W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aneuploidia embrionalna jest główną genetyczną przyczyną niepłodności u ludzi. Większość z tych zdarzeń ma swój początek podczas mejozy samic i chociaż jest pozytywnie skorelowana z wiekiem matki, sam wiek nie zawsze jest predyktorem ryzyka powstania zarodka aneuploidalnego. W związku z tym warianty genów mogą odpowiadać za nieprawidłową segregację chromosomów podczas oogenezy. Biorąc pod uwagę, że dostęp do ludzkich oocytów jest ograniczony do celów badawczych, opracowano serię testów w celu zbadania funkcji ludzkich genów podczas mejozy I przy użyciu oocytów myszy. Po pierwsze, informacyjny RNA (mRNA) genu i wariantu genu będącego przedmiotem zainteresowania jest mikrowstrzykiwany do oocytów myszy zatrzymanych w profazie I. Po pozostawieniu czasu na ekspresję, oocyty są synchronicznie uwalniane do dojrzewania mejotycznego, aby zakończyć mejozę I. Znakując mRNA sekwencją fluorescencyjnego reportera, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (Gfp), oprócz zmian fenotypowych można ocenić lokalizację ludzkiego białka. Na przykład zysk lub utratę funkcji można zbadać, ustanawiając warunki eksperymentalne, które stanowią wyzwanie dla produktu genu w celu naprawienia błędów mejotycznych. Chociaż system ten jest korzystny w badaniu funkcji białek ludzkich podczas oogenezy, należy podjąć odpowiednią interpretację wyników, biorąc pod uwagę, że ekspresja białka nie jest na poziomie endogennym i, o ile nie jest kontrolowana (tj. Nie jest znokautowana lub zmniejszona), mysie homologi są również obecne w systemie.
Wprowadzenie
Niepłodność to stan, który dotyka 10-15% populacji ludzkiej w wieku rozrodczym 1, z czego prawie połowa szuka pomocy medycznej 2. Chociaż etiologia niepłodności jest zróżnicowana i w wielu przypadkach wieloczynnikowa, najczęstszą nieprawidłowością genetyczną u ludzi jest aneuploidia embrionalna 3. Aneuploidia jest definiowana jako odchylenie (zysk lub utrata) prawidłowej liczby chromosomów w komórce. Zjawisko aneuploidii w ludzkich embrionach jest powszechne i nasila się wraz z zaawansowanym wiekiem matki 4,5. Cztery randomizowane badania kliniczne wykazały korzyści płynące z wyboru tylko chromosomalnie prawidłowych (euploidalnych) zarodków do transferu macicy, ponieważ strategia ta skutkowała zwiększonym wskaźnikiem implantacji, niższym wskaźnikiem poronień i krótszym czasem zajścia w ciążę 6,7,8,9. Dlatego zrozumienie etiologii ludzkiej aneuploidii może mieć ważne implikacje w wspomaganym rozrodzie.
Chociaż preimplantacyjne testy genetyczne na aneuploidie są korzystne w leczeniu niepłodności, nadal brakuje dokładnego zrozumienia, skąd biorą się aneuploidie. Powszechnie przyjmuje się, że istnieje pozytywna korelacja aneuploidii mejotycznych (powstałych podczas produkcji gamet) a wiekiem matki, jednak niektóre kobiety wykazują wskaźniki aneuploidii embrionalnej, które odbiegają od średniego wskaźnika dla ich wieku 4. Przypadki te sugerują, że sam wiek nie zawsze jest predyktorem ryzyka powstania aneuploidalnego zarodka. Inne czynniki mogą odgrywać rolę w zwiększaniu ryzyka aneuploidii zarodkowej, takie jak warianty genów.
