Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania >50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.
Artykuł metodologiczny
Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Technologie sekwencjonowania przeszły zmianę paradygmatu z rozdzielczości masowej na jednokomórkową w odpowiedzi na rozwijające się zrozumienie roli heterogeniczności komórkowej w systemach biologicznych. Jednak sekwencjonowanie pojedynczych komórek w dużych populacjach jest utrudnione przez ograniczenia w przetwarzaniu genomów do sekwencjonowania. W tym artykule opisujemy metodę sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki (SiC-seq), która wykorzystuje mikrofluidykę kropelkową do izolacji, amplifikacji i kodowania kreskowego genomów pojedynczych komórek. Enkapsulacja komórek w mikrożelach umożliwia przedziałowe oczyszczanie i znakowanie DNA, podczas gdy fuzja mikroprzepływowa skutecznie łączy każdy genom z unikalnym kodem kreskowym oligonukleotydu pojedynczej komórki, umożliwiając sekwencjonowanie > 50 000 pojedynczych komórek w jednym przebiegu. Dane sekwencjonowania są demultipleksowane za pomocą kodu kreskowego, generując grupy odczytów pochodzących z pojedynczych komórek. Jako metoda sekwencjonowania pojedynczych komórek o wysokiej przepustowości i niskim odchyleniu, SiC-seq umożliwi szerszy zakres badań genomicznych ukierunkowanych na różne populacje komórek.
Wprowadzenie
Genom służy jako plan tożsamości i funkcji komórki, zawierający całość potencjału kodującego organizmu. Zrozumienie biologii komórkowej na poziomie genomu może wyjaśnić obserwowaną różnorodność fenotypową w heterogenicznych populacjach komórek. Ta heterogeniczność jest widoczna w systemach biologicznych i ma szerokie implikacje dla zdrowia i chorób ludzkich. Na przykład różnice w liczbie kopii genów wśród komórek nowotworowych są związane z ewolucją i rozprzestrzenianiem się raka1,2. W infekcjach bakteryjnych wyspy chorobotwórczości obecne w niewielkiej części genomów mogą być przenoszone poziomo i prowadzić do namnażania się bakterii opornych na antybiotyki3,4. Podstawowym wyzwaniem w badaniu genomów na poziomie pojedynczej komórki jest niewielka ilość dostępnego DNA, a także konieczność analizy tysięcy komórek w celu pobrania próbki pełnej różnorodności genotypów. Z tych powodów ograniczenia w przepustowości eksperymentalnej utrudniły skuteczność badań na pojedynczych komórkach, wypaczając wyniki w kierunku najliczniejszych komórek. Techniki izolacji pojedynczych komórek, takie jak sortowanie przepływowe5,6, pęseta optyczna7, osadzanie w żelach luzem8 i microfluidics9 są w stanie przetwarzać setki komórek do sekwencjonowania; Stanowi to jednak tylko niewielki ułamek większości próbek. Metoda sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki o znacznie większej przepustowości pozwoliłaby na głębsze i pełniejsze profilowanie populacji komórek, wyjaśniając w ten sposób rolę różnorodności genotypowej w tych społecznościach.
Mikrofluidyka kropelkowa umożliwia wysokoprzepustową manipulację komórkami i odczynnikami biologicznymi w milionach reaktorów o skali pikolitrowej. Do tej pory technologie mikrokropelek były wykorzystywane do badania zróżnicowanych wzorców ekspresji między komórkami z heterogenicznych tkanek10,11,12, głęboko sekwencjonuj długie cząsteczki13,14,15, oraz przeprowadzaj analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChiP-seq) na pojedynczych komórkach16. Rzeczywiście, mikrokropelki są zdolne do wysokoprzepustowych, podzielonych na przedziały operacji, dzięki czemu można je stosować w genomice pojedynczej komórki. Rozwój tej technologii wiąże się jednak z unikalnymi wyzwaniami technologicznymi. Komórki muszą być poddawane lizie, oczyszczane i amplifikowane z minimalnym odchyleniem, aby równomiernie pobrać próbki z populacji komórek. Dodatkowo, w przeciwieństwie do poliadenylowanych transkryptów mRNA w komórkach ssaków, w genomie nie ma porównywalnego motywu molekularnego, który ułatwiałby wychwytywanie docelowego kwasu nukleinowego. Z tych powodów sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki było trudne do wdrożenia na platformach mikrokropelkowych.
W tej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół naszego wcześniej opisanego podejścia mikroprzepływowego do pojedynczych komórek, zdolnego do sekwencjonowania genomów dziesiątek tysięcy komórek w jednym eksperymencie17. Dzięki tej technologii, zwanej SiC-seq, komórki bakteryjne są zamykane w hydrożelach w skali mikronowej i indywidualnie lizowane, znakowane i łączone z mikrokropelką zawierającą unikalny oligonukleotydowy kod kreskowy, który jest spleciony z genomowym DNA komórki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z pojedynczym nałożeniem na siebie (PCR). Hydrożele służą jako izolowane pojemniki, w których genomowe DNA o wysokiej masie cząsteczkowej jest sterycznie zamknięte, umożliwiając mniejszym cząsteczkom, takim jak detergenty i enzymy lityczne, dostęp i oczyszczenie DNA przed kodowaniem kreskowym18. Protokół ten przetwarza >50 000 pojedynczych komórek w ciągu kilku godzin, w wyniku czego powstaje biblioteka kodów kreskowych gotowa do sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu odczyty są demultipleksowane zgodnie z sekwencją kodów kreskowych w jednej komórce, w wyniku czego powstaje zestaw danych składający się z milionów odczytów, z których każdy ma indeks komórkowy.
Protokół
1. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych
- Przygotuj projekty masek mikroprzepływowych za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (dostarczonego jako . Plik DWG; patrz Pliki uzupełniające). Zleć wydrukowanie tych projektów przez dostawcę w rozdzielczości 10 μm na folii na płytce drukowanej.
UWAGA: W przypadku wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych odpowiednie maski zawierają znaczniki wyrównania. - Dla każdego urządzenia wyprodukuj główną formę SU-8 (Rysunek 1A) w następujący sposób.
- Przygotuj wafel krzemowy o średnicy 3 cali, wlewając około 1 ml fotorezystu SU-8 3025 na środek płytki. Zabezpiecz wafel na uchwycie powlekarki wirowej, stosując ssanie.
- Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z listą grubości warstw i prędkości wirowania dla każdego urządzenia. W przypadku wszystkich urządzeń powlekanie wirowania należy rozpocząć od 30 s przy 500 obr./min, a następnie 30 s przy wskazanej prędkości.
- Wyjmij wafel silikonowy SU-8 z wirówki i piecz go na miękko na płycie grzejnej ustawionej na 135 °C przez 30 minut. Po upieczeniu pozostaw wafel do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
- Wystaw płytkę krzemową SU-8 z odpowiednią maską mikroprzepływową pod skolimowaną diodą LED UV o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty.
- Po ekspozycji wafelek pieczemy na twardo na płycie grzejnej ustawionej na 135 °C przez 1 min. Postępując zgodnie z tym etapem pieczenia, pozwól wafli ostygnąć do temperatury pokojowej.
- W przypadku jednowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego przejdź do kroku 1.2.7. W przypadku wielowarstwowego urządzenia mikroprzepływowego powtórz kroki 1.2.1 - 1.2.5 dla drugiej warstwy fotorezystu (Rysunek 1B).
- Po pierwszym twardym pieczeniu w przypadku urządzenia jednowarstwowego (lub drugim twardym w przypadku urządzenia wielowarstwowego), należy rozwinąć wafel, zanurzając go w kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 30 minut.
