Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57363

⸱

7 lutego 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

W tym artykule

Podsumowanie

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Streszczenie

Inżynieria tkankowa to obiecująca dziedzina, skoncentrowana na opracowywaniu rozwiązań dla rosnącego zapotrzebowania na tkanki i organy do celów transplantacyjnych. Proces generowania takich tkanek jest złożony i obejmuje odpowiednią kombinację określonych typów komórek, rusztowań oraz bodźców fizycznych lub biochemicznych, które kierują wzrostem i różnicowaniem komórek. Mikronośniki stanowią atrakcyjne narzędzie do namnażania komórek w trójwymiarowym (3D) mikrośrodowisku, ponieważ zapewniają wyższy stosunek powierzchni do objętości i bardziej naśladują sytuację in vivo w porównaniu z tradycyjnymi metodami dwuwymiarowymi. Układ naczyniowy, dostarczający tlen i składniki odżywcze do komórek oraz zapewniający usuwanie odpadów, stanowi ważny element budulcowy podczas wytwarzania tkanek inżynieryjnych. W rzeczywistości większość konstruktów zawodzi po implantacji z powodu braku wsparcia naczyniowego. W tym badaniu przedstawiamy protokół ekspansji komórek śródbłonka na rekombinowanych mikronośnikach na bazie kolagenu w warunkach dynamicznych w kolbie obrotowej i bioreaktorach oraz wyjaśniamy, jak określić w tym otoczeniu żywotność i funkcjonalność komórki. Ponadto proponujemy metodę dostarczania komórek w celu unaczynienia bez konieczności wykonywania dodatkowych etapów odłączania. Ponadto zapewniamy strategię oceny potencjału unaczynienia komórek w bioreaktorze perfuzyjnym na zdecelularyzowanej matrycy biologicznej. Wierzymy, że zastosowanie przedstawionych metod może doprowadzić do opracowania nowych terapii komórkowych dla szerokiego zakresu zastosowań inżynierii tkankowej w praktyce klinicznej.

Wprowadzenie

Jednym z ogólnych problemów w zastosowaniach inżynierii tkankowej jest uzyskanie dużej masy komórkowej z prawidłowym fenotypem różnicowania w miejscu potrzeby. Zastosowanie mikronośników w celu rozwiązania tego problemu rozpoczęło się w 1967 roku i do tej pory ma coraz większe znaczenie w dziedzinach takich jak ortopedyczna inżynieria tkankowa do generowania na dużą skalę skóry, kości, chrząstek i ścięgien1. Umożliwiają one obchodzenie się z przylegającymi kulturami w sposób podobny do kultur zawiesinowych2 poprzez ekspandowanie komórek na mikroskalowych trójwymiarowych (3D) podłożach. W ten sposób komórki doświadczają jednorodnego zaopatrzenia w składniki odżywcze i interakcji komórka-macierz, które prowadzą do lepszego utrzymania in vivo3,4 różnicowania, które często zanika z czasem w podejściach 2D5. Wyższy stosunek powierzchni do objętości - ostatecznie prowadzący do wyższej wydajności komórek6,7, wyższe wskaźniki wymiany gazów i składników odżywczych w porównaniu z systemami statycznymi8, możliwość regulowania i poddawania kultury bodźcom fizycznym9, oraz potencjał zwiększenia skali procesu ekspansji7 to kolejne zalety. Kilka cech, takich jak średnica, gęstość, porowatość, ładunek powierzchniowy i właściwości adhezyjne10,11 odróżnia różne dostępne na rynku mikro- i makronośniki. Jednak jedną z głównych zalet jest ich potencjał dostarczania jako mikrotkanek do wady lub zapotrzebowania na miejsce.

Dla zastosowań technologii mikronośników w inżynierii tkanki kostnej, zilustrowaliśmy w poprzednim raporcie12 produkcję nowego typu mikronośnika składającego się z rekombinowanego peptydu kolagenu I (RCP, komercyjnie dostępny jako Cellnest). Ten nowy mikronośnik umożliwia zgodne z GMP zwiększenie skali rusztowania i produkcji komórek, zgodnie z potrzebami do dostarczenia komórek w scenariuszu klinicznym. W tym kontekście, dostrojenie stabilności, szybkości degradacji i właściwości powierzchni rusztowania poprzez właściwy wybór odpowiedniej strategii sieciowania pozwala dostosować technikę do wybranego zastosowania, typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania lub tkanki docelowej13. W szczególności potencjalne zastosowanie tego mikronośnika jako systemu dostarczania komórek do wstrzykiwań do zastosowań terapeutycznych14 czyni je szczególnie interesującymi w warunkach klinicznych.

