Tutaj prezentujemy protokół modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i oceny jego wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cAMP przy użyciu układu Langendorffa ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w układzie Langendorffa ex vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od czasu swojego wynalezienia pod koniecXIX wieku, system perfuzji serca Langendorff ex vivo nadal jest odpowiednim narzędziem do badania szerokiego spektrum parametrów fizjologicznych, biochemicznych, morfologicznych i farmakologicznych w sercach z centralnie odnerwionymi mięśniami. W tym miejscu opisano konfigurację modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i ocenę jej wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). Wewnątrzsercowy autonomiczny układ nerwowy jest modulowany przez mechaniczne rozwarstwienie przedsionkowych poduszek tłuszczowych - w których znajdują się głównie mysie zwoje - lub przez zastosowanie globalnych i celowanych interwencji farmakologicznych. Do prawego przedsionka i prawej komory wprowadza się ośmiobiegunowy cewnik elektrofizjologiczny, a do określenia elektrofizjologii serca i arytmogenezy stosuje się matryce wieloelektrodowe umieszczone w nasierdziu (MEA) do mapowania w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie metodą rezonansu Förstera (FRET) jest wykonywane w celu monitorowania poziomów cAMP w czasie rzeczywistym w różnych regionach serca. W przeprowadzonych badaniach bada się neuromorfologię za pomocą barwienia całych serc na podstawie przeciwciał przy użyciu markerów neuronalnych w celu identyfikacji i modulacji określonych celów wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego. Układ Langendorffa ex vivo pozwala na przeprowadzenie dużej liczby powtarzalnych eksperymentów w krótkim czasie. Niemniej jednak częściowo otwarty charakter konfiguracji (np. podczas pomiarów MEA) utrudnia stałą kontrolę temperatury i powinna być ograniczona do minimum. Opisana metoda umożliwia analizę i modulację wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego w sercach zdecentralizowanych.
Wprowadzenie
System perfuzji serca ex vivo Langendorffa nadal stanowi odpowiednie narzędzie do przeprowadzania szerokiego spektrum badań fizjologicznych, biochemicznych, morfologicznych i farmakologicznych w sercach centralnie odnerwionych1,2,3,4,5 od czasu jego wynalezienia pod koniecXIX wieku6. Do tej pory ten system jest nadal szeroko stosowany do różnych tematów (np. reperfuzja niedokrwienna) lub do badania efektów farmakologicznych serca7,8, i jest podstawowym narzędziem w badaniach sercowo-naczyniowych. Długowieczność tej metody wynika z kilku zalet (np. pomiary wykonuje się bez wpływu ośrodkowego układu nerwowego lub innych narządów, krążenia ogólnoustrojowego czy krążących hormonów). W razie potrzeby farmaceutyki mogą być dodawane w kontrolowany sposób do buforu perfuzyjnego lub bezpośrednio nakładane na określone struktury. Eksperymenty są powtarzalne, a stosunkowo duża liczba eksperymentów może być wykonana w krótkim czasie. (Częściowo) otwarty charakter konfiguracji może utrudniać regulację temperatury i należy to wziąć pod uwagę. Chociaż system Langendorffa jest również używany u większych gatunków9, mniejsze zwierzęta są używane przede wszystkim, ponieważ konfiguracja eksperymentalna jest mniej złożona i można zastosować większą zmienność biologiczną (np. transgeniczne modele myszy).
W eksperymentalnej konfiguracji tego protokołu, oceniany jest wpływ wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego na podstawowe parametry elektrofizjologiczne, arytmogenezę komorową, przewodnictwo nasierdziowe i dynamikę cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). Duża liczba zwojów wewnątrzsercowych, które znajdują się głównie w przedsionkowych poduszeczkach tłuszczowych i są obecnie dobrze znane z kontrolowania elektrofizjologii serca niezależnie od centralnej kontroli neuronalnej, pozostaje nienaruszona lub jest ręcznie usuwana z ostrożnym mechanicznym rozwarstwieniem. Farmakologiczną modulację autonomicznego układu nerwowego przeprowadza się albo globalnie przez dodanie farmaceutyków do buforu perfuzyjnego, albo miejscowo przez ukierunkowaną modulację zwojów przedsionkowych. Po eksperymentach serca dobrze nadają się do oceny immunohistologicznej, ponieważ wszystkie komórki krwi zostały usunięte z powodu ciągłej perfuzji, co może poprawić jakość barwienia.
