Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wstrzykiwanie lipopolisacharydu myszom w celu naśladowania wnikania produktów pochodzenia mikrobiologicznego po naruszeniu bariery jelitowej

19.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57610

⸱

2 maja 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital of Basel

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół naśladowania wnikania związków pochodzenia bakteryjnego po naruszeniu bariery jelitowej. Niska subletalna dawka lipopolisacharydu została wstrzyknięta ogólnoustrojowo myszom, które były monitorowane przez 24 godziny po wstrzyknięciu. Ekspresję cytokin prozapalnych określono w kilku punktach czasowych w śledzionie, wątrobie i okrężnicy.

Streszczenie

Bariera nabłonkowa jelit oddziela gospodarza od mikrobioty, która jest normalnie tolerowana lub ignorowana. Naruszenie tej bariery powoduje przedostanie się bakterii lub produktów pochodzenia bakteryjnego do organizmu gospodarza, uzyskując dostęp do krążenia i narządów wewnętrznych gospodarza, co prowadzi do niekontrolowanego stanu zapalnego, obserwowanego u pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), które charakteryzują się zwiększoną przepuszczalnością nabłonka jelitowego.

Aby naśladować wnikanie związków pochodzenia bakteryjnego do gospodarza, zastosowano model endotoksemii, w którym lipopolisacharyd (LPS), składnik zewnętrznej ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, został wstrzyknięty myszom. W tym badaniu subletalna dawka LPS została wstrzyknięta dootrzewnowo, a myszy były następnie monitorowane przez 8 godzin przy użyciu oceny choroby. Ponadto poziomy ekspresji cytokin zapalnych Il6, Il1b i Tnfa analizowano w śledzionie, wątrobie i okrężnicy za pomocą qPCR w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu LPS. Model ten może być przydatny w badaniach obejmujących badanie odpowiedzi immunologicznych po inwazji mikroorganizmów lub produktów pochodzenia bakteryjnego spowodowanej naruszeniem bariery na powierzchniach ciała.

Wprowadzenie

Jelito ludzkie jest skolonizowane przez duże konsorcjum mikroorganizmów, które tworzą mikrobiotę, która podczas ewolucji rozwinęła wzajemnie korzystne relacje z gospodarzem. W tej relacji gospodarz zapewnia bezpieczną niszę dla mikrobioty, podczas gdy mikrobiota dostarcza witaminy, trawienie składników odżywczych i ochronę przed patogenami gospodarzowi, w którym znajduje się mikrobiota1. Gdy ta korzystna relacja między gospodarzem a mikrobiotą zostanie zaburzona, mogą rozwinąć się choroby, takie jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD). IBD jest wieloczynnikową przewlekłą chorobą zapalną jelit spowodowaną czynnikami genetycznymi i środowiskowymi, które występują w dwóch głównych postaciach: chorobie Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego (WZJG). Pomimo podobieństw między tymi dwiema formami IBD, charakteryzują się one pewnymi różnicami w lokalizacji i charakterze modyfikacji zapalnych. CD jest nawracającym przezściennym zaburzeniem zapalnym, które może potencjalnie rozciągać się na dowolną część przewodu pokarmowego, podczas gdy UC jest nietransmuralne i jest ograniczone do okrężnicy. Ponadto mutacje w białku 2 zawierającym domenę oligomeryzacji wiążącym nukleotydy (NOD2), receptorze rozpoznawania wzorców (PRR), który rozpoznaje dipeptyd muramylowy (MDP), składnik ściany komórkowej większości bakterii Gram-dodatnich i -ujemnych, są związane z CD2. Ponadto Escherichia coli (E. coli), Listeria i Streptococci oraz ich produkty zostały znalezione w makrofagach u pacjentów z CD, którzy dostali się do organizmu gospodarza po naruszeniu bariery3. Kiedy bakterie lub ich produkty dostają się do organizmu gospodarza podczas rozwoju CD, układ odpornościowy rozwija odpowiedź prowadzącą do produkcji krążących przeciwciał przeciwbakteryjnych4. Być może najbardziej przekonujące dowody na rolę mikrobioty w patogenezie IBD pochodzą z modeli mysich. Gdy zwierzęta są leczone antybiotykami lub gdy myszy są trzymane w warunkach wolnych od zarazków (GF), nasilenie choroby jest zmniejszone w większości modeli zapalenia jelita grubego, takich jak myszy IL-10-/-, u których nie rozwija się zapalenie jelita grubego w obiektach GF5,6. Co więcej, zapalenie jelita grubego zaburza również skład mikrobioty, która charakteryzuje się niezrównoważonym składem i zmniejszonym bogactwem zwanym dysbiozą7. Konsekwencją IBD może być zwiększona przepuszczalność jelit, która może prowadzić do wnikania drobnoustrojów i produktów pochodzenia drobnoustrojowego do organizmu gospodarza.