- Po rozwinięciu wafla użyj butelki ze spryskiwaczem zawierającej PGMEA, aby wypłukać wafel. Następnie opłucz wafel butelką ze spryskiwaczem zawierającą izopropanol przed umieszczeniem go na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę do wyschnięcia.
- Umieść wafel (zwany dalej mistrzem) na szalce Petriego w celu odlewania z polidimetylosiloksanem (PDMS).
- Po przygotowaniu wzorca w kroku 1.2 przystąp do wykonania urządzenia za pomocą odlewu PDMS.
- Przygotuj PDMS, łącząc bazę silikonową z utwardzaczem w stosunku 11:1 masowo. Wymieszaj bazę silikonową i utwardzacz ręcznie za pomocą patyczka do mieszania.
- Odgazowuje PDMS, umieszczając go w komorze odgazowującej i stosując próżnię. Pozwól PDMS odgazować się, aż pęcherzyki powietrza przestaną być widoczne (zwykle 30 minut).
- Ostrożnie wylać odgazowany PDMS na urządzenie główne, do końcowej grubości warstwy PDMS wynoszącej około 5 mm. Ponownie odgazuj PDMS, aby zapewnić usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza.
- Po odgazowaniu piec PDMS i master w temperaturze 80 °C przez 80 minut.
- Ostrożnie wytnij utwardzoną płytę PDMS z pieczonego mistrza za pomocą żyletki. Upewnij się, że wszystkie nacięcia znajdują się na wierzchu płytki krzemowej.
UWAGA: Wszelkie nacięcia wykonane na płytce krzemowej mogą spowodować, że warga uniemożliwi równomierne połączenie. - Przebić wloty i wyloty za pomocą stempla biopsyjnego 0,75 mm. Usuń kurz i zabłąkane PDMS za pomocą taśmy pakowej po stronie funkcji urządzenia.
- Przed przystąpieniem do obróbki plazmowej urządzenia należy oczyścić szkiełko o wymiarach 50 mm x 75 mm, spłukując je izopropanolem i susząc.
- W celu obróbki plazmowej umieść płytę PDMS i szkiełko szklane w spawarce plazmowej elementami skierowanymi do góry. Zabieg plazmowy należy wykonywać przy użyciu osocza 1 mbarO2 przez 1 min. Przymocuj urządzenie do szklanego szkiełka, zbliżając do siebie odsłonięte lub skierowane do góry strony.
- Po zabiegu plazmowym piecz urządzenie w temperaturze 80 °C przez 40 minut.
- Na koniec wstrzyknij płyn do obróbki powierzchni szkła do jednego z wlotów, aby kanały mikroprzepływowe stały się hydrofobowe. Upewnij się, że wszystkie kanały są całkowicie zalane roztworem i powtórzyć wstrzyknięcie dla każdego kroplomierza. Piec poddane działaniu środka urządzenie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika.
2. Enkapsulacja komórek w mikrożelach agarozowych
UWAGA: Zobacz Rysunek 2A.
- Przygotować 1 ml agarozy o niskiej temperaturze topnienia 3% w/v w 1x bufor Tris-EDTA (TE). Roztwór agarozy należy przechowywać w bloku grzewczym o temperaturze 90 °C do momentu bezpośrednio przed załadowaniem strzykawki.
- Przygotować zawiesinę komórkową.
UWAGA: Ten protokół i związane z nim urządzenia mikroprzepływowe zostały zatwierdzone do pracy z komórkami bakteryjnymi, zarówno z zamrożonego bulionu, jak i świeżego preparatu. Komórki ssaków, w zależności od typu komórki, mogą wymagać dostosowania wymiarów kanału mikroprzepływowego, aby dostosować się do większych rozmiarów komórek.- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Policz komórki w hemocytometrze lub przez sortowanie przepływowe. W przypadku mikrożeli 25 μm o docelowej szybkości enkapsulacji komórek 1 do 10 należy przygotować 1 ml zawiesiny komórkowej o końcowym stężeniu 2,4 x 107 komórek/ml.
- Obracaj komórki w dół w temperaturze 3 000 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki o gradiencie gęstości 17% v/v (patrz Tabela materiałów) w PBS. Przechowywać lek na lodzie do momentu załadowania strzykawki.
- Załaduj strzykawkę o pojemności 3 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającą 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę 27 G i umieść w pompie strzykawkowej.
UWAGA: Wyposażyć wszystkie strzykawki w igłę 27 G do etapów mikroprzepływowych w tym protokole. Aby zmniejszyć ryzyko przypadkowego ukłucia, należy trzymać nasadki na wszystkich igłach do momentu rozpoczęcia pracy pompy. - Załaduj zawiesinę komórek i stopioną agarozę do strzykawek o pojemności 1 ml, dopasuj je do igieł o rozmiarze 27 i umieść je w pompkach strzykawkowych.
- Utrzymuj strzykawkę z agarozą i pompuj w cieple za pomocą małego grzejnika, aby zapobiec zżeltywowaniu agarozy w strzykawce i rurkach wlotowych. Ustaw grzejnik w pozycji HIGH i ustaw go tak, aby powierzchnia grzewcza znajdowała się w odległości około 10 cm od strzykawki. Upewnij się, że temperatura mierzona na strzykawce wynosi około 80 °C.
UWAGA: Użytkownikom zaleca się utrzymywanie grzałki w zalecanej odległości od aparatu pompującego, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia sprzętu, w tym stopienia przewodów. - Wygeneruj krople mikrożelu o wielkości 25 μm za pomocą urządzenia do wytwarzania kropli współprzepływowych.
UWAGA: Zobacz Rysunek 3A dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.- Podłącz igły strzykawki do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki z polietylenu (PE). Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
- Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
- Do sporządzania kropli należy stosować następujące (zalecane) szybkości przepływu: 800 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG; 200 μL/h dla zawiesiny komórek w PBS i 200 μL/h dla 3% w/v agarozy.
- Po przygotowaniu kropli umieścić probówkę zbiorczą w temperaturze 4 °C na 30 minut, aby zapewnić całkowite zżelowanie agarozy.
3. Rozbijanie i mycie mikrożeli agarozowych
- Usunąć dolną warstwę oleju z probówki zbiorczej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę o sile 20 G, uważając, aby nie naruszyć górnej warstwy kropelek agarozy.
- Rozbij emulsje perfluorooktanolem (PFO).
- Dodaj 1 ml 10% v/v PFO w HFE do kropli agarozy. Pipetować ten roztwór w górę iw dół przez 1 minutę, aby dokładnie pokryć emulsje.
UWAGA: Na wszystkich etapach płukania mikrożelem należy pipetować roztwory za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl. Po odpipetowaniu zawiesina mikrożelu powinna wydawać się jednorodna i wolna od grudek. - Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2 000 x g przez 1 minutę, aby zebrać mikrożele agarozowe. Usunąć supernatant PFO/HFE przez aspirację; Mikrożele są teraz wolne od warstwy środków powierzchniowo czynnych i będą przezroczyste.
- Dodaj 1 ml 10% v/v PFO w HFE do kropli agarozy. Pipetować ten roztwór w górę iw dół przez 1 minutę, aby dokładnie pokryć emulsje.
- Umyj mikrożele środkiem powierzchniowo czynnym w heksanie.
UWAGA: Heksan jest lotnym rozpuszczalnikiem organicznym, a mycie w kroku 3.3 powinno odbywać się pod wyciągiem.- Dodać 2 ml 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego monooleinianu sorbitanu (patrz tabela materiałów) w heksanie do mikrożeli agarozowych. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać, zapewniając całkowite rozdrobnienie granulek mikrożelu.
