Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57410

⸱

20 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Streszczenie

Odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR) wykorzystuje mnóstwo białek do wykrywania, sygnalizowania i naprawy uszkodzeń DNA. Określenie tej reakcji ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów utrzymania genomu. Ze względu na to, że rekrutacja i wymiana białek w zmianach chorobowych jest bardzo dynamiczna, ich badanie wymaga zdolności do generowania uszkodzeń DNA w sposób szybki i ograniczony przestrzennie. W tym miejscu opisano procedury miejscowego wywoływania uszkodzeń DNA w komórkach ludzkich za pomocą powszechnie dostępnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w linię laserową o długości fali 405 nm. Akumulację czynników utrzymania genomu na paskach laserowych można ocenić za pomocą immunofluorescencji (IF) lub w czasie rzeczywistym przy użyciu białek oznaczonych reporterami fluorescencyjnymi. Za pomocą fosforylowanego histonu H2A. X (γ-H2A. X) i białko replikacyjne A (RPA) jako markery, metoda zapewnia wystarczającą rozdzielczość, aby odróżnić czynniki rekrutowane lokalnie od tych, które rozprzestrzeniają się na sąsiedniej chromatynie. Ponadto udostępniamy skrypty oparte na ImageJ, aby skutecznie monitorować kinetykę relokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA. Te udoskonalenia znacznie upraszczają badanie dynamiki DDR.

Wprowadzenie

Komórki są stale narażone na endogenne i egzogenne źródła uszkodzeń DNA, które zagrażają ich integralności genomowej. DDR to zespół szlaków sygnałowych, które wykrywają, sygnalizują i naprawiają zmiany w DNA w celu utrzymania stabilności genomu. W przypadku pęknięć dwuniciowych DNA (DSB) DDR występuje głównie na dwóch komplementarnych platformach: γ-H2A. Chromatyna znakowana chromosomem X i wycięty region jednoniciowego DNA (ssDNA) zwykle pokryty kompleksem wiążącym ssDNA RPA1,2.

Mikronaświetlanie laserowe UV komórek wstępnie uczulonych analogiem tymidyny 5-bromo-2'deoksyurydyny (BrdU) lub trichlorowodorkiem etoksydlenku bisbenzimidu (BBET, Hoechst 33342) Barwnik DNA tworzy mieszaninę uszkodzeń DNA, w tym jednoniciowe pęknięcia (SSB) i DSB, które wywołują zlokalizowany DDR zarówno na platformie chromatyny, jak i ssDNA3,4. Wcześniejsze prace wykazały, że rekrutacja czynników utrzymania genomu do tych dwóch odrębnych platform w DSB może być rozróżniana za pomocą wysokoenergetycznych laserów UV-A (335-365 nm) w połączeniu z IF2,5. Mikroskopy wyposażone w takie lasery są kosztowne, ponieważ wymagają lasera o wysokiej energii i dedykowanych obiektywów transmitujących promieniowanie UV-A, co czyni je znacznie mniej rozpowszechnionymi w środowisku akademickim i farmaceutycznym niż laserowe skaningowe mikroskopy konfokalne z liniami laserowymi 405 nm. Badania nad rekrutacją i wymianą białek w miejscach mikronapromieniowanych są również uniemożliwione przez pracochłonną ręczną analizę obrazu wymaganą do opisania dynamicznego zachowania czynników utrzymania genomu.

