Artykuł metodologiczny

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

DOI:

10.3791/57357

⸱

1 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi z dostosowaną różnorodnością. Przeciwciała syntetyczne mają szerokie zastosowanie, od badań podstawowych po diagnostykę chorób i terapię.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na przeciwciała monoklonalne (mAb) w badaniach podstawowych i medycynie rośnie z roku na rok. Technologia Hybridoma jest dominującą metodą rozwoju przeciwciał monoklonalnych od czasu pierwszego raportu w 1975 roku. Jako technologia alternatywna, metody wyświetlania fagów w celu rozwoju mAb stają się coraz bardziej atrakcyjne, ponieważ Humira, pierwsze przeciwciało pochodzące z fagów i jedno z najlepiej sprzedających się przeciwciał mAb, zostało zatwierdzone do klinicznego leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów w 2002 roku. Jako technologia rozwoju mAb nieoparta na zwierzętach, wyświetlanie fagów omija immunogenność antygenu, humanizację i utrzymanie zwierząt, które są wymagane przy opracowywaniu przeciwciał opartych na tradycyjnej technologii hybrydoma. W niniejszym protokole opisujemy metodę budowy syntetycznych bibliotek Fab wyświetlanych z fagami o rozmaitościach 109-10 10 możliwych do uzyskania za pomocą pojedynczej elektroporacji. Protokół ten składa się z: 1) wysokowydajnego przygotowania ogniw elektrokompetentnych; 2) ekstrakcja jednoniciowego DNA zawierającego uracyl (dU-ssDNA); 3) Metoda Kunkela oparta na mutagenezie ukierunkowanej oligonukleotydami; 4) elektroporacja i obliczanie wielkości biblioteki; 5) test immunoenzymatyczny na bazie białka A/L (ELISA) do oceny fałdowania i różnorodności funkcjonalnej; oraz 6) analiza sekwencji DNA różnorodności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mAb mają szerokie zastosowanie, począwszy od badań podstawowych, a skończywszy na diagnostyce chorób i terapii. Od 2016 roku ponad 60 mAb zostało zatwierdzonych przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (USFDA) do klinicznego leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów i chorób zakaźnych1,2.

W 1975 roku Kohler i Milstein opisali technikę ciągłego generowania przeciwciał o pojedynczej swoistości klonalnej ze źródła komórkowego, określaną jako 'hybrydoma', a następnie technika ta stała się kamieniem węgielnym w medycynie i przemyśle3,4. Wytwarzanie mAb tą metodą wymaga różnych etapów, w tym produkcji antygenu, immunizacji myszy, ekstrakcji limfocytów B, fuzji komórek B z komórkami szpiczaka w celu utworzenia nieśmiertelnych komórek hybrydoma, selekcji klonów, a do zastosowań terapeutycznych wymagana jest humanizacja, aby uniknąć ludzkiego przeciwciała anty-mysiego (HAMA)4,5. Jednak w przypadku tej technologii antygeny, w tym toksyny, patogeny i wysoce konserwatywne białka, są stosunkowo nieskuteczne w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej in vivo na produkcję mAb5.

W 1978 roku Hutchison et al. poinformowali o użyciu oligonukleotydu do kierowania mutagenezą reszty w jednoniciowym wirusie bakteriofagowym6. W 1985 roku Smith poinformował, że obce fragmenty genów mogą być łączone w ramce z genem kodującym białko płaszcza fagowego III, a tym samym mogą być wyświetlane na powierzchni faga bez uszczerbku dla jego zakaźności7. Te pionierskie prace położyły podwaliny pod późniejszą konstrukcję bibliotek przeciwciał wyświetlanych przez fagi w formach immunologicznych, naiwnych i syntetycznych z formatami jednołańcuchowego zmiennego fragmentu (scFv) i fragmentu wiążącego antygen (Fab) do terapeutycznego rozwoju mAb8,9. Z technicznego punktu widzenia, rozwój przeciwciał opartych na wyświetlaczu fagów oferuje uzupełniające podejście do rozwoju mAb opartego na hybrydomie, które może pomóc w obejściu ograniczeń, jakie mogą stwarzać niektóre antygeny, oraz procesu humanizacji, którego często wymagają przeciwciała pochodzące z hybrydomy5. Od 2016 r. na rynku zatwierdzono 6 mAb pochodzących z wyświetlacza fagowego, w tym Humira, jeden z najbardziej udanych mAb stosowanych w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, a wielu kandydatów na przeciwciała pochodzące z fagów jest obecnie na różnych etapach badań klinicznych10.

Dla bibliotek przeciwciał fagowych odpornych i naiwnych, różnorodność regionów determinujących komplementarność (CDR) w łańcuchu lekkim i ciężkim wynika z naturalnego repertuaru immunologicznego (tj. z limfocytów B). W przeciwieństwie do tego, różnorodność CDR w bibliotekach syntetycznych przeciwciał fagowych jest całkowicie sztuczna. Syntetyczne podejścia do budowy bibliotek zapewniają precyzyjną kontrolę nad projektowaniem różnorodności sekwencji i oferują możliwości mechanistycznych badań struktury i funkcji przeciwciał11,12. Co więcej, struktura dla bibliotek syntetycznych może być zoptymalizowana przed budową biblioteki, aby ułatwić dalszy rozwój przemysłowy na dużą skalę11,12.