- Obracaj probówkę o masie 1 000 x g przez 1 minutę, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia roztworu środka powierzchniowo czynnego/heksanu.
- Powtórzyć płukanie środkiem powierzchniowo czynnym/heksanem.
- Umyj mikrożele w wodnym buforze, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.
- Dodaj 5 ml buforu TET [0,1% v/v etoksylowanego niejonowego detergentu oktylofenolowego (patrz tabela materiałów) w 1x TE] do stożkowej probówki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
- Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia buforu TET.
- Powtórz pranie TET 2x.
- Dodaj 5 ml buforu 1x TE do stożkowej probówki. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
- Obracaj stożkową probówkę o wymiarach 2,000 x g przez 2 minuty, aby zebrać mikrożele. Odessać supernatant w celu usunięcia buforu TE.
- Powtórz pranie TE.
- Sprawdź enkapsulację komórek w mikrożelach pod mikroskopem pod 400-krotnym powiększeniem, barwiąc 10 μl porcji żeli 1x barwieniem kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Mikrożele będą przezroczyste pod przezroczystym kanałem, podczas gdy DNA komórki będzie fluoryzować pod kanałem GFP (długości fal wzbudzenia/emisji 497/520 nm). Nakładka przezroczystych i fluorescencyjnych kanałów pokaże komórki w mikrożelach, jak pokazano na Rysunek 4A.
4. Liza komórek w agarozie za pomocą enzymów litycznych
- Przygotować 1 ml koktajlu enzymów litycznych przy użyciu 800 μl buforu TE (1x), 2 μl enzymu litycznego drożdży (5 U/μL bulionu, 10 U/ml końcowego), 30 μL ditiotreitolu (1 M bulion, 30 mM końcowy), 60 mg lizozymu (liofilizowany proszek), 15 μL EDTA (0,5 M bulionu, 7,5 mM wersja ostateczna), 2 μl mutanolizyny (100 U/μL zapasu, 200 U/ml wersja ostateczna), 2 μL lizostafiny (10 U/μL zapasu, 20 U/ml wersji końcowej) i 30 μL NaCl (1 M zapas, 30 mM wersja ostateczna).
- Dodaj więcej TE, aby zwiększyć objętość do 1 ml. Wymieszaj roztwór, wirując.
- Dodaj cały 1 ml roztworu enzymu litycznego do nie więcej niż 1 ml umytych mikrożeli. Mieszać pipetując 10x. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez >2 godziny w wytrząsarce (maksimum to inkubacja przez noc).
5. Leczenie mikrożelem na bazie detergentu
- Po lizie za pomocą enzymów litycznych (krok 4) umyj mikrożele.
- Odwiruj mikrożele w temperaturze 2 000 x g przez 2 minuty i odessaj supernatant. Kropelki będą wydawać się nieprzezroczyste białe, z powodu resztek komórek rozproszonych w granulce.
- Ponownie zawiesić mikrożele w 5 ml 10 mM buforu Tris-HCl i pipetować w górę iw dół 10x, aby wymieszać.
- Wirować mieszaninę w temperaturze 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
- Wykonaj zabieg detergentowy na mikrożelach.
- Ponownie zawiesić żele w buforze do lizy dodecylosiarczanu litu (LiDS) (0,5% w/v LiDS w 20 mM Tris-HCl) i 60 μl 0,5 M EDTA do końcowej objętości 3 ml.
- Dodać 5 μl enzymu proteinazy K (800 j./ml bulionu). Pipetować w górę i w dół 10x, aby wymieszać, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze 42 °C na bloku grzewczym przez 1 godzinę w celu rozpuszczenia błon komórkowych i strawienia białek.
- Po zabiegu detergentowym umyj mikrożele.
- Wirować stożkową probówkę z mikrożelami w dół o masie 2 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant przez aspirację.
- Umyj mikrożele 10 ml 2% v/v polisorbatu 20 w wodzie. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
- Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
- Umyj mikrożele 10 ml 100% etanolu, aby dezaktywować wszelkie pozostałości enzymu. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
- Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
- Umyj mikrożele 10 ml 0,02% v/v polysorbate 20 w wodzie. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.
- Obracać stożkową probówkę w dół o wymiarach 2 000 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
- Powtórzyć płukanie polisorbatem 20 3 razy. Przepuść roztwór przez sitko do komórek o średnicy 100 μm przed ostatnim płukaniem, aby usunąć wszelkie duże grudki.
- Ponownie zawiesić mikrożele w 5 ml 10 mM buforu Tris-HCl, aby zapobiec degradacji DNA. Mikrożele mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed znakowaniem (etap 7).
6. Generowanie kropelek kodów kreskowych metodą Digital PCR
- Przygotuj 500-pM zapas startera BAR (Tabela 2) w buforze 1x TE w probówce o niskim wiązaniu. Przed każdym użyciem rozcieńczyć podkład do poziomu 1 pM i podgrzewać go do temperatury 70 °C przez 1 minutę na bloku grzewczym.
- Przygotować 150 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, używając 75 μl wysokiej jakości mieszanki wzorcowej gorącego startu (patrz tabela materiałów) (2x), 42 μl wody klasy PCR, 3 μl startera DNA_BAR (10 μM podstawy, 0,2 μM końcowy), 3 μL startera P7_BAR (10 μM zapasu, 0,2 μM końcowy), 6 μl rozcieńczenia kodu kreskowego (1 pM zapas, 40 fM końcowy), 6 μl polisorbatu 20 (50% v/v stock, 2% final) i 15 μl PEG 6k (50% w/v stock, 5% final). Mieszać pipetując w górę i w dół 10 razy.
- Przygotuj strzykawkę z zabezpieczeniem HFE, pobierając 200 μl oleju HFE do strzykawki i wyposażając ją w igłę. Przymocuj odcinek rurki PE do igły i ręcznie zagruntuj żyłkę. Włóż koniec rurki PE do roztworu docelowego i ostrożnie wciągnij wszystkie 150 μl mieszanki PCR do rurki PE i strzykawki. Załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej.
- Załaduj strzykawkę o pojemności 1 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającą 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
- Generuj krople kodów kreskowych o wielkości 25 μm za pomocą urządzenia do wytwarzania kropli współprzepływowych.
UWAGA: Zobacz Rysunek 3A dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.- Zatkaj wlot ogniw urządzenia do tworzenia kropli z przepływem za pomocą małego kawałka lutu ołowiowego.
- Podłączyć strzykawki załadowane mieszanką HFE i PCR do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE, używając wlotu stopionej agarozy do mieszanki PCR z kodem kreskowym. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
- Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w probówce PCR o pojemności 0,2 ml. Do sporządzania kropli należy stosować następujące (zalecane) natężenia przepływu: 600 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG i 200 μL/h dla mieszanki PCR. Zebrać krople do probówek do PCR, tak aby w każdej probówce znajdowało się około 50 μl kropli.
- Po wykonaniu kropli ostrożnie usuń dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąp ją olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% w/w środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG. Cykl termiczny z następującym protokołem: 98 °C przez 3 min, 40x (98 °C przez 10 s, 62 °C przez 20 s, 72 °C przez 20 s), 72 °C przez 5 min, a następnie trzymaj w temperaturze 12 °C.
UWAGA: Kropelki poddane cyklom termicznym mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 dzień. - Sprawdź szybkość wzmacniania i hermetyzacji kodów kreskowych.