Tutaj pokazujemy, że wstępne uwrażliwienie komórek za pomocą barwnika kwasem nukleinowym BrdU lub BBET, a następnie mikronaświetlanie za pomocą lasera 405 nm na wspólnym mikroskopie konfokalnym pozwala na monitorowanie dynamiki czynnika utrzymania genomu w uszkodzeniach DNA. Korzystanie z γ-H2A. Podjednostki kompleksu X lub RPA jako markery platformy, wraz z układaniem w stos z dla większej głębi ostrości i dekonwolucją, dla lepszej rozdzielczości, pozwala eksperymentatorowi odróżnić czynniki, które są lokalnie rekrutowane do DSB, od tych, które rozprzestrzeniają się na duże domeny chromatyny otaczające początkową zmianę. Ta podklasyfikacja według odrębnych przedziałów wewnątrzjądrowych pomaga uściślić potencjalne role niescharakteryzowanych białek rekrutowanych do miejsc mikronapromieniowanych. Ponadto zapewniamy wygodne protokoły i zoptymalizowane potoki do szybkiej analizy dynamiki czynników utrzymania genomu za pomocą oprogramowania open source Fiji (dystrybucja ImageJ)6,7,8. Te udoskonalenia w stosunku do obecnych metod mikronapromieniania sprawiają, że badanie DDR jest możliwe w praktycznie każdym środowisku laboratoryjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Presensybilizacja komórek

  1. Na 24 h przed eksperymentem z mikro-napromieniowaniem, zasiać 40 00 komórek U2OS na studnię w 8-studzienkowych szkiełkach do hodowli z DMEM 1x zawierającym 10% FBS z 170 µm- grube dna szklane lub polimerowe, przypominające szkiełka nakrywki, aby zapewnić maksymalną transmitancję światła lasera o długości fali 405 nm oraz doskonałą jakość obrazowania przy użyciu odwróconego konfokalnego mikroskopu skanującego. W przypadku użycia mikropłytki 8-dołkowej, należy użyć 500 µL pożywki lub roztworów na studzienkę dla wszystkich kolejnych etapów inkubacji iyplukania w protokole.
    UWAGA: Ze względu na płaską morfologię, dobrą adhezję i duże jądra komórkowe, komórki U2OS ułatwiają wykrywanie rekrutacji białek w miejscach mikroirradiacji, jednak w razie potrzeby można zastosować inne rodzaje komórek adherentnych. W momencie mikroirradiacji komórki powinny osiągnąć idealnie około 80% konfluencji, aby zwiększyć liczbę napromieniowanych komórek w każdym doświadczeniu. Bardzo wysoka konfluencja może prowadzić do zmian w cyklu komórkowym, co może zaburzyć specyficzne szlaki naprawy, takie jak rekombinacja homologiczna, która zachodzi podczas faz S i G2 cyklu komórkowego.9.
  2. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2następnie należy przeprowadzić przeczulić komórki za pomocą (krok 1.3) BrdU lub (krok 1.4) BBET (Hoechst 342).
    UWAGA: Aby obserwować rekrutację białka docelowego (POI) do uszkodzeń DNA na żywo, należy przeprowadzić transfekcję lub transdukcję plazmidowego DNA niosącego fuzję białka fluorescencyjnego z białkiem POI 24 godziny po wysianiu komórek. 24 godziny po transfekcji/transdukcji należy przeprowadzić przesensybilizację i mikroirradiancję komórek, aby monitorować rekrutację POI w miejscach uszkodzeń DNA w czasie rzeczywistym.
  3. Aby zwiększyć liczbę pęknięć dwuniciowych (DSB) powstałych w wyniku ekspozycji na laser o długości fali 405 nm, należy dodać 10 µM BrdU do pożywki na 24 h przed mikroirradiacją. Przed mikroirradiacją, za pomocą mikropipety, dwukrotnie wypłucz komórki pożywką bez czerwieni fenolowej, aby zapewnić maksymalną ekspozycję komórek na laser o długości fali 405 nm.
  4. Alternatywnie inkubować komórki przez 15 min z BBET w stężeniu 10 µg/mL w odpowiednim medium w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °CPo zakończeniu obróbki, przed mikroirradiacją, należy dwukrotnie przepłukać próbki pożywką bez czerwieni fenolowej.