W 1985 roku Kunkel opisał metodę mutagenezy opartej na szablonach jednoniciowego DNA (ssDNA), aby skutecznie wprowadzić mutacje ukierunkowane na miejsce do bakteriofaga M1313. Podejście to zostało następnie szeroko wykorzystane do budowy bibliotek wyświetlanych za pomocą fagów. Chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy DNA zaprojektowane w celu wprowadzenia różnorodności do Fab CDR są włączane do fagamidu z matrycą szkieletową przeciwciała. W tym procesie fagiamid ulega ekspresji jako ssDNA zawierający uracyl (dU-ssDNA), a oligonukleotydy są wyżarzane na CDR i wydłużane w celu syntezy dwuniciowego DNA (dsDNA) w obecności polimerazy DNA T7 i ligazy DNA T4. Wreszcie, wygenerowany ds-DNA może zostać wprowadzony do Escherichia coli przez elektroporację.

Dla wysokiej różnorodności, budowa biblioteki wyświetlanej na podstawie fagów, wysokonapięciowa elektroporacja dwuskładnikowej mieszaniny elektrokompetentnych komórek i kowalencyjnie zamkniętego kolistego dsDNA (CCC-dsDNA) powinna być starannie przygotowana. Sidhu i in. zmodyfikowali przygotowanie elektrokompetentnych komórek i DNA z tradycyjnych metod i znacznie poprawili różnorodność bibliotek14.

W tym protokole opisujemy metodę budowy bibliotek Fab wyświetlanych z syntetycznymi fagami o różnorodności 109-10 10 możliwych do uzyskania za pomocą pojedynczej elektroporacji. Rysunek 1 pokazuje przegląd budowy biblioteki, w tym: 1) wysokowydajne przygotowanie ogniw elektrokompetentnych; 2) ekstrakcja dU-ssDNA; 3) Metoda Kunkela oparta na mutagenezie ukierunkowanej oligonukleotydami; 4) elektroporacja i obliczanie wielkości biblioteki; 5) test ELISA oparty na białku A/L do oceny fałdowania i różnorodności funkcjonalnej; oraz 6) analiza sekwencji DNA różnorodności. Wszystkie odczynniki, szczepy i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów. Tabela 1 przedstawia konfigurację odczynników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Podczas pracy z fagami należy używać sterylnych końcówek filtra, aby uniknąć zanieczyszczenia pistoletu do pipet i otoczenia. Podczas pracy z bakteriami i eksperymentami fagowymi należy stosować aseptyczne pomieszczenie lub kaptur. Obszar eksperymentu z fagami należy oczyścić przy użyciu 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie 70% etanolu, aby uniknąć zanieczyszczenia fagami. Do wykonywania seryjnych rozcieńczeń w tym protokole należy stosować nowe końcówki dla każdego rozcieńczenia.

