Artykuł metodologiczny

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

DOI:

10.3791/57598

⸱

23 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco, 2UC Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California, San Francisco, 3Chan Zuckerberg Biohub

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania >50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie sekwencjonowania przeszły zmianę paradygmatu z rozdzielczości masowej na jednokomórkową w odpowiedzi na rozwijające się zrozumienie roli heterogeniczności komórkowej w systemach biologicznych. Jednak sekwencjonowanie pojedynczych komórek w dużych populacjach jest utrudnione przez ograniczenia w przetwarzaniu genomów do sekwencjonowania. W tym artykule opisujemy metodę sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki (SiC-seq), która wykorzystuje mikrofluidykę kropelkową do izolacji, amplifikacji i kodowania kreskowego genomów pojedynczych komórek. Enkapsulacja komórek w mikrożelach umożliwia przedziałowe oczyszczanie i znakowanie DNA, podczas gdy fuzja mikroprzepływowa skutecznie łączy każdy genom z unikalnym kodem kreskowym oligonukleotydu pojedynczej komórki, umożliwiając sekwencjonowanie > 50 000 pojedynczych komórek w jednym przebiegu. Dane sekwencjonowania są demultipleksowane za pomocą kodu kreskowego, generując grupy odczytów pochodzących z pojedynczych komórek. Jako metoda sekwencjonowania pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości i niskim odchyleniu, SiC-seq umożliwi szerszy zakres badań genomicznych ukierunkowanych na różne populacje komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom służy jako plan tożsamości i funkcji komórki, zawierający całość potencjału kodującego organizmu. Zrozumienie biologii komórkowej na poziomie genomu może wyjaśnić obserwowaną różnorodność fenotypową w heterogenicznych populacjach komórek. Ta heterogeniczność jest widoczna w systemach biologicznych i ma szerokie implikacje dla zdrowia i chorób ludzkich. Na przykład różnice w liczbie kopii genów wśród komórek nowotworowych są związane z ewolucją i rozprzestrzenianiem się raka1,2. W infekcjach bakteryjnych wyspy chorobotwórczości obecne w niewielkiej części genomów mogą być przenoszone poziomo i prowadzić do namnażania się bakterii opornych na antybiotyki3,4. Podstawowym wyzwaniem w badaniu genomów na poziomie pojedynczej komórki jest niewielka ilość dostępnego DNA, a także konieczność analizy tysięcy komórek w celu pobrania próbki pełnej różnorodności genotypów. Z tych powodów ograniczenia w przepustowości eksperymentalnej utrudniły skuteczność badań na pojedynczych komórkach, wypaczając wyniki w kierunku najliczniejszych komórek. Techniki izolacji pojedynczych komórek, takie jak sortowanie przepływowe5,6, pęseta optyczna7, osadzanie w żelach luzem8 i microfluidics9 są w stanie przetwarzać setki komórek do sekwencjonowania; Stanowi to jednak tylko niewielki ułamek większości próbek. Metoda sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki o znacznie większej przepustowości pozwoliłaby na głębsze i pełniejsze profilowanie populacji komórek, wyjaśniając w ten sposób rolę różnorodności genotypowej w tych społecznościach.

Mikrofluidyka kropelkowa umożliwia wysokoprzepustową manipulację komórkami i odczynnikami biologicznymi w milionach reaktorów o skali pikolitrowej. Do tej pory technologie mikrokropelek były wykorzystywane do badania zróżnicowanych wzorców ekspresji między komórkami z heterogenicznych tkanek10,11,12, głęboko sekwencjonuj długie cząsteczki13,14,15, oraz przeprowadzaj analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChiP-seq) na pojedynczych komórkach16. Rzeczywiście, mikrokropelki są zdolne do wysokoprzepustowych, podzielonych na przedziały operacji, dzięki czemu można je stosować w genomice pojedynczej komórki. Rozwój tej technologii wiąże się jednak z unikalnymi wyzwaniami technologicznymi. Komórki muszą być poddawane lizie, oczyszczane i amplifikowane z minimalnym odchyleniem, aby równomiernie pobrać próbki z populacji komórek. Dodatkowo, w przeciwieństwie do poliadenylowanych transkryptów mRNA w komórkach ssaków, w genomie nie ma porównywalnego motywu molekularnego, który ułatwiałby wychwytywanie docelowego kwasu nukleinowego. Z tych powodów sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki było trudne do wdrożenia na platformach mikrokropelkowych.

