Artykuł metodologiczny

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

DOI:

10.3791/57390

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Owady żywiące się łykiem i sokami roślinnymi atakują integralność upraw i owoców, aby odzyskać składniki odżywcze, uszkadzając przy tym uprawy żywności. Owady pluskwiaka stanowią szereg istotnych ekonomicznie szkodników roślin, które powodują szkody w uprawach, żywiąc się sokiem łyka. Brązowy marmoryzowany pluskwa cuchnąca (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) i azjatycki psyllid cytrusowy (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) to szkodniki owadów pluskwiakowych wprowadzone do Ameryki Północnej, gdzie są inwazyjnym szkodnikiem rolniczym upraw specjalistycznych, rzędowych i podstawowych o wysokiej wartości oraz owoców cytrusowych, a także uciążliwym szkodnikiem, gdy gromadzą się w pomieszczeniach. Odporność na insektycydy u wielu gatunków doprowadziła do opracowania alternatywnych metod strategii zwalczania szkodników. Interferencja RNA za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNAi) to mechanizm wyciszania genów w funkcjonalnych badaniach genomicznych, który ma potencjalne zastosowania jako narzędzie do zwalczania szkodników owadzich. Egzogennie zsyntetyzowane dsRNA lub małe interferujące RNA (siRNA) mogą wywołać wysoce skuteczne wyciszanie genów poprzez degradację endogennego RNA, który jest homologiczny do przedstawionego. Skuteczne i ekologiczne zastosowanie RNAi jako biopestycydów molekularnych do biokontroli owadów pluskwiaka wymaga dostarczania in vivo dsRNA poprzez karmienie. Tutaj pokazujemy metody dostarczania dsRNA owadom: ładowanie dsRNA do zielonej fasolki przez zanurzenie i wchłanianie specyficznego dla genu dsRNA z doustnym podawaniem przez spożycie. Przedstawiliśmy również nietransgeniczne podejścia do dostarczania roślin przy użyciu oprysków dolistnych, zraszania korzeni, iniekcji do pnia, a także granulek gliny, z których wszystkie mogą być niezbędne do trwałego uwalniania dsRNA. Potwierdzono, że skuteczne dostarczanie przez doustnie przyjmowane dsRNA jest skuteczną dawką wywołującą znaczny spadek ekspresji docelowych genów, takich jak kwas juwenilowy O-metylotransferaza (JHAMT) i witellogenina (Vg). Te innowacyjne metody reprezentują strategie dostarczania dsRNA do wykorzystania w ochronie upraw i przezwyciężenia wyzwań środowiskowych związanych z ochroną przed szkodnikami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Owady Hemipteran stanowią jedne z najbardziej znaczących ekonomicznie szkodników rolnictwa, ze względu na ich zdolność do osiągania wysokiego wzrostu populacji i rozprzestrzeniania chorób w roślinach. BMSB, H. halys Stål, jest inwazyjnym szkodnikiem, który został przypadkowo wprowadzony na półkulę zachodnią w Allentown w Pensylwanii z Azji (Chiny, Tajwan, Korea i Japonia) z pierwszą obserwacją zgłoszoną w 1996 roku1. Od czasu wprowadzenia BMSB został wykryty w 43 stanach, z największymi populacjami na środkowym Atlantyku (DE, MD, PA, NJ, VA i WV), a także w Kanadzie i Europie, i stanowi potencjalne zagrożenie dla rolnictwa2. Jako polifagiczny szkodnik, BMSB może wyrządzić szkody około 300 zidentyfikowanym gospodarzom roślinnym, w tym uprawach o wysokiej wartości, takich jak jabłka, winogrona, rośliny ozdobne, rośliny nasienne, soja i kukurydza. Uszkodzenia są spowodowane przede wszystkim sposobem karmienia znanym jako szarpanie i uderzenie, w którym zwierzę przebija roślinę żywicielską swoim igłowatym stylem, aby uzyskać dostęp do składników odżywczych z tkanek naczyniowych2,3. BMSB jest również szkodnikiem wewnętrznym, ponieważ od jesieni do zimy może zamieszkać w pomieszczeniach mieszkalnych, takich jak szkoły i domy2. Chemikalia i alergeny lotne uwalniane przez BMSB zostały zgłoszone jako nielegalna reakcja alergiczna u pracowników upraw sadowniczych. BMSB może również przyczyniać się do choroby alergicznej prowadzącej do kontaktowego zapalenia skóry, zapalenia spojówek i nieżytu nosa u osób wrażliwych4,5. Inny owad z rodziny pluskwiaków, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), jest poważnym szkodnikiem owoców cytrusowych i przenosi bakterie o ograniczonej liczbie łyka (Candidatus Liberibacter asiaticus) powodujące Huanglongbing (HLB), lepiej znane jako choroba zielenienia cytrusów6,7. HLB został po raz pierwszy zgłoszony z południowych Chin i rozprzestrzenił się na 40 różnych krajów Azji, Afryki, Oceanii, Ameryki Południowej i Północnej7. Zazielenianie cytrusów to ogólnoświatowy problem, który wiąże się z grożącymi stratami gospodarczymi i finansowymi z powodu utraty owoców cytrusowych; w związku z tym uważa się, że zarządzanie AKP ma ogromne znaczenie dla zapobiegania HLB i ich kontroli.