1. E. Coli SS320 Elektrokompetentne przygotowanie ogniw

  1. Wstępnie ogrzej płytkę agarową LB/tet (przygotowaną i przechowywaną w temperaturze 4 °C przez mniej niż 1 tydzień) w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Użyj sterylnej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki, aby delikatnie rozprowadzić bulion glicerolu z komórkami E. coli SS320 na wstępnie podgrzaną płytkę agarową LB/tet w kierunku zygzakowatym wzdłuż powierzchni płytki. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc przez około 12-15 godzin.
  2. Następnego dnia użyj sterylnej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki, aby wybrać dobrze oddzieloną pojedynczą kolonię wzdłuż zygzakowatej linii i zaszczepić w 10 ml pożywki 2YT/tet w 50-mililitrowej probówce z okrągłym dnem, zanurzając pętlę w pożywce i krótko mieszając.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez około 3-4 godziny, aż do osiągnięcia OD600 przy około 0,4-0,8 (wzrost w fazie logarytmicznej). Monitor OD600 po 2 godzinach. W tym okresie należy wstępnie ogrzać płytki agarowe o wadze 5 funtów/tet (przygotowane i przechowywane w temperaturze 4 °C przez mniej niż 1 tydzień) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  4. Dodaj 20 μl faga pomocniczego M13KO7 z bulionu laboratoryjnego z mianem około 1 x10 13 jednostek tworzących kolonie (jtk)/ml do 180 μl sterylnego 1X PBS w autoklawowanych probówkach 1,5 ml, aby przygotować 10 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych.
  5. Podwielokrotność 4 ml autoklawowanego i płynnego górnego agaru 2YT do probówek o okrągłym dnie 5 x 14 ml, oznaczyć każdą probówkę jednym rozcieńczeniem odpowiednio od piątego do dziewiątego dziesięciokrotnego rozcieńczenia i inkubować w inkubatorze o temperaturze 65 °C w celu utrzymania górnego agaru 2YT w stanie ciekłym.
  6. Wymieszać 500 μl komórek E. coli SS320 w fazie logarytmicznej z probówką rozcieńczającą M13KO7 (wybrać piąte dziesięciokrotne rozcieńczenie do dziewiątego dziesięciokrotnego rozcieńczenia) i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  7. Podczas inkubacji z kroku 1.6 przenieść agar górny 2YT z kroku 1.5 do temperatury pokojowej (RT) do ostygnięcia przez około 5 minut do około 42 °C. Użyj wewnętrznego nadgarstka, aby sprawdzić temperaturę górnego agaru 2YT; powinien on pozostać w postaci płynnej. Przenieść każdą mieszaninę rozcieńczania z kroku 1.5 do każdej odpowiadającej jej górnej probówki agarowej 2YT. Dokręć pokrywkę każdej probówki i wymieszaj, obracając kilka razy delikatnie i krótko do góry nogami, aby uniknąć powstawania pęcherzyków.
  8. Ostrożnie wylej każdą mieszaninę wzdłuż krawędzi wstępnie ciepłej płytki agarowej LB/tet (od kroku 1.3) i lekko pochyl płytkę, aby całkowicie i równomiernie napełnić płytkę mieszaniną, unikając wprowadzania pęcherzyków. Trzymaj płytki w temperaturze pokojowej przez około 5-10 minut, aby zestalić górny agar w każdej płytce i inkubuj górne płytki agarowe 2YT w temperaturze 37 °C przez noc przez około 15-18 godzin.
  9. Wybierz płytkę rozcieńczającą po nocnym wzroście z kroku 1.8 z około 100-200 średniej wielkości, pojedynczymi, dobrze oddzielonymi blaszkami do inokulacji płytki nazębnej. Jedną ręką przytrzymuj płytkę agarową przy źródle światła, a drugą ręką trzymaj pistolet do pipet załadowany długą, sterylną końcówką do pipet, aby pionowo wbić się w górny agar i zebrać pojedynczą i dobrze oddzieloną płytkę nazębną.
    1. Lekko pochylić końcówkę pipety, aby oddzielić górny agar od płytki nazębnej. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby usunąć agar z płytką nazębną do 14-mililitrowej probówki hodowlanej z okrągłym dnem wstępnie załadowanej 1 ml pożywki 2YT/kan/tet (patrz Tabela 1).
    2. Powtórz tę procedurę, aby wybrać w sumie 3-5 płytek. Celem pobrania kilku blaszek jest zapewnienie pomyślnej inokulacji, ponieważ blaszka może być słaba i stosunkowo mała w porównaniu z kolonią bakterii. Hodować płytki przez 8 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  10. Przenieść probówkę z kulturą hodowlaną do 50 ml pożywki 2YT/kan/tet w kolbie z przegrodą o pojemności 250 ml. Rosnąć w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc przez około 12 godzin.
  11. Zaszczepić trzy 2-litrowe kolby z przegrodami zawierającymi 900 ml pożywki superbulion/tet/kan każda z 5 ml nocnej kultury. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 6-7 godzin do OD600 około 0,6-0,8.
  12. Schłodzić trzy kolby z kulturą bakteryjną w łaźni lodowej przez 5 minut, delikatnie i stale obracając ręcznie. Poniższe czynności należy wykonać w chłodni, na lodzie, przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów i sprzętu.
  13. Użyć ręcznika z chusteczek chłonnych, aby osuszyć zewnętrzną szybę każdej kolby; jedną ręką pochylić 1-litrową autoklawizowaną butelkę wirówkową na stole, a drugą ręką delikatnie wlać pożywkę z każdej kolby do każdej butelki wirówkowej.
  14. Wirować w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby bakterie były osadzane.
  15. Po odwirowaniu delikatnie zdekantować supernatant do 5-litrowej autoklawizowanej zlewki na odpady.