U zwierząt, zastosowanie siarczanu sodu dekstranu (DSS) powoduje przerwanie nabłonka jelitowego, co prowadzi do zwiększonej przepuszczalności bariery nabłonkowej8. Stężenie Portal LPS jest podwyższone u zwierząt z zapaleniem jelita grubego DSS9. Co ciekawe, zwierzęta pozbawione wewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej specyficznej dla receptora lektyny typu C-3 chwytającej homolog nieintegrynowy 1 (SIGN-R1) są chronione przed zapaleniem jelita grubego DSS i endotoksemią wywołaną LPS10. Aby dalej rozprzestrzeniać się do gospodarza, bakterie lub produkty pochodzenia bakteryjnego muszą przejść przez barierę naczyniową11, jamę otrzewną, w której znajduje się jelito cienkie i grube, węzły chłonne krezkowe i/lub wątrobę12. Aby zmniejszyć złożoność tego systemu, wykorzystano zdefiniowany związek pochodzenia bakteryjnego. LPS, który powoduje endotoksemię po wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) lub dożylnym (i.v.) 13 wstrzyknięto myszom w celu zbadania ekspresji interleukiny Il6 i Ilb oraz cytokiny Tnfa w odpowiedzi na LPS.

LPS to wzór molekularny związany z patogenem (PAMP) wyrażony jako składnik ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, który składa się z lipidu A (główny PAMP w strukturze LPS), oligosacharydu rdzeniowego i łańcucha po stronie O14. Receptor toll-podobny 4 (TLR4) wyrażany przez komórki dendrytyczne, makrofagi i komórki nabłonkowe rozpoznaje LPS15, który wymaga koreceptorów do odpowiedniego wiązania. Białko wiążące LPS (LBP) białka ostrej fazy wiąże LPS, tworząc kompleks, który przenosi LPS do klastra różnicowania 14 (CD14), białka błonowego zakotwiczonego w glikozylofosfatydyloinozytolu. CD14 dalej transportuje LPS do antygenu limfocytów 96 lub znanego również jako MD-2, który jest związany z zewnątrzkomórkową domeną TLR4. Wiązanie LPS z MD-2 ułatwia dimeryzację TLR4 / MD-2 w celu wywołania zmian konformacyjnych w celu rekrutacji wewnątrzkomórkowych cząsteczek adaptorowych do aktywacji dalszego szlaku sygnałowego14, który obejmuje szlak zależny od genu podstawowej odpowiedzi szpiku 88 (MyD88) oraz szlak zależny od szlaku zależnego od β interferonu indukującego adaptor (TRIF) zawierającego domenę TIR16. Rozpoznanie LPS przez TLR4 aktywuje następnie szlak NF-κB i indukuje ekspresję cytokin prozapalnych, takich jak TNFα, IL-6 i IL-1β17.