W tej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół naszego wcześniej opisanego podejścia mikroprzepływowego do pojedynczych komórek, zdolnego do sekwencjonowania genomów dziesiątek tysięcy komórek w jednym eksperymencie17. Dzięki tej technologii, zwanej SiC-seq, komórki bakteryjne są zamykane w hydrożelach w skali mikronowej i indywidualnie lizowane, znakowane i łączone z mikrokropelką zawierającą unikalny oligonukleotydowy kod kreskowy, który jest spleciony z genomowym DNA komórki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z pojedynczym nałożeniem na siebie (PCR). Hydrożele służą jako izolowane pojemniki, w których genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest sterycznie zamknięte, umożliwiając mniejszym cząsteczkom, takim jak detergenty i enzymy lityczne, dostęp i oczyszczenie DNA przed kodowaniem kreskowym18. Protokół ten przetwarza >50 000 pojedynczych komórek w ciągu kilku godzin, w wyniku czego powstaje biblioteka kodów kreskowych gotowa do sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu odczyty są demultipleksowane zgodnie z sekwencją kodów kreskowych w jednej komórce, w wyniku czego powstaje zestaw danych składający się z milionów odczytów, z których każdy ma indeks komórkowy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Przygotuj projekty masek mikroprzepływowych za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (dostarczonego jako . Plik DWG; patrz Pliki uzupełniające). Zleć wydrukowanie tych projektów przez dostawcę w rozdzielczości 10 μm na folii na płytce drukowanej.
    UWAGA: W przypadku wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych odpowiednie maski zawierają znaczniki wyrównania.
  2. Dla każdego urządzenia wyprodukuj główną formę SU-8 (Rysunek 1A) w następujący sposób.
    1. Przygotuj wafel krzemowy o średnicy 3 cali, wlewając około 1 ml fotorezystu SU-8 3025 na środek płytki. Zabezpiecz wafel na uchwycie powlekarki wirowej, stosując ssanie.
    2. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z listą grubości warstw i prędkości wirowania dla każdego urządzenia. W przypadku wszystkich urządzeń powlekanie wirowania należy rozpocząć od 30 s przy 500 obr./min, a następnie 30 s przy wskazanej prędkości.
    3. Wyjmij wafel silikonowy SU-8 z wirówki i piecz go na miękko na płycie grzejnej ustawionej na 135 °C przez 30 minut. Po upieczeniu pozostaw wafel do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    4. Wystaw płytkę krzemową SU-8 z odpowiednią maską mikroprzepływową pod skolimowaną diodą LED UV o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty.
    5. Po ekspozycji wafelek pieczemy na twardo na płycie grzejnej ustawionej na 135 °C przez 1 min. Postępując zgodnie z tym etapem pieczenia, pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej.
    6. W przypadku jednowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego przejdź do kroku 1.2.7. W przypadku wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego powtórz kroki 1.2.1 - 1.2.5 dla drugiej warstwy fotorezystu (Rysunek 1B).
    7. Po pierwszym twardym pieczeniu w przypadku urządzenia jednowarstwowego (lub drugim twardym w przypadku urządzenia wielowarstwowego), należy rozwinąć wafel, zanurzając go w kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 30 minut.
    8. Po rozwinięciu wafla użyj butelki ze spryskiwaczem zawierającej PGMEA, aby wypłukać wafel. Następnie opłucz wafel butelką ze spryskiwaczem zawierającą izopropanol przed umieszczeniem go na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę do wyschnięcia.
    9. Umieść wafel (zwany dalej mistrzem) na szalce Petriego w celu odlewania z polidimetylosiloksanem (PDMS).
  3. Po przygotowaniu wzorca w kroku 1.2 przystąp do wykonania urządzenia za pomocą odlewu PDMS.
    1. Przygotuj PDMS, łącząc bazę silikonową z utwardzaczem w stosunku 11:1 masowo. Wymieszaj bazę silikonową i utwardzacz ręcznie za pomocą patyczka do mieszania.
    2. Odgazowuje PDMS, umieszczając go w komorze odgazowującej i stosując próżnię. Pozwól PDMS odgazować się, aż pęcherzyki powietrza przestaną być widoczne (zwykle 30 minut).
    3. Ostrożnie wylać odgazowany PDMS na urządzenie główne, do końcowej grubości warstwy PDMS wynoszącej około 5 mm. Ponownie odgazuj PDMS, aby zapewnić usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza.
    4. Po odgazowaniu piec PDMS i master w temperaturze 80 °C przez 80 minut.
    5. Ostrożnie wytnij utwardzoną płytę PDMS z pieczonego mistrza za pomocą żyletki. Upewnij się, że wszystkie nacięcia znajdują się na wierzchu płytki krzemowej.
      UWAGA: Wszelkie nacięcia wykonane na płytce krzemowej mogą spowodować, że warga uniemożliwi równomierne połączenie.
    6. Przebić wloty i wyloty za pomocą stempla biopsyjnego 0,75 mm. Usuń kurz i zabłąkane PDMS za pomocą taśmy pakowej po stronie funkcji urządzenia.
    7. Przed przystąpieniem do obróbki plazmowej urządzenia należy oczyścić szkiełko o wymiarach 50 mm x 75 mm, spłukując je izopropanolem i susząc.
    8. W celu obróbki plazmowej umieść płytę PDMS i szkiełko szklane w spawarce plazmowej elementami skierowanymi do góry. Zabieg plazmowy należy wykonywać przy użyciu osocza 1 mbarO2 przez 1 min. Przymocuj urządzenie do szklanego szkiełka, zbliżając do siebie odsłonięte lub skierowane do góry strony.
    9. Po zabiegu plazmowym piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 40 minut.
    10. Na koniec wstrzyknij płyn do obróbki powierzchni szkła do jednego z wlotów, aby kanały mikroprzepływowe stały się hydrofobowe. Upewnij się, że wszystkie kanały są całkowicie zalane roztworem i powtórzyć wstrzyknięcie dla każdego kroplomierza. Piec poddane działaniu środka urządzenie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika.

2. Enkapsulacja komórek w mikrożelach agarozowych

UWAGA: Zobacz Rysunek 2A.

  1. Przygotować 1 ml agarozy o niskiej temperaturze topnienia 3% w/v w 1x bufor Tris-EDTA (TE). Roztwór agarozy należy przechowywać w bloku grzewczym o temperaturze 90 °C do momentu bezpośrednio przed załadowaniem strzykawki.
  2. Przygotować zawiesinę komórkową.
    UWAGA: Ten protokół i związane z nim urządzenia mikroprzepływowe zostały zatwierdzone do pracy z komórkami bakteryjnymi, zarówno z zamrożonego bulionu, jak i świeżego preparatu. Komórki ssaków, w zależności od typu komórki, mogą wymagać dostosowania wymiarów kanału mikroprzepływowego, aby dostosować się do większych rozmiarów komórek.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Policz komórki w hemocytometrze lub przez sortowanie przepływowe. W przypadku mikrożeli 25 μm o docelowej szybkości enkapsulacji komórek 1 do 10 należy przygotować 1 ml zawiesiny komórkowej o końcowym stężeniu 2,4 x 107 komórek/ml.
    3. Obracaj komórki w dół w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki o gradiencie gęstości 17% v/v (patrz Tabela materiałów) w PBS. Przechowywać lek na lodzie do momentu załadowania strzykawki.
  3. Załaduj strzykawkę o pojemności 3 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającą 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę 27 G i umieść w pompie strzykawkowej.
    UWAGA: Wyposażyć wszystkie strzykawki w igłę 27 G do etapów mikroprzepływowych w tym protokole. Aby zmniejszyć ryzyko przypadkowego ukłucia, należy trzymać nasadki na wszystkich igłach do momentu rozpoczęcia pracy pompy.
  4. Załaduj zawiesinę komórek i stopioną agarozę do strzykawek o pojemności 1 ml, dopasuj je do igieł o rozmiarze 27 i umieść je w pompkach strzykawkowych.
  5. Utrzymuj strzykawkę z agarozą i pompuj w cieple za pomocą małego grzejnika, aby zapobiec zżeltywowaniu agarozy w strzykawce i rurkach wlotowych. Ustaw grzejnik w pozycji HIGH i ustaw go tak, aby powierzchnia grzewcza znajdowała się w odległości około 10 cm od strzykawki. Upewnij się, że temperatura mierzona na strzykawce wynosi około 80 °C.
    UWAGA: Użytkownikom zaleca się utrzymywanie grzałki w zalecanej odległości od aparatu pompującego, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia sprzętu, w tym stopienia przewodów.
  6. Wygeneruj krople mikrożelu o wielkości 25 μm za pomocą urządzenia do wytwarzania kropli współprzepływowych.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3A dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.
    1. Podłącz igły strzykawki do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki z polietylenu (PE). Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
    2. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
    3. Do sporządzania kropli należy stosować następujące (zalecane) szybkości przepływu: 800 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG; 200 μL/h dla zawiesiny komórek w PBS i 200 μL/h dla 3% w/v agarozy.
  7. Po przygotowaniu kropli umieścić probówkę zbiorczą w temperaturze 4 °C na 30 minut, aby zapewnić całkowite zżelowanie agarozy.