  16. Napełnij każdą butelkę 100 ml sterylnie przefiltrowanego 1,0 mM HEPES, pH 7,4 i dodaj autoklawowane mieszadło magnetyczne do każdej butelki, aby pomóc w ponownym zawieszeniu granulek przy 200 obr./min. Obracaj i usuwaj cały granul ze ścianki butelki co kilka minut podczas mieszania magnetycznego. Po rozpuszczeniu osadu napełnij każdą butelkę dodatkowymi 400 ml sterylnie przefiltrowanego 1,0 mM HEPES, pH 7,4.
  17. Odwirować w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zdekantować supernatant, zatrzymując mieszadło w butelce.
  18. Powtórz kroki od 1.16 do 1.17 raz.
  19. Zawiesić każdą granulkę w 500 ml sterylnie przefiltrowanego, 10% ultraczystego glicerolu za pomocą mieszadeł. Obracaj i usuwaj cały granul ze ścianki butelki co kilka minut podczas mieszania magnetycznego.
  20. Odwirować i zdekantować jak w kroku 1.17. Powtórz krok 1.19 raz. Użyj autoklawowanych kleszczy z długim ramieniem, aby usunąć mieszadło.
  21. Odwirować w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Zdekantować supernatant i usunąć pipetą wszelkie pozostałe ślady supernatantu z każdej butelki wirówkowej.
  22. Dodać 3,0 ml 10% ultraczystego glicerolu do jednej butelki i delikatnie zawiesić granulkę przez pipetowanie. Przenieść zawiesinę do następnej butelki i powtarzać, aż wszystkie granulki zostaną ponownie zawieszone i połączone w jednej butelce. Uzyskuje się około 6 ml wysoce skoncentrowanych komórek o mianie około 3 x 1011 jtk/ml.
  23. Przed tym etapem należy wstępnie schłodzić 1,5 ml autoklawowanych probówek wirówkowych i jeden pojemnik na probówki 96-dołkowe bez przegródek w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę. Przenieść wstępnie schłodzone probówki mikrowirówek do chłodni na lodzie przed pipetowaniem porcji zawiesiny osadów komórkowych. Za pomocą pipety wlej 350 μl zawiesiny komórek do każdej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  24. Przenieść porcje do pojemnika piankowego wypełnionego ciekłym azotem w celu błyskawicznego zamrożenia (3-5 min).
    1. Przetransportować pojemnik z pianką z ciekłym azotem do zamrażarki o temperaturze -80 °C (patrz krok 1.23).
    2. Wyjmij pojemnik na probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml z zamrażarki w temperaturze -80 °C (patrz krok 1.23) i połóż na lodzie.
    3. Szybko użyj metalowej siatki, aby przesiać porcje z ciekłego azotu i umieść je w pudełku do przechowywania probówek. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Ciekły azot może spowodować oparzenia i należy zachować ostrożność w celu ochrony bezpieczeństwa. Użyj fagagemidu szkieletowego Fab, aby sprawdzić wydajność przygotowanych elektrokompetentnych ogniw (materiał fagowy Fab powinien znajdować się w ultraczystej (MilliQ) wodzie o stężeniu 400 ng/μl). Rozmrozić 1 μg fagimidu szkieletowego Fab w 10 μl ultraczystej wody i 350 μl podwielokrotności elektrokompetentnego SS320 na lodzie i wstępnie schłodzić kuwetę do elektroporacji o średnicy 0,2 cm na lodzie.
  25. Po rozmrożeniu dodać 350 μl elektrokompetentnych komórek SS320 do 10 μl DNA i wymieszać przez kilkakrotne pipetowanie, utrzymując mieszaniny na lodzie. Unikaj wprowadzania bąbelków.
  26. Podgrzej 15 ml pożywki SOC w probówce o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed elektroporacją. Przenieś mieszaninę 360 μl do kuwety i wykonaj elektroporację zgodnie z instrukcjami producenta.
  27. Natychmiast uratuj ogniwa po elektroporacji, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża SOC (z kroku 1.27) i pipetując. Przenieść pożywkę z kuwety do kolby o pojemności 125 ml wstępnie załadowanej 5 ml wstępnie podgrzanego SOC.
  28. Przepłukać kuwetę dwukrotnie, za każdym razem 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SOC, a następnie przenieść pożywkę do kolby o pojemności 125 ml (patrz krok 1.27). Dodać wstępnie podgrzaną pożywkę SOC do końcowej objętości 10 ml do kolby o pojemności 125 ml.
  29. Inkubować 10 ml kultury komórkowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  30. Wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby określić skuteczność transfekcji i wskaźnik M13KO7 przed infekcją.
    1. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 180 μl pożywki 2YT do każdego dołka w pojedynczej kolumnie 96-dołkowej płytki.
    2. Wykonać 8 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych: przenieść 20 μl kultury z etapu 1.29 do pierwszego dołka płytki, wymieszać pipetując i przenieść 20 μl mieszaniny do następnego dołka. Powtórzyć ten krok do końca rozcieńczania szeregowego.
    3. Umieścić 10 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na płytkach LB/carb, LB/kan i LB/tet w dwóch egzemplarzach.
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Wzór na obliczenie wydajności: Załóżmy, że M to średnia liczba kolonii liczona od rozcieńczonego fałdu 10N (N wynosi od 1 do 8). Skuteczność transfekcji komórek E. coli SS320 elektrokompetentnej fagimidu szkieletowego Fab z płytki LB / carb jest równa M X 10N + 3 jtk / μg. Wskaźnik M13KO7 przed infekcją szacuje się na podstawie stosunku kolonii w LB/kan i LB/tet. Odsetek kompetentnych komórek E. coli SS320 transfekowanych fagemidem szkieletowym Fab szacuje się na podstawie stosunku kolonii w LB / carb i LB / kan.

