W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aneuploidia embrionalna jest główną genetyczną przyczyną niepłodności u ludzi. Większość z tych zdarzeń ma swój początek podczas mejozy samic i chociaż jest pozytywnie skorelowana z wiekiem matki, sam wiek nie zawsze jest predyktorem ryzyka powstania zarodka aneuploidalnego. W związku z tym warianty genów mogą odpowiadać za nieprawidłową segregację chromosomów podczas oogenezy. Biorąc pod uwagę, że dostęp do ludzkich oocytów jest ograniczony do celów badawczych, opracowano serię testów w celu zbadania funkcji ludzkich genów podczas mejozy I przy użyciu oocytów myszy. Po pierwsze, informacyjny RNA (mRNA) genu i wariantu genu będącego przedmiotem zainteresowania jest mikrowstrzykiwany do oocytów myszy zatrzymanych w profazie I. Po pozostawieniu czasu na ekspresję, oocyty są synchronicznie uwalniane do dojrzewania mejotycznego, aby zakończyć mejozę I. Znakując mRNA sekwencją fluorescencyjnego reportera, takiego jak zielone białko fluorescencyjne (Gfp), oprócz zmian fenotypowych można ocenić lokalizację ludzkiego białka. Na przykład zysk lub utratę funkcji można zbadać, ustanawiając warunki eksperymentalne, które stanowią wyzwanie dla produktu genu w celu naprawienia błędów mejotycznych. Chociaż system ten jest korzystny w badaniu funkcji białek ludzkich podczas oogenezy, należy podjąć odpowiednią interpretację wyników, biorąc pod uwagę, że ekspresja białka nie jest na poziomie endogennym i, o ile nie jest kontrolowana (tj. Nie jest znokautowana lub zmniejszona), mysie homologi są również obecne w systemie.
Wprowadzenie
Niepłodność to stan, który dotyka 10-15% populacji ludzkiej w wieku rozrodczym 1, z czego prawie połowa szuka pomocy medycznej 2. Chociaż etiologia niepłodności jest zróżnicowana i w wielu przypadkach wieloczynnikowa, najczęstszą nieprawidłowością genetyczną u ludzi jest aneuploidia embrionalna 3. Aneuploidia jest definiowana jako odchylenie (zysk lub utrata) prawidłowej liczby chromosomów w komórce. Zjawisko aneuploidii w ludzkich embrionach jest powszechne i nasila się wraz z zaawansowanym wiekiem matki 4,5. Cztery randomizowane badania ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Klonowanie molekularne
- Uzyskaj pełnowymiarową sekwencję kodującą interesującego genu i wektor transkrypcji plazmidowej in vitro (pIVT)11.
UWAGA: Pełnowymiarowe klony cDNA są dostępne na rynku od różnych dostawców lub mogą być generowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Zasoby online National Center for Biotechnology Information (NCBI) zawierają sekwencje transkryptów dla genów z baz danych Nucleotide i Expressed sequence tagged (EST). W celu ułatwienia wizualizacji białek i analizy poziomów ekspresji, w strategii klonowania może być pożądana fuzja z białkiem zielonej fluor....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po transkrypcji in vitro wysokiej jakości RNA powinno charakteryzować się stosunkiem A260/A280 w zakresie (1,8-2,2) oraz stosunkiem A260/A230 ≥1,7 przy pomiarze spektrofotometrem. Zdjęcie na Rysunku 1 przedstawia migrację RNA otrzymanego in vitro w denaturującym żelu agarozowym po elektroforezie. Prążek o rozmazanym wzorcu lub próbka zawierająca prążki o różnych rozmiarach mogą wskazywać na zanieczyszczenie lub degradację próbki. Alternatywn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ze względu na szybką i coraz częstszą identyfikację ludzkich wariantów genetycznych związanych z chorobami, konieczne jest ustanowienie systemów oceny ich znaczenia biologicznego. Zrozumienie funkcji białek w mejozie człowieka stanowi szczególne wyzwanie, ponieważ ludzkie oocyty są cenne i rzadkie, a ludzkie plemniki nie są podatne na manipulacje genetyczne. Oocyty myszy są systemem modelowym ssaków cennym dla oceny funkcji ludzkich genów mejotycznych 10,23. Mode.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant badawczy z American Society for Reproductive Medicine oraz z Charles and Johanna Busch Memorial Fund w Rutgers, The State University of NJ dla K.S. A.L.N. był wspierany przez grant od N.I.H. (F31 HD0989597).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,2 ml probówka Seal-Rite do PCR | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb Drabinka DNA | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 pz Drabinka DNA | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X Barwnik ładujący DNA | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-dołkowa szklana płytka punktowa | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agaroza | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumina z surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 sprzężona anty-mysia IgG | Thermo Scientific | A21050 | :200 rozcieńczenie |
| Alexa-fluor-633 sprzężone anty-ludzkie IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 rozcieńczenie |
| Ampicylina | VWR | AA0356 | |
| Stół antywibracyjny | Technical Manufacturing Corp | dowolny standardowy model | |
| Antyacetylowana tubulina przeciwciało | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 rozpylenie |
| Przeciwciała antycentromerowe (CREST) | Przeciwciała Włączone | 15-234 | 1:30 rozcieńczenie |
