającej magnezu jest nieenzymatyczne kopiowanie RNA, po raz pierwszy zademonstrowane w latach 1960.5 Gdy chemicznie aktywowane nukleotydy RNA (tj. nukleotydy 2-metyloimidazolidu) wiążą się z istniejącym wcześniej kompleksem starter-matryca, grupa 3'-hydroksylowa startera atakuje 5'-fosforan sąsiedniego aktywowanego monomeru, aby przemieścić grupę opuszczającą (tj. 2-metyloimidazol) i tworzy nowe wiązanie fosfodiestrowe. Ta chemia kopiowania RNA wymaga wysokiego stężenia Mg2+, który musi być chelatowany, aby był kompatybilny z protokomórkami kwasów tłuszczowych. 6 Inną zależną od Mg2+ reakcją jest ta katalizowana przez rybozym młota, który jest prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowanym katalitycznym RNA. Ten rybozym, który można odtworzyć z dwóch krótkich oligonukleotydów, przeprowadza reakcję samorozszczepienia, która jest wygodna do monitorowania przez przesunięcie żelu. W związku z tym jest często stosowany jako rybozym modelowy w badaniach nad pochodzeniem życia. 7 Ze względu na zapotrzebowanie tego rybozymu na niezligandowany magnez, liposomy są zazwyczaj budowane przez mieszaninę kwasów tłuszczowych i estrów glicerolu kwasów tłuszczowych, które są bardziej stabilne dla magnezu. 8,9 W tym protokole prezentujemy opracowane przez nas techniki przygotowania, manipulacji, charakterystyki tych pęcherzyków i demonstrujemy zastosowanie tych pęcherzyków jako protokomórek do nieenzymatycznego kopiowania RNA i katalizy rybozymu młota.

Protokół

1. Przygotowanie pęcherzyków

  1. Przygotowanie cienkich folii
    1. Użyć gazoszczelnych strzykawek przenieść pewną ilość lipidów, jak opisano w Tabeli 1.1, do chloroformu w szklanej fiolce.
    2. Powstały roztwór odparować pod strumieniem azotu lub argonu w dygestorium.
    3. Powstałą cienką warstwę należy poddać próżni domowej przez co najmniej 2 godziny, aby usunąć wszelkie pozostałości chloroformu. W tym momencie lipid można pozostawić na noc w próżni.
  2. Nawodnienie pęcherzyków
    1. Przygotuj 10 ml 5 mM buforu hydratacyjnego kalceiny 250 mM tris-HCl pH 8,0, rozpuszczając 31 mg kalceiny w proszku w 2,5 ml 1 M buforu tris-HCl pH 8,0 i dodając kolejne 7,5 ml wody dejonizowanej (DI).
    2. Odpipetować 250 μl powyższego buforu hydratacyjnego do pustej probówki i dodać 1,875 μl 10 M NaOH w celu uzyskania końcowej zasady 75 mM (odpowiednik 1/2 całkowitych kwasów tłuszczowych). Przenieść roztwór do cienkiej warstwy suchego lipidu, aby utworzyć pęcherzyki o całkowitym stężeniu lipidów 0,15 M .
    3. Użyj wirownika o dużej prędkości (>3000 obr./min), aby wirować powstałą mieszaninę przez 4-5 sekund.
    4. Pozostawić mieszaninę lipidów z buforem na obrotowej wytrząsarce o niskiej prędkości (ok. 30 obr./min) do ponownego nawodnienia, przynajmniej na noc.
  3. Wymiarowanie pęcherzyków (opcjonalnie)
    1. Za pomocą pęsety nałóż jedną podporę filtra na każdą wewnętrzną powierzchnię portów strzykawki ekstrudera.
    2. Zwilż każdy wspornik filtra 250 mM tris-HCl, pH 8.
    3. Za pomocą pęsety nałóż jedną wytrawioną ścieżką membranę poliwęglanową 100 nm na jeden z O-ringów ekstrudera i wsporników filtra. Uważając, aby nie rozerwać ani nie przebić membrany, delikatnie wepchnij membranę w O-ring, aby zapewnić dobry kontakt między dwiema powierzchniami.
    4. Zamontuj ekstruder, uważając, aby nie przesunąć membrany i wsporników filtra.
    5. Napełnij strzykawkę ekstrudera ok. 0,5 ml 250 mM tris-HCl, pH 8. Włóż tę strzykawkę po jednej stronie ekstrudera.
    6. Włóż pustą strzykawkę po drugiej stronie ekstrudera.
    7. Ręcznie powoli naciskać tłok strzykawki zawierającej bufor (≤ 50 μl/s) i sprawdzić, czy wyczuwalny jest opór, wskazujący, że membrana z wytrawionymi ścieżkami jest na swoim miejscu i nienaruszona. Pomocne jest przećwiczenie tego kroku bez założonej membrany, aby ocenić oczekiwany poziom oporu.
    8. Wyjąć i opróżnić obie strzykawki. Na tym etapie nie jest konieczne czyszczenie obu strzykawek, ponieważ zawierają one bufor o identycznym składzie jak preparat liposomowy.
    9. Załaduj preparat liposomowy do jednej z dwóch strzykawek.
    10. Zmontuj ekstruder ze strzykawką zawierającą próbkę pęcherzyków po lewej stronie i pustą strzykawką po prawej stronie.
    11. Ręcznie bardzo powoli wciskać tłok strzykawki zawierającej próbkę pęcherzyków (10-25 μl/s).
    12. Uważnie obserwuj strzykawkę po prawej stronie ekstrudera; przezroczysty bufor początkowo wejdzie po prawej stronie ekstrudera (ok. 50 μL, wynika to z wewnętrznej martwej objętości ekstrudera), a następnie pojawi się mały pióropusz wytłaczanych liposomów. W tym momencie natychmiast przestań naciskać, wyjmij strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wyrzuć ten roztwór.
    13. Wymień strzykawkę po prawej stronie ekstrudera i wytłaczaj, aż lewa strzykawka będzie pusta.
    14. Odwróć orientację ekstrudera i powtórz krok 13. Kontynuuj przez żądaną liczbę cykli (zwykle 7, 9 lub 11); Liczba nieparzysta jest zawsze używana, aby zapewnić, że niewytłaczane liposomy nie są pobierane ze strzykawki początkowo zawierającej preparat liposomowy do zmniejszania rozmiaru.
    15. Delikatnie dozować zawartość prawej strzykawki do probówki Eppendorf i umieścić probówkę na wytrząsarce o niskiej prędkości obrotowej (ok. 30 obr./min) na około 0,5 godziny.
    16. Kontynuuj oczyszczanie pęcherzyków, jak opisano w punkcie 2. Wytłaczane pęcherzyki należy zużyć w ciągu 24 godzin lub ponownie wytłoczyć przed następnym użyciem.