W tym artykule ilustrujemy zatem procedurę hodowli izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek zrębu pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego (hBMSC) i ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka skóry (HDMEC) na rekombinowanych mikronośnikach na bazie peptydów na bazie kolagenu I, oraz ich przygotowanie do dostarczenia w warunkach klinicznych. Ponadto opisujemy dodatkowe protokoły przydatne do utrzymania żywotności komórek po implantacji.

Żywotność komórek po implantacji jest w rzeczywistości silnie zależna od unaczynienia15,16,17, co zapewnia wymianę tlenu i składników odżywczych oraz ułatwia usuwanie odpadów. Bioreaktory stanowią jedno z podejść do przezwyciężenia wyzwań związanych z unaczynieniem w inżynierii tkankowej i utrzymania żywotności komórek, poprzez perfuzję pożywki hodowlanej, dostarczając tym samym tlen i składniki odżywcze18. W tym miejscu zilustrowano metodę in vitro do oceny zdolności migracyjnej komórek śródbłonka mikronaczyniowego z mikronośników RCP do biomatrycy oraz ich zdolności do przyczyniania się do unaczynienia de novo i angiogenezy. Ta biomatryca jest pozbawionym komórek segmentem jelita czczego świni zwanym BioVaSc (Biological Vascularized Scaffold), bogatym w kolagen i elastynę oraz z zachowanymi strukturami naczyniowymi, w tym tętnicą zasilającą i żyłą drenującą19, która została zastosowana w przypadku problemów z implantacją20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

hBMSC zostały wyizolowane z głowy kości udowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów poddawanych operacji wymiany głowy kości udowej. Zabieg został przeprowadzony za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej Uniwersytetu w Würzburgu i za świadomą zgodą pacjentów. Pierwotne komórki śródbłonka mikrokrążenia wyizolowano z biopsji napletka młodocianych dawców. Ich przedstawiciel prawny (ich przedstawiciele prawni) wyrazili pełną świadomą zgodę na piśmie. Badanie zostało zatwierdzone przez lokalną radę etyczną Uniwersytetu w Würzburgu (głos 182/10).