2. Przygotowanie ssDNA zawierającego uracyl (dU-ssDNA) z szablonu Fagemid

UWAGA: Wcześniej zgłoszony fagemid szkieletowy Fab został użyty jako szablon do przygotowania dU-ssDNA15. Architektura fagemidu szkieletowego Fab jest pokazana na Rysunek 2. Zestaw do spinania plazmidu (QIAprep Spin M13) służy do ekstrakcji dU-ssDNA z niewielkimi modyfikacjami.

  1. Na wstępnie podgrzaną płytkę LB/cmp (przygotowaną i przechowywaną w temperaturze 4 °C przez mniej niż 1 tydzień) należy wstępnie ogrzać w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Na wstępnie podgrzaną płytkę LB/cmp należy wytrzeć glicerolową warstwę komórek E. coli CJ236 (lub innego szczepu dut−/ung−) za pomocą sterylnych pętli lub końcówek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc przez około 12-15 godzin.
  2. Wybierz pojedynczą kolonię ze sterylną końcówką i zaszczepij w 2 ml pożywki 2YT/cmp w 14-mililitrowej probówce z polipropylenu okrągłodennego.
  3. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 3-4 godziny, aż do osiągnięcia OD600 przy około 0,4-0,8 (wzrost w fazie logarytmicznej).
  4. Dodać 5-10 μl faga matrycy szkieletowej Fab do hodowli i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez 30 minut, aby umożliwić infekcję fagową.
  5. Po inkubacji za pomocą sterylnej końcówki rozprowadzić 10 μl kultury na wstępnie podgrzaną płytkę LB/carb w temperaturze 37 °C. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc przez około 12-15 godzin.
  6. Wybierz pojedynczą kolonię E. coli CJ236 zawierającą fagemid szkieletowy Fab, aby zaszczepić kulturę starterową o objętości 3 ml 2YT/carb/cmp w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem z polipropylenu i rosnąć w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc przez około 12 godzin.
  7. Zaszczep 0,3 ml kultury starterowej do 30 ml 2YT/carb/cmp w butelce z przegrodą o pojemności 250 ml.
  8. Inkubować kulturę komórkową w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 3-4 godziny, aż do osiągnięcia OD600 przy około 0,4-0,8 (wzrost w fazie logarytmicznej).
  9. Dodaj M13KO7 (bulion laboratoryjny, miano około 1 x 1013 jtk/ml) do kultury z kroku 2.8 z wielokrotnością infekcji (MOI) około 10, a końcowe miano M13KO7 wynosi około 1 x10 10 jtk/ml.
  10. Inkubować przy 200 obr./min i temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  11. Osadzać kulturę przez odwirowanie w probówce okrągłodennej o pojemności 50 ml w temperaturze 5 000 × g i temperaturze 25 °C przez 20 minut.
  12. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad z 30 ml świeżego 2YT/carb/kan/urydyny. Przenieść zawiesinę do nowej butelki z przegrodą o pojemności 250 ml.
  13. Inkubować przy 200 obr./min i 25 °C przez 22-24 godziny.
  14. Przenieść kulturę z kroku 2.13 do probówki okrągłodennej o pojemności 50 ml i odwirować kulturę przy 12 000 × g przez 20 minut, aby oddzielić supernatant fagowy od osadu komórek bakteryjnych. Przenieś supernatant fagowy do nowej 50-mililitrowej probówki okrągłodennej i dodaj 1/5 końcowej objętości roztworu PEG/NaCl w celu wytrącenia faga. Dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 minut, aby wytrącić cząsteczki faga.
  15. Odwirować w temperaturze 12 000 × g i temperaturze 4 °C przez 30 minut. Zdekantować supernatant i odwirować w temperaturze 4 000 × g i 4 °C przez 2 minuty. Zassać pozostały supernatant.
  16. Zawiesić osad fagowy w 2 ml sterylnie przefiltrowanego 1X PBS i przenieść do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Wirować przy 12 000 × g przez 5 minut w mikrowirówce stołowej w celu usunięcia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń bakteryjnych i przenieść supernatant fagowy do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  17. Sprawdź skuteczność inkorporacji uracylu w E. coli CJ236 poprzez porównanie z E. coli SS320.
    1. Dodaj 180 μl pożywki 2YT do każdego dołka w jednym rzędzie płytki 96-dołkowej.
    2. Wykonać dziesięć 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych: przenieść 20 μl supernatantu fagowego do pierwszego dołka płytki, wymieszać pipetując i przenieść 20 μl mieszaniny do następnego dołka. Powtórzyć ten krok do końca rozcieńczania szeregowego.
    3. Dodać 10 μl faga z ostatnich ośmiu rozcieńczeń seryjnych, aby zainfekować 90 μl E. coli CJ236 i E. coli SS320 w fazie logarytmicznej (OD600 = 0,4-0,8). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając.
    4. Płytka 10 μl z seryjnego rozcieńczenia każdego zakażenia w E. coli CJ236 i E. coli SS320 na płytkach 2YT/Carb w dwóch egzemplarzach.
    5. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Wzór na obliczanie miana: Załóżmy, że M to średnia liczba kolonii liczona od rozcieńczonego fałdu 10N (N wynosi od 1 do 10). Miano E. coli CJ236 lub E. coli SS320 jest równe M X 10N+2 jtk/ml. Oszacować skuteczność inkorporacji uracylu na podstawie stosunku miana E. coli CJ236 i E. coli SS320.
  18. Dodać 1/100 objętości buforu wytrącającego się faga MP do supernatantu fagowego w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek i delikatnie odwrócić do góry nogami, aby kilkakrotnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 minuty. Cząsteczki fagów są wytrącane z pożywki hodowlanej, a zatem w tym momencie powinien być widoczny mętny roztwór.
  19. Nałożyć próbkę z kroku 2.18 na plazmidową kolumnę wirową (np. QIAprep) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zdolność wiązania jednej kolumny spinowej dla ssDNA może osiągnąć co najmniej 10 μg. Wirować w temperaturze 6 000 × g i temperaturze 25 °C przez 30 s w mikrowirówce stołowej. Wyrzuć przepływ, który znajduje się w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Na tym etapie cząstki faga pozostają związane z matrycą kolumny.
  20. Dodać 0,7 ml buforu do lizy i wiązania fagów UT-MLB (patrz Dyskusja) do kolumny i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 minutę. Wirować przy 6 000 x g i 25 °C przez 30 s i odrzucić przepływ.
  21. Dodać kolejne 0,7 ml buforu UT-MLB i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 minutę.
  22. Wirować przy 6 000 × g przez 30 s. Wyrzucić przepływ. Na tym etapie białko płaszcza fagowego jest oddzielane od dU-ssDNA, które pozostaje związane z macierzą kolumny.
  23. Dodać 0,7 ml buforu do płukania PE zawierającego etanol zgodnie z instrukcjami producenta. Odwirować przy 6 000 × g przez 30 s i odrzucić przepływ.
  24. Powtórzyć krok 2.23, a następnie ponownie odwirować przy 6 000 × g przez 30 s w celu usunięcia resztek buforu PE.
  25. Przenieść kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 100 μl buforu elucyjnego EB (10 mM Tris·CL, pH 8,5) do środka membrany kolumny.
  26. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odwirowywać przy 6 000 × g przez 1 minutę w celu elucji dU-ssDNA. W przybliżeniu można uzyskać hodowlę 1,5-2,5 μg dU-ssDNA/mL.
  27. Przeanalizuj wymyte DNA przez elektroforezę 1 μl na 1% żelu agarozowym TAE. DNA powinno wyglądać jak przeważnie pojedynczy prążek bez rozmazywania.
  28. Oznaczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję na spektrofotometrze nanokroplowym przy 260 nm (A260 = 1,0 dla 33 ng/μL ssDNA). Typowe stężenia dU-ssDNA mieszczą się w granicach 200-500 ng/μL.