W szczególności, gdy LPS jest wstrzykiwany zwierzętom, należy wziąć pod uwagę stężenie LPS podawanego zwierzętom, tło genetyczne zwierzęcia i dietę. Wysokie stężenia LPS prowadzą do wstrząsu septycznego, charakteryzującego się niedociśnieniem i niewydolnością wielonarządową, a w końcu do śmierci18. Myszy są mniej wrażliwe na LPS w porównaniu z ludźmi, gdzie stężenia LPS między 2-4 ng/kg masy ciała (BW) są w stanie wywołać burzę cytokinową19. Dla myszy dawka śmiertelna (LD50), która wywołuje śmierć u połowy myszy, waha się od 10-25 mg/kg BW20 w zależności od użytego szczepu myszy. Dla powszechnie stosowanych szczepów myszy, C57Bl/6 i BALB/c, dawka śmiertelna 50% (LD50) wynosi 10 mg/kg masy ciała. Natomiast szczepy C3H/HeJ i C57BL/10ScCr są chronione przed endotoksemią wywołaną LPS, która jest spowodowana mutacjami w Tlr421. W związku z tym myszy z niedoborem Tlr4 są hipowrażliwe na zastrzyki z LPS22. Inne genetycznie zmodyfikowane linie myszy, takie jak PARP1-/- myszy23 są odporne na wstrząs toksyczny wywołany przez LPS.

Opisany tutaj model myszy wykorzystuje subletalną dawkę LPS podawaną systemicznie, aby naśladować konsekwencje rozprzestrzeniania się LPS po naruszeniu bariery na powierzchni ciała. Wybrane stężenie LPS (2 mg/kg m.c.) nie indukowało śmiertelności u myszy C56Bl/6, ale indukowało uwalnianie cytokin prozapalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były hodowane i trzymane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w obiekcie dla zwierząt na Wydziale Biomedycyny Uniwersytetu w Bazylei (Bazylea, Szwajcaria). Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie ze szwajcarskimi przepisami federalnymi i kantonalnymi (protokół na zwierzętach nr 2816 [Kanton Bazylea-Miasto]).

1. Przygotowanie roztworu LPS

  1. Otworzyć zapas LPS oczyszczonego z Escherichia coli 0111:B4 w sterylnych warunkach i rozpuścić go w wodzie do stężenia 5 mg/ml.
  2. Rozcieńczyć podstawowy LPS sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) do stężenia roboczego 0,2 μg/μl.

2. Dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS myszom

  1. Odessać roztwór roboczy LPS do strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 30 G w laminarnym przepływie powietrza.
  2. Zważ samice myszy C57Bl/6 (w wieku od sześciu do 10 tygodni) i oblicz ilość LPS, która zostanie wstrzyknięta: 10 μL (2 μg)/g masy ciała.
    UWAGA: Na przykład, jeśli mysz waży 20 g, należy wstrzyknąć 20 g x 10 μl = 200 μl roztworu roboczego LPS.
  3. Trzymaj mysz delikatnie, ale stanowczo i trzymaj zwierzę jedną ręką. Upewnij się, że zwierzę jest w stanie normalnie oddychać, ale nie może skręcać się i obracać podczas krępowania.
  4. Lekko przechylić nos myszy w kierunku podłogi, aby odsłonić brzuch do wstrzyknięcia. Zlokalizować linię środkową brzucha i miejsce wstrzyknięcia w dolnej części brzucha po lewej lub prawej stronie od linii środkowej. Wstrzyknij i.p. PBS zamiast LPS myszom kontrolnym.
  5. Wolną ręką wstrzyknąć odpowiednią objętość (objętość obliczoną w kroku 2.2) roztworu roboczego LPS. Upewnij się, że igła weszła do jamy otrzewnej, ponieważ w przeciwnym razie może dojść do błędnych wstrzyknięć w warstwę mięśni brzucha. Mimo to nie należy wchodzić zbyt głęboko z igłą w jamę otrzewnej, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych znajdujących się w tym obszarze.
  6. Ostrożnie umieść zwierzę w klatce z maksymalnie 5 myszami w klatce.