1. Izolacja hBMSC i HDMEC

  1. Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące ze szpiku kostnego (hBMSC)
    1. Usuń gąbczastą kość z głowy kości udowej za pomocą sterylnej łyżki.
      UWAGA: Kość gąbczasta pojawia się jako luźna i ziarnista substancja wewnątrz kości korowej, która jest twarda i sztywna. Może być konieczne zadrapanie części kości gąbczastej od kości korowej za pomocą skalpela.
    2. Włóż usuniętą gąbczastą kość do dwóch probówek o pojemności 50 ml. Objętość kości gąbczastej może wynosić od 5 do 10 ml w zależności od wymiaru usuniętej głowy kości udowej podczas operacji wymiany stawu biodrowego.
    3. Przemyć DMEM-F12 (mieszanina 1:1 DMEM i pożywki Ham F12), napełniając probówkę ok. 30 ml pożywki.
    4. Potrząsaj rurką ręcznie, wzdłużnie, przez 5 sekund, aby wypuścić komórki tłuszczowe z gąbczastej kości. Wirować przy 300 x g i temperaturze 22 °C przez 5 min.
    5. Za pomocą plastikowej pipety z podziałką odessać warstwę komórek tłuszczowych i ok. 20 ml pozostałego supernatantu. Pozostaw wystarczającą ilość podłoża, aby pokryć gąbczastą kość.
    6. Napełnij probówki 10 ml DMEM-F12 i energicznie potrząsaj ręcznie wzdłuż przez 10 - 15 s, aby wypuścić komórki.
    7. Przenieść 10 - 15 ml zawiesiny komórek za pomocą plastikowej pipety z podziałką z probówek do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    8. Powtórzyć 2 - 3 razy od kroku 1.1.6, łącząc ze sobą otrzymaną zawiesinę komórek, aż gąbczasta kość zebrana w probówce o pojemności 50 ml stanie się biała.
    9. Przenieś zawiesinę komórek za pomocą plastikowej pipety z podziałką do dwóch nowych probówek, unikając zasysania osadu w postaci osadu na dnie probówek o pojemności 50 ml.
    10. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 300 x g i temperaturze 22 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez zasysanie go plastikową pipetą miarową.
    11. Dodać 40 ml DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 μg/mL Askorbinian-2-fosforanu w trzeciej probówce. Przenieść 5 ml tej pożywki do każdej probówki zawierającej osad komórkowy. Ponownie zawiesić osady komórkowe, energicznie migocząc dnem probówek i przenieść zawiesiny komórek do probówki zawierającej tylko pożywkę.
    12. OPCJONALNIE: Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórek do zliczania komórek, rozcieńczając najpierw 1:100 PBS, a następnie 1:10 w błękitu trypanowym, dodając 15 μl pierwszego rozcieńczenia do 15 μl DPBS i 30 μl błękitu trypanowego w celu uzyskania stosunku DPBS do błękitu trypanowego 1:1. Policz komórki za pomocą standardowej komory Neubauera.
    13. Wysiewać komórki w 10-9 komórkach/175 cm2 kolbie T w 25 ml pożywki, jak opisano w 1.1.11. Alternatywnie, podzielić całą zawiesinę komórek do maksymalnie dziesięciu kolb do hodowli komórkowycho średnicy 175 cm2 bez liczenia. Na tym etapie hBMSC nie są możliwe do odróżnienia od erytrocytów, które znacznie przewyższają je liczebnie. hBMSC pojawią się jako rzadkie kolonie (1 - 2 / kolbę) w ciągu pierwszych 7 dni.
    14. Zmienić podłoże po 4 dniach od wysiewu, aby umożliwić interakcję komórek krwi z hBMSC. Po pierwszej wymianie pożywki należy wymieniać podłoże co 2 - 3 dni. Przeprowadzić wymianę pożywki poprzez całkowite usunięcie pożywki hodowlanej za pomocą pipety z tworzywa sztucznego z podziałką, dwukrotne przemycie DPBS (poprzez dodanie 10 ml DPBS do przylegających komórek i całkowite usunięcie DPBS za pomocą pipety z tworzywa sztucznego z podziałką), a następnie dodanie 20 ml świeżej pożywki, jak opisano w ppkt 1.1.11.
  2. Ludzkie komórki mikronaczyniowe śródbłonka skóry (HDMEC)
    1. Wykonaj biopsje skóry i odizoluj HDMEC zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami21. Krótko, po oddzieleniu skóry właściwej od naskórka, inkubować skórę właściwą w trypsynie przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po czasie inkubacji przenieść skórę właściwą na szalkę Petriego zawierającą pożywkę hodowlaną i zdrapać każdy kawałek za pomocą skalpela. Otrzymaną zawiesinę komórek przenieść do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 22 °C. Zawiesinę komórek policzyć za pomocą komory Neubauera i zasiać w gęstości 1,2 x 104 komórek/cm2. Zmieniaj podłoże całkowicie co drugi dzień.

2. Konfiguracja i sterylizacja kolb wirujących, mikronośników RCP i bioreaktora

  1. Kolby obrotowe i mikronośniki RCP
    1. Na dzień przed eksperymentami należy ustawić kolby obrotowe i przygotować je do sterylizacji w autoklawie.
      UWAGA: Pozostaw nasadki kolb obrotowych luźno i, jeśli to możliwe, sterylizuj je w pozycji pionowej.
      1. Owinąć kolby obrotowe folią aluminiową wokół nasadek bocznych oddzielnie, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas rozpakowywania. Owinąć kolby 1-2 warstwami folii aluminiowej do autoklawowania, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia po sterylizacji.
    2. Zważyć wymaganą ilość makroporowatych mikronośników RCP w 20 ml DPBS.
      UWAGA: Wymagane jest 30 mg na kolbę wirową. Pozwól im nawodnić się przez co najmniej 1 godzinę przed sterylizacją termiczną w autoklawie (121 °C przez 15 minut).
  2. Bioreaktor perfuzyjny
    1. Użyj opisanego systemu bioreaktora do produkcji unaczynionych ekwiwalentów tkankowych20. Bioreaktor ten składa się z naczynia, w którym umieszcza się biomatrycę, zbiornika pożywki i butli ciśnieniowej.
      1. Połączyć naczynie ze zbiornikiem medium i butelką ciśnieniową przez silikonowe rurki (patrz Rysunek 3C). Pozostaw nakrętki luźne i umieść je w plastikowej torbie autoklawu, dobrze zamknij i umieść w drugiej plastikowej torbie autoklawu. Sterylizuj w autoklawie.