Kluczowym aspektem badania potencjalnego udziału wariantu genu w aneuploidii podczas mejozy oocytów jest zaprojektowanie systemu do szybkiej oceny funkcji genu mejotycznego. Ze względu na ograniczenia etyczne i ograniczony dostęp, przeprowadzanie tych eksperymentów na ludzkich komórkach jajowych jest niepraktyczne. Problemy te można obejść za pomocą mysich oocytów, a tutaj opisano serię testów oceniających funkcję ludzkich genów podczas mejozy. Poprzez mikrowstrzyknięcie informacyjnego RNA (mRNA) kodującego wariant genu będącego przedmiotem zainteresowania, lokalizacja ludzkiego białka w jaju myszy może być wizualizowana i wykorzystana do określenia, czy ektopowa ekspresja dzikiego i zmutowanego białka ludzkiego powoduje jakiekolwiek zmiany fenotypowe, które mogą prowadzić do aneuploidii. Fenotypy te obejmują wzrost mikrotubul, które przyłączają się do niewłaściwego dla siostry kinetochoru oraz niezdolność do wspierania wyrównania chromosomów w metafazie mejozy I. Co ważne, protokół ten może być wykorzystany do zbadania zarówno przyrostu, jak i utraty wariantów genetycznych funkcji poprzez ustanowienie określonych warunków eksperymentalnych w celu zakwestionowania kluczowych zdarzeń w mejozie oocytów, takich jak budowa wrzeciona i wyrównanie chromosomów 10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Klonowanie molekularne
- Uzyskaj pełnowymiarową sekwencję kodującą interesującego genu i wektor transkrypcji plazmidowej in vitro (pIVT)11.
UWAGA: Pełnowymiarowe klony cDNA są dostępne na rynku od różnych dostawców lub mogą być generowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Zasoby online National Center for Biotechnology Information (NCBI) zawierają sekwencje transkryptów dla genów z baz danych Nucleotide i Expressed sequence tagged (EST). W celu ułatwienia wizualizacji białek i analizy poziomów ekspresji, w strategii klonowania może być pożądana fuzja z białkiem zielonej fluorescencji (Gfp) lub innym odpowiednim znacznikiem fluorescencyjnym. - Korzystając ze zweryfikowanej strategii klonowania, wprowadź sekwencję kodującą gen będący przedmiotem zainteresowania do wielokrotnego regionu klonowania pIVT. Szczegółowy opis klonowania molekularnego i wymaganych kroków został wcześniej opisany 12.
UWAGA: Jeśli ma zostać wygenerowany produkt fuzji genów, należy upewnić się, że klonowanie znajduje się w odpowiedniej ramce odczytu. - Sekwencjonuj konstrukt za pomocą starterów Globin, aby zapewnić prawidłową insercję genu, prawidłową fuzję w ramie i to, że nie powstały żadne mutacje punktowe wywołane polimerazą.
UWAGA: Jeśli sprzęt do sekwencjonowania DNA Sanger nie jest dostępny, wiele firm oferuje tanie opcje sekwencjonowania DNA. - Mutagenizacja DNA w przypadku generowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) lub insercji/delecji (INDELS). Mutageneza DNA została opisana w krokach 1.5-1.7 poniżej. W przypadku konstrukcji typu dzikiego przejdź do kroku linearyzacji 1.7.
- Zaprojektuj startery mutagenezy i zakończ reakcję mutagenezy PCR, aby wygenerować zmutowany konstrukt zgodnie z protokołem producenta. Mutageneza ukierunkowana na miejsce za pośrednictwem PCR została wcześniej opisana 13. Ponadto wiele firm oferuje zestawy mutagenezy kierowanej do witryny, które zawierają protokoły.
- Przekształć zmutagenizowane DNA w bakteryjnego gospodarza. Wyizoluj i oczyść plazmid.
UWAGA: Wiele firm produkuje zestawy, które można wykorzystać do łatwej izolacji i oczyszczania plazmidowego DNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta. W przypadku stosowania szczepu bakterii Gram-ujemnego, takiego jak E. coli, zaleca się użycie zestawu usuwającego endotoksyny. - Sekwencjonuj wyizolowane DNA z transformantów bakteryjnych przy użyciu standardowego sekwencjonowania DNA Sangera, aby potwierdzić wprowadzenie pożądanego SNP lub INDEL.
- Linearyzacja produktów końcowych za pomocą trawienia oczyszczonego DNA metodą pojedynczego enzymu restrykcyjnego.
UWAGA: Wektor pIVT zawiera wiele miejsc cięcia pojedynczego enzymu wymienionych na mapie plazmidu na Addgene 14. - Upewnij się, że produkt jest liniowy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Metodologia elektroforezy w żelu agarozowym została wcześniej zdefiniowana 14.
UWAGA: Na wszystkich pozostałych etapach należy używać końcówek do pipet z barierą (filtrem) i materiałów wolnych od RNaz, aby zapewnić produkcję stabilnego, wysokiej jakości RNA. - Oczyść strawiony produkt za pomocą zatwierdzonego protokołu lub zestawu do oczyszczania DNA i eluuj w 30 μl wody wolnej od RNazy/DNaz.