3. Rozbijanie i mycie mikrożeli agarozowych

  1. Usunąć dolną warstwę oleju z probówki zbiorczej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę o sile 20 G, uważając, aby nie naruszyć górnej warstwy kropelek agarozy.
  2. Rozbij emulsje perfluorooktanolem (PFO).
    1. Dodaj 1 ml 10% v/v PFO w HFE do kropli agarozy. Pipetować ten roztwór w górę iw dół przez 1 minutę, aby dokładnie pokryć emulsje.
      UWAGA: Na wszystkich etapach płukania mikrożelem należy pipetować roztwory za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl. Po odpipetowaniu zawiesina mikrożelu powinna wydawać się jednorodna i wolna od grudek.
    2. Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2 000 x g przez 1 minutę, aby zebrać mikrożele agarozowe. Usunąć supernatant PFO/HFE przez aspirację; Mikrożele są teraz wolne od warstwy środków powierzchniowo czynnych i będą przezroczyste.
  3. Umyj mikrożele środkiem powierzchniowo czynnym w heksanie.
    UWAGA: Heksan jest lotnym rozpuszczalnikiem organicznym, a mycie w kroku 3.3 powinno odbywać się pod wyciągiem.
    1. Dodać 2 ml 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego monooleinianu sorbitanu (patrz tabela materiałów) w heksanie do mikrożeli agarozowych. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać, zapewniając całkowite rozdrobnienie granulek mikrożelu.
    2. Obracaj probówkę o masie 1 000 x g przez 1 minutę, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia roztworu środka powierzchniowo czynnego/heksanu.
    3. Powtórzyć płukanie środkiem powierzchniowo czynnym/heksanem.
  4. Umyj mikrożele w wodnym buforze, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.
    1. Dodaj 5 ml buforu TET [0,1% v/v etoksylowanego niejonowego detergentu oktylofenolowego (patrz tabela materiałów) w 1x TE] do stożkowej probówki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    2. Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia buforu TET.
    3. Powtórz pranie TET 2x.
    4. Dodaj 5 ml buforu 1x TE do stożkowej probówki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    5. Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia buforu TE.
    6. Powtórz pranie TE.
  5. Sprawdź enkapsulację komórek w mikrożelach pod mikroskopem pod 400-krotnym powiększeniem, barwiąc 10 μl porcji żeli 1x barwieniem kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Mikrożele będą przezroczyste pod przezroczystym kanałem, podczas gdy DNA komórki będzie fluoryzować pod kanałem GFP (długości fal wzbudzenia/emisji 497/520 nm). Nakładka przezroczystych i fluorescencyjnych kanałów pokaże komórki w mikrożelach, jak pokazano na Rysunek 4A.

4. Liza komórek w agarozie za pomocą enzymów litycznych

  1. Przygotować 1 ml koktajlu enzymów litycznych przy użyciu 800 μl buforu TE (1x), 2 μl enzymu litycznego drożdży (5 U/μL bulionu, 10 U/ml końcowego), 30 μL ditiotreitolu (1 M bulion, 30 mM końcowy), 60 mg lizozymu (liofilizowany proszek), 15 μL EDTA (0,5 M bulionu, 7,5 mM wersja ostateczna), 2 μl mutanolizyny (100 U/μL zapasu, 200 U/ml wersja ostateczna), 2 μL lizostafiny (10 U/μL zapasu, 20 U/ml wersji końcowej) i 30 μL NaCl (1 M zapas, 30 mM wersja ostateczna).
  2. Dodaj więcej TE, aby zwiększyć objętość do 1 ml. Wymieszaj roztwór, wirując.
  3. Dodaj cały 1 ml roztworu enzymu litycznego do nie więcej niż 1 ml umytych mikrożeli. Mieszać pipetując 10x. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez >2 godziny w wytrząsarce (maksimum to inkubacja przez noc).

5. Leczenie mikrożelem na bazie detergentu

  1. Po lizie za pomocą enzymów litycznych (krok 4) umyj mikrożele.
    1. Odwiruj mikrożele w temperaturze 2 000 x g przez 2 minuty i odessaj supernatant. Kropelki będą wydawać się nieprzezroczyste białe, z powodu resztek komórek rozproszonych w granulce.
    2. Ponownie zawiesić mikrożele w 5 ml 10 mM buforu Tris-HCl i pipetować w górę iw dół 10x, aby wymieszać.
    3. Wirować mieszaninę w temperaturze 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
  2. Wykonaj zabieg detergentowy na mikrożelach.
    1. Ponownie zawiesić żele w buforze do lizy dodecylosiarczanu litu (LiDS) (0,5% w/v LiDS w 20 mM Tris-HCl) i 60 μl 0,5 M EDTA do końcowej objętości 3 ml.
    2. Dodać 5 μl enzymu proteinazy K (800 j./ml bulionu). Pipetować w górę i w dół 10x, aby wymieszać, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 42 °C na bloku grzewczym przez 1 godzinę w celu rozpuszczenia błon komórkowych i strawienia białek.
  3. Po zabiegu detergentowym umyj mikrożele.
    1. Wirować stożkową probówkę z mikrożelami w dół o masie 2 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant przez aspirację.
    2. Umyj mikrożele 10 ml 2% v/v polisorbatu 20 w wodzie. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    3. Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
    4. Umyj mikrożele 10 ml 100% etanolu, aby dezaktywować wszelkie pozostałości enzymu. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    5. Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
    6. Umyj mikrożele 10 ml 0,02% v/v polysorbate 20 w wodzie. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
    7. Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
    8. Powtórzyć płukanie polisorbatem 20 3 razy. Przepuść roztwór przez sitko do komórek o średnicy 100 μm przed ostatnim płukaniem, aby usunąć wszelkie duże grudki.
  4. Ponownie zawiesić mikrożele w 5 ml 10 mM buforu Tris-HCl, aby zapobiec degradacji DNA. Mikrożele mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed znakowaniem (etap 7).

6. Generowanie kropelek kodów kreskowych metodą Digital PCR

  1. Przygotuj 500-pM zapas startera BAR (Tabela 2) w buforze 1x TE w probówce o niskim wiązaniu. Przed każdym użyciem rozcieńczyć podkład do poziomu 1 pM i podgrzewać go do temperatury 70 °C przez 1 minutę na bloku grzewczym.
  2. Przygotować 150 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, używając 75 μl wysokiej jakości mieszanki wzorcowej gorącego startu (patrz tabela materiałów) (2x), 42 μl wody klasy PCR, 3 μl startera DNA_BAR (10 μM podstawy, 0,2 μM końcowy), 3 μL startera P7_BAR (10 μM zapasu, 0,2 μM końcowy), 6 μl rozcieńczenia kodu kreskowego (1 pM zapas, 40 fM końcowy), 6 μl polisorbatu 20 (50% v/v stock, 2% final) i 15 μl PEG 6k (50% w/v stock, 5% final). Mieszać pipetując w górę i w dół 10 razy.
  3. Przygotuj strzykawkę z zabezpieczeniem HFE, pobierając 200 μl oleju HFE do strzykawki i wyposażając ją w igłę. Przymocuj odcinek rurki PE do igły i ręcznie zagruntuj żyłkę. Włóż koniec rurki PE do roztworu docelowego i ostrożnie wciągnij wszystkie 150 μl mieszanki PCR do rurki PE i strzykawki. Załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej.
  4. Załaduj strzykawkę o pojemności 1 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającą 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
  5. Generuj krople kodów kreskowych o wielkości 25 μm za pomocą urządzenia do wytwarzania kropli współprzepływowych.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3A dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.
    1. Zatkaj wlot ogniw urządzenia do tworzenia kropli z przepływem za pomocą małego kawałka lutu ołowiowego.
    2. Podłączyć strzykawki załadowane mieszanką HFE i PCR do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE, używając wlotu stopionej agarozy do mieszanki PCR z kodem kreskowym. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
    3. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w probówce PCR o pojemności 0,2 ml. Do sporządzania kropli należy stosować następujące (zalecane) natężenia przepływu: 600 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG i 200 μL/h dla mieszanki PCR. Zebrać krople do probówek do PCR, tak aby w każdej probówce znajdowało się około 50 μl kropli.
  6. Po wykonaniu kropli ostrożnie usuń dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąp ją olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% w/w środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG. Cykl termiczny z następującym protokołem: 98 °C przez 3 min, 40x (98 °C przez 10 s, 62 °C przez 20 s, 72 °C przez 20 s), 72 °C przez 5 min, a następnie trzymaj w temperaturze 12 °C.
    UWAGA: Kropelki poddane cyklom termicznym mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 dzień.
  7. Sprawdź szybkość wzmacniania i hermetyzacji kodów kreskowych.
    1. Przygotuj 1x barwienie kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów) w HFE z 2% w/w środkiem powierzchniowo czynnym PFPE-PEG; barwnik jest marginalnie mieszalny z HFE i wiąże się z DNA w kropelkach.
    2. Dodać 1 μl emulsji kodów kreskowych poddanych cyklom termicznym do 10 μl oleju barwiącego. Inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Kropelki obrazu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kanał GFP, długości fal wzbudzenia/emisji 497/520 nm) przy 200-krotnym powiększeniu i zliczanie szybkości enkapsulacji kodu kreskowego. Zauważ, że sygnał będzie dyskretny: kropelki zawierające wzmocnione kody kreskowe będą jasno fluoryzować, podczas gdy puste krople będą ciemne (Rysunek 4B).

