Artykuł metodologiczny

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

DOI:

10.3791/57524

⸱

19 czerwca 2018

 ,  , 
1UCL Institute of Ophthalmology, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawową funkcją śródbłonka naczyniowego w organizmach kręgowców jest służenie jako bariera między krwią a każdą tkanką ciała, dzięki czemu przepuszczalność śródbłonka dla komórek krwi, makrocząsteczek osocza i wody może być dostosowana do potrzeb fizjologicznych. W niektórych chorobach uwalniane są cytokiny i czynniki wzrostu, które celują w barierę śródbłonkową, aby przejściowo zwiększyć przepuszczalność naczyń; Jednak ich długotrwała obecność może powodować przewlekłą nadmierną przepuszczalność naczyń krwionośnych, a tym samym obrzęk uszkadzający tkanki. Test Milesa jest techniką in vivo, która pozwala naukowcom badać nadprzepuszczalność naczyń poprzez pomiar zastępczy przecieku naczyniowego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, jak wykonać tę procedurę na myszy, która jest najczęściej używanym organizmem modelowym do badania fizjologii i patologii ssaków. Procedura polega na dożylnym wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa w celu oznaczenia krążącej albuminy, a następnie wielokrotnym śródskórnym wstrzyknięciom środków indukujących przepuszczalność i roztworów kontrolujących nośnik do przeciwległych boków myszy. W związku z tym niebieski barwnik Evansa stopniowo przecieka do skóry właściwej, gdzie gromadzi się i może być ekstrahowany w celu ilościowego określenia jako wyciek wywołany przez czynnik indukujący przepuszczalność w stosunku do nośnika. Test Milesa może być wykonywany na modelach myszy typu dzikiego lub zmodyfikowanego genetycznie i może być połączony z podawaniem leków w celu zbadania mechanizmów molekularnych, które regulują przepuszczalność naczyń krwionośnych i identyfikacji czynników/celów zdolnych do indukowania lub blokowania nadmiernej przepuszczalności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawową funkcją układu sercowo-naczyniowego jest umożliwienie transferu gazów, składników odżywczych i produktów przemiany materii między krążeniem a tkankami we wszystkich narządach. Naczynia krwionośne mają specyficzne dla narządu poziomy podstawowej przepuszczalności, które umożliwiają taką wymianę1. Na przykład naczynia krwionośne w nerkach są wysoce przepuszczalne, podczas gdy bariera krew-mózg tworzy szczelny, wysoce nieprzenikalny interfejs2,3,4. Komórki śródbłonka, które tworzą wewnętrzną wyściółkę naczyń krwionośnych, stanowią fizyczną barierę między krążeniem a leżącymi poniżej tkankami i regulują przepuszczalność naczyń w sposób specyficzny dla narządu. Jednak niektóre bodźce powodują częściowe uszkodzenie bariery śródbłonkowej, aby zwiększyć wynaczynienie płynu z krążenia do śródmiąższu powyżej poziomów podstawowych1. Taką nadprzepuszczalność obserwuje się na przykład w miejscach urazu tkanki, w stanach zapalnych, w nowotworach, podczas sepsy, w oczach z chorobą neowaskularną lub w mózgu i sercu, gdy niedokrwienie tkanek występuje odpowiednio z powodu udaru lub zawału mięśnia sercowego5,6,7,8. Przewlekle podwyższona nadprzepuszczalność prowadzi do obrzęku, który z kolei powoduje uszkodzenie tkanek, takie jak utrata wzroku w chorobach oczu9. W związku z tym modelowanie odpowiedzi na nadmierną przepuszczalność naczyń krwionośnych jest pożądane w celu zrozumienia mechanizmów zwiększających przepuszczalność śródbłonka i przetestowania skuteczności środków zaprojektowanych w celu jej zahamowania.

Test Milesa jest dobrze znaną, powszechnie stosowaną i stosunkowo prostą techniką, która mierzy przeciek naczyniowy in vivo jako zastępczy pomiar nadmiernej przepuszczalności naczyń. Mimo że nie uwzględnia czynników narastających, które mogą zwiększać przeciek naczyniowy niezależnie od regulacji bariery śródbłonkowej, takich jak ciśnienie krwi lub przepływ krwi, ogólnie uważa się, że test Milesa zapewnia wiarygodną metodę oceny aktywności modulującej przepuszczalność substancji i identyfikacji mediatorów sygnałowych, które promują ich aktywność. W związku z tym test Milesa był integralną częścią licznych badań, które zidentyfikowały mediatory nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych i ich mechanizmy działania10,11,12,13,14,15, takie jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF-A, który został pierwotnie zidentyfikowany jako naczyniowy współczynnik przepuszczalności VPF16.