UWAGA: Zestawy oparte na kolumnach wirowych z matrycą krzemionkową są zalecane do wysokiej jakości, oczyszczonego DNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta. - Transkrypcja DNA in vitro przy użyciu polimerazy T7 zgodnie z protokołem producenta.
- Oczyść i eluuj RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz / DNaz za pomocą zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych na bazie kolumny spinowej na matrycy krzemionkowej zgodnie z protokołem producenta.
- Wykonaj denaturację elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu formaldehydu, aby potwierdzić ostateczny rozmiar produktu RNA. Zobacz kroki 1.13-1.22 poniżej 14. (Rysunek 1).
- Przygotować żel, podgrzewając 1 g agarozy w 72 ml wody do rozpuszczenia, a następnie schłodzić do temperatury 60 °C.
- Przygotuj bufor do pracy 10X MOPS, dodając 0.4 M MOPS (pH 7.0), 0.1 M octanu sodu i 0.01 M EDTA.
- Dodaj 10 ml buforu do pracy 10X MOPS i 18 ml 37% formaldehydu (12,3 M) do schłodzonego roztworu agarozy.
- Żel należy rozlać na kasę, wlewając roztwór agarozy do pojemnika tworzącego żel. Użyj grzebienia wystarczająco dużego, aby pomieścić 10 μl. Gdy żel stwardnieje i stanie się twardy w dotyku, delikatnie wyjmij grzebień.
- Zmontuj żel w zbiorniku do elektroforezy i dodaj wystarczającą ilość bufora do pracy 1X MOPS, upewniając się, że żel jest całkowicie pokryty.
- Przygotuj próbkę RNA, dodając 1 μg RNA do 0,5 razy większej objętości barwnika ładującego zawierającego formaldehyd.
- Dodać bromek etydyny do roztworu RNA w stężeniu 10 μg/ml.
- Denaturacja roztworu próbki RNA w temperaturze 70 °C przez 5 min.
- Używając sterylnych końcówek filtrujących o pojemności 10 μl, załadować 5 μl markera masy cząsteczkowej i 5 μl próbki (próbek) RNA do oddzielnych dołków żelu i elektroforezy pod napięciem 5 V/cm, aż barwnik przeniesie się na co najmniej dwie trzecie długości żelu.
- Wizualizuj RNA w żelu na oświetlaczu UV trans. Upewnij się, że RNA ma odpowiednią wielkość, porównując go z markerem masy cząsteczkowej.
- Aby zmierzyć stężenie i czystość RNA, przenieś 1,2 μl oczyszczonego RNA za pomocą sterylnych końcówek filtrujących 10 μl na spektrofotometr UV.
Należy pamiętać, że wysokiej jakości RNA powinno mieć współczynniki absorbancji odpowiednio A260/280 (1,8-2,2) i 260/230 (>1,7). - Używając końcówek filtrujących o pojemności 10 μl, podwielokrotnić pozostały oczyszczony RNA do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 μl (3-5 μl/probówkę). Probówki należy przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do mikroiniekcji.
UWAGA: Końcowe stężenie wtrysku wynoszące 500 ng/μl jest optymalnym punktem wyjścia. Zaleca się rozcieńczenie RNA w stosunku 1:2 w H20 wolnym od RNaz przed mikroiniekcją w celu zmniejszenia lepkości RNA w pipecie do mikroiniekcji.
2. Test przyłączania kinetochoru i mikrotubul
- Podziel oocyty na równe grupy do mikroiniekcji.
UWAGA: Pobieranie, transfer, mikroiniekcja i dojrzewanie mejotyczne oocytów zostały szczegółowo opisane w JoVE wcześniej 15. - Mikrowstrzyknąć jednej grupie eksperymentalne mRNA, a drugiej grupie (grupom) kontrolę WT i mRNA PBS lub Gfp.