2. Oczyszczanie pęcherzyków

  1. Przygotowanie fazy ruchomej oczyszczania pęcherzyków
    1. Przygotuj 5 ml 250 mM buforu hydratacyjnego tris-HCl pH 8, dodając 1,25 ml 1 M buforu tris-HCl pH 8, 3,75 ml wody DI do 15 ml probówki Falcon. Następnie dodać 37,5 μl 10 M NaOH (1/2 ekwiwalentu zasady w stosunku do nieestryfikowanego kwasu tłuszczowego) do buforu hydratacyjnego. Odpipetować 235 μl czystego kwasu oleinowego bezpośrednio do probówki Falcon, otrzymując roztwór pęcherzyków z 0,15 M całkowitymi lipidami.
    2. Użyj wirownika o dużej prędkości (>3000 obr./min), aby wirować mieszaninę przez 4-5 sekund, a następnie bębnić na wytrząsarce o niskiej prędkości obrotowej przez co najmniej 2 godziny. W tym momencie preparat lipidowy można pozostawić na noc na obracającym się wytrząsarce. Przed użyciem przefiltrować fazę ruchomą przez strzykawkowy filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby usunąć wszelkie potencjalne agregaty.
  2. Oczyszczanie pęcherzyków na sefalozie
    1. Usunąć z butelki ok. 5 ml etanolowej zawiesiny Sepharose 4B za pomocą pipety. Zastosować go do jednorazowej kolumny chromatograficznej o pojemności 10 ml.
    2. Pozwól, aby gnojowica opadła i przepłynął etanol, aż etanol zbliży się do górnej części złoża żywicy.
    3. Nałóż 5 ml wody dejonizowanej na wierzch żywicy i pozwól jej przepłynąć, aby zmyć pozostałości etanolu.
    4. Nałóż 250 mM tris-HCl, pH 8 w porcjach po 1-2 ml na wierzch żywicy, nakładając nową porcję za każdym razem, gdy poziom cieczy zbliży się do górnej części złoża żywicy. Powtórz 3-5 razy.
    5. Zacisnąć kolumnę na stojaku retortowym, a następnie podłączyć końcówkę kolumny ze złączem kurka i rurką do kolektora frakcji. Dodaj kolejną porcję buforu, aby przepłukać rurkę, zamknij kurek, gdy poziom cieczy w kolumnie zbliży się do górnej części żywicy.
    6. Nanieść wytłaczane pęcherzyki z sekcji 1 na wierzch żywicy za pomocą pipetora o pojemności 200 μl, zwracając uwagę, aby nanieść preparat pęcherzykowy tak równomiernie, jak to możliwe, na żywicę, nie dotykając łoża żywicy lub ścianki kolumny.
    7. Otwórz kurek, aby rozpocząć przepływ i zacznij zbierać frakcje do 96-dołkowej płytki. Nałóż ruchomą fazę oczyszczania pęcherzyków na wierzch złoża żywicy w porcjach po 0,5-1 ml w miarę wyczerpywania się buforu, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia złoża żywicy. Zbierz we frakcjach pięciokroplowych, zbierając co najmniej 36 dołków (trzy rzędy 96-dołkowej płytki).
  3. Charakterystyka fluorescencyjna frakcji oczyszczających
    1. Wziąć 96-dołkową płytkę z poprzedniego rozdziału i odczytać ją na czytniku płytek (λex=485 nm, λem=515 nm).
    2. Wykreśl wynikowe dane dotyczące fluorescencji jako liczbę fluorescencji w funkcji frakcji. Najpierw wymywają się pęcherzyki, a następnie frakcja niekapsułkowana (Rysunek 1).
  4. Ponowne oczyszczanie pęcherzyków w celu monitorowania wycieku z pęcherzyków
    1. Powtórzyć etapy oczyszczania i charakterystyki opisane w sekcjach 2.2 i 2.3. Pęcherzyki, które zachowały swoją zawartość, nie będą wykazywały piku niekapsułkowanej substancji rozpuszczonej (lub bardzo mały pik ok. 5-10% intensywności piku pęcherzyka).