Pierwotnie opracowane przez Milesa i Milesa do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych u świnek morskich17, ich test został następnie dostosowany do korzystania z myszy, które są teraz modelowym organizmem z wyboru do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów regulacji przepuszczalności naczyń ze względu na ich wyjątkową przydatność do manipulacji genetycznych. Krótko mówiąc, niebieski barwnik Evansa jest wstrzykiwany dożylnie dorosłym myszom i pozostawia się go do krążenia przez 30 minut (Ryc. 1). Środki indukujące przepuszczalność w porównaniu z kontrolą nośnika są następnie wstrzykiwane śródskórnie w wiele miejsc na przeciwległych bokach myszy w celu wywołania przecieku naczyniowego (Rysunek 1). W związku z tym niebieski barwnik Evansa związany z albuminą wynakręca się i gromadzi w skórze właściwej (Ryc. 1). Po humanitarnym uboju myszy, błękit Evansa jest ekstrahowany ze skóry właściwej, a poziom przecieku naczyniowego jest obliczany jako stosunek gęstości optycznej indukowanej substancją badaną do objętości optycznej wywołanej nośnikiem (Rysunek 2).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych oraz instytucjonalnego Organu ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki (AWERB).

1. Przygotowanie myszy

UWAGA: Przeprowadzaj eksperymenty na dorosłych myszach w wieku co najmniej 8 tygodni, do 6 miesięcy. W celu wykazania technicznej odtwarzalności i spójnego czasu dla każdego etapu tej procedury u różnych zwierząt, należy użyć co najmniej 2 i maksymalnie 6 myszy do każdej sesji doświadczalnej. Aby ocenić wpływ mutacji na substancję wywołującą przepuszczalność u genetycznie zmodyfikowanych myszy, najlepiej użyć 2 zmutowanych myszy i 2 kontrolnych miotu na eksperyment.

  1. Na 24 godziny przed stymulacją nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych znieczulić myszy odpowiednim środkiem znieczulającym wziewnym, takim jak izofluran. Stosować 3% izofrunu do indukcji znieczulenia, aż do utraty odruchu prostowania i przestania reagować na bodźce zewnętrzne. Użyj 1,5% izofluranu do utrzymania znieczulenia (upewnij się, że mysz ma stałą częstość oddechów). W znieczuleniu ostrożnie ogol obie boki każdej myszy golarką elektryczną, unikając obrażeń skóry.
    UWAGA: Znieczulenie stosuje się, aby uniknąć powodowania stresu u zwierzęcia i zminimalizowania ruchu podczas golenia, co może skutkować uszkodzeniem skóry.
  2. Umieść ogoloną mysz z powrotem w klatce domowej. W przypadku samców myszy umieść każdego samca w osobnej klatce po odzyskaniu znieczulenia, aby zapobiec walce, a tym samym uszkodzeniu skóry. W przypadku samic myszy należy je umieścić w grupie w klatce domowej.
    UWAGA: Jeśli wśród samców myszy w klatce zaobserwuje się zachowanie bojowe, przed zabiegiem należy je podzielić na indywidualne klatki na 3 dni przed eksperymentem, aby umożliwić zagojenie się potencjalnych uszkodzeń skóry.
  3. Monitoruj myszy, aż odzyskają przytomność (zwykle w ciągu kilku sekund) i poruszaj się po klatce (zwykle w ciągu 1 minuty).