UWAGA: 500 ng/μL to zalecane stężenie do wstrzykiwań, które należy rozpocząć od 10. Do kontrolowania ilości wstrzykiwań można użyć pikowtryskiwacza. Zalecana jest objętość wstrzyknięcia wynosząca 5-10 pL 15. - Za pomocą ręcznego lub ustnego aparatu do pipetowania, w którym szklany otwór pipety jest nieco większy niż średnica oocytu (100-150 μm), przenieś oocyty do 100 μl kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrynnonu na szalce Petriego pokrytej olejem mineralnym o jakości zarodka i inkubuj oocyty przez 7 godzin w temperaturze 37 °C w 5% C02, aby umożliwić wystarczające dojrzewanie do metafazy mejozy I (Met I) 15.
- Po inkubacji, używając tego samego pipety, co powyżej, przenieść oocyty do naczynia do hodowli narządów w basenie centralnym zawierającego 700 μl wstępnie schłodzonej pożywki do pobierania minimalnej ilości pożywki (MEM) w studzience środkowej i 500 μl H20 w pierścieniu zewnętrznym i umieścić naczynie na lodzie przez 7 min.
UWAGA: Zaleca się wstępne schłodzenie pożywek MEM i wyśrodkowania narządów w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut przed leczeniem oocytów. - Utrwalić oocyty, przenosząc je za pomocą pipety do studzienki z przezroczystej szklanej płytki punktowej zawierającej 400 μL 2% paraformaldehydu w 1X PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Używając tego samego pipety, przenieś oocyty do innego dołka na płytce punktowej zawierającej 400 μl roztworu blokującego (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do przetworzenia w celu barwienia immunologicznego.
UWAGA: Do przechowywania oocytów w temperaturze 4 °C należy przykryć szklaną płytkę punktową parafilmem, aby zapobiec parowaniu. - Za pomocą tej samej pipety przenieś oocyty do nowego dołka na płytce punktowej zawierającej 400 μl roztworu przepuszczalnego (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Szybko przenieś oocyty przez trzy krople 400 μl roztworu blokującego, aby usunąć resztki detergentu.
UWAGA: 9-dołkowa przezroczysta szklana płytka punktowa dobrze sprawdza się w przenoszeniu grup przez wiele zabiegów na jednym naczyniu (kroki 2.4-2.5). - Pozostałe procedury immunocytochemiczne należy wykonać w wilgotnej komorze, chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej. Użyj średniej wielkości plastikowego pojemnika wyłożonego wilgotnymi ręcznikami papierowymi i przykryj folią aluminiową.
- Za pomocą pipety przenieś oocyty do 30 μl roztworu blokującego na pokrywie 96-dołkowej płytki i umieść w wilgotnej komorze na 10 minut.
UWAGA: Krople umieszcza się w okrągłych wgłębieniach na płycie. - W celu oznaczenia centromerów i wrzeciona, za pomocą pipety, przenieść oocyty do 30 μl roztworu blokującego zawierającego antygen antycentromerowy (ACA, Crest) (1:30) i antyacetylowaną tubulinę (1:1000) i inkubować przez co najmniej 1 godzinę.
- Przepłucz oocyty, przenosząc przez trzy krople po 30 μl roztworu blokującego przez 10 minut każda.
- Za pomocą pipety przenieść oocyty do 30 μl kropli roztworu blokującego zawierającego przeciwciała drugorzędowe uzupełniające przeciwciała użyte powyżej (anty-ludzkie IgG 1:200, anty-mysie IgG 1:200) i inkubować przez 1 godzinę.
- Powtórz 3, 10-minutowe etapy płukania w 30 μl roztworu blokującego, jak opisano w kroku 2.11.
- Przenieść oocyty za pomocą pipety do 3-5 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI (5,9 μg/μL) na szklanym szkiełku mikroskopowym.
- Umieść 4 małe krople (wielkości główki szpilki) wazeliny na rogach szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zgnieceniu oocytów.
- Delikatnie ułóż szkiełko nakrywkowe wazeliną stroną do dołu na szkiełku.
- Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
- Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem, do czasu obróbki za pomocą mikroskopii konfokalnej.
UWAGA: Upewnij się, że współczynnik załamania światła medium montażowego i szkiełka nakrywkowego jest zgodny z używanymi obiektywami mikroskopu. Zalecane materiały montażowe zostały wcześniej opisane 15. - Obrazuj oocyty za pomocą obiektywu 40-63x pod mikroskopem konfokalnym, rejestrując małe kroki (≤ 1 μm) w płaszczyźnie z, zoptymalizowane pod kątem celu roboczego, i zobrazuj cały obszar wrzeciona metafazy.