Ogólnym celem opisanych technik jest zaoferowanie nowych perspektyw dla szczegółowych badań dotyczących wpływu autonomicznego układu nerwowego na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w sercu myszy. Powodem, dla którego warto stosować tę technikę, jest to, że możliwe jest badanie i zmiana autonomicznego układu nerwowego bez wpływu ośrodkowego układu nerwowego. Główną zaletą jest łatwe przeprowadzanie eksperymentów farmakologicznych, w których można testować potencjalne właściwości pro- lub antyarytmiczne starych i nowych środków. Ponadto dostępne są transgeniczne i nokautujące modele myszy różnych chorób serca w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw arytmii, niewydolności serca lub chorób metabolicznych. Podejście to poszerzyło naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób autonomiczny układ nerwowy na poziomie przedsionkowym może wpływać na elektrofizjologię serca komorowego i indukcję arytmii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez lokalne władze kraju związkowego Hamburg, Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu w Hamburgu.
1. Przygotowanie aparatu Langendorffa
UWAGA: Używany jest dostępny na rynku system perfuzyjny Langendorffa.
- Przygotować zmodyfikowany roztwór Krebsa-Henseleita (119 mM chlorku sodu, 25 mM wodorowęglanu sodu, 4,6 mM chlorku potasu, 1,2 mM jednozasadowego fosforanu potasu, 1,1 mM siarczanu magnezu, 2,5 mM chlorku wapnia, 8,3 mM glukozy i 2 mM pirogronianu sodu). Dodaj mieszaninę 95% tlenu/5% dwutlenku węgla do roztworu perfuzyjnego, aby zapobiec wytrącaniu się wapnia. Przefiltruj bufor o wielkości porów 0,22 μm.
- W razie potrzeby dodać środek farmakologiczny do buforu, aby zbadać jego wpływ na elektrofizjologię serca i arytmogenezę.
- Rozpocznij łaźnię wodną i umieść w niej roztwór perfuzyjny zawierający mieszaninę 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Dostosuj temperaturę łaźni wodnej tak, aby temperatura roztworu perfuzyjnego bezpośrednio przed kaniulą wynosiła ~37 °C.
- Uruchom pompę rolkową i napełnij aparat roztworem perfuzyjnym, gdy tylko zostanie osiągnięta odpowiednia temperatura.
- Wyreguluj szybkość pompy przed podłączeniem serca, tak aby podczas montażu kaniuli w kaniuli nie pozostały pęcherzyki powietrza.
2. Przygotowanie sprzętu i oprogramowania
- Podłącz cyfrowy system gromadzenia danych i odpowiadające mu oprogramowanie do aparatu Langendorffa w celu ciągłego rejestrowania ciśnienia perfuzji, natężenia przepływu i tętna.
- Ustaw docelowe ciśnienie perfuzji w ustawieniach ogólnych na 80 mmHg.
- Rozpocznij nagrywanie.
- Do rejestrowania danych i stymulacji za pomocą wyznaczonego cyfrowego generatora bodźców należy użyć cewnika elektrofizjologicznego (tabela materiałów) z elektrodami platynowymi o powierzchni 0,5 mm x 0,5 mm i odstępie między elektrodami 0,5 mm.
- Umieść cewnik blisko obszaru, w którym będzie umieszczone serce po podłączeniu do aparatu.
- Przygotuj stymulację, wybierając 2 elektrody z cewnika i użyj cyklu o długości 100 ms.