Środki skutecznego zwalczania tych szkodników zwykle wymagają stosowania chemicznych pestycydów, które są stosunkowo krótkotrwałe. Strategie kontroli insektycydów chemicznych często nie mają bezpiecznych strategii zarządzania środowiskiem lub mają zmniejszoną podatność ze względu na odporność na pestycydy w populacjach szkodników8,9. W związku z tym biologiczne zwalczanie szkodników za pomocą biopestycydów molekularnych jest potencjalną alternatywą, ale jego stosowanie na całym świecie pozostaje skromne, a różne gatunki parazytoidów (np. Trisolcus japonicus) mogą być również skuteczne jako naturalne środki kontroli biologicznej. RNAi to potencjalnie rozwijająca się technologia zwalczania inwazyjnych szkodników owadzich za pomocą biopestycydów molekularnych10. RNAi jest dobrze opisanym mechanizmem regulacji genów, który ułatwia skuteczne potranskrypcyjne wyciszanie genów endogennych, a także inwazyjnych dsRNA w sposób specyficzny dla sekwencji, co ostatecznie prowadzi do regulacji ekspresji genów na poziomie mRNA11,12. Krótko mówiąc, gdy egzogenne dsRNA jest internalizowane w komórce, jest przetwarzane na siRNA przez członka nadrodziny RNazy III nukleazy dwuzębnej, zwanej Dicer, która jest ewolucyjnie konserwowana u robaków, much, roślin, grzybów i ssaków13,14,15. Te 21-25 dupleksów nukleotydowych siRNA są następnie rozwijane i integrowane z kompleksem wyciszającym indukowanym RNA (RISC) jako przewodnikowe RNA. Ten kompleks RISC-RNA umożliwia parowanie zasad Watsona-Cricka z komplementarnym docelowym mRNA; to ostatecznie prowadzi do rozszczepienia przez białko Argonaute, wielodomenowe białko zawierające domenę podobną do RNazy H, która degraduje odpowiednie mRNA i zmniejsza translację białek, prowadząc w ten sposób do potranskrypcyjnego wyciszenia genów16,17,18.