3. Monitoruj myszy

  1. Monitorować zwierzęta w momencie wstrzyknięcia i co 2 godziny po wstrzyknięciu przez 8 godzin pod kątem występowania i nasilenia endotoksemii. W związku z tym należy skorzystać z arkusza ocen (Tabela 1), który został zaadaptowany z wcześniej opublikowanego manuskryptu 24.
  2. Oceń myszy, którym wstrzyknięto LPS, pod kątem następujących parametrów wymienionych w Tabeli 1
    1. Sprawdź wygląd futra, które zwykle jest gładkie. Jeśli futro wydaje się potargane, kolczaste lub puszyste, co wskazuje na dyskomfort i/lub ból, oceń je jako 1, 2 lub 3.
    2. Sprawdź aktywność mouse.
      UWAGA: Myszy zwykle poruszają się swobodnie po całej klatce, jedząc, pijąc, wspinając się, ale stłumiona lub ograniczona aktywność może być oznaką bólu.
    3. Sprawdź poziom świadomości.
      UWAGA: Myszy są bardzo ciekawskie i zwykle poruszają się po klatce, badając otoczenie. Brak lub ograniczenie ruchu może sugerować ból i dyskomfort.
    4. Sprawdź oczy.
      UWAGA: U zdrowych myszy oczekuje się całkowicie otwartych oczu, ale częściowo lub całkowicie zamknięte oczy, prawdopodobnie z wydzieliną, mogą wskazywać na ból.
    5. Sprawdź częstość oddechów.
      UWAGA: Zdrowe myszy zwykle mają normalne i szybkie tempo oddychania, zmniejszona częstość oddechów może wskazywać na dyskomfort).
    6. Sprawdź jakość oddychania.
      UWAGA: Utrudnione oddychanie z dyszeniem lub bez jest oznaką bólu.

4. Pobieranie próbek tkanek do ekstrakcji i homogenizacji kwasu rybonukleinowego (RNA)

  1. Przygotuj probówki do pobierania/homogenizacji: Dodaj 1 ml jednoetapowego odczynnika izolacyjnego RNA do probówek o pojemności 2 ml wstępnie wypełnionych kulkami ceramicznymi o średnicy 1,4 mm.
  2. W odpowiednich punktach czasowych (przed (0 h) i 2 h, 4 h i 8 h po wstrzyknięciu LPS) należy poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego (izofluranu), a następnie wykrwawić i przystąpić do sekcji.
  3. Przetnij skórę i warstwę mięśniową, odsłaniając jamę brzuszną wraz z narządami wewnętrznymi za pomocą nożyczek.
  4. Ostrożnie wypreparuj śledzionę, wątrobę i okrężnicę, oczyść narządy z tłuszczu i trzymaj je w PBS na lodzie.
  5. Wytnij mały kawałek (o długości około 0,5 cm) z każdego narządu za pomocą nożyczek lub skalpela.
    UWAGA: Ważne jest, aby zawsze pobierać fragment z mniej więcej tej samej części narządu u każdej myszy (ten sam płat wątroby, proksymalna lub dystalna część okrężnicy).
  6. Krótko wysusz tkankę na kawałku papierowej chusteczki i umieść ją w probówce do pobierania/homogenizacji, upewniając się, że jest całkowicie zanurzona w odczynniku do izolacji RNA.
  7. Homogenizuj tkankę w wysokoobrotowym homogenizatorze laboratoryjnym. W przypadku tkanek miękkich, takich jak śledziona, wątroba i okrężnica, należy zastosować 1 cykl homogenizacji z prędkością 6,00 przez 30 sekund.
  8. Próbki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Ostrożnie umieść probówkę w ciekłym azocie, aby zatrzasnąć lizat tkankowy. Zamrożony lizat należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu wyizolowania RNA.

5. Ekstrakcja RNA z tkanki

UWAGA: Odczynniki do izolacji RNA, chloroform i alkohole są uważane za materiał niebezpieczny. Wykonaj ekstrakcję RNA pod maską chemiczną. Używaj certyfikowanych odczynników i sprzętu wolnych od RNaz, aby utrzymać środowisko wolne od RNaz.