- Przygotuj 1x barwienie kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów) w HFE z 2% w/w środkiem powierzchniowo czynnym PFPE-PEG; barwnik jest marginalnie mieszalny z HFE i wiąże się z DNA w kropelkach.
- Dodać 1 μl emulsji kodów kreskowych poddanych cyklom termicznym do 10 μl oleju barwiącego. Inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Kropelki obrazu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (kanał GFP, długości fal wzbudzenia/emisji 497/520 nm) przy 200-krotnym powiększeniu i zliczanie szybkości enkapsulacji kodu kreskowego. Zauważ, że sygnał będzie dyskretny: kropelki zawierające wzmocnione kody kreskowe będą jasno fluoryzować, podczas gdy puste krople będą ciemne (Rysunek 4B).
7. Oznaczanie genomowego DNA w kropelkach
UWAGA: Zobacz Rysunek 2B.
- Przygotuj 500 μl roztworu do znakowania, używając odczynników z zestawu do przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (patrz tabela materiałów). Użyj 7 μl enzymu do znakowania, 250 μl buforu do znakowania i 243 μl wody klasy PCR. Wymieszaj je przez wirowanie i odkręć mieszaninę, aby zebrać. Załadować ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z olejem HFE i wyposażyć ją w igłę.
- Przygotować mikrożele do ponownego wstrzyknięcia.
- Wirować probówkę z mikrożelem przez 2 minuty przy 2 000 x g i odessać supernatant. Przenieś 200 μl żeli na wierzch strzykawki z wkładem HFE z końcówką do pipety z żelem i uszczelnij dyszę małym kawałkiem taśmy.
- Za pomocą wydrukowanego w 3D adaptera wirówki (patrz pliki uzupełniające 1 i 2), wiruj strzykawkę z mikrożelem przez 3 minuty przy 3,000 x g.
- Usunąć ciekły supernatant ze strzykawki za pomocą końcówki pipety z żelem. Dociśnij warstwę mikrożelu do podstawy dyszy strzykawki. Wyposażyć strzykawkę w igłę.
- Załaduj strzykawkę o pojemności 3 ml z olejem fluorowanym (HFE) zawierającym 2% w/w środka powierzchniowo czynnego perfluoropolieterowo-glikolu polietylenowego (PFPE-PEG), wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
- Ponownie kapsułkować mikrożele w kropelki zawierające odczynniki do znakowania.
UWAGA: Zobacz Rysunek 3B dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika.- Podłączyć strzykawki zawierające HFE, mieszankę do znakowania i mikrożele do wlotów urządzenia mikroprzepływowego za pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
- Podłącz kawałek rurki do wylotu i umieść wolny koniec w pustej strzykawce o pojemności 1 ml z tłokiem przyciągniętym do linii o pojemności 1 ml.
- Stosować następujące (zalecane) prędkości przepływu dla kropli: 2 000 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG, 200 μL/h dla mikrożeli i 500 μL/h dla mieszanki do znakowania.
- Sprawdź szybkość kapsułkowania mikrożelu pod mikroskopem świetlnym przy 400-krotnym powiększeniu. Około 80 - 90% kropli powinno zawierać mikrożel, jak pokazano na Rysunek 4C.
- Założyć strzykawkę zawierającą emulsje znakujące z igłą i inkubować ją w pozycji pionowej w bloku grzewczym lub piecu przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C w celu fragmentacji genomowego DNA.
8. Kodowanie kreskowe pojedynczych komórek za pomocą podwójnego łączenia mikroprzepływowego
UWAGA: Zobacz Rysunek 2C.
- Przygotuj kropelki kodu kreskowego do połączenia, zastępując frakcję olejową FC-40 HFE 2% w/w PFPE-PEG. Ostrożnie przenieś te krople do strzykawki o pojemności 1 ml, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
- Załadować inkubowaną i oznakowaną strzykawkę z kroplami mikrożelu do pompy strzykawkowej.
- Przygotuj 500 μl mieszanki PCR. Dodaj odczynniki w następującej kolejności, aby zapobiec tworzeniu się osadów: 140 μL wody klasy PCR, 10 μL startera P5_DNA (10 μM stock, 0,2 μM final), 10 μL startera P7_BAR (10 μM stock, 0,2 μM final), 50 μL PEG 6k (50% w/v stocku, 5% końcowy), 50 μL polisorbatu 20 (50% v/v zapasu, 5% finału), 250 μL Taq Master Mix (2x) (patrz Tabela materiałów), 10 μL polimerazy izotermicznej (patrz Tabela materiałów) i 10 μL buforu neutralizującego (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj je, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie odkręć mieszaninę w dół, aby ją zebrać. Załaduj ten roztwór do strzykawki o pojemności 1 ml z wkładem HFE, wyposaż ją w igłę i umieść w pompie strzykawkowej.
- Załadować trzy strzykawki o pojemności 3 ml olejem fluorowanym (HFE) zawierającym 2% w/w środka powierzchniowo czynnego z glikolu perfluoropolieterowo-polietylenowego (PFPE-PEG), wyposażyć każdą z nich w igłę i umieścić je w pompkach strzykawkowych.
- Załadować trzy strzykawki o pojemności 1 ml z 2 M NaCl, dopasować do każdej z nich igłę i odłożyć na bok.
- Połącz kropelki kodu kreskowego, oznaczone kropelki genomu i mieszankę PCR za pomocą urządzenia do podwójnego łączenia.
UWAGA: Zobacz Rysunek 5 dla schematu urządzenia wskazującego lokalizację wlotów i wylotów odczynnika oraz elektrody.- Podłącz 3 strzykawki NaCl do 2 wlotów elektrod i wlotu pojedynczej fosy za pomocą kawałków rurki PE. W przypadku elektrod należy ręcznie docisnąć strzykawki, aż elektrody zostaną całkowicie wypełnione roztworem soli. Po napełnieniu elektrod należy ręcznie docisnąć strzykawkę do fosy, aż fosa zostanie wypełniona. Zatkaj wolny koniec fosy małym kawałkiem ołowianego lutowia.
- Podłącz 3 strzykawki HFE zamontowane na pompach do 2 wlotów oleju dystansowych i wlotu oleju do kroplowaniaza pomocą kawałków rurki PE. Przed włożeniem rurek do urządzenia należy zalać pompy, aby usunąć powietrze z przewodu.
- Podłącz strzykawkę z mieszanką PCR, strzykawkę z kroplami mikrożelu i strzykawkę z kroplami z kodem kreskowym do odpowiednich wlotów za pomocą rurki PE. Przestrzel wszystkie rurki do ponownego wstrzykiwania kropel pistoletem antystatycznym przed podłączeniem ich do igieł strzykawki; Obróbka antystatyczna zmniejsza ryzyko koalescencji kropel wywołanej przez ładunki elektrostatyczne na rurce PE.
- Podłącz kawałek rurki PE do wylotu i umieść wolny koniec w probówce PCR o pojemności 0.2 ml.
- Podłącz igłę strzykawki z elektrodą do falownika fluorescencyjnego z zimną katodą za pomocą zacisku krokodylkowego. Ustaw zasilanie prądem stałym falownika na 2 V.
- Uruchomić urządzenie do podwójnego łączenia z zalecanymi natężeniami przepływu: 300 μL/h dla oznakowanych kropli mikrożelu, 100 μL/h dla kropli z kodami kreskowymi, 1500 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (olej do tworzenia kropli), 600 μL/h dla mieszanki amplifikacyjnej, 200 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (olej do przekładek kodów kreskowych), i 700 μL/h dla HFE 2% w/w PFPE-PEG (microgel spacer oil). Zebrać krople do probówek PCR z około 50 μl emulsji w każdej probówce.