RNAi do zwalczania szkodników wymaga wprowadzenia dsRNA in vivo, aby wyciszyć interesujący nas gen, aktywując w ten sposób szlak siRNA. Różne metody, które zostały wykorzystane do dostarczania dsRNA owadom i komórkom owadów w celu indukcji ogólnoustrojowego RNAi, obejmują karmienie10,19, soaking20,21, mikroiniekcja22, nośniki, takie jak liposomy23 i inne techniki24. Po raz pierwszy zademonstrowano RNAi u Caenorhabditis elegans w celu wyciszenia ekspresji genu unc-22 przez Fire and Mello25, a następnie obniżenie ekspresji kędzierzawych genów u Drosophila melanogaster26. Początkowe badania funkcjonalne wykorzystywały mikroiniekcję do dostarczania dsRNA owadom, takim jak Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30 oraz owady lepidoptera (sprawdzone przez Terenius et al.31). Mikroiniekcja jest korzystna dla dostarczenia dokładnej i precyzyjnej dawki do miejsca zainteresowania owada. Chociaż takie nakłucia septyczne mogą wywoływać ekspresję genów związanych z odpornością z powodu trauma32, co wyklucza jego praktyczność w rozwoju biopestycydów rolniczych.

Inną metodą dostarczania dsRNA in vivo jest moczenie, które polega na spożyciu lub absorpcji dsRNA przez zawieszenie zwierząt lub komórek zazwyczaj w pożywce zewnątrzkomórkowej zawierającej dsRNA. Moczenie stosowano do skutecznego indukowania RNAi w komórkach hodowli tkankowej Drosophila S2 w celu zahamowania kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPKK) Downstream of-Raf1 (DSOR1) 20, a także u C. elegans w celu wyciszenia genu pos-133. Jednak dsRNA dostarczane za pomocą namaczania jest mniej skuteczne w indukowaniu RNAi w porównaniu do mikroiniekcji20. Wyciszanie za pośrednictwem RNAi u owada żującego zostało po raz pierwszy pokazane u zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) poprzez wprowadzenie dsRNA do sztucznej diety agarowej10. Wcześniejsze doniesienia podsumowywały metody dostarczania dsRNA w infuzji w naturalnej diecie specyficznej dla stawonogów34. Ustalono ponadto, że te metody dostarczania są porównywalnie skuteczne ze sztucznymi środkami dostarczania; jak w przypadku muchy tse-tse (Glossina morsitans morsitans), gdzie zaobserwowano równy knockdown genu związanego z odpornością, gdy dsRNA było dostarczane albo przez mączkę z krwi, albo przez mikrowstrzyknięcie35. Podobnie, dostarczanie dsRNA przez kropelki u jasnobrązowej jabłoniowej (Epiphyas postvittana)36, larw diamentowej (Plutella xylostella)37, a także pszczół miodnych38,39 indukowały wydajne RNAi. Najbardziej efektywne eksperymenty RNAi u owadów hemipteran wykorzystywały wstrzyknięcie dsRNA40, ponieważ doustne dostarczanie dsRNA u owadów z pluskwiakami jest żmudne, ponieważ musi być dostarczane przez tkanki naczyniowe rośliny żywicielskiej. Skuteczne RNAi zaobserwowano również u ACP i skoczka wyborowego szklistego (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA było dostarczane przez cytrusy i winorośle, które wchłonęły dsRNA do tkanek naczyniowych poprzez zraszanie korzeni, opryskiwanie dolistne, iniekcje do pnia lub wchłanianie przez sadzonki41,42,43,44,45,46. Zaowocowało to również pierwszym patentem na dsRNA przeciwko ACP (2016, US 20170211082 A1). Dostarczanie siRNA i dsRNA za pomocą nośników, takich jak nanocząstki i liposomy, nadaje stabilność i szybko pojawia się wzrost skuteczności dostarczanego dsRNA23,47,48,49,50. Nowa klasa opartych na nanocząstkach nośników kwasów nukleinowych do in vitro i in vivo, która została podsumowana specjalnie do zastosowań terapeutycznych, może wnieść ogromny potencjał jako odpowiednie wektory dostarczania51. Nanocząstki jako nośnik dostarczania dsRNA mogą mieć wady, takie jak rozpuszczalność, hydrofobowość lub ograniczona bioakumulacja52, ale odpowiednie dostarczanie polimeru może zrekompensować te wady. Pojawiają się również prace rozwojowe i zastosowanie samodostarczających się nukleotydów zwanych "oligonukleotydami antysensownymi", które są jednoniciowymi dupleksami RNA/DNA46.