3. Mutageneza ukierunkowana oligonukleotydami oparta na metodzie Kunkela

Uwagi: Zaleca się przeprowadzanie reakcji na małą skalę przed reakcjami na pełną skalę, aby zapewnić jakość mutagennego oligonukleotydu i składników reakcji. Karykatura mutagenezy ukierunkowanej na oligonukleotydy opartej na metodzie Kunkela jest pokazana w Rysunek 3. Różne odmiany aminokwasów są wprowadzane do regionów CDRH1, CDRH2, CDRH3 i CDRL3 z nomenklaturą numeracji IMGT16 (Tabela 2). Teoretyczna różnorodność aminokwasów każdego CDR, całkowita teoretyczna różnorodność aminokwasów i sekwencje oligonukleotydowe są wymienione w tabeli 2.

  1. Fosforylacja oligonukleotydów kinazą polinukleotydową T4
    1. Połącz 0,6 μg mutagennych oligonukleotydów, zaprojektowanych do mutacji pojedynczego CDR, z 2 μl buforem 10X TM, 2 μl 10 mM ATP i 1 μL 100 mM DTT. Dodać ultraczystyH2Odo całkowitej objętości 18 μl w probówce o pojemności 1,5 ml. Do budowy biblioteki ustawia się 4 oddzielne i równoległe reakcje fosforylacji odpowiadające odpowiednio CDRH1, CDRH2, CDRH3 i CDRL3.
    2. Dodać 20 U (2 μl) kinazy polinukleotydowej T4 do każdej probówki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (reakcja 1 w tabeli 3). Użyć natychmiast do wyżarzania.
  2. Wyżarzanie oligonukleotydów do matrycy
    1. Do 20 μg matrycy dU-ssDNA dodaj 25 μl buforu 10X TM, 20 μl każdego fosforylowanego roztworu oligonukleotydów i ultraczysty H2O do końcowej objętości 250 μl w probówce o pojemności 0,5 ml. Dobrze wymieszać i przenieść do probówek PCR o pojemności 0,20 ml (każda po 50 μl) jako reakcja 2 w tabeli 3. Te ilości DNA zapewniają stosunek molowy 3:1 między oligonukleotydem a matrycą, przy założeniu, że stosunek długości oligonukleotydu do matrycy wynosi 1:100.
    2. Inkubować reakcję w maszynie do PCR w temperaturze 90 °C przez 3 minuty, w temperaturze 50 °C przez 3 minuty i w temperaturze 20 °C przez 5 minut.
  3. Enzymatyczna synteza CCC-dsDNA
    1. Do 250 μl wyżarzonej mieszaniny oligonukleotydów/matryc dodać 10 μl 10 mM ATP, 10 μl 25 mM mieszaniny dNTP, 15 μl 100 mM DTT, 30 jednostek Weissa Ligazy DNA T4 i 30 U Polimerazy DNA T7 jako reakcję 3 w tabeli 3.
    2. Inkubować reakcję w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze 20 °C przez noc.
    3. Przemyć i zagęścić zsyntetyzowane CCC-dsDNA w 0,5 ml filtra odśrodkowego z membraną o wielkości porów 30 kDa w temperaturze pokojowej.
      1. Przenieść mieszaninę reakcyjną z dnia na noc do urządzenia filtrującego i dodać ultraczystyH2Odo 400 μl końcowej objętości. Wirować z prędkością 14 000 × g przez 10 minut; objętość jest mniejsza niż 50 μl.
      2. Odrzuć przepływ, dodaj 400 μl ultraczystegoH2Odo filtra i wiruj z prędkością 14 000 × g przez 10 minut.
      3. Powtórz krok 3.3.3.2 jeszcze raz.
      4. Umieść filtr do góry nogami w czystej probówce mikrowirówkowej, aby odzyskać CCC-dsDNA. Wirować z prędkością 1 000 × g przez 2 minuty; odzyskana objętość wynosi na ogół około 20-40 μL. Odzyskane CCC-dsDNA można natychmiast wykorzystać do elektroporacji E. coli lub zamrozić w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Zwykle można uzyskać 20-40 μg CCC-DNA.
    4. Elektroforeza 1,0 μl eluowanego produktu reakcji wraz z matrycą dU-ssDNA w celu wizualizacji wyniku reakcji.