2. Dożylne wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa

  1. W komorze z przepływem laminarnym przygotuj oddzielne sterylne roztwory inhibitora histaminy maleinianu pirylaminy (4 μg/μl w 0,9% soli fizjologicznej) i niebieskiego barwnika Evansa (1% w/v w 0,9% soli fizjologicznej). Sterylizować, przepuszczając roztwory przez filtr 22 μm.
  2. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G, aby wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 10 μl roztworu maleinianu pirylaminy/gram masy ciała (Rysunek 1A). Aby wykonać wstrzyknięcie, należy najpierw pochylić mysz, a następnie przechylić ją tak, aby głowa była skierowana w stronę ziemi, a brzuch skierowany do góry. Wstrzyknąć w dolne ćwiartki brzucha z dala od linii środkowej, aby uniknąć uderzenia w pęcherz.
    UWAGA: Waga myszy w wieku od 8 tygodni do 6 miesięcy zwykle waha się od 15 do 30 g. Maleinian pirylaminy hamuje uwalnianie endogennej histaminy, która w przeciwnym razie sprzyjałaby przeciekaniu naczyń krwionośnych niezależnie od badanego środka.
  3. Umieść mysz w komorze grzewczej o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych. Alternatywnie, użyj odpowiedniej lampy grzewczej skoncentrowanej na ogonie, aby promować rozszerzenie naczyń krwionośnych, jeśli użycie lampy grzewczej jest dozwolone przez lokalne wytyczne etyczne.
  4. Przesuwaj jedną mysz na raz do unieruchomienia myszy i przetrzyj ogon 70% etanolem, aby oczyścić obszar wstrzyknięcia i dodatkowo przyspieszyć rozszerzenie naczyń krwionośnych.
  5. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G, aby podać dożylnie 100 μl niebieskiego barwnika Evansa przez żyłę ogonową (Rysunek 1B). Natychmiast należy przyłożyć ucisk do miejsca wstrzyknięcia, trzymając ogonek między palcem a kciukiem, aby zapobiec krwawieniu.
    UWAGA: Wizualizację żyły ogonowej można poprawić, kierując światło lampy na obszar iniekcji. Więcej szczegółów na temat wykonywania iniekcji dożylnych do żyły ogonowej myszy można znaleźć w opublikowanym protokole18.
  6. Pozwól barwnikowi krążyć przez 30 minut.

3. Stymulowanie nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych

  1. Stosując sterylne roztwory w komorze z przepływem laminarnym, rozcieńczyć czynnik indukujący przepuszczalność do stężenia umożliwiającego dostarczenie dawki końcowej w objętości 20 μl.
    UWAGA: W przykładowym eksperymencie pokazanym na Rysunek 1-Rysunek 2, VEGFA jest stosowany do stymulowania nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych w stężeniu 2,5 ng/μL w PBS, dając całkowitą dawkę 50 ng, a PBS jest używany jako kontrola nośnika.
  2. Załadować interesujący nas czynnik indukujący przepuszczalność i kontrolę nośnika do 2 oddzielnych sterylnych strzykawek o pojemności 300 μl z igłą 31 G. Umieścić roztwór w ilości wystarczającej do wstrzyknięcia każdej myszy z 20 μl roztworu w trzech egzemplarzach (tj. przygotować 60 μl środka i nośnika na mysz plus dodatkową objętość w celu uwzględnienia martwej objętości igły).
  3. Pierwszą badaną mysz należy znieczulić izofluranem (3% w przypadku indukcji znieczulenia do momentu utraty odruchu prostego i przestania reakcji myszy na bodźce zewnętrzne oraz 1,5% w celu utrzymania znieczulenia, upewniając się, że mysz ma stałą częstość oddechów).
  4. Śródskórnie wstrzyknąć 20 μl środka zwiększającego przepuszczalność w bok myszy (Rysunek 1C). Upewnij się, że igła jest ustawiona pod kątem 15° do skóry. Sprawdzić, czy w skórze nie tworzy się wypukły pęcherzyk, który wskazuje na udane wstrzyknięcie. Powtórzyć wstrzyknięcie śródskórne w 2 dodatkowych miejscach w odległości co najmniej 1 cm od siebie.
  5. Obrócić mysz, aby odsłonić 2. bok i powtórzyć trzykrotne wstrzyknięcia roztworu pojazdu kontrolnego. Zapisać na papierze położenie każdego miejsca wstrzyknięcia, aby ułatwić jego identyfikację w celu późniejszego pobrania próbek skóry.
    UWAGA: Na tym etapie należy obchodzić się ze skórką myszy ostrożnie; Na przykład należy unikać szczypania skóry podczas wykonywania wstrzyknięć śródskórnych.
  6. Umieść mysz z wstrzykniętą wstrzyknięciem w klatce domowej i monitoruj ją, aż odzyska przytomność (zwykle w ciągu kilku sekund) i zacznie poruszać się po klatce.
  7. Podczas gdy pierwsza mysz wraca do zdrowia, natychmiast powtórz kroki 3.3 i 3.5 z drugą myszą i tak dalej (maksymalnie do 6 myszy na sesję). Zapisuj czas, w którym każda mysz została wstrzyknięta, aby dostosować czas, w którym należy przejść do następnego kroku.