3. Stosowanie pęcherzyków w obecności magnezu

  1. Stosowanie magnezu niezligandowanego
    1. Przygotować i oczyścić pęcherzyki zgodnie z opisem w sekcjach 1, 2.1 i 2.2.
    2. Przygotować 1 ml 50 mM roztworu MgCl2 w 250 mM buforze tris-HCl pH 8,0, dodając 250 μl 1 M buforu tris-HCl pH 8,0 i 50 μl 1 M MgCl2 do 700 μl wody DI. Wiruj, aby dobrze wymieszać.
    3. Aby uzyskać pożądane stężenie magnezu 5 mM, zmieszaj 0,9 ml oczyszczonych pęcherzyków i 100 μl roztworu magnezu i szybko wymieszaj, aby zminimalizować pękanie pęcherzyków przez przejściowe narażenie pęcherzyków na wysokie miejscowe stężenie magnezu.
      UWAGA: Szybkie mieszanie roztworu magnezu ma kluczowe znaczenie dla stabilności pęcherzyków. Jeśli magnez i pęcherzyki nie zostaną szybko wymieszane przez natychmiastowe wirowanie, niektóre pęcherzyki będą narażone na wyższe stężenia magnezu, co spowoduje niespójne wyniki między próbkami.
    4. Pozostawić próbkę pęcherzyków na kubku na co najmniej 30 minut przed ponownym oczyszczeniem, jak opisano w ppkt 2.4, w celu sprawdzenia, czy zawartość nie wycieka. Dodać takie samo stężenie magnezu jak w próbce pęcherzyków do ruchomej fazy oczyszczania.
  2. Stosowanie ligandowanego magnezu
    1. Przygotować i oczyścić pęcherzyki zgodnie z opisem w sekcjach 1, 2.1 i 2.2.
      UWAGA: Użyj 1/2 równoważnika KOH zamiast NaOH do deprotonowania kwasów tłuszczowych; stwierdzono, że powoduje to wytwarzanie bardziej stabilnych liposomów w chelatowanych systemach MgCl2.
    2. Przygotuj 2M roztwór cytrynianu potasu i dostosuj pH do 8,0 za pomocą KOH.
    3. Premix MgCl2 i cytrynian potasu w określonym stosunku (ok. 1:4 dla stabilnych pęcherzyków kwasu oleinowego) w 250 mM buforze tris-HCl pH 8,0.
    4. Dodać wstępnie zmieszany roztwór cytrynianu magnezu do próbki pęcherzyka, krótko vortex.
      UWAGA: Zawsze mieszaj roztwór magnezu i liganda. Nigdy nie wystawiaj pęcherzyków na działanie samego niechelatowanego roztworu magnezu.
    5. Pozostawić próbkę pęcherzyków na bębnie na co najmniej 30 minut przed ponownym oczyszczeniem, jak opisano w ppkt 2.4. Dodać takie samo stężenie magnezu i cytrynianu, jak w próbce pęcherzyka, do ruchomej fazy oczyszczania.