2. Mikroirradiacja komórek

  1. Wybierz odpowiedni konfokalny mikroskop skaningowy.
    UWAGA: Przedstawione tutaj eksperymenty przeprowadzono na systemie mikroskopowym wyposażonym w linię lasera o mocy 50 mW i długości fali 405 nm oraz obiektyw olejowy 63X o aperturze numerycznej 1,4. W celu wygenerowania DSB komórki poddano mikroirradiacji przy 1-krotnym powiększeniu skanowania i rozdzielczości 1024 x 1024 piksele/pole (0.21 µm/pixeprzy powiększeniu 63X) oraz w trybie jednokierunkowym przy 8 µs/pixeZastosowana moc lasera wynosiła odpowiednio 25% dla komórek uwrażliwionych BBET oraz 80% dla komórek uwrażliwionych BrdU. Aby ułatwić użytkownikom konfigurację systemu, zmierzono moc lasera za obiektywem w prezentowanym układzie przy użyciu miernika mocy, zgodnie z instrukcją producenta. Pomiary te odpowiadają wartościom 2,6 mW dla komórek uwrażliwionych BBET oraz 7,0 mW dla komórek uwrażliwionych BrdU.
  2. Włącz mikroskop i komorę środowiskową.
    1. Ustawić komorę na 37 °C z 5% CO2 przed umieszczeniem próbek w inkubatorze na stoliku, aby uniknąć niepotrzebnego stresu komórek i zapewnić jednorodną kinetykę DDR we wszystkich doświadczeniach.
  3. Wybierz pole (pola) z równomiernie rozmieszczonymi komórkami, ustaw ostrość i zarejestruj ich pozycję, aby ułatwić akwizycję obrazów po przeprowadzeniu protokołu IF. Pozyskaj co najmniej jeden obraz, który będzie służył jako punkt odniesienia przed uszkodzeniem, w celu monitorowania kinetyki rekrutacji białek po mikroirradiacji.
    UWAGA: W celu ułatwienia lokalizacji komórek poddanych mikro-naświetlaniu w kolejnych etapach można również zastosować naczynia hodowlane z siatką.
    1. W przypadku eksperymentów IF z wykorzystaniem komórek znakowanych BBET, należy ustawić ostrość na komórkach, używając lasera o długości fali 405 nm przy najniższej mocy lasera wystarczającej do wizualizacji komórek, aby uniknąć niepożądanych uszkodzeń DNA.
      1. Należy unikać stosowania fluorescencji szerokopolowej do ustawiania ostrości w komórkach barwionych metodą BBET, ponieważ światło UV emitowane przez lampę wywoła uszkodzenia DNA w oświetlonych miejscach.
    2. W przypadku użycia komórek znakowanych BrdU należy ustawić ostrość, korzystając z obrazowania w kontraście interferencyjnym (DIC) lub fazowym, obserwując struktury wewnątrzjądrowe, takie jak jąderka.
    3. W przypadku użycia komórek wykazujących ekspresję białek docelowych (POI) znakowanych fluorescencyjnie, należy wybrać płaszczyznę ogniskową o reprezentatywnej intensywności fluorescencji.
      UWAGA: Należy unikać komórek wykazujących bardzo wysoki poziom ekspresji białka zainteresowania (POI), ponieważ silna nadekspresja może prowadzić do artefaktowej lokalizacji. Ponadto należy wybierać komórki, w których białko POI jest eksponowane na porównywalnych poziomach (w celu zminimalizowania różnic w poziomach ekspresji i rekrutacji POI zdecydowanie zaleca się wybór stabilnych klonów).
  4. Skonfiguruj mikroskop do etapu mikro-naświetlania, korzystając z modułu fluorescence-recovery after photobleaching (FRAP) systemu.
    UWAGA: Najważniejszymi parametrami, które należy wziąć pod uwagę podczas konfigurowania systemu mikroskopowego do eksperymentów z mikroirradiacją, są: moc wyjściowa lasera 405 nm oraz liczba iteracji (t.j. liczba razy, w których laser przejdzie nad tymi samymi współrzędnymi), liczba pikseli/pole (przy powiększeniu 63X i rozdzielczości 1 024 x 1 024, 1 piksel = 0.21 µm), oraz czasu przebywania wiązki na pojedynczym pikselu. Wszystkie te czynniki wpływają na ilość energii dostarczanej do komórek, a tym samym na ilość i rodzaj wywołanych uszkodzeń DNA (patrz Dyskusja w celu uzyskania dalszych informacji dotyczących optymalizacji dawki).
  5. Przy użyciu modułu FRAP systemu mikroskopowego przeprowadź mikroirradiację komórek.
    UWAGA: W większości systemów mikroirradiacja wielu komórek może być przeprowadzona w jednym polu w formie punktów lub linii/prostokątów (zazwyczaj 1-2 µm (szeroki). Podczas obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio po uszkodzeniu, należy ograniczyć mikroirradiację do niewielkiej liczby komórek w jednym polu widzenia, ponieważ czas potrzebny na mikroirradiację każdej komórki spowoduje opóźnienie indukcji DDR. Jest to szczególnie istotne podczas monitorowania białek, które są bardzo szybko rekrutowane do uszkodzeń DNA.
  6. Po mikroirradiacji należy umieścić wieloodworowe szkiełka lub płytki z powrotem w inkubatorze przy temperaturze 37 °C z dodatkiem 5% CO2 przez wymagany czas przed przetwarzaniem próbek do immunofluorescencji (IF) (rozdział 5) lub przejść bezpośrednio do obrazowania na żywo (rozdział 3).
    1. W pierwszym kroku należy utrwalić komórki w ciągu kilku minut i do kilku godzin po napromieniowaniu zgodnie z protokołem IF. W zależności od badanego białka (POI) kinetyka rekrutacji może być różna. Zazwyczaj białka wiążące się z chromatyną w obrębie DSB i SSB lokalizują się w miejscu uszkodzenia bardzo szybko i czasami są usuwane w ciągu 5 min. Niektóre czynniki, takie jak te gromadzące się na ssDNA, będą rekrutowane w późniejszych punktach czasowych, po uruchomieniu mechanizmu resekcji, i pozostaną tam przez wiele godzin (patrz Rysunek 1 oraz referencje4).