- Przed cyklem termicznym należy ostrożnie usunąć dolną warstwę oleju HFE z emulsji za pomocą żelowych końcówek pipet i zastąpić je olejem fluorowanym FC-40 zawierającym 5% w/w środka powierzchniowo czynnego PFPE-PEG. Cykl termiczny z następującym protokołem: 65 °C przez 5 min, 95 °C przez 2 min, 30x (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 72 °C przez 1 min), 72 °C przez 5 min, następnie utrzymuj w temperaturze 12 °C.
- Odzyskaj DNA z kodem kreskowym z kropelek poddanych cyklom termicznym.
- Zebrać kropelki w probówce do mikrowirówki i rozbić emulsje za pomocą 20 μl PFO. Wiruj je przez 10 sekund, aby wymieszać.
- Wirować probówkę o masie 10 000 x g przez 1 minutę, aby frakcjonować mieszaninę na fazę wodną (górną) i olejową (dolną). Ostrożnie usunąć górną warstwę wodną z probówki za pomocą pipety i przenieść ją do nowej probówki do mikrowirówki. Wyrzuć fazę olejową.
- Oczyścić produkt PCR z kodem kreskowym w kolumnie wirowej zgodnie z protokołem producenta i wymyć go w 20 μl 1x buforu TE.
- Przejdź do wykonanego sekwencjonowania i analizy zgodnie z krokami 9 i 10.
9. Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki
- Przygotuj bibliotekę jednokomórkową do sekwencjonowania, postępując zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi wyboru wielkości fragmentów i kwantyfikacji.
- Sekwencjonuj bibliotekę sparowanych końców z domyślnym składem chemicznym dla odczytu 1 i odczytu 2. Użyj niestandardowego I7_READ startera Index 1 (Tabela 2), aby uzyskać odczyt indeksu 15 pz, odpowiadający jednokomórkowemu kodowi kreskowemu.
10. Analiza danych w jednej komórce
UWAGA: Niestandardowe skrypty Pythona do kontroli jakości i wstępnej analizy danych SiC-seq można pobrać z https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.
- Uruchom skrypt "barcodeCleanup.py", aby przeprowadzić kontrolę jakości odczytów z kodami kreskowymi i wyeksportować dane z pojedynczej komórki do bazy danych SQLite. W przypadku eksperymentu kontrolnego użyj tego skryptu z flagą "-align" ustawioną w celu wyrównania odczytów do znanych genomów referencyjnych.
- Przeanalizuj czystość grup kodów kreskowych (dla eksperymentu kontrolnego) za pomocą skryptu "purity.py" i potwierdź wysokie wartości czystości zgodne z Rysunek 6B.
Wyniki
Procedura eksperymentalna SiC-seq obejmuje 3 mikroprzepływowe urządzenia PDMS wykonane metodą miękkiej litografii (Rysunek 1). Generator kropel współpłynnych (Rysunek 3A) wytwarza krople cyfrowych kodów kreskowych o rozmiarze 25 µm służące do znakowania DNA genomowego unikalnym identyfikatorem pojedynczej komórki. Oligonukleotydy kodów kreskowych składają się z 15 bp sekwencji zdegenerowanej, flankowanej przez uchwyty PCR do amplifikacji (Tabela 2, starter BAR). Kody kreskowe rozcieńcza się do stężenia femtomolarnego, aby uzyskać enkapsulację pojedynczych cząsteczek, tak aby każda kropla zawierała 0 lub 1 fragment kodu. Krople zawierające kod są amplifikowane, co daje wiele kopii dwuniciowych amplikonów kodów kreskowych. Barwnik kwasów nukleinowych jest wykorzystywany do weryfikacji pomyślnej amplifikacji oraz ilościowego określenia stopnia enkapsulacji fragmentów kodów kreskowych (Rysunek 4B). Mikrzele są generowane poprzez współpłynięcie zawiesiny komórek bakteryjnych i stopionego żelu agarozy przy równych prędkościach przepływu (Rysunek 2A). Agarozę przygotowuje się w dwukrotności pożądanej stężenia końcowego, ponieważ proces generowania kropel współpłynnych skutecznie rozcieńcza roztwory wodne dwukrotnie. W miarę stygnięcia agaroza krzepnie, tworząc mikrzele o średnicy 25 µm zajmujące sferyczną objętość kropli.
Seria etapów przemywania i lizy służy do oczyszczania wysokocząsteczkowego DNA genomowego w mikrogelach (Rysunek 2B). Po rozbiciu emulsji przeprowadza się przemywania wodne w dużych objętościach, aby rozcieńczyć śladowe ilości rozpuszczalników organicznych, które mogą hamować późniejsze procesy enzymatyczne. Przemyte mikrogela obserwuje się pod mikroskopem w celu zweryfikowania stopnia enkapsulacji komórek (Rysunek 4A). Do zawiesiny mikrogeli dodaje się koktajl enzymów o szerokim spektrum aktywności litycznej w celu strawienia ścian komórkowych bakterii i mikroorganizmów eukariotycznych19. Druga obróbka z użyciem Proteinazy K i detergentu degraduje białka i solubilizuje szczątki komórkowe.
Tagmentację oczyszczonego DNA przeprowadza się w kropelkach, aby uniknąć potencjalnej kontaminacji krzyżowej wynikającej z dyfuzji niewielkich fragmentów tagmentowanego DNA między mikrogelami18. Urządzenie do enkapsulacji w kropelkach (Ryc. 3B) wydziela każdy mikrogel wraz z buforem i enzymem do tagmentacji, który jednocześnie fragmentuje dwuniciowe DNA i „oznacza” je załadowanym wcześniej oligonukleotydem20. Mikrogele są ładowane do kropelek jako gęsto upakowane cząsteczki, co pozwala osiągnąć stopień enkapsulacji bliski 1 mikrogelowi na każdą kropelkę, z niewielką liczbą dubletów21 (Ryc. 4C).
W ostatnim kroku procesu mikroprzepływowego (Rysunek 2C), urządzenie wykonuje operację podwójnego łączenia, łącząc 1 kroplę z kodem kreskowym, 1 kroplę zawierającą mikrogel oraz mieszaninę do amplifikacji w kontrolowanym, dwuetapowym procesie. Najpierw kropla zawierająca odczynnik PCR zostaje sparowana i połączona z kroplą z kodem kreskowym w obszarze zaznaczonym na żółto (Rysunek 5). Elektrody solankowe w kanale mikroprzepływowym wytwarzają wysoki gradient pola elektrycznego, który inicjuje łączenie kropel. W podobny sposób pierwsza połączona kropla zostaje sparowana z kroplą mikrogelu i połączona po raz drugi w obszarze zaznaczonym na czerwono. Krople są zbierane i poddawane cyklom termicznym poza układem (off-chip) w reakcji PCR z jednokrotnym przedłużeniem nakładki (SOE PCR). Nakładające się komplementarne końce kodu kreskowego i tagmentowanego DNA genomowego umożliwiają fuzję i wykładniczą amplifikację wyłącznie prawidłowo okodowanych konstruktów.
Dane z sekwencjonowania są najpierw filtrowane pod kątem jakości odczytów, a następnie analizowane poprzez grupowanie odczytów zgodnie z ich 15-bp sekwencją kodów kreskowych dla pojedynczych komórek. Aby grupa kodów kreskowych została uznana za prawidłową, musi zawierać minimalną liczbę odczytów; takie progowanie ogranicza analizę do komórek z użyteczną ilością danych sekwencyjnych i usuwa z zestawu danych „sieroty”, czyli kody kreskowe zmutowane w wyniku PCR. W tym przykładowym przebiegu wartość minimalna została ustawiona na 7,5 kbps na grupę (50 odczytów po 150 bp każdy). Histogram liczby kodów kreskowych w stosunku do wielkości grupy pokazuje, że znaczna część prawidłowych grup kodów kreskowych znajduje się tuż powyżej wartości progowej (Rysunek 6A).