4. Nieenzymatyczne kopiowanie RNA w pęcherzykach

  1. Przygotowanie pęcherzyków zamkniętych w monodyspersyjnym RNA
    1. Przygotować suchą warstwę kwasu oleinowego, jak opisano w sekcji 1.1.
    2. Przygotować bufor do hydratacji pęcherzyków z 50 μM znakowanym fluorescencyjnie starterem RNA, 150 μM matrycą RNA i 250 mM tris-HCl pH 8,0 zawierającym 1/2 równoważnika KOH w stosunku do kwasu oleinowego.
    3. Dodać 250 μl buforu nawadniającego do filmu lipidowego i postępować zgodnie z krokami 1.2.2 i 1.2.3, aby utworzyć pęcherzyki o całkowitym stężeniu lipidów 0,15 M.
    4. W celu wytworzenia małych jednowarstwowych pęcherzyków monodyspersyjnych, należy postępować zgodnie z sekcją 1.3 dotyczącą wytłaczania pęcherzyków.
  2. Dodatek cytrynianu magnezu i oczyszczanie pęcherzyków
    1. Wymieszaj magnez i cytrynian, a następnie wymieszaj je z próbką pęcherzyków do końcowego stężenia lipidów 0,1 M.
    2. Oczyść pęcherzyki na kolumnie wykluczającej wielkość Sepharose 4B, z 250 mM tris-HCl pH 8,0, 0,1 M lipidów i podając magnez i cytrynian jako fazę ruchomą.
    3. Zebrać frakcje pęcherzyków, postępując zgodnie z sekcją 2.3.
  3. Reakcja przedłużania podkładu
    1. Przygotować 200 mM roztwór podstawowy 2-MeImpG (5'-monofosforan 2-metyloimidazolidu guanozyny) o 250 mM tris-HCl pH 8,0. (UWAGA: Postępuj zgodnie z poprzednio opublikowanym protokołem10 dla syntezy 2-MeImpG.)
    2. Aby zainicjować reakcję przedłużania startera, przenieś 150 μl roztworu podstawowego 2-MeImpG do 450 μl próbki pęcherzyków, aby osiągnąć końcowe stężenie 75 mM lipidu i 50 mM aktywowanego monomeru. Uruchom stoper i utrzymuj próbkę reakcyjną w stanie wirowania przez cały czas.
    3. (Opcjonalnie) W celu ciągłego podawania świeżych monomerów przenieś 300 μl roztworu reakcyjnego do jednej komory zbudowanego w laboratorium dializatora liposomowego o małej objętości11 i umieść 300 μl roztworu do karmienia w drugiej komorze. Roztwór do karmienia powinien zawierać wszystkie składniki w tym samym stężeniu, co w roztworze reakcyjnym, z wyjątkiem zastąpienia pęcherzyków zawierających RNA pustymi pęcherzykami. Każda runda dializ trwa od 1 do 24 godzin, w zależności od użytego analitu i membrany.
    4. W przypadku badań kinetycznych należy pobrać podwielokrotność 100 μl w każdym punkcie czasowym i ponownie oczyścić podwielokrotność przez kolumnę wykluczającą Sepharose 4B z 250 mM tris-HCl pH 8,0 jako fazą ruchomą.
    5. Zebrać frakcje pęcherzyków w probówce eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
    6. Pipetę Triton odpipetować do frakcji pęcherzyków do końcowego około 0,1% v/v.
    7. Dodać 0,5 ml zimnego etanolu do probówki i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny.
    8. Odwirować wszystkie próbki w temperaturze 16.1×1000 rcf (16.1 × g) przez 10 minut i delikatnie odpipetować ciecze. Umyj granulki RNA 70% zimnym etanolem i ponownie odwiruj przez 5 minut. Wyrzuć ciecz i umieść probówkę z granulkami RNA na bloku grzewczym o temperaturze 80 °C na 2 minuty w celu odparowania resztek etanolu. Rozpuść granulki w 50 μL 8 M Mocznika z buforem ładującym 1xTBE.
  4. Analiza PAGE
    1. Przygotować żel 20% PAGE mieszając 200 ml koncentratu systemu UreaGel, 25 ml rozcieńczalnika systemu UreaGel, 25 ml buforu 10xTBE, 80 μl TEMED i 250 mg nadsiarczanu amonu. Szybko wlej mieszaninę żelu między zaciśnięte płytki żelowe (35 cm × 45 cm) i włóż grzebień. Odczekaj co najmniej 30 minut do całkowitej polimeryzacji.
    2. Zamontuj płytkę żelową na stojaku na żel i napełnij pudełka żelowe buforem do biegania 1xTBE. Zdejmij grzebień i przepłucz studzienki strzykawką. Uruchom żel o mocy 60 W przez 30 minut.
    3. Podgrzewać próbki w bloku grzewczym o temperaturze 80 °C przez 2 minuty i załadować 5 μl każdej próbki do dołka.
    4. Włącz żelową skrzynkę zasilającą i ustaw żel ze stałą mocą 60 W na 2,5 godziny.
    5. Zdemontuj płytkę żelową ze stojaka na żel, wytrzyj szkło do czysta i włóż całą płytkę do skanera żelu, aby rozpocząć skanowanie żelu.
    6. Określ ilościowo żel za pomocą analizy ImageQuant TL 1D. Wykreślić logarytm naturalny stosunku ilości startera pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości startera w funkcji czasu, dopasować do linii i obliczyć szybkość reakcji pseudo-pierwszego rzędu (Rysunek 2).