3. Obrazowanie na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie

  1. Wykonaj obrazowanie time-lapse mikroirradiowanych komórek. W przypadku białek rekrutowanych bardzo szybko do miejsc uszkodzeń idealny będzie odstęp kilku sekund na klatkę, natomiast w przypadku białek lokalizujących się w obszarze uszkodzenia później (np. czynników resekcji), akwizycję można przeprowadzać co 1–2 min aż do osiągnięcia plateau.
    UWAGA: Zminimalizuj moc lasera podczas akwizycji obrazu, aby w możliwie największym stopniu uniknąć wybielania oraz upewnić się, że rekrutacja białek w miejscach uszkodzeń nie osiągnie poziomu nasycenia, co uniemożliwiłoby kwantyfikację sygnału i późniejsze analizy (patrz analiza danych w sekcji 4). W prezentowanym systemie obrazowanie wykonano przy użyciu obiektywu olejowego 63X/1.4, czasie przebywania wiązki 8 µs/pixel, rozdzielczości 1 024 x 1 024, powiększeniu 1X oraz uśrednianiu wyników równym 2. Należy pamiętać, że parametry te mogą wymagać optymalizacji dla innych systemów i/lub różnych eksperymentów.
  2. Mikroirradiuj komórki w dodatkowych polach, aż do uzyskania pomiarów kinetyki dla 15-30 komórek. Powtórz eksperymenty co najmniej 3 razy w powtórzeniach biologicznych, aby zapewnić dokładność i powtarzalność kinetyki rekrutacji.
    UWAGA: Przy adaptacji tego protokołu do konkretnego systemu konfokalnego pomocne może być rozpoczęcie od monitorowania kinetyki rekrutacji znanego, znakowanego fluorescencyjnie czynnika utrzymania genomu (np. 53BP1-GFP, RPA32-GFP itp.). Wykorzystanie obrazowania na żywo do optymalizacji warunków mikroirradiacji pozwoli użytkownikowi na szybkie przetestowanie wielu parametrów.