3. Przygotowanie serca
- Dodać zimny (~2 - 4 °C) bufor perfuzyjny (10 - 20 ml i 40 - 50 ml, tak aby cała szalka była pokryta) do 2 szalek Petriego (średnica 6 cm i 10 cm) oraz szalki z kaniulą i umieścić je na lodzie bezpośrednio obok i pod mikroskopem. Przygotuj podwójny węzeł wokół kaniuli.
- Szybko wyciąć serce po zwichnięciu szyjki macicy, otwierając klatkę piersiową za pomocą nożyczek Mayo i kleszczy o wąskim wzorze. Następnie chwyć aortę i żyłę główną nad przeponą za pomocą kleszczy londyńskich i wyciąć blok płuco-serce, przecinając wszystkie naczynia i tkankę łączną w pobliżu kręgosłupa nożyczkami do zeza.
- Przenieś blok płuco-serce do pierwszego naczynia (o średnicy 6 cm) wypełnionego lodowatym buforem i ostrożnie usuń płuca bez uszkodzenia serca za pomocą nożyczek do zeza i kleszczy londyńskich. Następnie umieść serce pod mikroskopem i ostrożnie usuń grasicę, przełyk i tchawicę za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy Dumont SS.
- Za pomocą nożyczek sprężynowych wyciąć otwór o średnicy 1,5 - 2 mm w górnej części prawego przedsionka w celu wprowadzenia cewnika. Wytnij dziurę w tętnicy płucnej. Następnie przetnij aortę bezpośrednio pod gałęziami nadaortalnymi i usuń tkankę z aorty, aby można było łatwo przymocować węzeł.
- Utrzymuj poduszeczki tłuszczowe przedsionków, w tym główną splot zwojową zlokalizowaną przedsionkowo, wokół lewego przedsionka w stanie nienaruszonym lub całkowicie je usuń przez staranne rozwarstwienie.
- Przenieś serce do naczynia z kaniulą i umieść je pod mikroskopem. Przeciągnij aortę przez kaniulę za pomocą kleszczyków Dumont SS i zawiąż przygotowany węzeł ciasno wokół aorty. Upewnij się, że kaniula nie jest umieszczona zbyt głęboko w aorcie, aby zastawka aortalna i naczynia wieńcowe pozostały wolne.
- Szybko podłącz kaniulę do aparatu Langendorffa. Upewnij się, że w kaniuli nie pozostały żadne pęcherzyki.
- Zmień ciśnienie perfuzji na 80 mmHg, umożliwiając perfuzję pod stałym ciśnieniem.
- Ostrożnie włóż cewnik do prawego przedsionka i prawej komory, nie dotykając ani nie uszkadzając serca, a następnie przymocuj cewnik do kaniuli za pomocą taśmy.
- Rozpocznij stymulację od przygotowanego cyklu o długości 100 ms przez początkowy 20-minutowy okres równowagi.
- Zamknij komorę, aby zapewnić stabilną temperaturę.
4. Parametry elektrofizjologiczne i arytmogeneza
- Zastosuj zaprogramowaną stymulację za pomocą dystalnych lub proksymalnych elektrod cewnika przy dwukrotności progu stymulacji przedsionkowej lub komorowej, aby ocenić parametry elektrofizjologiczne zgodnie z opisem w poniższych krokach.
- Określ czas regeneracji węzła zatokowego jako maksymalną długość cyklu powrotu po 10 s stymulacji o stałej szybkości przy długości cyklu S1S1 wynoszącej 120 ms, 100 ms i 80 ms.
- Określ punkt Wenckebacha jako najdłuższą długość cyklu S1S1 (8 bodźców; S1S1: 100 ms; Redukcja skokowa 2 ms) ze stratą 11 przewodzenia węzłowego AV. Określ okresy refrakcji węzłów przedsionkowo-komorowych jako najdłuższe S1S2 (12 bodźców; S1S1: 120 ms, 110 ms i 100 ms; jeden krótki sprzężony bodziec dodatkowy ze stopniową redukcją S1S2 o 2 ms) z utratą przewodnictwa węzłowego przedsionkowo-komorowego.