5. Samoczynne rozszczepienie RNA młota w pęcherzykach

  1. Przygotowanie i oczyszczanie rybozymu zamkniętego w pęcherzykach
    1. Przygotować cienką warstwę lipidów (OA: GMO=9:1), jak w sekcji 1.1, ze składnikami jak w tabeli 1.2. UWAGA: przed użyciem podgrzej GMO do co najmniej 60 °C w celu całkowitego stopienia.
    2. Przygotować bufor do nawadniania pęcherzyków z 5 μM każdej nici rybozymu młotkowatego i 250 mM tris-HCl pH 8,0.
    3. Dodać 250 μl buforu nawadniającego do filmu lipidowego i postępować zgodnie z krokami 1.2.2 i 1.2.3, aby uzyskać pęcherzyki o całkowitym stężeniu lipidów 0,15 M.
    4. W celu wytworzenia małych jednowarstwowych pęcherzyków monodyspersyjnych, należy postępować zgodnie z sekcją 1.3 dotyczącą wytłaczania pęcherzyków.
    5. Oczyść pęcherzyki na kolumnie wykluczającej sefarozę o wielkości 4B, z 250 mM tris-HCl pH 8,0, 0,15 M mieszanymi lipidami jako fazą ruchomą.
  2. Reakcja samorozszczepienia rybozymu młota
    1. Przygotować roztwór magnezu i wymieszać z oczyszczonymi pęcherzykami, jak opisano w sekcji 3.1, aby zainicjować reakcję samorozszczepienia.
    2. W przypadku badań kinetycznych należy pobrać 100 μl mieszaniny w każdym punkcie czasowym i bezpośrednio ponownie oczyścić tę podwielokrotność przez kolumnę wykluczającą Sepharose o wielkości 4B z 250 mM tris-HCl pH 8,0 jako fazą ruchomą. Zbierz frakcję pęcherzyków.
  3. Analiza PAGE
    1. Wykonaj kroki od 4.3.6 do 4.3.8, aby przygotować próbkę do obciążenia RNA.
    2. Umieść komercyjnie odlewany żel 15% TBE-Mocznik w pudełku żelowym i napełnij pudełko żelowe buforem do biegania 1xTBE.
    3. Podgrzewać próbki w bloku grzewczym o temperaturze 80 °C przez 1 minutę i załadować 5 μl każdej próbki do dołka.
    4. Uruchom żel ze stałym napięciem 200 V przez około 1 godzinę.
    5. Zeskanuj żel.
    6. Określ ilościowo żel za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak ImageQuant TL 1D, aby zmierzyć zakres rozszczepienia, porównując intensywność pozostałego pasma substratu RNA i rozszczepionego pasma fragmentu RNA (Rysunek 3).