UWAGA: Upewnij się, że obrazowałeś wszystkie 3 kanały w oparciu o specyficzne przeciwciała drugorzędowe użyte w kroku 2.11. Uśrednianie obrazu ≥ 4 i zoom 3 są idealne dla uzyskania odpowiedniej rozdzielczości. Wielkość kroku 1 μm zapewnia wyraźną wizualizację mikrotubul i kinetochorów w oocytach myszy. Procedura przechwytywania obrazu będzie się różnić w zależności od mikroskopu. Zapoznaj się z instrukcją obsługi konfokalnego producenta, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji ustawień mikroskopu. - Zidentyfikuj stan przyczepu kinetochoru-mikrotubuli za pomocą oprogramowania do obrazowania, wykonując czynności 2.21-2.23 poniżej.
UWAGA: Poniższe kroki opisują tę procedurę przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do pobrania Image J (NIH), jednak można użyć alternatywnego oprogramowania do obrazowania. Typy stanów załączników zostały wcześniej zdefiniowane 16 . - Otwórz obraz, przeciągając plik na pasek narzędzi obrazu J.
- W otwartej serii Z uwidocznij wszystkie kanały (DNA, kinetochor i wrzeciono), klikając "scal kanały", dostępne w menu rozwijanym "Obraz", pod zakładką podrzędną "kolor".
- Za pomocą przełącznika u dołu obrazu przejdź przez każdy plasterek z i określ przyczepienie mikrotubuli kinetochoru. Szczegółowe opisy załączników zostały wcześniej opisane 16
3. Test wyzwania dopasowania chromosomów
- Używając pipety opisanej w kroku 2.3, przenieś oocyty do 100 μl kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu pod olejem i inkubuj oocyty przez 7 godzin, aby umożliwić wystarczające dojrzewanie do metafazy mejozy I (Met I), jak opisano wcześniej w kroku 2.3 17.
UWAGA: Procedury pobierania oocytów, mikroiniekcji i dojrzewania zostały opisane wcześniej 15. Zapoznaj się z protokołem testu przyłączeniowego w krokach 2.1-2.2 w celu uzyskania informacji o kontrolach i stężeniach mikroiniekcji RNA. - Używając tego samego pipety, przenieść oocyty do naczynia do hodowli narządów z centralną studzienką zawierającą 700 μl pożywki hodowlanej zawierającej monoastrol [100 μM] w studzience środkowej i 400 μl H20 w otaczającym pierścieniu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Wypłukać monoastrol, przenosząc oocyty, za pomocą aparatu do pipetowania, jak powyżej, przez trzy krople 100 μl pożywki hodowlanej CZB, a następnie przenieść oocyty do nowego naczynia do hodowli narządów w basenie centralnym zawierającego 700 μl pożywki hodowlanej + MG132 [5 μM] przez 3 godziny w pierścieniu środkowym. Dodać 400 μL H20 do pierścienia zewnętrznego.
- Utrwalić oocyty, przenosząc je za pomocą pipety do studzienki z przezroczystą szklaną płytką punktową zawierającą 400 μl 2% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Po utrwaleniu przenieść oocyty, za pomocą pipety, do nowego dołka z przezroczystej szklanej płytki punktowej zawierającej 400 μl roztworu blokującego i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia w celu barwienia immunologicznego.
UWAGA: Do przechowywania oocytów w temperaturze 4 °C należy przykryć szklaną płytkę punktową parafilmem, aby zapobiec parowaniu. - Permeabilizacja i znakowanie oocytów za pomocą immunocytochemii, jak opisano w krokach 2.6-2.16.
- Obrazuj oocyty za pomocą obiektywu 40-63x pod mikroskopem konfokalnym, rejestrując kroki <1 μm w płaszczyźnie z, upewniając się, że obrazujesz cały obszar wrzeciona metafazy.
- Aby określić stan wyrównania chromosomów, otwórz pliki obrazów za pomocą oprogramowania do obrazowania.
UWAGA: Poniższe kroki opisują tę procedurę przy użyciu bezpłatnego oprogramowania do pobrania Image J (NIH), jednak można użyć alternatywnego oprogramowania do obrazowania. - Przeciągnij obraz do panelu sterowania obrazu J.