7. Oznaczanie genomowego DNA w kropelkach

UWAGA: Zobacz Rysunek 2B.

  1. Przygotuj 500 μl roztworu do znakowania, używając odczynników z zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (patrz tabela materiałów). Użyj 7 μl enzymu do znakowania, 250 μl buforu do znakowania i 243 μl wody klasy PCR. Wymieszaj je przez wirowanie i odkręć mieszaninę, aby zebrać. Załadować ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z olejem HFE i wyposażyć ją w igłę.
  2. Przygotować mikrożele do ponownego wstrzyknięcia.
    1. Wirować probówkę z mikrożelem przez 2 minuty przy 2 000 x g i odessać supernatant. Przenieś 200 μl żeli na wierzch strzykawki z wkładem HFE z końcówką do pipety z żelem i uszczelnij dyszę małym kawałkiem taśmy.
    2. Za pomocą wydrukowanego w 3D adaptera wirówki (patrz pliki uzupełniające 1 i 2), wiruj strzykawkę z mikrożelem przez 3 minuty przy 3,000 x g.
    3. Usunąć ciekły supernatant ze strzykawki za pomocą końcówki pipety z żelem. Dociśnij warstwę mikrożelu do podstawy dyszy strzykawki. Wyposażyć strzykawkę w igłę.
  3. Załaduj strzykawkę o pojemności 3 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającym 2% w/w środka powierzchniowo czynnego perfluoropolieterowo-glikolu polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
  4. Ponownie kapsułkować mikrożele w kropelki zawierające odczynniki do znakowania.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 3B dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.
    1. Podłączyć strzykawki zawierające HFE, mieszankę do znakowania i mikrożele do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
    2. Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w pustej strzykawce o pojemności 1 ml z tłokiem przyciągniętym do linii o pojemności 1 ml.
    3. Stosować następujące (zalecane) prędkości przepływu dla kropli: 2 000 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG, 200 μL/h dla mikrożeli i 500 μL/h dla mieszanki do znakowania.
  5. Sprawdź szybkość kapsułkowania mikrożelu pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. Około 80 - 90% kropli powinno zawierać mikrożel, jak pokazano na Rysunek 4C.
  6. Założyć strzykawkę zawierającą emulsje znakujące z igłą i inkubować ją w pozycji pionowej w bloku grzewczym lub piecu przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C w celu fragmentacji genomowego DNA.

8. Kodowanie kreskowe pojedynczych komórek za pomocą podwójnego łączenia mikroprzepływowego

UWAGA: Zobacz Rysunek 2C.

  1. Przygotuj kropelki kodu kreskowego do połączenia, zastępując frakcję olejową FC-40 HFE 2% w/w PFPE-PEG. Ostrożnie przenieś te krople do strzykawki o pojemności 1 ml, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
  2. Załadować inkubowaną i oznakowaną strzykawkę z kroplami mikrożelu do pompy strzykawkowej.
  3. Przygotuj 500 μl mieszanki PCR. Dodaj odczynniki w następującej kolejności, aby zapobiec tworzeniu się osadów: 140 μL wody klasy PCR, 10 μL startera P5_DNA (10 μM stock, 0,2 μM final), 10 μL startera P7_BAR (10 μM stock, 0,2 μM final), 50 μL PEG 6k (50% w/v stocku, 5% końcowy), 50 μL polisorbatu 20 (50% v/v zapasu, 5% finału), 250 μL Taq Master Mix (2x) (patrz Tabela materiałów), 10 μL polimerazy izotermicznej (patrz Tabela materiałów) i 10 μL buforu neutralizującego (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj je, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie odkręć mieszaninę w dół, aby ją zebrać. Załaduj ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z wkładem HFE, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
  4. Załadować trzy strzykawki o pojemności 3 ml olejem fluorowanym (HFE) zawierającym 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposażyć każdą z nich w igłę i umieścić je w pompkach strzykawkowych.
  5. Załadować trzy strzykawki o pojemności 1 ml z 2 M NaCl, dopasować do każdej z nich igłę i odłożyć na bok.
  6. Połącz kropelki kodu kreskowego, oznaczone kropelki genomu i mieszankę PCR za pomocą urządzenia do podwójnego łączenia.
    UWAGA: Zobacz Rysunek 5 dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika oraz elektrody.
    1. Podłącz 3 strzykawki NaCl do 2 wlotów elektrod i wlotu pojedynczej fosy za pomocą kawałków rurki PE. W przypadku elektrod należy ręcznie docisnąć strzykawki, aż elektrody zostaną całkowicie wypełnione roztworem soli. Po napełnieniu elektrod należy ręcznie docisnąć strzykawkę do fosy, aż fosa zostanie wypełniona. Zatkaj wolny koniec fosy małym kawałkiem ołowianego lutowia.
    2. Podłącz 3 strzykawki HFE zamontowane na pompach do 2 wlotów oleju dystansowych i wlotu oleju do kroplowaniaza pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
    3. Podłącz strzykawkę z mieszanką PCR, strzykawkę z kroplami mikrożelu i strzykawkę z kroplami z kodem kreskowym do odpowiednich wlotów za pomocą rurki PE. Przestrzel wszystkie rurki do ponownego wstrzykiwania kropel pistoletem antystatycznym przed podłączeniem ich do igieł strzykawki; Obróbka antystatyczna zmniejsza ryzyko koalescencji kropel wywołanej przez ładunki elektrostatyczne na rurce PE.
    4. Podłącz kawałek rurki PE do wylotu i umieść wolny koniec w probówce PCR o pojemności 0.2 ml.
    5. Podłącz igłę strzykawki z elektrodą do falownika fluorescencyjnego z zimną katodą za pomocą zacisku krokodylkowego. Ustaw zasilanie prądem stałym falownika na 2 V.
    6. Uruchomić urządzenie do podwójnego łączenia z zalecanymi natężeniami przepływu: 300 μL/h dla oznakowanych kropli mikrożelu, 100 μL/h dla kropli z kodami kreskowymi, 1500 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (olej do tworzenia kropli), 600 μL/h dla mieszanki amplifikacyjnej, 200 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (olej do przekładek kodów kreskowych), i 700 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (microgel spacer oil). Zebrać krople do probówek PCR z około 50 μl emulsji w każdej probówce.
  7. Przed cyklem termicznym należy ostrożnie usunąć dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąpić je olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% w/w środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG. Cykl termiczny z następującym protokołem: 65 °C przez 5 min, 95 °C przez 2 min, 30x (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min), 72 °C przez 5 min, następnie utrzymuj w temperaturze 12 °C.
  8. Odzyskaj DNA z kodem kreskowym z kropelek poddanych cyklom termicznym.
    1. Zebrać kropelki w probówce do mikrowirówki i rozbić emulsje za pomocą 20 μl PFO. Wiruj je przez 10 sekund, aby wymieszać.
    2. Wirować probówkę o masie 10 000 x g przez 1 minutę, aby frakcjonować mieszaninę na fazę wodną (górną) i olejową (dolną). Ostrożnie usunąć górną warstwę wodną z probówki za pomocą pipety i przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki. Wyrzuć fazę olejową.
    3. Oczyścić produkt PCR z kodem kreskowym w kolumnie wirowej zgodnie z protokołem producenta i wymyć go w 20 μl 1x buforu TE.
    4. Przejdź do wykonanego sekwencjonowania i analizy zgodnie z krokami 9 i 10.

9. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki

  1. Przygotuj bibliotekę jednokomórkową do sekwencjonowania, postępując zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi wyboru wielkości fragmentów i kwantyfikacji.
  2. Sekwencjonuj bibliotekę sparowanych końców z domyślnym składem chemicznym dla odczytu 1 i odczytu 2. Użyj niestandardowego I7_READ startera Index 1 (Tabela 2), aby uzyskać odczyt indeksu 15 pz, odpowiadający jednokomórkowemu kodowi kreskowemu.

10. Analiza danych w jednej komórce

UWAGA: Niestandardowe skrypty Pythona do kontroli jakości i wstępnej analizy danych SiC-seq można pobrać z https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

  1. Uruchom skrypt "barcodeCleanup.py", aby przeprowadzić kontrolę jakości odczytów z kodami kreskowymi i wyeksportować dane z pojedynczej komórki do bazy danych SQLite. W przypadku eksperymentu kontrolnego użyj tego skryptu z flagą "-align" ustawioną w celu wyrównania odczytów do znanych genomów referencyjnych.
  2. Przeanalizuj czystość grup kodów kreskowych (dla eksperymentu kontrolnego) za pomocą skryptu "purity.py" i potwierdź wysokie wartości czystości zgodne z Rysunek 6B.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny przepływ pracy SiC-seq zawiera 3 urządzenia mikroprzepływowe PDMS wykonane przy użyciu procedury miękkiej litografii (Rysunek 1). Kroplarka współprzepływowa (Rysunek 3A) generuje 25 μm kropelek cyfrowego kodu kreskowego do znakowania genomowego DNA za pomocą unikalnego identyfikatora pojedynczej komórki. Oligonukleotydy kodu kreskowego składają się ze zdegenerowanej sekwencji o długości 15 pz otoczonej uchwytami PCR do amplifikacji (tabela 2, starter BAR). Kody kreskowe są rozcieńczane do stężenia femtomolowego w celu uzyskania enkapsulacji pojedynczej cząsteczki, a wszystkie kropelki otrzymują 0 lub 1 fragment(y) kodu kreskowego. Kropelki zawierające kod kreskowy są amplifikowane, co daje wiele kopii dwuniciowych amplikonów kodów kreskowych. Barwienie kwasem nukleinowym służy do weryfikacji pomyślnej amplifikacji i ilościowego określenia szybkości enkapsulacji fragmentów kodu kreskowego (Rysunek 4B). Mikrożele są wytwarzane przez współprzepływ zawiesiny komórek bakteryjnych i stopionego żelu agarozowego przy równych prędkościach przepływu (Rysunek 2A). Agaroza jest przygotowywana w dwukrotnie wyższym stężeniu końcowym niż pożądane, ponieważ proces wytwarzania kropli w przepływie skutecznie rozcieńcza roztwory wodne 2-krotnie. Gdy agaroza stygnie, krzepnie w mikrożel o średnicy 25 μm, zajmujący kulistą objętość kropli.

Seria etapów mycia i lizy oczyszcza genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w mikrożelach (Rysunek 2B). Po rozdrobnieniu emulsji przeprowadza się przemywanie wodą w dużych ilościach w celu rozcieńczenia śladowych rozpuszczalników organicznych, które mogą hamować dalszą obróbkę enzymatyczną. Umyte mikrożele obserwuje się pod mikroskopem w celu sprawdzenia szybkości enkapsulacji komórek (Rysunek 4A). Do zawiesiny mikrożelu dodaje się koktajl enzymów o szerokiej aktywności litycznej w celu trawienia ścian komórkowych bakterii i drobnoustrojów eukariotycznych19. Druga obróbka proteinazą K i detergentem degraduje białka i rozpuszcza resztki komórek.

Znakowanie oczyszczonego DNA odbywa się w kropelkach, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia krzyżowego wynikającego z dyfuzji małych oznaczonych fragmentów DNA między mikrożelami18. Urządzenie do kapsułkowania kropelek ( Rysunek 3B) dzieli każdy mikrożel na przedziały za pomocą buforu i enzymu tagującego, który jednocześnie fragmentuje dwuniciowe DNA, jednocześnie "oznaczając" je wstępnie załadowanym oligonukleotydem20. Mikrożele są ładowane do kropelek jako gęsto upakowane cząstki, osiągając szybkość enkapsulacji zbliżającą się do 1 mikrożelu na każdą kroplę z kilkoma dubletami21 (Rysunek 4C).

W końcowym kroku przepływu pracy mikroprzepływów (Rysunek 2C), urządzenie wykonuje operację podwójnego łączenia, łącząc 1 kroplę kodu kreskowego, 1 kroplę zawierającą mikrożel i mieszankę wzmacniającą w kontrolowanym dwuetapowym procesie. Najpierw kropla zawierająca odczynnik PCR jest parowana i łączona z kroplą kodu kreskowego w obszarze pokazanym na żółto (Rysunek 5). Elektrody słonowodne w kanale mikroprzepływowym wytwarzają wysoki gradient pola elektrycznego, który powoduje łączenie się kropel. W podobny sposób pierwsza scalona kropla jest parowana z kroplą mikrożelu i łączona po raz drugi w obszarze pokazanym na czerwono. Kropelki są zbierane i poddawane cyklom termicznym poza chipem w PCR z pojedynczym nakładaniem się (SOE). Nakładające się na siebie komplementarne końce kodu kreskowego i oznakowane genomowe DNA umożliwiają fuzję i wykładniczą amplifikację tylko prawidłowo oznaczonych konstruktów oznaczonych kodem kreskowym.

Dane sekwencjonowania są najpierw filtrowane według jakości odczytu, a następnie analizowane poprzez grupowanie odczytów według sekwencji kodów kreskowych 15 bp z pojedynczą komórką. Aby grupa kodów kreskowych została uznana za ważną, powinna zawierać minimalną liczbę odczytów; ten próg ogranicza analizę do komórek z użyteczną ilością danych sekwencjonowania i usuwa "osierocone" kody kreskowe z mutacją PCR ze zbioru danych. W tym przykładowym przebiegu wartość minimalna jest ustawiona na 7,5 kb/s na grupę (50 odczytów po 150 bp każdy). Histogram liczby kodów kreskowych w stosunku do wielkości grupy pokazuje, że znaczna część prawidłowych grup kodów kreskowych znajduje się tuż powyżej rozmiaru progowego (Rysunek 6A).