6. Gigantyczne pęcherzyki kwasów tłuszczowych do mikroskopii

  1. Przygotowanie gigantycznych pęcherzyków kwasów tłuszczowych
    1. Postępuj zgodnie z sekcją 1.1 i tabelą 1.3, aby przygotować cienką warstwę kwasu oleinowego o stężeniu 0,2% fluorescencyjnie znakowanego lipidu w celu lepszej obserwacji błony.
    2. Ponownie uwodnić film lipidowy za pomocą 500 μl 250 mM tris-HCl pH 8,0, aby próbka pęcherzyka zawierała łącznie 10 mM lipidów. W razie potrzeby bufor może zawierać barwniki fluorescencyjne lub cząsteczki RNA. Pozostaw próbkę pęcherzyków na noc w stanie przewrócenia.
    3. Przygotować 150 ml czystego buforu do dializy kwasów tłuszczowych z 10 mM lipidów całkowitych, mieszając 470 μl kwasu oleinowego i 150 ml 250 mM tris-HCl pH 8,0 zawierającego 1/2 równoważnika NaOH.
    4. Wytłacz próbkę pęcherzyka przez membranę poliwęglanową o grubości 10 μm, aby usunąć duże agregaty.
    5. Przenieść próbkę pęcherzyka do kasety dializacyjnej o dużych porach 1 μm, jak opisano wcześniej. 12
    6. Umieścić kasetę do dializy w zlewce o pojemności 100 ml zawierającej 30 ml buforu do dializy. Delikatnie wymieszaj zlewkę na wytrząsarce stołowej z prędkością 80-100 obr./min.
    7. Zmieniaj bufor dializacyjny co 30 minut 5 razy, aby usunąć wolne barwniki lub RNA i małe pęcherzyki.
    8. Ostrożnie wyjąć próbkę pęcherzyków z kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki i przenieść do probówki Eppendorfa.
  2. Obserwacja mikroskopowa
    1. Pobrać pipetę z 10 μl pęcherzyków na czyste standardowe szkiełko mikroskopowe i nałożyć szklaną szkiełko nakrywkowe na próbkę. Uszczelnij szkło nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.
    2. Obserwuj pęcherzyki z 60-krotną dyspersją oleju lub podobnym obiektywem za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu odpowiedniego źródła lasera dla znakowanej fluorescencyjnie membrany, RNA lub kapsułkowanego barwnika (Rysunek 4).

Wyniki

Oczyszczanie liposomów przeprowadzamy zazwyczaj na kolumnach do chromatografii żelowej. Typowe preparaty liposomów zawierają fluorofor. Podczas tworzenia i ekstruzji liposomów substancje przeznaczone do enkapsulacji znajdują się zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz liposomów. Dzięki oczyszczaniu liposomów na żywicy do wykluczania molekularnego (Sepharose 4B), niezaenkapsulowane substancje rozpuszczone są zatrzymywane w porach żywicy, podczas gdy większe liposomy nie są zatrzymywane i eluują jako pierwsze (Rycina 1A). Zbieranie frakcji i wykreślenie zależności fluorescencji od numeru frakcji (Rycina 1B) zazwyczaj daje wykres z dwoma pikami, gdzie frakcje eluujące wcześniej odpowiadają liposom, które są następnie zbierane i wykorzystywane w dalszych zastosowaniach.

Często badamy nieenzymatyczne reakcje wydłużania starterów, które prawdopodobnie stanowiły sposób replikacji RNA przed pojawieniem się rybozymów i białkowych polimeraz RNA. W reakcjach tych zazwyczaj wykorzystuje się starter znakowany fluorescencyjnie (Rysunek 2A), który jest wydłużany przez aktywowane monomery. Przebieg tych reakcji można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 2B), a otrzymane elektrofereogramy poddać całkowaniu w celu wyznaczenia stałych szybkości dla określonych warunków reakcji (Rysunek 2C).

Aby wykazać, że RNA może funkcjonować wewnątrz protokomórek, wykorzystaliśmy samocięcie rybozymu typu hammerhead (Rysunek 3A) jako modelową reakcję katalityczną RNA. Reakcja ta wymaga wolnych jonów Mg2+ do wspomagania katalizy, dlatego zastosowano pęcherzyki OA/GMO, ponieważ są one stabilne w obecności 5 mM Mg2+. Podobnie jak w reakcjach wydłużania startera, reakcję samocięcia rybozymu typu hammerhead można monitorować za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 3B), a następnie poddać analizie w celu wyznaczenia stałej szybkości reakcji w określonych warunkach (Rysunek 3C).

Obrazujemy liposomy, wykorzystując zarówno fluorescencję, jak i światło przechodzące. Liposomy można znakować za pomocą lipidów fluorescencyjnych, co pozwala na znakowanie błony (Rysunek 4A), lub za pomocą fluorescencyjnego substancji rozpuszczonej w ich wnętrzu (Rysunek 4B). Światło przechodzące może być również wykorzystane do obserwacji pęcherzyków (pokazane również na Rysunku 4B).

Tabela 1.1 czysty kwas oleinowy w chloroformie
KomponentZasóbIlość
Kwas oleinowy>99%11.7 µL
Chloroform1 mL
Tabela 1.2 kwas oleinowy i monooleinian glicerolu (9:1) w chloroformie
KomponentRoztwór zapasowyIlość
Kwas oleinowy>99%10.5 µL
Monooleinian glicerolu>99%1.4 µL
Chloroform1 ml
Tabela 1.3 kwas oleinowy z 0,2mol% rodaminy-PE w chloroformie
KomponentRoztwór zapasowyIlość
Kwas oleinowy>99%1.6 µL
Rhodamina-PE w chloroformie10 mM20 µL
Chloroform1 ml

Tabela 1. Chloroformowe roztwory kwasów tłuszczowych.