4. Elektroporacja i obliczanie wielkości biblioteki

  1. Schłodzić oczyszczone CCC-dsDNA (20 μg w maksymalnej objętości 50 μl) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i kuwecie do elektroporacji o średnicy 0,2 cm na lodzie.
  2. Podgrzej 20 ml pożywki SOC w stożkowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
  3. Rozmrozić na lodzie 350 μl podwielokrotności elektrokompetentnej bakterii E. coli SS320. Dodaj komórki do DNA i dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując. Unikaj wprowadzania bąbelków.
  4. Przenieś mieszaninę do kuwety i wykonaj elektroporację zgodnie z instrukcjami producenta. Na przykład, gdy używany jest system elektroporacji BTX ECM-630, odpowiednie ustawienia to natężenie pola 2,5 kV, rezystancja 125 Ω i pojemność 50 μF.
  5. Natychmiast uratuj elektroporowane ogniwa, dodając 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SOC i przenosząc do 17 ml pożywki SOC w kolbie o pojemności 125 ml. Przepłukać kuwetę dwukrotnie 1 ml pożywki SOC i przenieść do tej samej kolby (końcowa objętość wynosi 20 ml).
  6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  7. Określ wydajność elektroporacji.
    1. Dodać 180 μl pożywki 2YT do każdego dołka w pojedynczej kolumnie płytki 96-dołkowej.
    2. Wykonać 8 dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych: przenieść 20 μl 20 ml kultury do pierwszego dołka płytki, wymieszać z pipetowaniem i przenieść 20 μl mieszaniny do następnego dołka. Powtórzyć ten krok do końca rozcieńczania szeregowego.
    3. Umieścić 10 μl każdego z seryjnych rozcieńczeń na jednej płytce LB/carb w dwóch egzemplarzach. Umieścić 100 μl pozostałych z każdego z seryjnych rozcieńczeń na oddzielnych płytkach LB/carb w celu kontroli krzyżowej liczby kolonii. Płytki te dostarczą również pojedynczych klonów do analizy ELISA i sekwencji (patrz punkt 5).
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Policz kolonie z duplikatów 10 μl na płytce LB/carb. Załóżmy, że M to średnia liczba kolonii liczona na 10N krotnej płytce LB / węglowodan (N wynosi od 1 do 8). Całkowity rozmiar biblioteki jest równy 2M X 10N+3 koloniom.
  8. Podzielić kulturę z kroku 4.6 równomiernie na dwie kolby z przegrodami o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 500 ml pożywki 2YT/carb/kan do generowania biblioteki fagów.
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc przez około 16 godzin.
  10. Przenieść kulturę do dwóch 1-litrowych autoklawowanych butelek wirówkowych i wirować przez 30 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.
  11. Przenieść supernatant do dwóch nowych 1-litrowych autoklawowanych butelek wirówkowych i dodać 1/5 końcowej objętości roztworu PEG/NaCl w celu wytrącenia faga. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  12. Wirować przez 30 minut w temperaturze 12 000 × g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i nie dopuścić do uszkodzenia osadu fagowego. Wirować przez 1 minutę w temperaturze 4 000 x g i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.
  13. Zawiesić osad fagowy za pomocą 20 ml sterylnie przefiltrowanego buforu 1X PBS i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  14. Zawiesić nierozpuszczalną substancję przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 12 000 × g i temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  15. Zmierzyć stężenie faga za pomocą spektrofotometru (OD268 = 1,0 dla roztworu 5 X 1012 fagów/ml).
  16. Dostosuj stężenie faga do 5 X 1012 fagów / ml w 1X PBS z 10% ultraczystym glicerolem.
  17. Podwielokrotność 1 ml roztworu fagowego na 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Biblioteki należy natychmiast wykorzystać do panoramowania lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Ocena jakości za pomocą testu ELISA bezpośredniego wiązania białka A/L i sekwencjonowania

  1. Losowo wybierz 96 pojedynczych kolonii na płytce LB/carb z kroku 4.7.3 do płytki hodowlanej o głębokości 96 zawierającej 800 μl 2YT/carb w każdym dołku. Inkubować przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min do OD600 = 0,4-0,8.
  2. Dodać 100 μl M13KO7 (1 X 1011 jtk/ml) do każdego dołka płytki hodowlanej o głębokości 96 za pomocą wielokanałowej pipety. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min przez 1 godzinę.
  3. Dodaj 100 μL 2YT zawierającego 10-krotne stężenie kanamycyny (500 μg/ml) do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1 000 obr./min.
  4. Rozpuść białko L do 1 μg/ml w 1X PBS. Pokryj 3/4 studzienek w 384-dołkowej płytce polistyrenowej o wysokim poziomie wiązania białka 30 μl / studzienkę roztworu białka L. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Odrzucić roztwór L powlekający białko na noc z kroku 5.4. Dodać 50 μl M-PBST (roztwór blokujący) do wszystkich studzienek w 384-dołkowej płytce polistyrenowej o wysokim poziomie wiązania białka za pomocą wielokanałowej pipety. Inkubować płytki na wytrząsarce do mikropłytek przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Odwirować kulturę przez noc z kroku 5.3 na głębokiej 96-dołkowej płytce hodowlanej w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. znajduje się w supernatancie.
  7. Odrzuć roztwór blokujący z kroku 5.5. Dodać 15 μl M-PBST i 15 μl każdego supernatantu fagowego (etap 5.6) do 3 studzienek pokrytych białkiem L w trzech powtórzeniach i 1 studzienki bez powłoki jako kontroli ujemnej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
  8. Wyrzuć roztwór faga. Umyj płytkę 6 razy 80 μl PBST za pomocą automatycznej myjki do płyt.
  9. Dodać 15 μl M-PBST i 15 μl białka A-HRP (1:1,500 rozcieńczone w 1X PBS) do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować w temperaturze RT przez 1 godzinę z wytrząsaniem z prędkością około 200 obr./min.
  10. Roztwór białka A-HRP/M-PBST należy wyrzucić. Umyj płytkę 6 razy 80 μl PBST.
  11. Dodać substrat TMB (30 μl/studzienkę) za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 2-3 minuty, aż do uzyskania koloru. Zatrzymać reakcję za pomocą 1,0 M H3PO4 (30 μL/basenik).
  12. Odczytać płytki spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm. Klony dodatnie definiuje się jako te, które wykazują średni stosunek absorbancji OD450 baseników białkowych L do dołka M-PBST większy niż 3,0.
  13. W studzience o głębokości 96 zainfekuj 50 μl SS320 w 2YT/tet w fazie logarytmicznej 5 μl tego samego faga, który został użyty do testu ELISA (krok 5.6) przez 30 minut w RT.
  14. Dodać 950 μl 2YT/carb do dołka o głębokości 96 z kroku 5.13 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 1,000 obr./min.
  15. Ekstrakcja DNA fagowca za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA mini-prep. Użyj starterów VL (5'-TCGCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTAATGTA-3') i VH (5'-GACTACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') do analizy sekwencji w celu oszacowania różnorodności sekwencji biblioteki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podążając za schematem budowy biblioteki Fab (patrz Rysunek 1), przygotowaliśmy M13KO7 wspomagające fagi wstępnie zainfekowane elektrokompetentne komórki E. coli SS320. Wydajność tych elektrokompetentnych ogniw szacuje się na 2 X 109 jtk/μg, gdy użyto szkieletu Fab phagemid do budowy biblioteki (Rysunek 4).