Witellogeneza u stawonogów jest kluczowym procesem kontrolującym reprodukcję i regulowanym przez hormon juweniliczny (JH) lub ekdyzon, które są kluczowymi induktorami syntezy Vg przez tkankę tłuszczową; Vg jest ostatecznie pobierane przez rozwijający się oocyt poprzez endocytozę, w której pośredniczy receptor Vg53. Vg to grupa polipeptydów syntetyzowanych pozajajnikowo, która jest niezbędna do rozwoju głównego białka żółtka jaja, witeliny54,55, a zatem jest ważna w reprodukcji i starzeniu się56. Vg zostało skutecznie wyciszone u nicieni57, a także u pszczół miodnych (Apis mellifera), gdzie zaobserwowano niedobór Vg za pośrednictwem RNAi u dorosłych i jaj22. Przetestowano posttranskrypcyjne wyciszanie genów Vg za pośrednictwem RNAi, ponieważ uważano, że jego wyczerpanie doprowadzi do obserwowalnego efektu fenotypowego, takiego jak zmniejszona płodność i płodność, aby potencjalnie pomóc w kontroli BMSB. Gen JHAMT, który koduje O-metylotransferazę kwasu S-adenozylo-L-metioniny (SAM) zależną od kwasu JH, katalizuje ostatni etap szlaku biosyntezy JH58. W tym szlaku pirofosforan farnezylu (FPP) jest sekwencyjnie przekształcany z farnezolu w kwas farnezoinowy, a następnie przekształcany przez JHAMT w farnezoinian metylu w JH. Szlak ten jest zachowany u owadów i stawonogów specjalnie do metamorfozy, procesu, który jest regulowany rozwojowo przez hormony59,60,61. U B. mori ekspresja genu JHAMT i aktywność biosyntetyczna JH w ciałkach białych sugerują, że supresja transkrypcji genu JHAMT ma kluczowe znaczenie dla zakończenia biosyntezy JH58. W związku z tym geny JHAMT i Vg zostały wybrane do celowego zubożenia za pomocą RNAi. RNAi testowano również na drzewach cytrusowych pod kątem kontroli ACP i GWSS. Drzewa cytrusowe potraktowano dsRNA poprzez zraszanie korzeni, stuknięcie w łodygę (iniekcje do pnia), a także opryskiwanie dolistne dsRNA przeciwko transkryptom kinazy argininowej (AK) specyficznej dla owadów42,44. Miejscowe stosowanie dsRNA wykryto na całym baldachimie drzew cytrusowych, co wskazuje na skuteczne dostarczanie przez tkanki naczyniowe roślin i spowodowało zwiększoną śmiertelność w ACP i GWSS41,42,45.

W obecnym badaniu zidentyfikowaliśmy naturalną metodę dostarczania diety do leczenia takiego jak dsRNA. Ta nowo opracowana technika została następnie wykorzystana do wyciszenia mRNA JHAMT i Vg przy użyciu specyficznych dla genów dsRNA w nimfach BMSB, jak wykazano wcześniej62. Zademonstrowane tutaj nowe protokoły dostarczania zastępują konwencjonalne systemy dostarczania RNA, które wykorzystują miejscowe spraye lub mikroiniekcje. Warzywa i owoce, kran z łodygą, nasiąkanie glebą i absorbenty gliniane mogą być wykorzystywane do dostarczania dsRNA, co ma kluczowe znaczenie dla dalszego rozwoju biopestycydów w zakresie zwalczania szkodników i patogenów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla BMSB

  1. Hoduj owady BMSB zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną i wcześniej opisaną63.
  2. Hoduj owady ACP (D. citri) na Citrus macrophylla w szklarni (22 °C) i naturalnym świetle. Stosować ACP dla dorosłych, około 5-7 dni po eklozji.