Separacja pęcherzyków z kalceiną, schemat SDS-PAGE, wykres fluorescencji przedstawiający wyniki analizy piku.
Rycina 1. Oczyszczanie pęcherzyków i charakterystyka fluorescencyjna frakcji oczyszczania. A. Oddzielanie pęcherzyków zawierających kalceinę od wolnej kalceiny na kolumnie z Sepharose 4B. B. Wykrywanie piku kalceiny w pęcherzykach oraz wolnej kalceiny poprzez wykreślenie fluorescencji w każdej studzience w funkcji numeru studzience po zebraniu frakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

proces elongacji DNA, elektroforeza żelowa, analiza rozpadu; eksperyment, wyniki w funkcji czasu.
Rycina 2. Nieenzymatyczna replikacja RNA wewnątrz pęcherzyków OA. A. Schemat nieenzymatycznej elongacji startera RNA. B. Obraz PAGE reakcji wydłużania startera wewnątrz czystych pęcherzyków kwasu oleinowego, w warunkach opisanych w sekcji 4. C. Regresja liniowa naturalnego logarytmu stosunku ilości primera pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości primera w funkcji czasu w ciągu 30 h. Szybkość reakcji, obliczona na podstawie nachylenia ln(P/P0) w funkcji czasu wynosi 0,058 h-1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat cięcia RNA, elektroforeza żelowa, wykres analizy kinetycznej; przedstawia konwersję substratu.
Rysunek 3. Cięcie przez rybozym typu hammerhead w pęcherzykach OA/GMO. A. Schemat cięcia fluorescencyjnie znakowanej nici substratu (góra) przez rybozym typu hammerhead. B. Obraz PAGE obrazujący cięcie rybozymu typu hammerhead wewnątrz pęcherzyków OA/GMO w obecności 5 mM Mg2+. C. Aktywność rybozymu wewnątrz pęcherzyków. Regresja liniowa naturalnego logarytmu stosunku ilości substratu pozostałego w danym punkcie czasowym do początkowej ilości substratu w funkcji czasu w ciągu pierwszych 4 h. Szybkość reakcji, obliczona na podstawie nachylenia ln(S/S0) w funkcji czasu wynosi 0,36 h-1. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obraz mikroskopowy, test fluorescencyjny porównujący markery czerwone i zielone w badaniach komórkowych.
Rycina 4. Gigantyczne pęcherzyki kwasów tłuszczowych do mikroskopii. A. Obraz z mikroskopii konfokalnej pęcherzyka kwasu oleinowego znakowanego Rodaminą PE, pasek skali 10 μm. B. Obraz z mikroskopii konfokalnej pęcherzyka kwasu oleinowego zawierającego RNA znakowane Alexa48 z membraną widoczną w kanale detektora transmitowanego (TD), pasek skali 5 μm.

Dyskusja

Liposomy utworzone z kwasów tłuszczowych są przez wielu sugerowane jako potencjalne modele dla komórek prymitywnych ze względu na ich wysoką przepuszczalność i właściwości dynamiczne. Karboksylowa grupa główna jednołańcuchowych kwasów tłuszczowych pozwala na samoorganizację w błony tylko w ograniczonym zakresie pH, a powstałe błony są dość wrażliwe na obecność soli. W rezultacie pęcherzyki kwasów tłuszczowych wymagają innych metod przygotowania i obchodzenia się z pęcherzykami fosfolipidowymi.

W tym protokole, chociaż używamy kwasu oleinowego jako przykładu tworzenia liposomów, inne długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe (C14) i ich pochodne (ok. kwas mirystoleinowy, kwas palmitynowy i odpowiadające im alkohole i estry glicerolu) również tworzą pęcherzyki zgodnie z metodą rehydratacji cienkowarstwowej, o ile całkowite stężenie lipidów jest powyżej cmc, a pH buforu hydratacyjnego jest zbliżone do pKa kwasu tłuszczowego w błonie. Poza buforem tris-HCl stosowanym w tym protokole, doniesiono, że inne systemy buforowe (ca. bicyna, fosforan, boran) wspierają tworzenie pęcherzyków kwasów tłuszczowych, chociaż pęcherzyki utworzone w buforze fosforanowym lub boranowym są zwykle dość nieszczelne13. Powstałe pęcherzyki kwasów tłuszczowych po ponownym uwodnieniu są polidyspersyjne i wielopłytkowe, ale łatwo przekształcają się w małe monodyspersyjne pęcherzyki jednowarstwowe przez wytłaczanie, jak opisano. W porównaniu z sonikacją jako alternatywną metodą generowania małych pęcherzyków, ekstruzja zapewnia więcej możliwości kontroli wielkości pęcherzyków poprzez zastosowanie membran o różnej wielkości porów. Pęcherzyki po ekstruzji są zwykle nieco większe niż rozmiar porów błony, ale zwiększając liczbę cykli ekstruzji, można uzyskać pęcherzyki o węższym rozkładzie wielkości i średniej wielkości zbliżonej do wielkości porów błony.