4. Kwantyfikacja nagromadzonego błękitu Evansa w skórze właściwej

  1. Każdą mysz należy usunąć przez zwichnięcie szyjki macicy 20 minut po otrzymaniu wstrzyknięć śródskórnych, przestrzegając tej samej kolejności, w jakiej wstrzyknięto myszy.
    UWAGA: Czas trwania przecieku naczyniowego może się różnić w zależności od zastosowanego środka indukującego przepuszczalność, a zatem czas między wstrzyknięciem śródskórnym a ubojem może wymagać optymalizacji.
  2. Połóż każdą zabitą mysz na grzbiecie i przypnij jej stopy do tablicy korkowej owiniętej czystą chusteczką (Rysunek 1D).
  3. Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie o długości około 3 - 4 cm od dolnej części brzucha do klatki piersiowej martwej myszy. Za pomocą kleszczy i skalpela oderwij skórę z obu boków, aby odsłonić wewnętrzną stronę skóry właściwej i miejsca nagromadzenia niebieskiego Evansa (Rysunek 1E). Przygnij luźną skórę i usuń tłuszcz z obszarów wokół miejsca wycieku za pomocą skalpela. W razie potrzeby zrób reprezentatywne zdjęcie, aby zademonstrować wielkość przeciekania niebieskiego Evansa do skóry.
  4. Za pomocą kleszczy i skalpela wyciąć obszary skóry zawierające wyciekający niebieski barwnik Evansa dla każdego miejsca, w którym wstrzyknięto środek lub nośnik indukujący przepuszczalność.
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę na wycięcie obszarów skóry o podobnej wielkości, aby upewnić się, że w kolejnym Kroku 4.7 podobna część objętości formamidu zostanie zaadsorbowana przez każdą próbkę skóry, co pozwoli na rozcieńczenie wyekstrahowanego barwnika w podobnej objętości pozostałego formamidu. Mapa iniekcji zapisana w kroku 3.5 pomoże określić obszar do wycięcia.
  5. Umieść każdą próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml i odpowiednio ją oznacz, upewniając się, że każda próbka spoczywa na dnie probówki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Jeśli przetwarzasz natychmiast, wykonaj poniższe czynności.
  6. Wysuszyć próbki skóry przez noc, umieszczając otwarte probówki w piecu lub w studzience bloku grzewczego w temperaturze 55 °C.
  7. Aby wyekstrahować niebieski barwnik Evansa, dodaj 250 μl dejonizowanego formamidu do próbek w dygestorium, zamknij probówki. Upewnij się, że wszystkie próbki skóry są pokryte formamidem i inkubować przez noc w piecu lub bloku grzewczym w temperaturze 55 °C.
  8. Odwirować próbki w wirówce stołowej z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 40 minut.
  9. W dygestorium przenieść 100 μl supernatantu zawierającego barwnik z każdej próbki do oddzielnego dołka przezroczystej, 96-dołkowej płytki o płaskim dnie (Rysunek 2A).
  10. Zmierzyć szczytową absorbancję niebieskiego Evansa przy 620 nm z odczytem referencyjnym 740 nm na spektrofotometrze.
    UWAGA: 620 nm to szczyt absorbancji niebieskiego Evansa, podczas gdy 740 nm nie jest absorbowane przez błękit Evansa i działa jako referencyjna długość fali.
  11. Uśrednić odczyty absorbancji trzykrotnych wstrzyknięć tego samego czynnika lub nośnika dla każdej myszy, aby uwzględnić zmienność techniczną (Rysunek 2B).
  12. Oblicz różnicę zagięć odczytów środka indukującego przepuszczalność w porównaniu ze sterowaniem pojazdem (Rysunek 2C).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy testu Miles, aby ocenić zdolność VEGF-A do indukowania przecieku naczyniowego w stosunku do kontroli pojazdu (PBS) u myszy C57/Bl6 typu dzikiego. Tutaj pokazujemy reprezentatywny eksperyment z użyciem myszy typu dzikiego stymulowanych śródskórnym wstrzyknięciem 20 μl roztworu zawierającego 50 ng VEGF-A tylko w PBS lub podłożu PBS. Wyraźny wzrost wycieku niebieskiego barwnika Evansa w próbkach skóry, którym wstrzyknięto VEGF-A w porównaniu z PBS, był widoczny in situ (Rysunek 1E) i po ekstrakcji barwnika w formamidzie (Figura 2A). Kwantyfikacja wielu eksperymentów pokazuje, że 50 ng VEGF-A znacząco indukuje więcej wycieku niebieskiego Evansa niż sam PBS (Rysunek 2B), ze średnim 3-krotnym wzrostem przecieku naczyniowego w porównaniu z nośnikiem ( Rysunek 2C).