2. Wybór regionów genów i synteza in vitro dsRNA

  1. Wybierz geny specyficzne dla BMSB z wcześniej opublikowanych profili transkryptomu32.
  2. Upewnij się, że wybrane obszary zainteresowania wahają się od 200 do 500 par zasad.
  3. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w warunkach opisanych poniżej, aby wygenerować fragmenty związane z wybranym genem będącym przedmiotem zainteresowania z genomowego DNA. Patrz Tabela 1 dla oligonukleotydów specyficznych dla genu.
    1. Reakcja PCR: W probówce PCR o pojemności 0,25 ml należy połączyć 5 μl buforu 10X PCR, 4 μl mieszaniny dNTP (po 2,5 mM każda), 2 μl matrycy DNA (50 ng / μL), po 2,5 μl starterów 1 i 2 (10 μM), 0,25 μl polimerazy DNA (5 U/μL), oraz woda wolna od DNaz/RNaz do 50 μL.
    2. Warunek PCR: Cyklicznie przeprowadzać reakcję PCR w celu amplifikacji obszaru zainteresowania w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72°C przez 1 minutę. Inkubować reakcję w temperaturze 72 °C przez dodatkowe 10 minut. Oczyszczać reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania.
  4. Otrzymane fragmenty PCR należy dalej amplifikować za pomocą starterów specyficznych dla genu otoczonych sekwencją promotora polimerazy RNA T7 (5'-GAA, TTA, ATA, CGA, CTC, ACT, AGA, GGG, AGA-3'), jak wspomniano wcześniej62.
  5. Użyj genu LacZ jako kontroli negatywnej (pozorowanej) dla RNAi.
    UWAGA: LacZ jest genem kodującym β-galaktozydazę amplifikowaną z genomowego DNA Escherichiacoli (użyte startery są wymienione w Tabeli 1).
  6. Wykonaj transkrypcję in vitro, aby uzyskać dsRNA, jak opisano wcześniej62.
  7. Rozpuść i ponownie zawieś powstałe dsRNA w 150 μl wody wolnej od DNazy/RNaz, zmierz stężenie i przechowuj w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Dostarczanie dsRNA za pomocą zielonej fasoli

  1. Wybierz wczesne nimfy BMSB w czwartym stadium rozwojowym wykluły się z tej samej masy jajowej i głodz je przez 24 godziny przed karmieniem dsRNA.
  2. Wybierz smukłą, certyfikowaną ekologiczną fasolkę szparagową (Phaseolus vulgaris L.) i myj 0,2% roztworem podchlorynu sodu przez 5 min.
    UWAGA: Smukła fasolka szparagowa została wybrana tak, aby fasola mogła być łatwo umieszczona w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
  3. Umyć 3 razy za pomocą ddH2O i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
  4. Przytnij fasolkę szparagową od końca kielicha do całkowitej długości 7,5 cm za pomocą czystej żyletki.
  5. Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 300 μl roztworu kontrolnego (rozcieńczenie 1:10 zielonego barwnika spożywczego (składniki: woda, glikol propylenowy, Fd&C Yellow 5, Fd&C Blue 1 i Propyloparaben jako środek konserwujący)).
  6. Rozcieńczyć zsyntetyzowane in vitro dsRNA LacZ, JHAMT lub Vg, rozcieńczając 5 μg lub 20 μg w 300 μl wody wolnej od RNazy/DNazy, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,017 μg/μL lub 0,067 μg/μL.
  7. Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 300 μl roztworu dsRNA (od kroku 3.6).
  8. Owinąć i uszczelnić krawędzie probówek do mikrowirówek otaczających zanurzone ziarna, aby uniknąć parowania roztworu dsRNA i zapobiec przedostawaniu się zwierząt do probówki mikrowirówkowej.
  9. Umieść te probówki w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, aby umożliwić załadowanie roztworu dsRNA w całej zielonej fasoli poprzez działanie kapilarne.
  10. Umieść te probówki w czystych naczyniach hodowlanych (polipropylen). Umieść trzy wygłodzone nimfy BMSB w czwartym stadium rozwojowym w naczyniach hodowlanych.
  11. Potraktuj trzy zwierzęta na naczynie hodowlane, z których każde zawiera trzy zielone fasolki, zielonym barwnikiem spożywczym lub roztworem dsRNA. Utrzymuj owady w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 72%, w fotoperiodzie 16L:8D w inkubatorze.
  12. Pozwól owadom żywić się zieloną fasolką (zanurzoną i wchłoniętą z dsRNA) przez 5 dni, ale po 3 dniach uzupełnij świeżą dietą zieloną kulki do leczenia dsRNA.