W eksperymencie kontrolnym, w którym znany jest skład społeczności mikrobiologicznej, wskaźniki czystości i względnej obfitości są używane do oceny jakości serii SiC-seq. Tutaj analizowana jest syntetyczna 10-komórkowa społeczność składająca się z 3 bakterii Gram-ujemnych, 5 bakterii Gram-dodatnich i 2 drożdży. Czystość danej grupy kodów kreskowych definiuje się jako liczbę odczytów odwzorowujących najpowszechniejszy genom w grupie podzieloną przez całkowitą liczbę odczytów w grupie. Zdecydowana większość grup kodów kreskowych ma czystość większą niż 0,95 (Rysunek 6B). Względna obfitość typów komórek jest obliczana przez zliczanie surowych odczytów i zliczanie grup kodów kreskowych, gdzie grupom przypisuje się typ komórki odpowiadający konsensusowi odczytów ich członków (Rysunek 6C). Obfitość odczytów i grup kodów kreskowych przebiega w mniej więcej równych proporcjach, co wskazuje, że populacje komórek są próbkowane w taki sposób, że niektóre gatunki nie są zawarte w nieproporcjonalnie małych lub dużych grupach kodów kreskowych. Wykreślenie zagregowanego pokrycia wszystkich grup kodów kreskowych z jednego gatunku wskazuje na wysoki zasięg w całym genomie, z niewielką liczbą regionów rezygnacji lub bez nich (Rysunek 7). Jednorodność pokrycia można zweryfikować za pomocą rozkładu częstości znormalizowanych wartości pokrycia, przy czym większość wartości jest wyśrodkowana wokół średniej (Rysunek 7, wstawka).

figure-results-1
Rysunek 1: Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych za pomocą fotolitografii. (A) Formy wzorcowe o pojedynczej wysokości cechy są wytwarzane przez wirowanie warstwy fotorezystu SU-8 na płytce krzemowej. Fotorezystor jest następnie modelowany za pomocą maski fotolitograficznej i światła UV, sieciując naświetlony SU-8. Na koniec nieusieciowany SU-8 rozpuszcza się w kąpieli wywoływaczowej. Powstała forma jest używana do odlewania PDMS, który jest połączony ze szklanym szkiełkiem w celu wytworzenia kompletnego urządzenia mikroprzepływowego. (B) W przypadku urządzenia dwuwarstwowego, produkcja podobnie rozpoczyna się od etapów powlekania wirowego i naświetlania. Te kroki są następnie powtarzane w celu stworzenia urządzenia dwuwarstwowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przegląd przepływu pracy SiC-seq. (A) Zawiesina mikrobiologiczna jest współpłynna ze stopioną agarozą w urządzeniu do wytwarzania kropli, aby zamknąć pojedyncze komórki w mikrożelach. (B) Mikrożele są poddawane serii płukania w celu oczyszczenia bakteryjnego genomowego DNA. Enzymy lityczne trawią ściany komórkowe bakterii Gram-dodatnich i drożdży, a detergent rozpuszcza resztki komórkowe. Mikrożele są ponownie kapsułkowane w kropelki w celu znakowania w celu zmniejszenia zanieczyszczenia krzyżowego. (C) Fuzja mikroprzepływowa łączy cyfrowy kod kreskowy PCR, oznakowany genom mikrożelu i mieszankę amplifikacyjną z częstotliwością >1 kHz. Off-chip SOE-PCR łączy unikalny jednokomórkowy kod kreskowy z oznakowanym genomem i selektywnie amplifikuje w pełni zakodowane konstrukty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Urządzenia mikroprzepływowe do wytwarzania kropli i re-kapsułkowania mikrożeli. (A) Ten panel przedstawia kroplówkę współprzepływową (25 μm wysokości elementu). Komórki i stopiona agaroza są wprowadzane do urządzenia przy równych natężeniach przepływu, aby wytworzyć kropelki 25 μm na złączu 25 μm x 25 μm. W przypadku cyfrowego tworzenia kodów kreskowych wlot ogniwa jest zatykany, a do wlotu agarozy wprowadzana jest mieszanina PCR. (B) Ten panel przedstawia urządzenie do rekapsułkowania mikrożelu (25 μm wysokości elementu). Mikrożele przepływają do wlotu w kształcie lejka, aby utrzymać ich ciasno upakowaną kolejność i otrzymują objętość mieszanki znakującej przed ponownym enkapsulacją w złączu 25 μm x 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mikrofotografie kropelek i mikrożeli. (A) Ten panel pokazuje umyte mikrożele o wielkości 25 μm przed lizą enzymatyczną. Bakterie są barwione fluorescencyjnie w celu ilościowego określenia szybkości enkapsulacji. Statystyki ładowania Poissona dyktują, że komórki powinny być kapsułkowane z szybkością 1 na 10 kropli lub mniej, aby zminimalizować częstotliwość zdarzeń wielokrotnej enkapsulacji. (B) Ten panel pokazuje obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kropelek cyfrowego kodu kreskowego o wielkości 25 μm potraktowanych barwieniem kwasem nukleinowym. Kropelki zawierające wzmocnione fragmenty kodu kreskowego wytwarzają silny sygnał fluorescencyjny. (C) Ten panel pokazuje mikrożele ponownie zamknięte w kroplach o wielkości 50 μm. Ścisłe upakowanie mikrożeli pozwala na szybkość kapsułkowania zbliżającą się do 1 żelu na kroplę z kilkoma dubletami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Mikroprzepływowe urządzenie do podwójnego łączenia do kodowania kreskowego genomu pojedynczej komórki. Dwuetapowa operacja łączenia łączy kropelki kodów kreskowych z oznaczonymi genomami z dużą przepustowością. Najpierw generowana jest kropla mieszaniny PCR i łączona z kropelką kodu kreskowego w obszarze pokazanym na żółto za pomocą elektrod słonowodnych. Następnie wprowadza się kroplę zawierającą mikrożel i łączy się ją po raz drugi w obszarze pokazanym na czerwono. Wloty oleju pozwalają na precyzyjną kontrolę odstępów między ponownie wstrzykiwanymi kropelkami. Komora wtrysku kodów kreskowych i jej olej dystansowy umieszczone są na krótszej warstwie 25 μm, zacienionej na niebiesko. Wszystkie inne cechy urządzenia należą do grubszej warstwy o całkowitej wysokości 45 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Metryki grupy kodów kreskowych dla 10-komórkowej społeczności syntetycznych mikroorganizmów. (A) Ten panel pokazuje rozkład rozmiarów grup kodów kreskowych. Liczba grup o danej wielkości zmniejsza się wykładniczo wraz ze wzrostem wielkości grupy. Minimalny próg wynoszący 7,5 kb/s na grupę ogranicza analizę do grup z wystarczającą ilością informacji i usuwa "osierocone" sekwencje z mutacją PCR. (B) Ten panel pokazuje rozkład czystości grup kodów kreskowych. Zdecydowana większość (>90%) grup ma bardzo wysoką czystość (>95%). (C) Ten panel pokazuje względną liczebność 10 gatunków obliczoną na poziomie grupy odczytu i kodu kreskowego. Te 2 metody liczenia dają podobne wyniki, co wskazuje, że rozmiary grup kodów kreskowych są spójne dla wszystkich gatunków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Zagregowane pokrycie genomowe grup kodów kreskowych Bacillus subtilis. Odczyty ze wszystkich grup kodów kreskowych odwzorowujących bakterię B. subtilis (N = 9 398) są łączone i analizowane w ujęciu zagregowanym. Okrągła mapa zasięgu ilustruje jednorodność zasięgu odczytów sekwencyjnych SiC, bez obserwowalnych obszarów zaniku. Przerywana linia na obwodzie oznacza średnie pokrycie (5,55x). Wstawka histogramu względnych częstości pokrycia pokazuje, że większość zasad jest pokryta na głębokości bliskiej średniej dla całego genomu, reprezentowanej przez linię przerywaną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt.
urządzenieWysokość 1. warstwy (μm)Prędkość wirowania 1. warstwy (obr./min)Wysokość 2. warstwy (μm)Prędkość wirowania 2. warstwy (obr./min)
Kroplowarka współprzepływowa254000N/aN/a
Re-enkapsulator żelowy254000N/aN/a
Podwójna fuzja254000205000