figure-results-1
Rycina 1: Indukcja przecieku naczyniowego w teście Milesa. Schematyczne przedstawienie (górne panele) i odpowiadające im obrazy (dolne panele) kolejnych kroków podczas wykonywania testu mil w myszy. (A) Maleinian pirylaminy wstrzykuje się dootrzewnowo, aby zapobiec uwalnianiu endogennej histaminy na 10 do 30 minut przed (B) dożylnym wstrzyknięciem 100 μl 1% błękitu Evansa do żyły ogonowej myszy. (C) 30 minut później, przeciek naczyniowy jest indukowany przez śródskórne wstrzyknięcie środka (50 ng VEGF-A; zielone kółka) w porównaniu z kontrolą nośnika (PBS; białe kółka). (D, E) Aby uzyskać dostęp do miejsc akumulacji niebieskiego Evansa, mysz jest zabijana 20 minut po wstrzyknięciach śródskórnych, a skóra obu boków jest preparowana i przygwożdżana. i.p.: dootrzewnowe; I.V.: dożylnie; I.D.: śródskórny; podziałka liniowa, 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Kwantyfikacja przecieku naczyniowego w teście Milesa. (A) Niebieski barwnik Evansa jest ekstrahowany formamidem z próbek skóry pobranych z każdego śródskórnego wstrzyknięcia w Rysunek 1 i ładowany do 96-dołkowej płytki w celu odczytu absorbancji za pomocą spektrofotometru. (B, C) Graficzne przedstawienie odczytów absorbancji z wielu eksperymentów poprzez wykreślenie albo (B) znormalizowanych wartości absorbancji (gęstość optyczna, OD) zarówno czynnika indukującego przepuszczalność (VEGF-A; ciemnozielone kółka), jak i nośnika (PBS; szare kółka), albo (C) zmiany krotności OD dla czynnika w stosunku do nośnika (słupki błędów: SEM). Odczyty absorbancji potrójnych próbek PBS i VEGF-A pokazane w (A) są uśrednione i pokazane w (B, C) odpowiednio jako białe lub zielone kółka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu pierwszego opisu w 1952roku17, test Milesa dostarczył naukowcom stosunkowo szybkiej, prostej i niezawodnej metody badania molekularnych mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń. Na przykład test Milesa został wykorzystany do zbadania zdolności i/lub siły działania różnych czynników do wywoływania nadprzepuszczalności19,20,21 lub do przetestowania skuteczności środków blokujących nadprzepuszczalność 8,22,23. Jako inny przykład, czynniki indukujące przepuszczalność naczyń krwionośnych zostały przetestowane na genetycznie zmodyfikowanych myszach i ich rodzeństwie z miotu w celu określenia wymagań określonych receptorów i białek transdukujących sygnał dla odpowiedzi nadmiernej przepuszczalności wywołanej ligandem 10,11,12,13,14,15,20,23. Od tego czasu zastosowano kilka zmodyfikowanych wersji testu Miles, na przykład w odniesieniu do zastosowanego znacznika. W ten sposób Evans Blue został zastąpiony w niektórych badaniach znakowanym fluorescencyjnie dektransem o różnych rozmiarach lub mikrosferach11,13.