4. Ilościowa analiza ekspresji genów w czasie rzeczywistym (qPCR) po wyciszeniu za pośrednictwem RNAi w BMSB

  1. Zmierz wpływ RNAi na poziomy ekspresji transkryptu za pomocą qPCR.
  2. Wyizoluj całkowite RNA od zwierząt traktowanych dsRNA i zsyntetyzuj cDNA62.
  3. Skonfiguruj reakcje qPCR przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym i starterów wymienionych w Tabeli 1. Stosować następujące warunki cykliczne qPCR: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 minutę, wraz z etapem dysocjacji, w tym 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 15 s.
  4. Określić wzorce qPCR: jako wzorzec odniesienia do oznaczania ilościowego należy użyć seryjnego rozcieńczenia cDNA przygotowanego z całkowitego RNA wyizolowanego od normalnego zwierzęcia.
  5. Użyj RNA BMSB 18s jako wewnętrznego wzorca, aby skorygować różnice w odzyskiwaniu RNA z tkanek32.

5. Opryskiwanie dolistne dużych doniczkowych drzew cytrusowych i sadzonek

Uwaga: Rośliny cytryny odmiany cytrusowej 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae) były hodowane w szklarni w naturalnym świetle i temperaturze, uprawiane w pojemnikach o pojemności 1,2 L. Rośliny były stale przycinane, aby pobudzić wzrost nowych pędów liściowych, zwanych "flush". ACP preferuje żerowanie i składanie jaj na nowym wzroście cytrusów64.

  1. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez 2-3 dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła.
  2. Za pomocą butelki z rozpylaczem z pompką ręczną nałóż 200 ml roztworu dsRNA (0,5 mg/ml) na dolny baldachim (Rysunek 4A).
    UWAGA: Przygotuj wyżej wymienione roztwory dsRNA w wodzie wolnej od DNaz/RNaz.
  3. Po rozpyleniu należy pozostawić zastosowany roztwór dsRNA do całkowitego wchłonięcia przez liście.
    UWAGA: Drzewa cytrusowe wchłonęły zastosowane dsRNA, a następnie wyekstrahowano liście z nowego wzrostu lub z gałęzi, które zostały pokryte przed aplikacją; dsRNA był wykrywalny za pomocą qPCR i wykazywał ogólnoustrojowy ruch w liściach korony drzewa w 3-4 h44,45,46.
  4. Próbkę nowego wzrostu z wcześniej ściętych drzew należy pobrać po 25-40 dniach, zbierając około 10 liści z końcówek czterech gałęzi. Wyodrębnij całkowity RNA i przeanalizuj go za pomocą odwrotnej transkrypcji PCR (RT-PCR) i qPCR pod kątem obecności zastosowanego wyzwalacza dsRNA przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli 1 i wcześniej opisanych metod46.
    UWAGA: Pobieranie próbek, całkowita izolacja RNA, RT-PCR i qPCR zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem46.
  5. Podobnie, rozpyl miejscowo 10 ml dsRNA na dolną część sadzonki lub liści małego drzewa doniczkowego.
    UWAGA: Owady z rodzaju pluskwiaka (ACP i GWSS) miały dostęp do żerowania normalnie po 24 godzinach, po zabiegach na nowych przyrostach (liściach), które nie zostały bezpośrednio opryskiwane lub które wyrosły kilka tygodni później, lub na całych roślinach. W ten sposób powstały owady, które uzyskały pozytywny wynik testu na dsRNA po 3, 6 i 10 dniach po karmieniu.