Tabela 1: Parametry produkcji urządzeń mikroprzepływowych. Poniższa tabela przedstawia listę urządzeń mikroprzepływowych używanych w przepływie pracy SiC-seq wraz z ich wymaganymi prędkościami do powlekania spinowego fotorezystu (w oparciu o specyfikacje producenta dla SU-8 3025).

etykieta>Sekwencja (5' > 3')
barGCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCCCCCGACACT
DNA_BARCTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCCCACGAGCGAGCGGGGCTGGCTCTTA
P7_BARCAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNAAATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

Tabela 2: Sekwencje podkładów.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowy przepływ pracy SiC-seq generuje dane sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki z tysięcy komórek bakteryjnych. Cyfrowe kody kreskowe wplecione w genomy komórek otoczonych mikrożelem pozwalają na dekonwolucję in silico danych NGS na grupy odczytów kodów kreskowych pochodzących z tej samej komórki. Eksperyment kontrolny na zbiorowisku drobnoustrojów o znanym składzie jest niezbędny do oceny czystości grup kodów kreskowych. Duża część grup o niskiej czystości wskazuje, że szybkość enkapsulacji komórek jest zbyt wysoka lub że podczas etapów przetwarzania mikroprzepływowego dochodzi do znacznego zanieczyszczenia krzyżowego kropelkami. Zgodnie ze statystykami Poissona, kody kreskowe i komórki powinny być zamknięte w docelowej proporcji 1 cząstki na każde 10 kropli, aby ograniczyć częstotliwość wielokrotnych zdarzeń enkapsulacji do mniej niż 5% wszystkich niepustych kropel. Wyższy współczynnik enkapsulacji zwiększa wykładniczo wskaźniki dubletów, dlatego weryfikacja współczynnika enkapsulacji podczas procesu wytwarzania kropli ma kluczowe znaczenie. Użytkownicy powinni zachować szczególną ostrożność w przypadku enkapsulacji wielu komórek w jednym mikrożelu, ponieważ odczyty z różnych komórek o tej samej sekwencji kodu kreskowego nie mogą być bioinformatyczne oddzielone. W przypadku, gdy 1 komórka otrzymuje 2 różne kody kreskowe, czystość grupy kodów kreskowych pozostaje nienaruszona, chociaż wskaźniki obfitości są zniekształcone podczas liczenia według sekwencji kodów kreskowych.

Zanieczyszczenie krzyżowe kropelkowe może również powstać z powodu nieoptymalnych warunków łączenia. Podczas udanej operacji urządzenie do łączenia mikroprzepływów (rysunek 5) może w kontrolowany sposób sparować 1 kroplę kodu kreskowego z 1 mikrożelem i objętością odczynnika PCR. Nieidealne natężenie przepływu spowoduje parowanie kropel w nieprawidłowych proporcjach: na przykład 1 kod kreskowy można sparować z 2 mikrożelami. Wszystkie natężenia przepływu wymienione w protokole mają charakter szacunkowy i mogą wymagać dostosowania w zależności od niewielkich różnic w geometrii urządzenia i rozmiarach kropel. Użytkownicy mający dostęp do kamer z możliwością szybkiego nagrywania (>10 000 klatek/s) powinni zweryfikować prawidłowe łączenie się kropel na początku i w trakcie operacji mikroprzepływowej. Użytkownicy, którzy nie mają dostępu do szybkiej kamery, mogą zebrać niewielką objętość połączonych danych wyjściowych i ręcznie zmierzyć rozmiary kropel pod mikroskopem. Wielkość kropel powinna być jednolita: nadmiar niepołączonych kodów kreskowych lub kropli mikrożelu wskazuje, że należy odpowiednio zmniejszyć szybkość ponownego wstrzykiwania.

Podczas obchodzenia się z mikrożelami i mikrokropelkami należy podjąć kilka ogólnych środków ostrożności, aby zachować ich integralność. Mikrożele, choć wytrzymałe mechanicznie, muszą być wystarczająco schłodzone przed etapem łamania i mycia, aby zapewnić całkowite żelowanie. Niesferyczne mikrożele wskazują, że agaroza nie miała odpowiedniego czasu na zestalenie. Podczas mycia mikrożeli należy odwirować zawiesiny z wymaganą prędkością, aby uniknąć utraty produktu. Hydrożel agarozowy ma współczynnik załamania światła ściśle zbliżony do indeksu wody i może być trudny do zauważenia w probówce22, dlatego użytkownicy powinni dokładnie określić granicę żel-ciecz przed aspiracją. Kropelki wody w oleju są podatne na koalescencję w wyniku narastania sił statycznych23 na rękawicach laboratoryjnych i rurkach. Z tego powodu zalecamy załadowanie strzykawek do ponownego wstrzykiwania kropelek gołymi rękami i potraktowanie wszystkich przewodów do ponownego wstrzykiwania pistoletem antystatycznym przed zalaniem pompy. Duże połączone kropelki można usunąć, powoli obracając emulsje w strzykawce i ręcznie zasysając większe krople, które gromadzą się w pobliżu góry ze względu na ich większą siłę wyporu.

SiC-seq to pierwsza technologia, która demonstruje sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki > 50 000 komórek bakteryjnych. Platforma ta oferuje znaczne korzyści w zakresie przepustowości w porównaniu z istniejącymi podejściami i umożliwia dokładniejsze pobieranie próbek heterogenicznych społeczności mikroorganizmów. Do tej pory technologie mikroprzepływowe do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki wykorzystywały mikrokomory9 i mikrostudzienki24 do izolacji i amplifikacji komórek, ale z przepustowością w zakresie zaledwie dziesiątek do setek komórek. Sortowanie przepływowe pojedynczych komórek do płytek studzienkowych 5,6 nie wymaga specjalistycznego oprzyrządowania mikroprzepływowego, ale charakteryzuje się podobnie niską przepustowością. Biorąc pod uwagę, że próbki gleby i wody ze środowiska zwykle mają różnorodność alfa wynoszącą >1000 na poziomie gatunku25,26, sekwencja SiC jest bardzo korzystna ze względu na jej zdolność do pobierania próbek znacznie większej liczby organizmów. Przepływ pracy SiC-seq można dostosować do danych wejściowych z hodowli laboratoryjnej, środowiska naturalnego lub żywego gospodarza. Próbka komórkowa musi być jedynie w zawiesinie wodnej i wolna od dużych cząstek (>10 μm), aby nadawała się do enkapsulacji mikroprzepływowej. Na przykład metoda ta została wcześniej zastosowana do próbki wody morskiej przy użyciu szeregu etapów płukania i filtrowania w celu wstępnego przetworzenia komórek przed enkapsulacją17.