| Bariera (filtr) Końcówki do pipet | Thermo Scientific | AM12635 | Upewnij się, że są kompatybilne z pipetorami Twojej marki. Są one kompatybilne z pipetorami marki Eppendorf. |
| BD Difco Dehydrated Culture Podłoże: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Podłoża: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Rurka kapilarna | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well naczynie do hodowli organów | VWR | 25381-141 | |
| Zbiornik | Do inkubatora | ||
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | dowolny model standardowy | |
| Wirówka (ze zdolnością chłodzenia) | Thomas Scientific | dowolny model standardowy | |
| Szkło nakrywkowe 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Grubość Thomas Scientific | 6663-F10 | będzie się różnić w zależności od mikroskopu |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Cyfrowa sucha kąpiel | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy Wysoki enzym klonowania wierności | Agilent | 600400 | Do klonowania DNA |
| Można stosować enzymy do linearyzacji pIVT | New England Biolabs | NdeI lub KasI | |
| Bromek etydyny | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego | ||
| Formaldehyd (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyd RNA Barwnik ładujący Ambion | 8552 | ||
| Matowe szkiełka mikroskopowe (nienaładowane) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Pełne klony | Można uzyskać od dowolnego dostawcy, który dostarcza otwarty odczyt klony ramek | ||
| Aparat do elektroforezy żelowej | Bio-Rad | dowolny model standardowy | |
| Szklane pipety Pasteura | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer do pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Można kupić w dowolnej firmie, która generuje niestandardowe oligonucelotydy | ||
| Globin Reverse Primer dla pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Można kupić w dowolnej firmie, która generuje niestandardowe oligonucelotydy | ||
| Pipety do przechowywania | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Można używać Tupperware | ||
| Illustra Ready-To-Go Koraliki RT-PCR | |||
| dowolny | standardowy model z technologią CO2 i płaszczem wodnym | ||
| Probówka wirówkowa o niskiej przyczepności 0,5 ml | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | Oprogramowanie do analizy sekwencji | MacVector | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Markery RNA Millenium-Formaldehyd | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Ponowne zawieszenie w DMSO przy 2,5 mM |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M5310 | Używany tylko testowany na zarodkach, sterylnie filtrowany |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Ponowne zawieszenie w DMSO przy 100 mM |
| Ustnik | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 | do stołu antywibracyjnego | ||
| Lakier do paznokci; Przezroczysty | Można użyć dowolnego przezroczystego lakieru do paznokci | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektrofotometr | Thermo Scientific | dowolny standardowy model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Bufor do biegania | Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Bufor do biegania | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Naczynie do hodowli organów 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyd | Polysciences, Inc. | ||
| Termocykler do PCR | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| szalka Petriego 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| szalka Petriego 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| szalka Petriego 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picowtryskiwacz | XenoWorks Digital | dowolny model standardowy | |
| Ściągacz do pipet | Flaming-Brown Ściągacz do mikropipet | Model P-1000 | |
| plazmid pIVT | AddGene | 32374 | Pusty wektor odpowiedni do ekspresji oocytów. |
| Surowica klaczy w ciąży Gonadotropina | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | oczyszczanie do 20 uL plazmidowego DNA |
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| Zestaw mutagenezy ukierunkowanej na miejsce Quikchange II | Agilent | 200523 | zestaw mutagenezy do wstawiania i usuwania |
| Quikchange lightning wielomiejscowy zestaw mutagenezy ukierunkowanej | Agilent | 210512 | zestaw mutagenezy do zmian w jednym miejscu |
| Nożyczki (cienki punkt) | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 14393 | |
| Nożyczki (średni punkt) | Narzędzia do nauki precyzyjnej | WP114225 | |
| Probówka do mikrowirówek Seal-Rite 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Podgrzewacz | dowolny standardowy model | ||
| Spektrofotometr (Nanodrop) | Mikroskop | ||
| DOWOLNY STANDARDOWY MODEL | |||
| zestaw do transkrypcji RNA z czapeczką | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | 274348 | Sigma-Aldrich | |
| (Fine point - Rozmiar 5) | Narzędzia do nauki | precyzyjnej SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Woda destylowana | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Bromek etydyny 10mg/ml | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Medium montażowe | Vector Laboratories | H-1000 |
Bibliografia
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