W eksperymencie kontrolnym, w którym skład społeczności mikrobiologicznej jest znany, do oceny jakości przebiegu SiC-seq wykorzystuje się wskaźniki czystości i względnej liczebności. W tym przypadku analizowana jest syntetyczna społeczność 10 komórek składająca się z 3 bakterii gram-ujemnych, 5 bakterii gram-dodatnich i 2 drożdży. Czystość danej grupy kodów kreskowych definiuje się jako liczbę odczytów mapujących do najczęstszego genomu w grupie podzieloną przez całkowitą liczbę odczytów w grupie. Zdecydowana większość grup kodów kreskowych wykazuje czystość przekraczającą 0,95 (Rysunek 6B). Względna liczebność typów komórek jest obliczana poprzez zliczanie surowych odczytów oraz zliczanie grup kodów kreskowych, gdzie grupom przypisuje się typ komórki odpowiadający konsensusowi odczytów będących ich członkami (Rysunek 6C). Liczebność odczytów i grup kodów kreskowych przebiega w zbliżonych proporcjach, co wskazuje, że populacje komórek są próbkowane w taki sposób, że niektóre gatunki nie są zawarte w nieproporcjonalnie małych lub dużych grupach kodów kreskowych. Wykreślenie zagregowanego pokrycia wszystkich grup kodów kreskowych z jednego gatunku wskazuje na wysokie pokrycie w obrębie całego genomu, z niewielką liczbą regionów z brakami (dropout) lub ich całkowitym brakiem (Rysunek 7). Jednolitość pokrycia można zweryfikować za pomocą rozkładu częstości znormalizowanych wartości pokrycia, w którym większość wartości skupia się wokół średniej (Rysunek 7, wstawka).
Rycina 1: Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych metodą fotolitografii. (A) Formy matrycowe o pojedynczej wysokości struktur wytwarza się poprzez nanoszenie warstwy fotorezystu SU-8 na wafer krzemowy metodą spin coatingu. Następnie fotorezyst jest naświetlany przez maskę fotolitograficzną światłem UV, co powoduje sieciowanie naświetlonego SU-8. Na koniec nienasiękowany SU-8 zostaje rozpuszczony w kąpieli wywoływacza. Powstałą formę wykorzystuje się do odlewania PDMS, który jest następnie wiązany z szkiełkiem przedmiotowym w celu uzyskania kompletnego urządzenia mikroprzepływowego. (B) W przypadku urządzenia dwuwarstwowego proces wytwarzania analogicznie rozpoczyna się od etapów nanoszenia warstwy i naświetlania. Kroki te są następnie powtarzane w celu stworzenia urządzenia dwuwarstwowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Przegląd schematu pracy SiC-seq. (A) Zawiesina drobnoustrojów jest wprowadzana wspólnie z roztopioną agarozą do urządzenia do tworzenia kropli w celu enkapsulacji pojedynczych komórek w mikrożelach. (B) Mikrożele poddawane są serii płukań w celu oczyszczenia bakteryjnego DNA genomicznego. Enzymy lityczne trawią ściany komórkowe bakterii gram-dodatnich i drożdżaków, a detergent solubilizuje szczątki komórkowe. Mikrożele są ponownie enkapsulowane w kroplach w celu przeprowadzenia tagmentacji, aby zredukować zanieczyszczenia krzyżowe. (C) Mikrofluidyczny merger łączy kod kreskowy cyfrowego PCR, tagmentowany genom w mikrożelu oraz mieszaninę do amplifikacji z częstotliwością >1 kHz. Poza układem (off-chip) SOE-PCR łączy unikalny kod kreskowy pojedynczej komórki z tagmentowanym genomem i selektywnie amplifikuje w pełni obarkodowane konstrukty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Urządzenia mikroprzepływowe do wytwarzania kropel i ponownej enkapsulacji mikrożeli. (A) Ten panel przedstawia wytwórcę kropel w układzie współpływu (wysokość kanału 25 µm). Komórki i stopiona agaroza są wprowadzane do urządzenia z takimi samymi prędkościami przepływu, aby wytworzyć krople o średnicy 25 µm w złączu o wymiarach 25 µm x 25 µm. W przypadku wytwarzania kropel z cyfrowym kodem kreskowym wlot komórkowy zostaje zablokowany, a do wlotu agarozy wprowadzana jest mieszanina PCR. (B) Ten panel przedstawia urządzenie do ponownej enkapsulacji mikrożeli (wysokość kanału 25 µm). Mikrożele przepływają przez lejkowaty wlot, aby zachować ich gęste upakowanie, a następnie otrzymują objętość mieszaniny do tagmentacji przed ponowną enkapsulacją w złączu o wymiarach 25 µm x 30 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Mikrografie kropli i mikrożeli. (A) Ten panel przedstawia wypłukane mikrożele o średnicy 25 µm przed lizą enzymatyczną. Bakterie zostały zabarwione fluorescencyjnie w celu ilościowego oznaczenia stopnia enkapsulacji. Statystyka rozkładu Poissona wskazuje, że komórki powinny być enkapsulowane w tempie 1 na 10 kropli lub mniej, aby zminimalizować częstotliwość zdarzeń wielokrotnej enkapsulacji. (B) Ten panel przedstawia obraz z mikroskopii fluorescencyjnej kropli z cyfrowym kodem kreskowym o średnicy 25 µm, poddanych zabarwieniu kwasami nukleinowymi. Krople zawierające amplifikowane fragmenty kodów kreskowych emitują silny sygnał fluorescencyjny. (C) Ten panel przedstawia mikrożele ponownie enkapsulowane w kroplach o średnicy 50 µm. Gęste upakowanie mikrożeli pozwala na osiągnięcie stopnia enkapsulacji bliskiego 1 żelowi na kroplę przy niewielkiej liczbie dubletów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Mikroprzepływowe urządzenie do podwójnego łączenia kropel przeznaczone do kodowania paskowego genomu pojedynczych komórek. Dwuetapowa operacja łączenia pozwala na wysokoprzepustowe parowanie kropel z kodem kreskowym z tagmentowanymi genomami. Najpierw generowana jest kropla mieszaniny PCR, która zostaje połączona z kroplą kodu kreskowego w obszarze zaznaczonym na żółto za pomocą elektrod solankowych. Następnie wprowadzana jest kropla zawierająca mikrogel, która zostaje połączona po raz drugi w obszarze zaznaczonym na czerwono. Wloty oleju umożliwiają precyzyjną kontrolę odstępów między ponownie wstrzykiwanymi kroplami. Komora ponownego wstrzykiwania kodu kreskowego oraz olej separatorowy są umieszczone w cieńszej warstwie o grubości 25 µm, zaznaczonej na niebiesko. Pozostałe elementy urządzenia znajdują się w warstwie grubszej o całkowitej wysokości 45 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6: Metryki grup kodów kreskowych dla syntetycznej społeczności mikrobiologicznej składającej się z 10 komórek. (A) Ten panel przedstawia rozkład wielkości grup kodów kreskowych. Liczba grup danej wielkości maleje wykładniczo wraz ze wzrostem wielkości grupy. Minimalny próg 7,5 kbps na grupę ogranicza analizę do grup zawierających wystarczającą ilość informacji i usuwa „sieroty”, czyli sekwencje zmutowane podczas PCR. (B) Ten panel przedstawia rozkład czystości grup kodów kreskowych. Zdecydowana większość (>90%) grup wykazuje bardzo wysoką czystość (>95%). (C) Ten panel przedstawia względną liczność 10 gatunków obliczoną na poziomie odczytów oraz na poziomie grup kodów kreskowych. Obie metody zliczania dają podobne wyniki, co wskazuje na spójność wielkości grup kodów kreskowych pomiędzy gatunkami. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7Zagregowane pokrycie genomowe dla Bacillus subtilis grupy kodów kreskowych Odczyty ze wszystkich grup kodów kreskowych mapujące do bakterii B. subtilis (N = 9 398) zostają połączone i przeanalizowane zbiorczo. Kołowa mapa pokrycia ilustruje jednorodność pokrycia odczytów SiC-seq, bez widocznych regionów luk (dropout). Przerywana linia wokół obwodu wskazuje średnie pokrycie (5,55x). Wstawiony histogram względnych częstotliwości pokrycia pokazuje, że większość zasad jest pokryta na głębokości zbliżonej do średniej dla całego genomu, reprezentowanej przez linię przerywaną. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Urządzenie | Wysokość pierwszej warstwy (µm) | Prędkość wirowania pierwszej warstwy (obr./min) | Wysokość drugiej warstwy (µm) | Prędkość wirowania drugiej warstwy (obr./min) |
| Współpływowy generator kropel | 25 | 4000 | N/A | Nie dotyczy |
| Urządzenie do ponownej enkapsulacji w żelu | 25 | 4000 | Brak danych | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski. |
| Podwójna fuzja | 25 | 4000 | 20 | 5000 |
Tabela 1: Parametry wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych. Tabela ta zawiera wykaz urządzeń mikroprzepływowych wykorzystywanych w procesie SiC-seq wraz z wymaganymi prędkościami nanoszenia fotorezystu metodą spin coatingu (na podstawie specyfikacji producenta dla SU-8 3025).