3. Hodowla hBMSC i HDMEC na makroporowatych mikronośnikach RCP

UWAGA: HDMEC używane do inicjowania mikronośników RCP zostały oznaczone RFP przez transdukcję lentiwirusową. Ten protokół został zmodyfikowany po wcześniej opublikowanym protocol5.

  1. Pozwól makroporowatym mikronośnikom RCP osiąść na dnie i umyj je 10 ml pożywki hodowlanej. Powtórz 3 razy.
  2. Umyć kolby wirowe 10 ml pożywki hodowlanej.
  3. Dodać 30 mg makroporowatych mikronośników RCP na kolbę wirową w 8 ml pożywki hodowlanej. Równowaga kolb obrotowych zawierających mikronośniki RCP w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, przed wysiewem komórek.
    UWAGA: Jest to oparte na przybliżonej suchej masie mikronośników RCP przed sterylizacją.
  4. Wysiew: 5 x 10,5 hBMSC lub HDMEC (przejście 3) na kolbę przędzalniczą w 2 ml pożywki hodowlanej.
  5. Umieścić kolby wirujące na płycie mieszadła i rozpocząć mieszanie z prędkością 90 obr./min przez 5 minut, a następnie odpocząć przez 55 minut, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , w sumie przez 1 godzinę inkubacji statycznej/dynamicznej. Powtórz 4 razy.
  6. Dodać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych na kolbę wirową, a następnie rozpocząć ciągłe mieszanie z prędkością 95 obr./min. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Za pomocą mikropipety pobrać próbki w 1, 4 i 7 dniu: 333 μL dla zawartości DNA (~ 0,5 mg), 1000 μL dla analizy SEM (~ 1,5 mg) i 333 μL dla barwienia żywego/martwego (~ 0,5 mg).
    UWAGA: Jest to oparte na przybliżonej suchej masie mikronośników RCP przed sterylizacją.
  8. Zmieniaj 10 ml pożywki hodowlanej co drugi dzień. W tym celu należy poczekać, aż mikronośniki RCP osiądną na dnie i bardzo ostrożnie odessać 10 ml z kolby wirowej, za pomocą pipety o pojemności 10 ml, a następnie dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej.
  9. Przechowywać kultury na mieszadle ustawionym na 95 obr./min, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni.