- Określ okresy refrakcji przedsionkowej i komorowej jako najdłuższe S1S2 (12 bodźców; S1S1: 120 ms, 110 ms i 100 ms; jeden krótki sprzężony bodziec dodatkowy z 2 ms stopniową redukcją S1S2) z brakiem odpowiedzi przedsionkowej lub komorowej10,11.
- Wykonaj zaprogramowaną dodatkową stymulację (S1S1: 120 ms, 100 ms i 80 ms, a następnie do 3 dodatkowych uderzeń; 60 - 20 ms ze stopniową redukcją o 2 ms) lub protokoły stymulacji serii (5 s przy S1S1: 50 - 10 ms ze stopniową redukcją o 10 ms) zgodnie z konwencjami Lambetha w celu oceny arytmogenezy komorowej10, 11,12.
5. Pomiary przewodnictwa nasierdziowego
UWAGA: Nagrywaj jednobiegunowe elektrogramy episierdziowe za pomocą 128-kanałowego, wspomaganego komputerowo systemu nagrywania z częstotliwością próbkowania 25 kHz dla mapowania w wysokiej rozdzielczości. Użyj 32 matryc wieloelektrodowych (MEA; odległość między elektrodami: 300 μm; 1,8 x 1,8 mm). Należy pamiętać, że dane zostały przefiltrowane pasmowo (50 Hz) i zdigitalizowane za pomocą 12 bitów i zakresu sygnału 20 mV.
- Umieść MEA w wyznaczonym miejscu serca i dodaj uziemienie do innej części serca13,14,15.
- Umieść cewnik do stymulacji nasierdzia w pobliżu MEA i rozpocznij ciągłą stymulację.
- Rozpocznij nagrywanie po potwierdzeniu dobrego kontaktu elektrod, sprawdzając jakość i amplitudę sygnału.
- Użyj analizy offline do określenia prędkości rozchodzenia się i dyspersji fal w kierunku przewodzenia.
6. Obrazowanie cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) opartego na rezonansie Förster Resonance Energy Transfer (FRET)
UWAGA: Dla pomiarów opartych na FRET, zbieraj serca od transgenicznych myszy CAG-Epac1-camps16.
- Użyj samodzielnie zbudowanego systemu obrazowania wokół mikroskopu stereoskopowego15,17.
- Umieść mikroskop stereoskopowy przed sercem i dostosuj go do ostrości.
- Wzbudzić czujnik cAMP źródłem światła [np. użyj diody elektroluminescencyjnej o pojedynczej długości fali (440 nm)]. Podziel światło emisyjne na kanały donorowe i akceptorowe za pomocą rozdzielacza wiązki (w przypadku pary cyjan fluorescencyjne białko/żółte białko fluorescencyjne użyj lustra dichroicznego 565dcxr i filtrów emisyjnych D480/30 i D535/40).
- Zapewnij stabilną temperaturę, owijając komorę folią.
- Rób zdjęcia za pomocą naukowej kamery z komplementarnym półprzewodnikiem metal-tlenek-półprzewodnik (sCMOS). Koordynuj rejestrowanie obrazu ze źródła światła i kamery za pomocą oprogramowania do obrazowania typu open source, takiego jak Micro-Manager.
- Aby rozpocząć akwizycję obrazu, naciśnij przycisk Multi-D Acq. i ustaw tryb poklatkowy, który rejestruje obraz co 10 s, z odpowiednim czasem naświetlania, który zależy od siły sygnału fluorescencyjnego (około 100 ms).
- Użyj wcześniej opisanych i dostępnych wtyczek FRET online i FRET online 217, aby podzielić obraz na dwa kanały, wybrać interesujące obszary i monitorować śledzenie proporcji.
- Podczas akwizycji należy perfować serce zmodyfikowanym roztworem Krebsa-Henseleita zawierającym różne substancje, w zależności od charakteru eksperymentu.
- Pod koniec eksperymentu wyłącz akwizycję, naciskając przycisk Stop i zapisz stos obrazów.