Aby zsyntetyzować funkcjonalne protokomórki, pęcherzyki kwasów tłuszczowych muszą być gospodarzami określonych reakcji biochemicznych wynikających z enkapsulacji RNA lub innych elementów budulcowych. Metoda rehydratacji cienkowarstwowej zapewnia łatwy sposób tworzenia pęcherzyków zawierających pożądane zamknięte materiały. Jednak skuteczność enkapsulacji jest stosunkowo niska, a duża część cennych materiałów, takich jak RNA, jest zwykle tracona podczas procesu oczyszczania. W niektórych przypadkach wydajność hermetyzacji można nieznacznie poprawić poprzez powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania przed wytłaczaniem. Mikroprzepływowe metody wysokowydajnego otrzymywania liposomów fosfolipidowych pozwalają na uzyskanie niemal 100% skuteczności enkapsulacji, jednak analogiczne metody nie zostały jeszcze opracowane dla pęcherzyków kwasów tłuszczowych.

W przypadku pracy z protokomórkami chelatowanymi lub wolnymiMg2+, oczyszczanie po dodaniu roztworu magnezu i ponowne oczyszczanie przed każdym punktem czasowym zapewnia usunięcie nieszczelnego materiału zamkniętego w kapsułkach, który może wpływać na dokładność pomiarów szybkości reakcji wewnątrz pęcherzyków. Ponieważ każde oczyszczanie trwa co najmniej 10 minut, aby osiągnąć dobrą separację i zebrać frakcje pęcherzyków, analiza szybkich reakcji jest trudna, a reakcję należy zatrzymać przed ponownym oczyszczeniem kolumny.

Przedstawiony przez nas protokół doskonale nadaje się do budowy liposomów kwasów tłuszczowych, w których przeprowadzane są reakcje naśladujące te, które mogą zachodzić w prymitywnych komórkach. Nasze protokoły umożliwiają również potencjalne zastosowania w rozwoju biomedycznych systemów dostarczania i bioreaktorów dla innych reakcji biochemicznych.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

J.W.S. jest badaczem Instytutu Medycznego Howarda Hughesa. Praca ta była częściowo wspierana przez grant (290363) Fundacji Simonsa dla J.W.S. Zarówno A.E.E., jak i K.P.A. potwierdzają wsparcie ze strony funduszy start-upowych University of Minnesota.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
sephorose 4BSIGMA-ALDRICH INC4B200
calceinaSIGMA-ALDRICH INCC0875-10G
tris-HCl pH8.0 1MLIFE TECHNOLOGIES CORPAM9851
kwas cytrynowySIGMA-ALDRICH INC251275-500G
wodorotlenek soduSIGMA-ALDRICH INC71690-250G
wodorotlenek potasuSigma30614
kwas oleinowyNu-ChekU-46-A
monooleinian gliceroluNu-ChekM-239
Liss Rhodamine-PELIFE TECHNOLOGIES CORPL1392
chlorek magnezuFisher/Thermo Fisher ScientificAM9530G
koncentrat sequagelNational DiagnosticsEC-830
sequagel DILUENTNational DiagnosticsEC-840
15% TBE-UREA GELThermo Fisher ScientificEC68852BOX
mocznikSigmaAldrich U6504-500G
titon-100xSIGMA-ALDRICH INCT9284-100ML
Podkład RNAIDT5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA szablonIDT5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
nić podłoża młotkowategoIDT5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
pasmo rybozymu młotkaIDT5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG
zestaw wytłaczarek pęcherzykowychAVANTI POLAR LIPIDS610000
kolektor frakcjiGilson, Inc.
96-dołkowe płytkiCzytnikNC9995941/675
Urządzenia molekularneSpectraMax i3
Nikon NikonA1R MP Skaner żelowy konfokalny
GE Healthcare Nauki przyrodniczeSkaner
171041 płytek Fisher Mikroskop konfokalny Typhoon 9410

Bibliografia

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454 (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559 (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116 (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59 (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342 (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328 (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10 (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4 (4), e5009(2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Liposomy z kwasów tłuszczowychprzygotowanie liposomówoczyszczanie liposomówekstruzja liposomówkolumna Sepharose 4Bwykluczanie wielkości pęcherzykówpęcherzyki z kwasu oleinowegobufor Tris-HClniskoobrotowy wstrząsaczwysokoobrotowy wstrząsacz vortex
Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.