6. Stosowanie zraszania gleby/korzeni w dużych lub małych doniczkowych drzewach cytrusowych i sadzonkach

  1. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez 2-3 dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła (tworzy to przestrzeń powietrzną do przechowywania płynnego roztworu, który ma być zastosowany).
  2. Dodać 1 l roztworu dsRNA (0,2 mg/ml) do gleby dużych roślin doniczkowych (około 2,5 m) i po 1 godzinie dodać 1 l wody (chaser).
  3. Zastosuj 100 ml roztworu dsRNA (1,33 mg/ml) na glebę drzew doniczkowych o wysokości 1 m w częściowo suchych glebach.
  4. W przypadku małych sadzonek nałóż 10 ml roztworu dsRNA (1 mg / ml) na glebę w szyszkach lub na gołe korzenie (Rysunek 4B, C).
  5. Pozwól roślinom, które otrzymują roztwór dsRNA zastosowany jako zraszanie gleby, moczyć się przez 30 minut. Następnie zastosuj zwykłą wodę, aby wspomóc wchłanianie przez korzenie (20 ml dla roślin w żółtych pojemnikach lub 100 ml, jeśli większe doniczki mają > 1 galon).
    UWAGA: Miejscowo stosowane dsRNA na liście powodowały wykrycie co najwyżej dystalnych końcówek gałęzi w ciągu 3-6 godzin po zabiegach, wykazując ogólnoustrojowy ruch przez drzewa. Nowe gałęzie wzrostu dały wynik pozytywny na obecność dsRNA po 60-90 dniach od zabiegów. Sadzonki są dostarczane owadom (ACP i GWSS) w teście biologicznym karmienia dsRNA44.

7. Zastosowanie Stem Tap (iniekcja pnia drzewa) w dużych doniczkowych drzewach cytrusowych i sadzonkach

  1. Wybierz sadzonki cytrusów, nowe lub około 3,5-letnie rośliny do wstrzykiwania dsRNA metodą stuknięcia w łodygę (iniekcja do pnia).
  2. Wywierć otwory w roślinach cytrusowych za pomocą wiertła i wiertła 10 mm, uważając, aby nie przekroczyć 2 cm, czyli około połowy średnicy łodygi.
  3. Owiń miedzianą końcówkę każdego wtryskiwacza 4-6 razy paskiem folii uszczelniającej o szerokości 0.6 cm (1/4 cala), aby zapobiec wyciekom w pobliżu końcówki.
  4. Napełnij wtryskiwacze pni drzew 6 ml (1,7 mg / ml) roztworu dsRNA rozcieńczonego w wodzie wolnej od DNaz / RNaz (oznaczonej tutaj jako kolorowy roztwór).
  5. Wstrzyknąć roztwór do pnia drzewa i pozostawić wtryskiwacz w pniu na 6-10 godzin, aby umożliwić wchłonięcie roztworu dsRNA. Pozwól owadom żerować na sadzonkach z traktowanych drzew po 3, 10 i 30 dniach od zabiegu.
    UWAGA: dsRNA wstrzyknięty metodą iniekcji pnia utrzymywał się na drzewach przez okres 30-60 dni41,42,44. Walidację RNAi przeprowadzono metodą qPCR przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1.