- Analizuj dane FRET w trybie offline za pomocą dedykowanego oprogramowania analitycznego, które może podzielić obrazy na dwie identyczne sekcje dla kanałów dawcy i akceptora oraz może przeprowadzić analizę FRET w wielu obszarach zainteresowania.
UWAGA: Potrzebna jest dedykowana wtyczka (FRET offline), która jest dostarczona w Sprenger et al.17.- Uruchom oprogramowanie. Otwórz analizę, przechodząc do menu Wtyczki, następnie kliknij MicroManager, a następnie Otwórz plik Micro-Manager.
- Uruchom wtyczkę offline FRET, aby podzielić film poklatkowy na dwa identyczne obrazy dla kanałów CFP i YFP.
- Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby oznaczyć obszar zainteresowania na obrazie YFP. Naciśnij przycisk Dodaj, aby dodać zaznaczenie do okna Multi Measure.
- Wybierz obszar zainteresowania w oknie Multi Measure i naciśnij przycisk Multi , aby uzyskać tabelę ze średnimi wartościami szarości dla każdej klatki i regionu. Skopiuj i wklej wszystkie dane do arkusza Excel.
- Kliknij stos obrazów CFP. Wykonaj te same czynności, co w kroku 6.10.4 dla stosu CFP i wklej średnie wartości szarości do tego samego arkusza programu Excel.
- Popraw surowe dane w trybie offline pod kątem współczynnika przebijania dawcy do kanału akceptora17.
- Użyj następującego wzoru, gdzie B jest współczynnikiem krwawienia:
Stosunek = (YFP - B x CFP) / CFP - Określ czynnik B krwawienia, obrazując serce wyrażające tylko CFP i zmierz procentową zawartość fluorescencji dawcy w kanale YFP (B = YFP / CFP).
- Użyj następującego wzoru, gdzie B jest współczynnikiem krwawienia:
7. Neuromorfologia
UWAGA: Analizuj wewnątrzsercowy autonomiczny układ nerwowy, używając całościowych barwień immunologicznych nienaruszonych mysich serc. Należy zauważyć, że większość zwojów wewnątrzsercowych jest zlokalizowana w tkance tłuszczowej nasierdzia w pobliżu żył płucnych.
- Użyj różnych barwień do zobrazowania neurofilamentu (ogólne struktury neuronalne; anty-NF-H kurczaka, 1:3,000), hydroksylazy tyrozynowej (TH, współczulne struktury neuronalne; królik α TH, 1:1,000) i acetylotransferazy choliny (ChAT, przywspółczulne struktury neuronalne; koza α ChAT, 1:50).
- Po perfuzji w aparacie Langendorffa umieścić serca myszy w 10 ml formaliny na 24 godziny i przechowywać je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.
- Wybielaj serca w wybielaczu Denta (4:1:1 metanol: roztwór nadtlenku wodoru 30% (w/w) w H2O: dimetylosulfotlenek (DMSO)) przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C, a następnie nawadniaj je do PBS w serii opadającego metanolu w PBS (100%, 75%, 50%, 25%; po 1 godzinie)18.
- Wykonać następujące inkubacje na płytce 24-dołkowej z delikatnym mieszaniem w temperaturze 4 °C:
- Przepuszczalność serc w 1% Triton-X-100/PBS (PBS-T) przez 3x 1 h w temperaturze pokojowej przed zablokowaniem ich na noc w buforze blokującym [5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) / PBS-T + 0,2% azydku sodu].
- Rozcieńczyć przeciwciała w następujący sposób: kozi α ChAT (1:50), królik α TH (1:1 000), kurczak α neurofilament (1:3 000); przeciwciała drugorzędowe do znakowania fluorescencyjnego (1:500; lub zgodnie z instrukcjami producenta); biotynylowane przeciwciała drugorzędowe do znakowania chromogennego (1:200; lub zgodnie z instrukcjami producenta).
- Próbki należy inkubować w pierwszorzędowych przeciwciałach rozcieńczonych w buforze blokującym przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
- Myć serca przez 3 x 15 minut w PBS-T przed drugorzędową inkubacją przeciwciał w buforze blokującym przez 4 dni.