Główną zaletą testu Milesa w porównaniu z innymi testami do badania mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń jest to, że jest stosunkowo łatwy do wykonania i nie wymaga drogiego sprzętu. Ponadto, jako technika in vivo, test ten modeluje przeciek naczyniowy w kontekście nienaruszonych naczyń krwionośnych, w przeciwieństwie do pomiaru przecieku za pomocą testów in vitro, takich jak testy strumienia trans studziennego lub testy oporności elektrycznej śródbłonka (TEER), które koncentrują się wyłącznie na monowarstwie śródbłonka. Alternatywne testy nadprzepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo mogą różnić się od opisanego tutaj testu Milesa poprzez wykorzystanie innej drogi dostarczania czynnika indukującego nadprzepuszczalność lub poprzez analizę przecieku naczyniowego w różnych miejscach, na przykład poprzez ogólnoustrojowe dostarczanie środka przez żyłę ogonową, a następnie badanie przecieku naczyniowego w płucach lub tchawicy11, Rozdział 13,15. Jednym z ograniczeń testu Milesa jest to, że śródskórne wstrzyknięcie niektórych środków może w zasadzie wpływać na ciśnienie i przepływ krwi oprócz zakłócenia bariery śródbłonkowej, a zatem wpływać na przepuszczalność naczyń krwionośnych również pośrednio. Niemniej jednak ostatnio wykazano, że test ten mierzy przepuszczalność naczyń indukowaną przez VEGF-A niezależnie od wpływu na ogólnoustrojowe ciśnienie krwi15. Innym ograniczeniem testu Milesa jest to, że łożyska naczyniowe w różnych tkankach mogą różnie reagować na czynniki zwiększające przepuszczalność, a wyniki uzyskane za pomocą testu Milesa w skórze mogą zatem nie być reprezentatywne, na przykład, dla tego, co dzieje się w płucach lub mózgu.

Wiek i waga zwierzęcia mogą mieć wpływ na wyciek zaobserwowany w teście Milesa. Aby zminimalizować wpływ tych zmiennych, naukowcy powinni używać rodzeństwa z miotu lub myszy o podobnej wielkości i w wieku jako kontrolnych. Oceniając mutanty myszy pod kątem określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania, myszy powinny być generowane za pomocą heterozygotycznej kontra heterozygotycznej strategii hodowlanej, a rodzeństwo z dzikiego miotu powinno być używane jako kontrole. Ponadto zaleca się stosowanie szybko odwracalnych gazowych środków znieczulających, takich jak izofluran, aby uniknąć zwężenia naczyń krwionośnych, co zostało opisane w przypadku niektórych leków znieczulających podawanych w iniekcjach pozajelitowych24,25. Wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa do bocznej żyły ogonowej myszy jest krytycznym krokiem w tym protokole i może znacznie wpłynąć na jakość eksperymentu i danych. W związku z tym badacze muszą być kompetentni w wykonywaniu iniekcji do żył ogonowych i prawdopodobnie będą potrzebować wcześniejszego doświadczenia lub praktyki przed rozpoczęciem eksperymentu z testem Milesa. Alternatywnie, naukowcy mogą użyć innych dróg dożylnych w celu dostarczenia błękitu Evansa, takich jak wstrzyknięcie retroorbitalne, jeśli mają z tym doświadczenie. Śródskórne wstrzyknięcie roztworów zwiększających przepuszczalność może spowodować uszkodzenie skóry niezależnie od środka. Dlatego wstrzyknięcia śródskórne nie powinny przekraczać objętości 20 μl, powinny być zawsze wykonywane w obecności inhibitora histaminy i znormalizowane do wstrzyknięć kontrolnych nośnika.