4. Analiza kinetyki rekrutacji

  1. Zainstaluj wtyczkę Microirradiation Analysis10 w oprogramowaniu do analizy obrazów Fiji11.
  2. Otwórz pozyskane obrazy w programie Fiji. Wybierz „Analizator uszkodzeńz menu rozwijanego wtyczek w pakiecie Microirradiation Analysis. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) tła (zazwyczaj 3 x 3 µm), oraz nienaświetlane i naświetlone obszary zainteresowania (ROI) w każdej mikro-naświetlanej komórce.
    1. Należy stosować obszary zainteresowania (ROI) o tej samej wielkości, aby zminimalizować potencjalne błędy w pomiarach średniej intensywności sygnału. W przypadku uzyskanych obrazów należy uwzględnić co najmniej jedną klatkę sprzed naświetlania, która będzie służyć jako linia bazowa do monitorowania rekrutacji w miejscach mikro-naświetlanych.
    2. Po zebraniu wszystkich danych z ROI dla całej serii time-lapse, należy zapisać plik z wynikami utworzony przez wtyczkę jako plik csv (rozdzielany przecinkami) lub plik txt (rozdzielany tabulatorami). Plik ten zawiera pomiary średniej intensywności dla każdego punktu czasowego i każdego ROI (średnia intensywność tła, średnia intensywność obszaru nienaświetlanego oraz średnia intensywność obszaru naświetlanego).
      UWAGA: Wtyczka automatycznie odejmuje intensywność tła (Ib) z intensywności napromieniowanych ROI (Is) i nienaświetlanych obszarów zainteresowania (In). Oblicza również stosunek obu wartości (patrz. poniższa formuła) w celu skorygowania fotobleachingu (naświetlone/nienaświetlone).
      Schemat równania stosunku absorpcji dla analizy danych spektroskopowych z wykorzystaniem symboli natężenia.
      Wtyczka oblicza również normalizację pomiędzy pierwszym punktem czasowym (wartość ustawiona na 1) a wszystkimi pozostałymi punktami czasowymi dla każdego jądra komórkowego (stosunek względem pierwszego punktu czasowego). Dodatkowe informacje można znaleźć na stronie internetowej wtyczki.10.
  3. Przeprowadź analizę za pomocą wtyczki dla wszystkich komórek poddanych mikro-naświetlaniu (co najmniej 15–30 komórek) i przedstaw na wykresie średnie względne wzbogacenie w obszarach mikro-naświetlonych w funkcji czasu. Oblicz błędy standardowe średniej dla każdego punktu danych i nanieś je na wykres.
    1. Potwierdź różnice w kinetyce rekrutacji pomiędzy dwoma warunkami eksperymentalnymi, wykonując test t Studenta t-testy dla każdego punktu danych.