Sprawdzono skuteczność inkorporacji uracylu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby skonstruować biblioteki Fab o wysokiej różnorodności, wyświetlane na fagach, potrzebne są punkty kontroli jakości do monitorowania różnych etapów procesu budowy, w tym kompetencji komórek elektrokompetentnych, jakości matrycy dU-ssDNA, wydajności syntezy CCC-dsDNA, miana po elektroporacji, fałdowania Fab oraz różnorodności aminokwasów CDR poprzez analizę sekwencji klonów Fab-phage.

Wysoka wydajność i czystość dU-ssDNA jest niezbędna do wysokiego współczynnika mutagenezy. Z naszego doświadc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają Dr. Frederica Fellouse'a z laboratorium Sidhu za krytyczne uwagi na temat opartej na metodzie Kunkela konstrukcji biblioteki syntetycznych fagów Fab. Autorzy doceniają panią Alevtinę Pavlenco i innych członków laboratorium Sidhu za cenną pomoc w przygotowaniu wysokowydajnych, elektrokompetentnych komórek E. coli i wysokiej jakości dU-ssDNA. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr: 81572698, 31771006) dla DW oraz przez ShanghaiTech University (nr grantu: F-0301-13-005) dla Laboratorium Inżynierii Przeciwciał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
1.0 M H3PO4FisherAC29570
1.0 M Tris, pH 8.0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM ditiotreitolFisherBP172
100 mM dNTP zmieszać roztwór GE Healthcare28-4065-60zawierający po 25 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP.
3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgarozaFisherBP160
Karbenicylina, węglowodanSigmaC1389100 mg / ml w wodzie,  0,22 μ m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 100 μ g/ml.
Chloramfenikol, cmpSigmaC0378100 mg/ml w etanolu, 0,22 μ m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 10 μ g/ml.
EDTA 0,5 M, pH 8,0InvitrogenAM9620G
Agar granulowanyVWRJ637-500G
H2O2 sub peroksydazyKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycyna, AC61129Fisher50 mg/ml w wodzie,  0,22 μ m Filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 50 μ g/ml.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! UWAGA NaOH powoduje oparzenia.
Mleko beztłuszczowe w proszkuSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Koniugat białka A-HRPInvitrogen101123
Zestaw QIAprep Spin M13Qiagen22704
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28706
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104
Rekombinowane białko LFisher77679
Polimeraza DNAT4 New England BiolabsM0203S
T4New England BiolabsM0201S
Polimeraza DNA T7New England BiolabsM0274S
Tetracyklina, tetSigmaT766050 mg/ml w wodzie, 0. 22 μ m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 10 μ g/ml.
TryptoneFisher0123-07-5
Tween-20SigmaP2287
Ultraczysty glicerolInvitrogen15514-011
UrydynaSigmaU375025 mg / ml w etanolu, stężenie robocze: 0,25 μ g/ml.
Ekstrakt drożdżowyVWRDF0127-08
NazwaFirma Numer katalogowyKomentarze
Szczepy
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotyp: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Służy do przygotowania dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Genotyp: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu)7679 Δ lacX74 galUgalK rpsL thi. Zoptymalizowany pod kątem wysokowydajnej elektroporacji i produkcji bakteriofagów nitkowatych.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NazwaCompany Numer katalogowyUwagi
Sprzęt
0,2 cm szczelina kuweta do elektroporacjiBTX
96-dołkowa 2mL Płytki głębokostudzienkoweFisher278743
96-dołkowe płytki immunologiczne MaxisorpKolby Nunc151759
z przegrodamiCorning
Wirówka stołowaEppendorf5811000096
Butelki wirówkoweNalgene
ECM-630 ElektroporatorBTX
Magnetyczny mieszadłaWirówka Nalgene
Thermo FisherWytrząsarka
TAITEKMBR-034P
Wytrząsarka do mikropłytekQILINBEIERQB-9002
Ładowarka do cieczy do 96 i 384 dołkówPipeta kanałowa RAININ
E4XLS
Amicon koncentratorMerckUFC803096
Kinaza polinukleotydowa szybkoobrotowa Fisher Mutil RAININ

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Syntetyczny phage displaykonstrukcja biblioteki Fabmutageneza kierowana oligonukleotydamiwysokowydajne kom rki elektrokompetentneELISA z bia kiem A Lanaliza sekwencji DNAmetoda Kunkelawielko biblioteki po elektroporacjidostosowana r norodno przeciwciasyntetyczna biblioteka przeciwcia

Powiązane artykuły