- W otwartej serii Z użyj narzędzia punktowego (dostępnego po kliknięciu ikony narzędzia punktu na pasku sterowania Obraz J), aby zaznaczyć punkty na końcu każdego bieguna wrzeciona w odpowiednim przekroju z, umieszczając narzędzie nad biegunem wrzeciona na obrazie i klikając obraz. Dodaj te punkty do menedżera obszaru zainteresowania (ROI), naciskając Command+t na klawiaturze.
- Określ konkretne współrzędne dla każdej z pozycji ustawionych w kroku 3.10, podświetlając określony punkt w menedżerze zwrotu z inwestycji i klikając przycisk pomiaru. Spowoduje to wyświetlenie tabeli wyników zawierającej współrzędne x i y dla każdego punktu. Będą to odpowiednio punkty X1, Y1 i X1, Y2.
- Następnie określ rzeczywistą współrzędną Z. Odbywa się to poprzez pomnożenie numeru wycinka konkretnego plasterka z w stosie z, w którym zidentyfikowano biegun wrzeciona (tj. plaster #2 z 6), w którym znajduje się każdy pojedynczy punkt, przez grubość stosu (tj. 1 μm) (przykład: plaster 2 x 1 μm = 2). Będą to odpowiednio punkty Z1 i Z2.
- Określ długość wrzeciona za pomocą równania twierdzenia Pitagorasa (a2 + b2 = c2) używając wcześniej zdefiniowanych współrzędnych x, y i z z kroków 3.11-3.13. Dla każdego wrzeciona końcowa długość jest równa:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Określ strefę środkową wrzeciona. Oblicza się to jako połowę długości wrzeciona. Korzystając z narzędzia linii na obrazie J, klikając ikonę linii na pasku narzędzi obrazu J, narysuj linię biegnącą od jednego bieguna wrzeciona do strefy środkowej wrzeciona. Długość zostanie wyświetlona na pasku narzędzi Obraz J.
- Określ stan wyrównania chromosomów, oceniając odległość chromosomu od strefy środkowej wrzeciona za pomocą narzędzia do pomiaru linii. Korzystając z narzędzia linii dostępnego po kliknięciu ikony linii na pasku narzędzi Obraz J, narysuj linię od strefy środkowej wrzeciona do chromosomu. Długość zostanie wyświetlona na pasku narzędzi Obraz J. Chromosomy większe niż 4 μm od strefy środkowej wrzeciona są uważane za niewyrównane 18.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po transkrypcji in vitro wysokiej jakości RNA powinno charakteryzować się stosunkiem A260/A280 w zakresie (1,8-2,2) oraz stosunkiem A260/A230 ≥1,7 przy pomiarze spektrofotometrem. Zdjęcie na Rysunku 1 przedstawia migrację RNA otrzymanego in vitro w denaturującym żelu agarozowym po elektroforezie. Prążek o rozmazanym wzorcu lub próbka zawierająca prążki o różnych rozmiarach mogą wskazywać na zanieczyszczenie lub degradację próbki. Alternatywn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na szybką i coraz częstszą identyfikację ludzkich wariantów genetycznych związanych z chorobami, konieczne jest ustanowienie systemów oceny ich znaczenia biologicznego. Zrozumienie funkcji białek w mejozie człowieka stanowi szczególne wyzwanie, ponieważ ludzkie oocyty są cenne i rzadkie, a ludzkie plemniki nie są podatne na manipulacje genetyczne. Oocyty myszy są systemem modelowym ssaków cennym dla oceny funkcji ludzkich genów mejotycznych 10,23. Mode...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant badawczy z American Society for Reproductive Medicine oraz z Charles and Johanna Busch Memorial Fund w Rutgers, The State University of NJ dla K.S. A.L.N. był wspierany przez grant od N.I.H. (F31 HD0989597).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,2 ml probówka Seal-Rite do PCR | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb Drabinka DNA | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 pz Drabinka DNA | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X Barwnik ładujący DNA | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-dołkowa szklana płytka punktowa | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agaroza | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumina z surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 sprzężona anty-mysia IgG | Thermo Scientific | A21050 | :200 rozcieńczenie |
| Alexa-fluor-633 sprzężone anty-ludzkie IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 rozcieńczenie |
| Ampicylina | VWR | AA0356 | |
| Stół antywibracyjny | Technical Manufacturing Corp | dowolny standardowy model | |
| Antyacetylowana tubulina przeciwciało | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 rozpylenie |
| Przeciwciała antycentromerowe (CREST) | Przeciwciała Włączone | 15-234 | 1:30 rozcieńczenie |
| Bariera (filtr) Końcówki do pipet | Thermo Scientific | AM12635 | Upewnij się, że są kompatybilne z pipetorami Twojej marki. Są one kompatybilne z pipetorami marki Eppendorf. |
| BD Difco Dehydrated Culture Podłoże: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Podłoża: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Rurka kapilarna | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well naczynie do hodowli organów | VWR | 25381-141 | |