5. Protokół IF

  1. Przygotowanie roztworów do IF. W stożkowych probówkach polipropylenowych przygotować roztwór do pre- i post-ekstrakcji (lodowaty 1x PBS zawierający 0,25% Triton X-10), roztwór płuczący (1x PBS zawierający 0,05% Tween-20), roztwór blokujący (1x PBS zawierający 3% BSA i 0,05% Tween-20) oraz roztwór do fiksacji (Paraformaldehyd 3% + sacharoza 2% w PBS 1x).
    UWAGA: Dla jednego mikroslajdu z 8 dołkami wymagane są: 10 mL roztworu do pre-/post-ekstrakcji, 50 mL roztworu płuczącego, 10 mL roztworu blokującego i 5 mL roztworu do fiksacji.
    1. Przygotowanie roztworu do fiksacji.
      1. W dygestorium chemicznym zmieszać 40 mL wody dwukrotnie destylowanej (ddH2O) z 15 g paraformaldehydu i 30 µL 10 N NaOH w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 L.
      2. Zamknąć naczynie i podgrzewać do 65 °C na mieszadle magnetycznym z podgrzewaniem podczas mieszania, aby całkowicie rozpuścić paraformaldehyd.
      3. Za pomocą pipety o pojemności 25 mL dodać 50 mL 10X PBS, wymieszać i przefiltrować przez filtr 0,45 µm.
      4. Dodać 10 g sacharozy i dopełnić ddH2O do objętości 50 mL.
      5. Rozdzielić roztwór do stożkowych probówek 15 mL; przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    2. Przygotować roztwór do barwienia jąder poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) o stężeniu 1 mg/mL w stosunku 1:1 0 w 1x PBS.
  2. Za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć medium z dołków wielodołkowych slajdów mikroskopowych lub płytek i natychmiast przemyć 50 µL roztworu płuczącego do IF, wymieniając roztwór dwukrotnie bez zwłoki.
    UWAGA: Przedstawione tutaj dane IF uzyskano z komórek hodowanych na 8-dołkowych slajdach mikroskopowych, które płukano i inkubowano w 50 µL wszystkich roztworów. Objętości należy dostosować do rodzaju naczyń hodowlanych stosowanych przez badacza. Ponadto protokół IF należy przeprowadzać z najwyższą ostrożnością, ponieważ komórki mogą łatwo oddzielić się od szklanego lub polimerowego dna. Do wszystkich wymian roztworów należy używać mikropipety, aby zminimalizować utratę komórek.
  3. Inkubować na lodzie przez 5 min z 50 µL lodowatego roztworu do pre-/post-ekstrakcji IF i delikatnie wymieszać ręcznie przez 15–30 s, aby przeprowadzić etap pre-ekstrakcji, który usuwa większość białek cytoplazmatycznych i nukleoplazmatycznych i maksymalizuje sygnał z czynników związanych z chromatyną/DNA.
  4. Przemyć dwukrotnie 50 µL roztworu płuczącego do IF.
  5. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej w 50 µL roztworu do fiksacji IF. Alternatywnie można użyć gotowego roztworu paraformaldehydu (3–4%) do etapu fiksacji.
  6. Przemyć dwukrotnie 500 µL roztworu płuczącego do IF.
  7. Inkubować na lodzie przez 5 min w 500 µL lodowatego roztworu do pre-/post-ekstrakcji IF i delikatnie wymieszać slajd ręcznie, aby przeprowadzić etap permeabilizacji.
  8. Przemyć dwukrotnie 50 µL roztworu płuczącego do IF.
  9. Inkubować przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej z 500 µL roztworu blokującego do IF.
  10. Usunąć roztwór blokujący za pomocą mikropipety i inkubować przez noc w komorze wilgotnej w temperaturze 4 °C z 250 µL przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzanie inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi sekwencyjnie, aby uniknąć potencjalnych artefaktów kolokalizacji. Po przeprowadzeniu odpowiednich kontroli można inkubować przeciwciała pierwszorzędowe jednocześnie, aby przyspieszyć proces.
  11. Przemyć czterokrotnie po 5 min w 500 µL roztworu płuczącego do IF przy łagodnym wstrząsaniu (60 obr./min na rotatorze).
  12. Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C z 250 µL przeciwciał wtórnych rozcieńczonych w roztworze blokującym w komorze wilgotnej.
    UWAGA: Po dodaniu znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał wtórnych chronić próbki przed światłem.
  13. Przemyć czterokrotnie, po 5 min za każdym razem, w 500 µL roztworu płuczącego do IF przy łagodnym wstrząsaniu.
  14. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min w 50 µL 1x PBS zawierającego 1 µg/mL DAPI w celu zabarwienia jąder.
  15. Przemyć dwukrotnie 50 µL 1x PBS i pozostawić komórki w 50 µL roztworu 1x PBS do obrazowania.