Protokół SiC-seq generuje stosunkowo niewielką ilość danych sekwencjonowania z każdej pojedynczej komórki i może nie być odpowiedni dla wszystkich zastosowań. Niektóre algorytmy bioinformatyczne, takie jak składanie genomu de novo lub wywoływanie wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), wymagają większej głębokości pokrycia, aby działać skutecznie. Zamiast tego grupy kodów kreskowych mogą być grupowane in silico za pomocą taksonomicznych metod kategoryzacji27 , dzięki czemu algorytmy mogą być stosowane do większych zestawów odczytów. Stosunkowo niska ogólna wydajność kodów kreskowych w przepływie pracy SiC-seq może również stanowić wyzwanie w przypadkach, gdy dostępność próbki wejściowej jest niska. SiC-seq opiera się na etapie enkapsulacji kodów kreskowych z dystrybucją Poissona, dlatego około 10% komórek otrzymuje molekularny kod kreskowy i jest wzmacniane na ostatnim etapie przygotowania biblioteki. Chociaż jest to porównywalne z innymi schematami kodowania kreskowego opartymi na mikrokropelkach10, użytkownicy pracujący z cennymi próbkami komórek mogą mieć trudności z osiągnięciem odpowiedniej wydajności biblioteki do sekwencjonowania i mogą być zmuszeni do zwiększenia liczby cykli PCR na końcowym etapie amplifikacji. Innym potencjalnym rozwiązaniem dla użytkowników posiadających wiedzę z zakresu mikroprzepływów jest sortowanie dodatnich kropelek kodów kreskowych po etapie cyfrowego PCR, co zwiększa ogólną wydajność kodów kreskowych do >85%28.

Potencjalnym przyszłym kierunkiem rozwoju technologii SiC-seq jest dostosowanie przepływu pracy do użytku z komórkami ssaków, torując drogę do nowych badań klinicznych na pojedynczych komórkach. Na przykład analiza zmienności liczby kopii wśród pojedynczych komórek nowotworowych może pogłębić nasze zrozumienie roli heterogeniczności w patologii raka2. Alternatywnie, zintegrowanie SiC-seq z istniejącymi metodami badania i wzbogacania sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania29 umożliwiłoby ukierunkowane sekwencjonowanie pojedynczych komórek subpopulacji lub rzadkich szczepów komórek. Dzięki próbkom środowiskowym można było namierzyć geny pochodzące ze znanego szlaku metabolicznego i przeanalizować je kontekstowo wraz z sąsiednimi genami w celu zidentyfikowania nowych wysp genomowych. Z poziomu ludzkiego środowiska gospodarza można wyizolować próbki bakterii chorobotwórczych o niskim mianie i zsekwencjonować je na poziomie pojedynczej komórki, aby dokładniej zbadać ich genotypowe pochodzenie zjadliwości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patenty związane z tym przepływem pracy mogą być licencjonowane przez firmę Mission Bio, której udziałowcem jest Adam R. Abate.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation poprzez CAREER Award (numer grantu DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (numery grantów HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); oraz Defense Advanced Research Projects Agency Living Foundries Program (numery umów HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-calowe wafle krzemowe, typ P, klasa dziewiczatestowej Wafle uniwersyteckie447
SU-8 3025 fotorezystorMicrochem17030192
powlekarka wirowaSpecjalistyczne systemy powłokG3P-8
FotomaskiCadArt Servcies(niestandardowe)Zobacz pliki uzupełniające do projektów masek
Programista PGMEASigma-Aldrich
IsopropanolSigma-Aldrich109827
Sylgard 184Komora4019862
Bel-Art42025
Dziurkacz do biopsji 0,75 mmWorld Precision Instruments504529
Szkiełka mikroskopowe szklane (75 mm x 50 mm)Corning294775X50
Aquapel (hydrofobowa obróbka szkła)Pittsburgh Glass Works47100
Rurki polietylenowe PE-2Scientific CommoditiesB31695-PE/2
Strzykawki 1 mlIgły BD309628
27 GaugePompa
Era Pump SystemsNE-501
Novec HFE-7500 olej fluorowany ( HFE)3M98-0212-2928-5
FC-40 olej fluorowanySigma-AldrichF9755
Środek powierzchniowo czynny PEG-PFPERan Biotechnologies008-FluoroSurfaktant
Grzejnik Lasko CD09250 
Agaroza, niska temperatura żelowaniaSigma-Aldricha9414
TE (10X)Rocklandmb-007
PBS 1X, pH 7,4E& K Scientific ProductsEK-65083
OptiPrep (medium gradientu gęstości)Sigma-Aldrichd1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
Span 80 (monooleinian sorbitanu)Sigma-Aldrichs6760
HeksanSigma-Aldrich139386
Tween 20 (polisorbat 20)Sigma-Aldrichp2287
Lizozym typu IVMP Biomedicals195303
MutanolizynaSigma-AldrichM9901
Zymoliaza (enzym lityczny drożdży)Zymo Researche1004
LizostafinaSigma-AldrichL7386
Chlorek soduSigma-AldrichS9888
EDTASigma-AldrichE6758
Tris-HCl, pH 7,5, 1MInvitrogen15567-027
Ditiothreitol (DTT)Teknovad9750
Dodecylowy siarczan lituSigma-AldrichL9781
Proteinaza KNew England BiosciencesP8107S
Etanol, 200 Proof (100%)KoptecV1001
SYBR Green I (barwienie kwasami nukleinowymi)InvitrogenS7563
PEG 6kSigma-Aldrich81260
Triton X-100 (etoksylat oktylofenolu)Sigma-Aldricht8787
Nextera Zestaw do przygotowania biblioteki DNAIlluminaFC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)Nowa Anglia Nauki biologicznem05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)Applied Biosystems4464263
Warmstart 2.0 Bst Polimeraza (polimeraza izotermiczna)Bufor New England Biosciencesm0538m
NT z zestawu Nextera XT (bufor neutralizacyjny)IlluminaFC-131-1024
Inwerter fluorescencyjny z zimną katodą(niestandardowy)(niestandardowy)
Zasilacz prądu stałegoMastechHY1503D
Zerostat 3 pistolet antystatycznyMilty5036694022153
wydrukowany w 3D uchwyt na strzykawkę wirówki(niestandardowy)(niestandardowy)Zobacz pliki uzupełniające do pliku do druku 3D
Zymo DNA Clean & Koncentrator-5Zymo ResearchD4003
klasy 484431 Zestaw elastomerów silikonowych odgazowująca Krayden strzykawkowa BD 305109 New

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  2. Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
  3. Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
  4. Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
  5. Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
  6. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  7. Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
  8. Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
  9. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
  13. Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
  15. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784(2016).
  16. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  17. Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
  18. Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
  19. Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
  20. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
  21. Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).
  22. Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).
  23. Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
  24. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  25. Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).
  26. Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
  27. Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
  28. Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).
  29. Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrofluidyka kropelkowaenkapsulacja kom rektagmentacja DNAczenie kod w kreskowychoczyszczanie mikrogelisekwencjonowanie wysokoprzepustoweolej fluorescencyjnycykliczno termiczna

Powiązane artykuły