  1. Separacja faz
    1. Rozmrozić zamrożony lizat tkankowy na lodzie.
    2. Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pozostałych cząstek tkanki, które mogą pozostać.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od nukleaz.
    4. Dodać 200 μl lodowatego chloroformu na 1 ml odczynnika do izolacji RNA i energicznie wstrząsać ręcznie przez 10-15 s.
    5. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Wirować przy 12 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Próbka będzie teraz zawierać 3 fazy: dolną czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę i górną bezbarwną fazę wodną. RNA jest obecny w górnej fazie wodnej.
    7. Zebrać górną fazę wodną (50% całkowitej objętości) i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od nukleaz.
  2. Wytrącanie RNA
    1. Dodaj 0,5 ml lodowatego izopropanolu na 1 ml odczynnika izolacyjnego RNA i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę 5-6 razy.
    2. Inkubować przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Na tym etapie powinien być widoczny osad RNA.
  3. Mycie osadu RNA
    1. Całkowicie usunąć supernatant zawierający izopropanol bez naruszania osadu.
    2. Przemyć osad 1 ml lodowatego 75% etanolu na 1 ml odczynnika izolacyjnego RNA użytego do początkowej lizy.
    3. Krótko wymieszać próbkę.
    4. Odwirować próbkę w temperaturze 7 500 (lub 12 000) x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Rozpuszczanie RNA
    1. Całkowicie usunąć etanol z supernatantu, nie naruszając osadu.
    2. Pozostaw otwartą probówkę pod kapturem chemicznym na 3-5 minut, aby wysuszyć granulkę RNA na powietrzu w temperaturze pokojowej (nie suszyć nadmiernie, ponieważ w takim przypadku trudno będzie rozpuścić RNA).
    3. Rozpuść osad RNA w 20-50 μl wody wolnej od nukleaz, ostrożnie pipetując w górę iw dół.
    4. Inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 10-15 minut, aby jeszcze bardziej poprawić roztwór RNA.
      UWAGA: Na tym etapie RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

6. Trawienie pozostałego DNA

  1. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru, pipetując podwielokrotność (2 μl) do spektrofotometru i dostosować do zalecanego stężenia.
  2. Rozpocznij trawienie zanieczyszczonego DNA za pomocą maksymalnie 10 μg RNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Dodać 0,1 objętości 10x buforu DNazy I i 1 μl rDNazy I na próbkę i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20-30 min.
  5. Odczynnik do inaktywacji DNazy Vortex i dodać 0,1 objętości do próbki, dobrze mieszając pipetą.
  6. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu mieszając ręcznie.
  7. Wirować przy 10 000 x g przez 1,5 min.
  8. Przenieś supernatant zawierający RNA wolne od DNA do nowej probówki wolnej od nukleazy.
  9. Zmierzyć stężenie i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.

7. Odwrotna transkrypcja

  1. Użyj dostępnego na rynku zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA kwasu dezoksyrybonukleinowego (RT) do odwrotnej transkrypcji.
    UWAGA: Tutaj do 2 μg RNA może być odwrócone w transkrypcji.
  2. Oblicz objętość, która zawiera 2 μg RNA. Odpipetować 2 μg RNA w nowej probówce do PCR.
  3. Dodać wodę wolną od nukleaz do próbki w probówce do PCR do końcowej objętości 10 μl.
  4. Przygotuj 2x Master Mix, mieszając następujące składniki wymienione w Tabeli 2
  5. Dodać 10 μL 2x Master Mix do 10 μl RNA, aby uzyskać 1x Master Mix w całkowitej objętości 20 μL.
  6. Zamknij probówkę z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) i krótko odwiruj próbkę.
  7. Umieść próbki w termocyklerze PCR i ustaw ustawienia wymienione w Tabeli 3.
  8. Wytworzone cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.