| Etykieta | Sekwencja (5' > 3') | ||||
| BAR | GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT | ||||
| KOD_KRESKOWY_DNA | CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA | ||||
| P7_BAR | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG | ||||
| P5_DNA | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC | ||||
| I7_CZYTAJ | GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA | ||||
Tabela 2: Sekwencje starterów.
Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 2: Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Dyskusja
Mikroprzepływowy przepływ pracy SiC-seq generuje dane sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki z tysięcy komórek bakteryjnych. Cyfrowe kody kreskowe wplecione w genomy komórek otoczonych mikrożelem pozwalają na dekonwolucję in silico danych NGS na grupy odczytów kodów kreskowych pochodzących z tej samej komórki. Eksperyment kontrolny na zbiorowisku drobnoustrojów o znanym składzie jest niezbędny do oceny czystości grup kodów kreskowych. Duża część grup o niskiej czystości wskazuje, że szybkość enkapsulacji komórek jest zbyt wysoka lub że podczas etapów przetwarzania mikroprzepływowego dochodzi do znacznego zanieczyszczenia krzyżowego kropelkami. Zgodnie ze statystykami Poissona, kody kreskowe i komórki powinny być zamknięte w docelowej proporcji 1 cząstki na każde 10 kropli, aby ograniczyć częstotliwość wielokrotnych zdarzeń enkapsulacji do mniej niż 5% wszystkich niepustych kropel. Wyższy współczynnik enkapsulacji zwiększa wykładniczo wskaźniki dubletów, dlatego weryfikacja współczynnika enkapsulacji podczas procesu wytwarzania kropli ma kluczowe znaczenie. Użytkownicy powinni zachować szczególną ostrożność w przypadku enkapsulacji wielu komórek w jednym mikrożelu, ponieważ odczyty z różnych komórek o tej samej sekwencji kodu kreskowego nie mogą być bioinformatyczne oddzielone. W przypadku, gdy 1 komórka otrzymuje 2 różne kody kreskowe, czystość grupy kodów kreskowych pozostaje nienaruszona, chociaż wskaźniki obfitości są zniekształcone podczas liczenia według sekwencji kodów kreskowych.
Zanieczyszczenie krzyżowe kropelkowe może również powstać z powodu nieoptymalnych warunków łączenia. Podczas udanej operacji urządzenie do łączenia mikroprzepływów (rysunek 5) może w kontrolowany sposób sparować 1 kroplę kodu kreskowego z 1 mikrożelem i objętością odczynnika PCR. Nieidealne natężenie przepływu spowoduje parowanie kropel w nieprawidłowych proporcjach: na przykład 1 kod kreskowy można sparować z 2 mikrożelami. Wszystkie natężenia przepływu wymienione w protokole mają charakter szacunkowy i mogą wymagać dostosowania w zależności od niewielkich różnic w geometrii urządzenia i rozmiarach kropel. Użytkownicy mający dostęp do kamer z możliwością szybkiego nagrywania (>10 000 klatek/s) powinni zweryfikować prawidłowe łączenie się kropel na początku i w trakcie operacji mikroprzepływowej. Użytkownicy, którzy nie mają dostępu do szybkiej kamery, mogą zebrać niewielką objętość połączonych danych wyjściowych i ręcznie zmierzyć rozmiary kropel pod mikroskopem. Wielkość kropel powinna być jednolita: nadmiar niepołączonych kodów kreskowych lub kropli mikrożelu wskazuje, że należy odpowiednio zmniejszyć szybkość ponownego wstrzykiwania.
Podczas obchodzenia się z mikrożelami i mikrokropelkami należy podjąć kilka ogólnych środków ostrożności, aby zachować ich integralność. Mikrożele, choć wytrzymałe mechanicznie, muszą być wystarczająco schłodzone przed etapem łamania i mycia, aby zapewnić całkowite żelowanie. Niesferyczne mikrożele wskazują, że agaroza nie miała odpowiedniego czasu na zestalenie. Podczas mycia mikrożeli należy odwirować zawiesiny z wymaganą prędkością, aby uniknąć utraty produktu. Hydrożel agarozowy ma współczynnik załamania światła ściśle zbliżony do indeksu wody i może być trudny do zauważenia w probówce22, dlatego użytkownicy powinni dokładnie określić granicę żel-ciecz przed aspiracją. Kropelki wody w oleju są podatne na koalescencję w wyniku narastania sił statycznych23 na rękawicach laboratoryjnych i rurkach. Z tego powodu zalecamy załadowanie strzykawek do ponownego wstrzykiwania kropelek gołymi rękami i potraktowanie wszystkich przewodów do ponownego wstrzykiwania pistoletem antystatycznym przed zalaniem pompy. Duże połączone kropelki można usunąć, powoli obracając emulsje w strzykawce i ręcznie zasysając większe krople, które gromadzą się w pobliżu góry ze względu na ich większą siłę wyporu.