- Myj serca przez 3 x 15 min w PBS-T i przechowuj je w podłożu montażowym do barwienia fluorescencyjnego przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub użyj zestawu do wykrywania kompleksu awidyna-biotyna zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wstępnie inkubować serca przez 1 godzinę w komercyjnym buforze dla 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), a następnie rozwijać je pod kontrolą wzrokową w buforze zawierającym DAB zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przechowuj próbki w wodzie podwójnie destylowanej.
- W przypadku sekcji parafinowych odwodnić i zanurzyć serca w parafinie.
- Wytnij odcinki o grubości 4 μm i odparafinowaj je zgodnie z rutynowymi procedurami laboratorium. To, czy i w jaki sposób należy pobrać antygen, należy ustalić dla każdej indywidualnej konfiguracji, ponieważ zależy to od kombinacji przeciwciał.
- Przepuszczać skrawki przez 10 minut w 0,2% Triton-X-100/Tris-buforowanym roztworem soli fizjologicznej (TBS), a następnie 3 x 5 minut płukać w TBS.
- Zablokuj je 3% BSA/TBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C [przeciwciała pierwszorzędowe: α kozi ChAT (1:50), królik α TH (1:500), kurczak α neurofilament (1:1 000)] lub 2 godziny w temperaturze pokojowej (przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie, 1:500) w 1% BSA/TBS z 3 x 5 min płukania TBS pomiędzy nimi.
- Dodać 1 μg/ml trichlorowodorku bisbenzimidu H33342 do roztworu przeciwciała drugorzędowego lub zastosować inną metodę barwienia jądrowego.
- Zamontuj szkiełka w podłożu montażowym do barwienia fluorescencyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat układu Langendorffa, w tym dwie macierze wieloelektrodowe (MEA). Przed rozpoczęciem eksperymentu cewnik wewnątrzsercowy umieszcza się blisko kaniuli, aby ułatwić szybką i łatwą inserkcję do prawego przedsionka/prawej komory oraz zapewnić krótki czas oczekiwania do rozpoczęcia procesu równoważenia. Dolna część komory może zostać podniesiona (patrz strzałki w Rycina 1), tak aby komora była całkowicie z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie przedstawiono dobrze znany system perfuzji serca ex vivo Langendorffa jako narzędzie do badania wpływu neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę przy użyciu różnych technik mapowania i stymulacji, w tym dostępu wsierdziowego i nasierdziowego.
Kilka części protokołu ma kluczowe znaczenie dla konfiguracji. Po pierwsze, ważne jest, aby zastosować technikę przygotowania, w której przedsionkowe poduszeczki tłuszczowe pozostają nienaruszone lub ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Hartwigowi Wieboldtowi za doskonałą pomoc techniczną, a także Zakładowi Obrazowania Mikroskopowego UKE (Umif) Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Hamburg-Eppendorf za dostarczenie mikroskopów i wsparcie. Badania te zostały sfinansowane przez Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. oraz przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych) [FKZ 81Z4710141].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S3014 | Modyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | 401676 | Zmodyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P5405 | Modyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | P5655 | Modyfikowany Krebs-Henleit roztwór |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma-Aldrich | M1880 | Modyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Sigma-Aldrich | C7902 | Modyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | Modyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Pirogronian sodu bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modyfikowany Krebs-Henleit roztwór |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Niemcy | Modyfikowany roztwór | |
| Sterylny filtr steritop-GP 0,22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Zmodyfikowany roztwór Krebsa-Henleita |
| Siarczan atropiny | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulacja |
| Chlorek heksametonium | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulacja |
| Zasada wolna od nikotyny 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulacja |
| Roztwór formaliny neutralny buforowany 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Barwienie całego mocowania |
| Tris(hydroksymetylo)aminometan | Sigma-Aldrich | 252859 | Barwienie całego mocowania |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Barwienie całego mocowania |
| Roztwór nadtlenku wodoru 30% (w/w) w H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Niemcy | H1009 | Barwienie całego mocowania |
| Dimetylosulfotlenek Merck | , KGA, Darmstadt, Niemcy | D8418 | Barwienie całego mocowania |
| Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Barwienie |
| całego mocowaniaTriton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Barwienie całego mocowania |
| Albumina frakcja bydlęca V | Biomol, Hamburg, Niemcy | 11924.03 | Barwienie całego mocowania |
| Kurczak anty neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Barwienie całego mocowania |
| Królik hydroksylaza anty tyrozynowa | EMD Millipore | AB152 | Barwienie całego mocowania Koza |
| anty cholina acetylotransferaza | EMD Millipore | AP144P | Barwienie całego wierzchowca |
| Osioł i alfa; królik IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Barwienie całego mocowania |
| Osioł i alfa IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Barwienie całego wierzchowca |
| Osioł i alfa; kurczak IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Niemcy | AP194SA6 | Całość mount barwienie |
| Osioł sprzężony z biotyną i alfa; królik igG | R& D Systems | AP182B | Barwienie całego mocowania |
| sprzężony z biotyną osioł i alfa; koza igG R | & D Systems | AP192P | Barwienie całego mocowania |
| koza sprzężona z biotyną i alfa; igY kurczaka R | & D Systems | BAD010 | Barwienie całego mocowania |
| Vectashield podłoże montażowe | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemia |
| Zestaw ABC Vectastain | Laboratoria wektorowe, Burlingame, Kalifornia, USA | PK-4000 | Immunohistochemia |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, Wielka Brytania | ab103723 | Barwienie całego mocowania |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Niemcy | HS2002 | Immunohistochemia |
| Trichlorowodorek bisBenzimidu H33342 (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemia |
| Vectashield HardSet | podłoże montażowe Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemia |
| System perfuzyjny | HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Niemcy | 73-4343 | Aparat Langendorffa |
| System akwizycji danych i odpowiednie oprogramowanie do cewnika i parametrów fizjologicznych | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Nowa Zelandia | PL3508 PowerLab 8/35 | Konfiguracja Langendorffa |
| Cewnik oktapolarny | CIB' Mysz ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | niestandardowa | konfiguracja Langendorffa |
| Generator bodźców | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy | STG4002-160µ Konfiguracja stymulacji | |
| Oprogramowanie do stymulacji | Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy | MC_Stimulus II | Konfiguracja |
| stymulacji System gromadzenia danych i odpowiednie oprogramowanie do elektrogramów nasierdziowych | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy | USB-ME128-System | MEA konfiguracja |
| Matryca wieloelektrodowa | MEA, EcoFlexMEA36, Systemy wielokanałowe, Reutlingen, Niemcy | Konfiguracja EcoFlexMEA36 | MEA |
| Oprogramowanie do nagrywania matrycy wieloelektrodowej | Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy | MC_Rack | konfiguracji MEA |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 15003-08 | Przygotowanie serca |
| Nożyczki do zeza | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 14575-09 | Majonez do przygotowania serca |
| Nożyczki | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 14110-15 | Preparatyka serca |
| Dumont SS Kleszcze | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11203-25 | Przygotowanie serca |
| Kleszcze londyńskie | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11080-02 | Kleszcze do przygotowania serca |
| wąskim wzorze | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Niemcy | 11003-13 | Przygotowanie serca |
| Folia plastikowa | Parafilm M, Bemis NA, z siedzibą w Neenah, WI, Stany Zjednoczone | Materiały eksploatacyjne | |
| Stereomikroskop | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, Wielka Brytania | em>pE-100 | |
| FRET DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView zestaw filtrów | Fotometria, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS naukowa kamera CMOS | Qimaging, Surrey, BC, Kanada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Mikro-menedżer; Vale Lab, Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco, Kalifornia, USA | |||
| Oprogramowanie do analizy | Oprogramowanie Image J; Domena publiczna, NIH, USA | FRET |
Bibliografia
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671(2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203(2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155(2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172(2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081(2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