8. Ilościowy PCR (qPCR)

  1. Przeprowadzić reakcję qPCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
  2. Samodzielnie zaprojektuj i przetestuj startery obejmujące intron, przed użyciem, z różnymi stężeniami matrycy cDNA. Przeanalizuj skuteczność podkładu, tworząc krzywą standardową i używaj podkładów o wysokiej skuteczności i prawidłowych krzywych topnienia.
    UWAGA: Sekwencje starterów użytych w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli 2.
  3. Przygotować ilościową reakcję łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) na płytce 384-dołkowej z układem reakcji opisanym w Tabeli 4.
  4. Utrzymuj wszystkie roztwory i płytkę na lodzie za pomocą folii aluminiowej, aby zapobiec zamoczeniu płytki podczas przygotowywania mieszaniny reakcyjnej.
  5. Wykonaj wszystkie reakcje w trzech egzemplarzach.
  6. Przeprowadzić reakcję PCR na termocyklerze, stosując ustawienie wymienione w Tabeli 5.
  7. Obliczyć średnią wartość Ct dla wszystkich reakcji z trzech powtórzeń. Znormalizuj wszystkie geny docelowe do poziomu ekspresji genu porządkowania dehydrogenazy aldehydu glicerynoaldehydo-3-fosforanowego (Gapdh), obliczając 2^(-ΔCt).
    UWAGA: Wszystkie geny docelowe o średnim Ct >35 uznano za poniżej granicy wykrywalności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zasymulować skutki dla gospodarza po wniknięciu bakterii lub produktów bakteryjnych, do których dochodzi po przerwaniu bariery jelitowej, myszom C57Bl/6 wstrzyknięto subletalną dawkę LPS (2 µg/g masy ciała). Każda mysz była monitorowana i oceniana pod kątem wystąpienia endotoksemii zgodnie z parametrami wymienionymi w arkuszu ocen, które obejmowały wygląd myszy, aktywność zwierząt, stan oczu oraz częstotliwość i jakość oddychania (Tabela 1). Zwierzęta wykazywały klini...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten naśladuje procesy immunologiczne, które zachodzą po inwazji produktów pochodzenia mikrobiologicznego. Krytycznymi krokami w protokole są wybór linii myszy, stan higieny myszy, dawka LPS, monitorowanie zwierząt pod kątem wystąpienia endotoksemii oraz punkt czasowy zakończenia eksperymentu. Co najważniejsze, należy wziąć pod uwagę tło genetyczne szczepu myszy. Różne szczepy myszy mają różną podatność na LPS. Na przykład myszy C3H/HeJ i C57BL/10ScCr są odporne na endotoksemię wywołaną LPS21,25...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JHN jest wspierany przez Szwajcarską Fundację Narodową (SNSF 310030_146290).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAK1081
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności,Applied Biosystems, Foster City, CA, USA4368813
Zestaw DNazy bez RNaz,Qiagen, Hilden, Niemcy79254
LPS Escherichia coli O111:B4Invivogen, San Diego, CA, USA.tlrl-eblps
Omnican 50 Jednorazowa strzykawka insulinowaB. Braun Melsungen, Melsungen, Niemcy9151125
Bioanalyzer 2100Agilent Technologie, Santa Clara, USAnie dotyczy
Wirówka 5430Eppendorf, Hamburg, Niemcynie dotyczy
Wirówka Mikro 220RHettich, Kirchlengern, Niemcynie dotyczy
Narzędzia do preparacjiAesculap, Tuttlingen, Niemcynie dotyczy
System przygotowania próbek Fast-Prep-24 5GM.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USAnie dotyczy
NanoDrop ND-1000NanoDrop Products, Wilmington, DE, USAnie dotyczy
TRI ReagentZymo Research, Irvine, CA, USAR2050-1

Bibliografia

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
  3. Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn's disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
  4. Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn's patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
  5. Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
  6. Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28(2014).
  7. Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn's disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
  8. Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
  9. Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
  10. Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
  11. Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
  12. Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266(2014).
  13. Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
  14. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  15. Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
  16. Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
  17. Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
  18. Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
  19. Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
  20. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
  21. Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
  22. Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
  23. Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
  24. Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233(2014).
  25. Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
  26. Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
  27. Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
  28. Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 8/04/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

One of the authors' names was corrected from:

Katarina Raduolovic

to:

Katarina Radulovic

Przeglądaj więcej artykułów

Iniekcja lipopolisacharydumodel endotoksemiinieswoiste zapalenia jelitanaliza ekspresji cytokinprotokół izolacji RNAmonitorowanie wskaźnika aktywności chorobyiniekcja dootrzewnowa u myszyhomogenizacja tkanekkwantyfikacja qPCR
Wstrzykiwanie lipopolisacharydu myszom w celu naśladowania wnikania produktów pochodzenia mikrobiologicznego po naruszeniu bariery jelitowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.