8. Granulki gliny poddane działaniu dsRNA do dostarczania owadom przez glebę

  1. Wylej absorbent gliny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml do oznaczenia 35 ml (około 30 g absorbentu gliny) na probówce.
  2. Wlać 20 ml roztworu dsRNA rozcieńczonego w wodzie wolnej od DNaz/RNaz (100 μg/ml) do probówki, aby zwilżyć cały absorbent. Zakryj stożkową rurkę, przechyl rurkę, aby ułatwić usunięcie powietrza, i zakryj rurkę.
  3. Ustaw probówkę pionowo i odstaw na 1-2 minuty, aby cząsteczki gliny wchłonęły roztwór.
  4. Dodaj wystarczającą ilość gliny nasączonej dsRNA do mieszanki gleby, aby wypełnić doniczkę o pojemności 1 galona.
  5. Wymieszaj i obróć glebę ręcznie, aby dokładnie wymieszać glinę nasączoną dsRNA z glebą.
  6. Użyj tej gleby do przesadzenia sadzonek wybranych do zabiegu dsRNA.
  7. Podlewaj glebę 200 ml zwykłej wody bez dsRNA. Po 30 minutach do 1 godziny należy skroplić 100 ml czystej wody. Po 24 godzinach ustaw roślinę na normalnym harmonogramie podlewania.
  8. Testuj 4-6 liści traktowanych roślin doniczkowych za pomocą absorbentów gliny i dsRNA każdego miesiąca po zabiegu na dsRNA, zbierając najbardziej wierzchołkowe liście nowego wzrostu roślin.
    UWAGA: Rośliny lub sadzonki z tych roślin poddanych działaniu środka są karmione owadom w dowolnym momencie po 24 godzinach od zabiegu i są w stanie dostarczać owady RNAi przez okres do roku (dane niepublikowane).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczanie dsRNA za pośrednictwem roślin poprzez karmienie w nimfach BMSB 4th instar zostało przetestowane pod kątem rozwoju molekularnych biopestycydów przy użyciu RNAi dla inwazyjnych szkodników owadzich. BMSB żywią się za pomocą igiełkowatych stylów za pomocą mechanizmu znanego jako szarpanie i spłukiwanie, który powoduje znaczne szkody w uprawach. Smukła organiczna fasolka szparagowa, P. vulgaris L., została użyta do sprawdzenia, czy składniki odżywcze lub dsRNA ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAi okazał się ważnym narzędziem do badania funkcji biologicznych i regulacji genów, z ogromnym potencjałem do wykorzystania w zwalczaniu szkodników owadzich 19,68,69,70,71. Ogromne znaczenie ma zarówno zaprojektowanie i wybór odpowiedniego genu (genów) do wyciszenia u danego gatunku owadów oraz metoda dostarczania odpowiadającego mu dsRNA (genów) owadow. Opt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Donaldowi Weberowi i Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) za dostarczenie BMSB i HB do eksperymentów i utrzymania kolonii; oraz Marii T. Gonzalez, Salvadorowi P. Lopezowi, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) i Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) za utrzymanie kolonii, przygotowanie próbek i analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Owady BMSB (H. halys) USDA
ACP (D. citri) owady USDA
organiczna fasolka szparagowaNie dotyczy Rośliny
cytrusoweUSDA
roztwór podchlorynu soduJ.T. Baker
zielony barwnik spożywczy McCormick & Co., Inc
Komory Thermo Forma Naczynie Thermo Fisher Scientific
Magenta (Kultura)Podkłady Sigma
 IDT DNA
SensiMix SYBRBioline
qPCR ABI 7500Applied Biosystems 
Butelka z rozpylaczemN/A
ParafilmAmerican Can Company
TaKaRa Ex TaqClontech
QIAquickQiagen

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483(2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854(1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1(2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63(2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730(2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646(2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160(2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082(2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553(2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291(2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861(2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587(2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673(2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736(2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207(2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155(2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

adowanie fasoli szparagowejoprysk dolistnyiniekcja pniowadrena glebowygranulaty glinianeanaliza RT PCR

Powiązane artykuły