4. Zawartość DNA, analiza SEM, barwienie żywych żywych trupów i test kiełkowania

  1. Zawartość DNA
    1. Za pomocą mikropipety pobrać ok. 0,5 mg mikronośników z każdej kolby wirującej (zawartej w 333 μl zawiesiny) i przenieść do probówki plastikowej o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Jest to oparte na przybliżonej suchej masie mikronośników RCP przed sterylizacją.
    2. Przemyć raz 1 ml DPBS, a następnie odessać supernatant.
    3. Usuń pozostały DPBS w liofilizatorze i zważ liofilizowane mikronośniki w celu późniejszej normalizacji.
    4. Zamrażać próbki w temperaturze -80 °C przez co najmniej 6 godzin.
    5. Próbki inkubować w temperaturze 60 °C przez noc z 300 μl papainy 5 U/mL.
    6. Ustalić odpowiednie krzywe miareczkowania zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do oznaczania ilościowego (np. testu PicoGreen dsDNA) i przeprowadzić pomiar sygnału fluorescencyjnego przy długości fali 520 nm za pomocą detektora luminescencji.
  2. Analiza skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Zebrać ok. 1 mg mikronośników z każdej kolby przędzalniczej i przenieść do plastikowej probówki o pojemności 2 ml.
    2. Umyj mikronośniki raz 1 ml DPBS.
    3. Usunąć DPBS i inkubować w 1 ml 70% etanolu przez 1 godzinę.
    4. Usunąć supernatant i inkubować w 1 ml 80% etanolu przez 1 godzinę.
    5. Usunąć supernatant i inkubować w 1 ml 90% etanolu przez 1 godzinę.
    6. Usunąć supernatant i inkubować w 1 ml 100% etanolu przez 1 godzinę.
    7. Usunąć supernatant i inkubować w 1 ml heksametylodilazanu przez 10 minut.
    8. Otwórz nakrętkę i pozostaw próbki do wyschnięcia przez noc pod maską chemiczną.
    9. Umieść próbki na odpowiednim podłożu i przystąp do analizy SEM zgodnie z ustalonymi protokołami.
  3. DAPI i barwienie żywe/martwe
    1. W 2, 4 i 7 dniu po wysiewie komórek na mikronośnikach należy zebrać 0,5 mg mikronośników z każdej kolby obrotowej i przenieść do plastikowej probówki o pojemności 2 ml. Umyć raz 1 ml DPBS.
    2. DAPI (interfejs DAPI)
      1. Utrwal próbki przez 10 minut w wystarczającej ilości 4% paraformaldehydu, aby je pokryć.
      2. Umyć raz 1 ml DPBS.
      3. Inkubować w temperaturze pokojowej z roztworem barwiącym przez 45 minut na wstrząsającym shakerze.
      4. Wykrywanie sygnału fluorescencyjnego DAPI na mikroskopie fluorescencyjnym z filtrem emisyjnym 420 nm i pozyskiwanie obrazów.
    3. Barwienie żywe/martwe
      1. Próbki inkubować w 500 μl żywego/martwego roztworu barwnika. Próbki należy przechowywać w temperaturze 37 °C przez 20 minut, chroniąc je przed światłem.
      2. Umyć raz 1 ml DPBS.
      3. Wykrywanie sygnału fluorescencji żywych komórek za pomocą filtra emisyjnego 490 nm i martwych komórek za pomocą filtra emisyjnego 545 nm pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pobieranie obrazów.
    4. Test kiełkowania dla HDMEC
      1. Wymieszaj 330 μl roztworu kolagenu R 0,4%, 170 μl 0,1% kwasu octowego i 50 μl pożywki M199 w plastikowej tubie o pojemności 15 ml. Trzymaj na lodzie.
      2. Pobrać ~0,375 mg mikronośników (250 μL) za pomocą mikropipety. Przenieść do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml, poczekać, aż mikronośniki RCP osiądą na dnie i całkowicie usunąć pożywkę.
        UWAGA: Jest to oparte na przybliżonej suchej masie mikronośników RCP przed sterylizacją.
      3. Dodać objętość NaOH 0,2 N potrzebną do zneutralizowania mieszaniny kolagenu i natychmiast wymieszać ją z mikronośnikami RCP.
        UWAGA: Określić wcześniej wymaganą ilość NaOH 0,2 N, dodając go do mieszaniny do zmiany pH (zmiana koloru z żółtego na różowy), a następnie umieszczenie mieszaniny w inkubatorze na 1 minutę, po czym należy utworzyć żel.
      4. Mieszaninę żelu kolagenowego i mikronośników RCP należy umieścić w dołku na 24-dołkowej płytce. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
      5. Dodać 200 μl czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (np. pożywki hodowlanej VascuLife VEGF-Mv). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
      6. Obserwuj pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym, używając obiektu o 10-krotnym powiększeniu i uzyskuj obrazy.

5. Zasiewanie biomatrycy i uruchomienie systemu bioreaktorów dla HDMEC

  1. Na dzień przed uruchomieniem hodowli bioreaktora należy rozciąć BioVaSc (biomatrycę) wzdłużnie po stronie antykrezkowej i zamocować ją w uprzednio zdezynfekowanej ramie z poliwęglanu (patrz Rysunek 3A, B).
    UWAGA: BioVaSc to biomatryca uzyskana z pozbawionego komórek segmentu jelita czczego świni, przygotowana zgodnie z wcześniejszymi publikacjami21.
    UWAGA: Ponieważ rama z poliwęglanu nie może być sterylizowana termicznie, należy ją zdezynfekować przez 20 minut inkubacji w kąpieli sonicznej (40 kHz), a następnie 3-krotną inkubację w etanolu 70% przez 25 minut. Następnie umyj ramę 3 razy sterylnym DPBS.
    1. Umieścić system biomatrix-frame na szalce Petriego o średnicy 100 mm i wypełnić go czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego + 1% penicyliny Streptomycyny (Pen/Strep).
    2. Zrównoważyć biomatrycę, inkubując przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Po odłączeniu i zliczeniu komórek wstrzyknąć 10 x 107 HDMEC w 1000 μl pożywki hodowlanej przez zachowane naczynia krwionośne biomatrycy, za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Wstrzyknąć ~700 μL przez wlot tętniczy i ~300 μL przez ujście żyły.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny, aby umożliwić przyłączenie komórek.
  4. Napełnij system bioreaktora 350 ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych + 1% Pen/Strep i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Umieść ramę wewnątrz naczynia bioreaktora. Połącz szypułki tętnicze i żylne z naczyniem.
  6. Rozpocznij perfuzję, podłączając system bioreaktora do pompy perystaltycznej. Ustaw ciśnienie na 10 mmHg i amplitudę ±1.
  7. Zwiększaj ciśnienie stopniowo co godzinę, aż do osiągnięcia 100 mmHg ciśnienia, amplitudy ±20.
  8. Utrzymuj system bioreaktora przez 7 dni w tych warunkach w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