SiC-seq to pierwsza technologia, która demonstruje sekwencjonowanie genomu pojedynczej komórki > 50 000 komórek bakteryjnych. Platforma ta oferuje znaczne korzyści w zakresie przepustowości w porównaniu z istniejącymi podejściami i umożliwia dokładniejsze pobieranie próbek heterogenicznych społeczności mikroorganizmów. Do tej pory technologie mikroprzepływowe do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki wykorzystywały mikrokomory9 i mikrostudzienki24 do izolacji i amplifikacji komórek, ale z przepustowością w zakresie zaledwie dziesiątek do setek komórek. Sortowanie przepływowe pojedynczych komórek do płytek studzienkowych 5,6 nie wymaga specjalistycznego oprzyrządowania mikroprzepływowego, ale charakteryzuje się podobnie niską przepustowością. Biorąc pod uwagę, że próbki gleby i wody ze środowiska zwykle mają różnorodność alfa wynoszącą >1000 na poziomie gatunku25,26, sekwencja SiC jest bardzo korzystna ze względu na jej zdolność do pobierania próbek znacznie większej liczby organizmów. Przepływ pracy SiC-seq można dostosować do danych wejściowych z hodowli laboratoryjnej, środowiska naturalnego lub żywego gospodarza. Próbka komórkowa musi być jedynie w zawiesinie wodnej i wolna od dużych cząstek (>10 μm), aby nadawała się do enkapsulacji mikroprzepływowej. Na przykład metoda ta została wcześniej zastosowana do próbki wody morskiej przy użyciu szeregu etapów płukania i filtrowania w celu wstępnego przetworzenia komórek przed enkapsulacją17.
Protokół SiC-seq generuje stosunkowo niewielką ilość danych sekwencjonowania z każdej pojedynczej komórki i może nie być odpowiedni dla wszystkich zastosowań. Niektóre algorytmy bioinformatyczne, takie jak składanie genomu de novo lub wywoływanie wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), wymagają większej głębokości pokrycia, aby działać skutecznie. Zamiast tego grupy kodów kreskowych mogą być grupowane in silico za pomocą taksonomicznych metod kategoryzacji27 , dzięki czemu algorytmy mogą być stosowane do większych zestawów odczytów. Stosunkowo niska ogólna wydajność kodów kreskowych w przepływie pracy SiC-seq może również stanowić wyzwanie w przypadkach, gdy dostępność próbki wejściowej jest niska. SiC-seq opiera się na etapie enkapsulacji kodów kreskowych z dystrybucją Poissona, dlatego około 10% komórek otrzymuje molekularny kod kreskowy i jest wzmacniane na ostatnim etapie przygotowania biblioteki. Chociaż jest to porównywalne z innymi schematami kodowania kreskowego opartymi na mikrokropelkach10, użytkownicy pracujący z cennymi próbkami komórek mogą mieć trudności z osiągnięciem odpowiedniej wydajności biblioteki do sekwencjonowania i mogą być zmuszeni do zwiększenia liczby cykli PCR na końcowym etapie amplifikacji. Innym potencjalnym rozwiązaniem dla użytkowników posiadających wiedzę z zakresu mikroprzepływów jest sortowanie dodatnich kropelek kodów kreskowych po etapie cyfrowego PCR, co zwiększa ogólną wydajność kodów kreskowych do >85%28.
Potencjalnym przyszłym kierunkiem rozwoju technologii SiC-seq jest dostosowanie przepływu pracy do użytku z komórkami ssaków, torując drogę do nowych badań klinicznych na pojedynczych komórkach. Na przykład analiza zmienności liczby kopii wśród pojedynczych komórek nowotworowych może pogłębić nasze zrozumienie roli heterogeniczności w patologii raka2. Alternatywnie, zintegrowanie SiC-seq z istniejącymi metodami badania i wzbogacania sekwencji DNA będących przedmiotem zainteresowania29 umożliwiłoby ukierunkowane sekwencjonowanie pojedynczych komórek subpopulacji lub rzadkich szczepów komórek. Dzięki próbkom środowiskowym można było namierzyć geny pochodzące ze znanego szlaku metabolicznego i przeanalizować je kontekstowo wraz z sąsiednimi genami w celu zidentyfikowania nowych wysp genomowych. Z poziomu ludzkiego środowiska gospodarza można wyizolować próbki bakterii chorobotwórczych o niskim mianie i zsekwencjonować je na poziomie pojedynczej komórki, aby dokładniej zbadać ich genotypowe pochodzenie zjadliwości.
Oświadczenia
Patenty związane z tym przepływem pracy mogą być licencjonowane przez firmę Mission Bio, której udziałowcem jest Adam R. Abate.
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez National Science Foundation poprzez CAREER Award (numer grantu DBI-1253293); National Institutes of Health (NIH) (numery grantów HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); oraz Defense Advanced Research Projects Agency Living Foundries Program (numery umów HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-calowe wafle krzemowe, typ P, klasa dziewicza | testowej Wafle uniwersyteckie | 447 | |
| SU-8 3025 fotorezystor | Microchem | 17030192 | |
| powlekarka wirowa | Specjalistyczne systemy powłok | G3P-8 | |
| Fotomaski | CadArt Servcies | (niestandardowe) | Zobacz pliki uzupełniające do projektów masek |
| Programista PGMEA | Sigma-Aldrich | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| Sylgard 184 | Komora | 4019862 | |
| Bel-Art | 42025 | ||
| Dziurkacz do biopsji 0,75 mm | World Precision Instruments | 504529 | |
| Szkiełka mikroskopowe szklane (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
| Aquapel (hydrofobowa obróbka szkła) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Rurki polietylenowe PE-2 | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| Strzykawki 1 ml | Igły BD | 309628 | |
| 27 Gauge | Pompa | ||
| Era Pump Systems | NE-501 | ||
| Novec HFE-7500 olej fluorowany ( HFE) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| FC-40 olej fluorowany | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Środek powierzchniowo czynny PEG-PFPE | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfaktant | |
| Grzejnik Lasko | CD09250 | ||
| Agaroza, niska temperatura żelowania | Sigma-Aldrich | a9414 | |
| TE (10X) | Rockland | mb-007 | |
| PBS 1X, pH 7,4 | E& K Scientific Products | EK-65083 | |
| OptiPrep (medium gradientu gęstości) | Sigma-Aldrich | d1556 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| Span 80 (monooleinian sorbitanu) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| Heksan | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| Tween 20 (polisorbat 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Lizozym typu IV | MP Biomedicals | 195303 | |
| Mutanolizyna | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Zymoliaza (enzym lityczny drożdży) | Zymo Research | e1004 | |
| Lizostafina | Sigma-Aldrich | L7386 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl, pH 7,5, 1M | Invitrogen | 15567-027 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Teknova | d9750 | |
| Dodecylowy siarczan litu | Sigma-Aldrich | L9781 | |
| Proteinaza K | New England Biosciences | P8107S | |
| Etanol, 200 Proof (100%) | Koptec | V1001 | |
| SYBR Green I (barwienie kwasami nukleinowymi) | Invitrogen | S7563 | |
| PEG 6k | Sigma-Aldrich | 81260 | |
| Triton X-100 (etoksylat oktylofenolu) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Nextera Zestaw do przygotowania biblioteki DNA | Illumina | FC-121-1030 | |
| Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix) | Nowa Anglia Nauki biologiczne | m05365 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Warmstart 2.0 Bst Polimeraza (polimeraza izotermiczna) | Bufor New England Biosciences | m0538m | |
| NT z zestawu Nextera XT (bufor neutralizacyjny) | Illumina | FC-131-1024 | |
| Inwerter fluorescencyjny z zimną katodą | (niestandardowy) | (niestandardowy) | |
| Zasilacz prądu stałego | Mastech | HY1503D | |
| Zerostat 3 pistolet antystatyczny | Milty | 5036694022153 | |
| wydrukowany w 3D uchwyt na strzykawkę wirówki | (niestandardowy) | (niestandardowy) | Zobacz pliki uzupełniające do pliku do druku 3D |
| Zymo DNA Clean & Koncentrator-5 | Zymo Research | D4003 |
Bibliografia
- Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
- Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
- Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
- Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
- Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
- Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
- Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784(2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
- Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
- Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
- Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).
- Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).
- Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
- Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
- Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).
- Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
- Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
- Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).
- Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).
Przedruki i uprawnienia