| Zbiornik | Do inkubatora | ||
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | dowolny model standardowy | |
| Wirówka (ze zdolnością chłodzenia) | Thomas Scientific | dowolny model standardowy | |
| Szkło nakrywkowe 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Grubość Thomas Scientific | 6663-F10 | będzie się różnić w zależności od mikroskopu |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Cyfrowa sucha kąpiel | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy Wysoki enzym klonowania wierności | Agilent | 600400 | Do klonowania DNA |
| Można stosować enzymy do linearyzacji pIVT | New England Biolabs | NdeI lub KasI | |
| Bromek etydyny | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego | ||
| Formaldehyd (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyd RNA Barwnik ładujący Ambion | 8552 | ||
| Matowe szkiełka mikroskopowe (nienaładowane) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Pełne klony | Można uzyskać od dowolnego dostawcy, który dostarcza otwarty odczyt klony ramek | ||
| Aparat do elektroforezy żelowej | Bio-Rad | dowolny model standardowy | |
| Szklane pipety Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer do pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Można kupić w dowolnej firmie, która generuje niestandardowe oligonucelotydy | ||
| Globin Reverse Primer dla pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Można kupić w dowolnej firmie, która generuje niestandardowe oligonucelotydy | ||
| Pipety do przechowywania | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Można używać Tupperware | ||
| Illustra Ready-To-Go Koraliki RT-PCR | |||
| dowolny | standardowy model z technologią CO2 i płaszczem wodnym | ||
| Probówka wirówkowa o niskiej przyczepności 0,5 ml | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | Oprogramowanie do analizy sekwencji | MacVector | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Markery RNA Millenium-Formaldehyd | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Ponowne zawieszenie w DMSO przy 2,5 mM |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5310 | Używany tylko testowany na zarodkach, sterylnie filtrowany |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Ponowne zawieszenie w DMSO przy 100 mM |
| Ustnik | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 | do stołu antywibracyjnego | ||
| Lakier do paznokci; Przezroczysty | Można użyć dowolnego przezroczystego lakieru do paznokci | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektrofotometr | Thermo Scientific | dowolny standardowy model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Bufor do biegania | Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Bufor do biegania | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Naczynie do hodowli organów 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyd | Polysciences, Inc. | ||
| Termocykler do PCR | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| szalka Petriego 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| szalka Petriego 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| szalka Petriego 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picowtryskiwacz | XenoWorks Digital | dowolny model standardowy | |
| Ściągacz do pipet | Flaming-Brown Ściągacz do mikropipet | Model P-1000 | |
| plazmid pIVT | AddGene | 32374 | Pusty wektor odpowiedni do ekspresji oocytów. |
| Surowica klaczy w ciąży Gonadotropina | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | oczyszczanie do 20 uL plazmidowego DNA |
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| Zestaw mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Quikchange II | Agilent | 200523 | zestaw mutagenezy do wstawiania i usuwania |
| Quikchange lightning wielomiejscowy zestaw mutagenezy ukierunkowanej | Agilent | 210512 | zestaw mutagenezy do zmian w jednym miejscu |
| Nożyczki (cienki punkt) | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 14393 | |
| Nożyczki (średni punkt) | Narzędzia do nauki precyzyjnej | WP114225 | |
| Probówka do mikrowirówek Seal-Rite 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Podgrzewacz | dowolny standardowy model | ||
| Spektrofotometr (Nanodrop) | Mikroskop | ||
| DOWOLNY STANDARDOWY MODEL | |||
| zestaw do transkrypcji RNA z czapeczką | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | 274348 | Sigma-Aldrich | |
| (Fine point - Rozmiar 5) | Narzędzia do nauki | precyzyjnej SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Woda destylowana | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Bromek etydyny 10mg/ml | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Medium montażowe | Vector Laboratories | H-1000 |
Bibliografia
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