6. Dodanie RFP-HDMEC do biomatrycy

  1. Wymieszaj 330 μl 0,4% roztworu R kolagenu, 170 μl 0,1% kwasu octowego i 50 μl pożywki M199 w 15 ml probówce Falcon. Trzymaj na lodzie.
  2. Pobrać mikronośniki RCP z kolb obrotowych. Całkowicie usuń pożywkę hodowlaną.
  3. Dodać objętość NaOH 0,2 N potrzebną do zneutralizowania mieszaniny kolagenu i natychmiast wymieszać ją z mikronośnikami RCP.
  4. Dodaj mieszaninę żelu kolagenowego i mikronośników RCP na światło biomatrycy. Pozostaw do żelowania na 30 minut.
  5. Równolegle zmień pożywkę bioreaktora, całkowicie usuwając pożywkę, a następnie dodaj 350 ml świeżego, wstępnie podgrzanego, czynnika wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych + 1% Pen/Strep.
  6. Podłącz bioreaktor do pompy perystaltycznej i ustaw ciśnienie na 100 mmHg i amplitudę ±20.
  7. Zmieniaj podłoże co 7 dni.
  8. Utrzymuj bioreaktor w kulturze przez 21 dni.

7. Analiza i odczyty kultur bioreaktorów

  1. Przygotowanie próbek
    1. Odłącz biomatrycę od bioreaktora i wyjmij ją z ramy z poliwęglanu.
    2. Otrzymany kawałek należy podzielić na 6 sekcji: 2 do MTT, 2 do zatapiania/barwienia parafiny i 2 do analizy SEM.
  2. Zatapianie parafiny
    1. Umieść sekcje na szalce Petriego i umyj wystarczającą ilością DPBS, aby je przykryć. Wyrzuć DPBS.
    2. Utrwal skrawki w 4% paraformaldehydzie przez noc.
    3. Przygotuj kasety do zatapiania parafiny i wykonaj to zgodnie ze standardowymi protokołami.
    4. Przygotować skrawki w blokach parafinowych i wyciąć próbki o wielkości 3 μm do barwienia H&E za pomocą mikrotomu.
  3. Barwienie H&E
    1. Zabarwić ponownie nawodnione sekcje zgodnie ze standardowymi protokołami32.
  4. Analiza skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Umieść sekcje na szalce Petriego i umyj wystarczającą ilością DPBS, aby je przykryć. Wyrzuć DPBS.
    2. Utrwal skrawki 4,75% aldehydu glutarowego na noc.
    3. Wykonaj łańcuch odwadniania ze wzrostem stężenia etanolu 50% - 100%.
    4. Przykryj sekcje heksametylodylazanem (HMDS) przez 10 minut. Wyrzuć zużyte gogle HMDS i dodaj świeże gogle.
    5. Pozostaw skrawki do wyschnięcia przez noc pod wyciągiem, a następnie przygotuj próbki do obrazowania.
  5. Bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT)
    1. Wymieszać odczynnik MTT z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych w stężeniu 1 mg/ml.
    2. Inkubować skrawki w roztworze MTT przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Obserwuj struktury naczyniowe i mikronośniki wysiewane przez komórki makroskopowo lub pod mikroskopem jasnego pola, aby wykryć komórki aktywne metabolicznie. Pobieranie obrazów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1A, po 7 dniach hodowli na mikronośnikach RCP uzyskano wysoką liczbę żywych komórek, co stwierdzono za pomocą barwienia live/dead. Wyniki te potwierdzono analizą SEM, w której zaobserwowano całkowicie zkolonizowane mikronośniki wokół porów, częściowo je przerastające (Rysunek 1B). Z drugiej strony, eksperymenty, w których komórki nie zostały wysiane równomiernie, doprowadziły do powstania kilku pustych mik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z głównych celów mikronośnika jest ekspansja komórek przy jednoczesnym zachowaniu ich różnicowania w celu dostarczenia komórek do miejsca potrzebowania. Przedstawiona metoda wprowadziła mikronośniki RCP, w