Test Milesa był używany przez wielu badaczy do oceny składników szlaku sygnałowego VEGF-A, na przykład dlatego, że przepuszczalność naczyń wywołana przez VEGF-A powoduje wodobrzusze u pacjentów z rakiem16 i obrzęk upośledzający widzenie w kilku neowaskularnych chorobach oczu7. W ten sposób my i inni użyliśmy testu Milesa do porównania nieszczelności naczyniowej wywołanej przez VEGF-A u myszy, które zostały genetycznie zmodyfikowane tak, aby nie zawierały określonych składników kaskady sygnalizacyjnej VEGF-A 12,13,14,15,20,23. Nasze ostatnie badanie z wykorzystaniem tego podejścia ujawniło, że główna patologiczna izoforma VEGF-A, VEGF165, sygnalizuje przez kompleks VEGFR2 i NRP1, w którym domena cytoplazmatyczna NRP1 promuje aktywację kinaz rodziny SRC za pośrednictwem kinazy ABL w celu wywołania odpowiedzi nadmiernej przepuszczalności14. VEGFA wspomaga również wzrost naczyń krwionośnych i dlatego może być stosowany terapeutycznie w celu przywrócenia przepływu krwi do niedokrwionych tkanek, jeśli jego nadmierna przepuszczalność może być wyraźnie zahamowana. Badania wyjaśniające mechanizm molekularny, który steruje odpowiedziami VEGF-A komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w kierunku nadmiernej przepuszczalności naczyń, mogą zatem zidentyfikować szlaki, którymi można selektywnie manipulować w celu zahamowania patologicznego obrzęku wywołanego przez VEGF-A w chorobach, takich jak rak lub choroba niedokrwienna oczu. Test Milesa bez wątpienia będzie nadal pomocną metodą stanowiącą podstawę tych i wielu innych rodzajów badań funkcjonalnych w celu wyjaśnienia molekularnych regulatorów i efektorów nadmiernej przepuszczalności naczyń.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Laurze Denti, Valentinie Senatore i personelowi Jednostki Zasobów Biologicznych w Instytucie Okulistyki UCL za pomoc w hodowli myszy oraz Camille Charoy za wsparcie techniczne. Praca ta została wsparta grantem Rady ds. Badań Medycznych (MR/N011511/1) dla C. Ruhrberga oraz stypendium doktoranckim British Heart Foundation dla J.T. Brasha (FS/13/59/30649).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól maleinianu pirylaminySigma-AldrichP5514-5GZawiesić w PBS
Dejonizowany formamidSigma-AldrichS4117Stosować w dygestoriach
Igły Microlance 30g x 0,5"BD 
Sterylny Plastipak 1ml LuerBD 
Sterylne strzykawki MicroFine 0,3 ml - 8 mm - 30G BD 
Evans niebieskiSigma AldrichE2129
Ogranicznik
Komora
Maszynka
IsofluraneMerialap/drugs/220/96
Scalpal 
nożyczki
Kleszcze
Rurki Eppendorfa
Blok
grzewczy Tablica
Wirówka
Rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165ReliatechM30-004
305106309659324826myszygrzewczado strzyżenia włosówkorkowastołowa z chłodzeniem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis. Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).
  2. Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).
  3. Ruhrberg, C. Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF. Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).
  4. Risau, W. Differentiation of Endothelium. FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).
  5. Strbian, D., et al. The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia. Neuroscience. 153, 175-181 (2008).
  6. Weis, S. M., Cheresh, D. A. Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability. Nature. 437, 497-504 (2005).
  7. Campochiaro, P. A. Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).
  8. Aman, J., et al. Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib. Circulation. , 126(2012).
  9. Claesson-Welsh, L. Vascular permeability-the essentials. Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).
  10. Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).
  11. Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120, (2017).
  12. Eliceiri, B. P., et al. Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).
  13. Sun, Z. Y., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).
  14. Fantin, A., et al. VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation. Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).
  15. Li, X. J., et al. VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread. Nat Commun. 7, (2016).
  16. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
  17. Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs. J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).
  18. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability. Jove-J Vis Exp. , e50062(2013).
  19. Roth, L., et al. Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation. Sci Signal. 9, (2016).
  20. Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor. Blood. 111, 2674-2680 (2008).
  21. Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration. P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).
  22. Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice. Circulation. 126, (2012).
  23. Chislock, E. M., Pendergast, A. M. Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice. PLoS ONE. 8, e85231(2013).
  24. Busch, C. J., et al. Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice. Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).
  25. Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Can Vet J. 44, 885-897 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

barwnik b kit Evansaprzeciekanie naczyniowesk ra myszywstrzykni cie r dsk rnewstrzykni cie do ylneekstrakcja formamidemanaliza spektrofotometrycznaprzepuszczalno VEGF

Powiązane artykuły