  16. Za pomocą slajdów z siatką lub zarejestrowanych pozycji stolika odnaleźć komórki mikro-naświetlone, używając dobrze scharakteryzowanego markera uszkodzeń DNA (np. γ-H2A.X, RPA32, itp.).
  17. Wykonąć obrazowanie wielodołkowych slajdów hodowlanych lub płytek we wszystkich odpowiednich kanałach, stosując właściwe ustawienia w konfokalnym mikroskopie laserowym.
    UWAGA: W zaprezentowanym systemie obrazowanie wykonano z użyciem obiektywu olejowego 63X/1,4, przy czasie przebywania 8 µs/piksel, rozdzielczości 1 024 x 1 024, powiększeniu 1X i uśrednianiu równej 2. Należy pamiętać, że parametry te mogą wymagać optymalizacji dla innych systemów i/lub różnych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po mikroirradiacji komórki poddawane są regeneracji przez określony czas, zależnie od charakteru białek odpowiedzialnych za utrzymanie genomu1,12. Pęknięcia dwuniciowe (DSB) są przetwarzane przez nukleazy, najintensywniej w fazach S i G2 cyklu komórkowego, co prowadzi do powstania ograniczonego obszaru ssDNA, który jest szybko pokrywany przez RPA i inne czynniki utrzymania genomu9. Ten region ssDNA jest oto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stosując metody opisane powyżej, mikronaświetlanie laserowe 405 nm komórek wstępnie uczulonych za pomocą BBET lub BrdU pozwala na miejscowe generowanie zmian DNA, w tym DSB, w jądrach przylegających komórek ludzkich. Kinetyka DDR w tych DSB jest podobna do tej generowanej innymi metodami w komórkach eukariotycznych 9,18,19. Resekcja DSB w miejscach mikronapromieniania prowadzi do wytworzenia ssDNA, które można śledzić za pomocą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych [grant Discovery 5026 dla A.M.] oraz przez Stypendium Następnego Pokolenia Naukowców od Towarzystwa Badań nad Rakiem [21531 do A.M]. Dziękujemy Jean-François Lucier za zapewnienie doskonałej kontroli jakości skryptów Fiji Python i doradztwo w zakresie analizy statystycznej. Dziękujemy dr Stephanie A. Yazinski za przepis na roztwór do utrwalania IF. Dziękujemy Paulowi-Ludovicowi Karsentiemu za pomoc w pomiarach mocy lasera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rezonansowy skaningowy mikroskop konfokalny Olympus FLUOVIEW FV3000Oprogramowanie Olympus
FluoView FV3000 (wersja 2.1)Laserowe
405 nm
cel zanurzenia
: 8-dołkowe szkiełka hodowlane na szkle nakrywkowym (X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS kostniakomięsak ludzka linia komórkowaATCCHTB-96Stabilne linie komórkowe 
4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)ThermoFisherD1306Uwaga toksyczny
5-bromo-2′-deoksyurydyna ( BrdU) Sigma-Aldrich59-14-3
ParaformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4Uwaga toksyczny
Bisbenzimid H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)ThermoFisherBP1600-100
Trypsyna EDTA 0,1% ThermoFisher15400-054
Triton X-100 BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
Sacharoza Odczynnik doSUC507
JetPRIME Polyplus114-07
ProLong Diamond Antifade mocowanie z DAPI ThermoFisherP36962
DMEM 1X, + czerwień fenolowaŻubr 319-005-CL
DMEM 1X, - czerwień fenolowaŻubr319-051-CL
Surowica bydlęca płodu (FBS)Żubry 080-150
Mysie przeciwciało anty-RPA32Abcamab21751:500 dla
anty-γ-H2A IF Rabbit. Sygnalizacja komórkowa przeciwciała X 9718S1:500 dla
przeciwciała IF Rabbit Anti-53BP1 4937S1:500 dla
przeciwciała anty-PRP19 królikaIF Abcam ab276921:500 dla IF
Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 647Sygnalizacja komórkowa 4414S1:250 dla
IF Goat anty-myszy  IgG Alexa Fluor 488 Sygnalizacja komórkowa 4408S1:250 do
analizy obrazu IF Fidżi oprogramowanie typu open source https://fiji.sc
1918-K Miernik mocy  z czujnikiem 918D-SL-0D3Newport
źródło promieniowania koherentnego Olympus Inkubator mikroskopowy AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1 60X /1.4 Obiektyw Olympus Oil transfekcji BioShop sygnalizacji komórkowej

Bibliografia

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Odpowiedź na uszkodzenia DNAmikroskopia konfokalnahistona H2AXbiałko replikacyjne Aanaliza w programie ImageJmoduł FRAPprotokół immunofluorescencji
Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.