których komórki były w stanie przyłączać, namnażać i kolonizować mikronośniki o dużej gęstości komórek. Zaobserwowano to za pomocą barwienia żywych/martwych, w którym wykryto ponad 90% żywotnych komórek, podczas gdy po 7 dniach dynamicznych hodowli uzyskano tylko kilka martwych komórek. Podobnie, obrazy SEM potw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania prowadzące do tych wyników otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej FP7/2007-2013 na podstawie umowy o grant nr 607051 (BIO-INSPIRE). Dziękujemy Carolien van Spreuwel-Goossens z Fujifilm Manufacturing Europe B.V. za pomoc techniczną podczas produkcji RCP oraz Wernerowi Stracke z Instytutu Fraunhofera ds. Badań nad Silikatami ISC za pomoc w analizie SEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliumbromek (MTT)Serva Electrophoresis GmbH20395.01
Chlorowodorek 4',6-dimidino-2-fenylindoldi (DAPI)Sigma-AldrichD9542
Kwas octowy 100%Sigma-Aldrich533,001
Waga analityczna Kern EG 2200-2NMKern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphateSigma-AldrichA8960
BioreaktorKatedra Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wuerzburg, Niemcy
Mikroskop jasnego pola Axiovert 40CCarl Zeiss AG
CellnestFujifilm
Probówki wirówkowe (15 mL, 50 mL)Greiner Bio-One
Roztwór kolagenu R 0,4%Serva Electrophoresis GmbH47254.01
DMEM-F12Gibco11320-033
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537Modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
Eozyna 1%Morphisto10177.01000
Etanol 96%Carl Roth GmbHT171.4Denaturowana
płodowa surowica cielęca (FCS)Bio& SPRZEDAJFCS. ADD.0500nie inaktywowany termicznie
Mikroskop fluorescencyjny BZ-9000Keyence
HaematoxylinMorphisto10231.01000
HeksametylodilazanSigma-Aldrich440191Klasa odczynnika, ≥ 99%
Inkubator do bioreaktoraKatedra Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Würzburg, Niemcy
Zestaw do podwójnego barwienia żywych/martwych komórekFluka04511KT-F
Mieszadło magnetyczne2Mag80002
Medium 199Sigma-AldrichM065010X
Czytnik mikropłytek
Tecan Infinite M200		Tecan
Igła 21G 16mmVWR613-5389
Papaina z lateksu papaiSigma-AldrichP4762liofilizowany proszek, ≥ 10 jednostek/mg białka
ParafinaCarl Roth GmbH6642.6
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Pompa perystaltycznaIsmatec
Zestaw testowy Quanti-iT PicoGreen dsDNAThermo Fischer ScientificP7589
Histofix 4%Carl Roth GmbHP087
Skaningowy mikroskop elektronowy Supra 25Carl Zeiss AG
Wodorotlenek sodu, roztwór 1,0 NSigma-AldrichS2770
Kolby obrotowe (25 mL)Strzykawka Wheaton356879
1 mlVWR720-2561
Kolby do hodowli tkankowych (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2)TPP Techno Plastik Products AG
Trypan niebieski 0,4%Sigma-AldrichT8154
VascuLife VEGF-MvTechnologia komórkowa LifelineLL-0005

Bibliografia

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025(2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23(2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460(2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885(2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspansja kom rek na mikrono nikachdostarczanie kom rek r db onkahodowla w kolbie z mieszad em spinner flasksystem perfuzyjny bioreaktoraunaczynione ekwiwalenty tkanekanaliza ywotno ci kom rekskaningowa mikroskopia elektronowabarwienie Live Deadelowanie kolagenu
Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.