Artykuł metodologiczny

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57645

⸱

7 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life and Medical Systems, Doshisha University, 2Bruker Daltonics K.K., 3The Brain Bank for Aging Research, Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital and Institute of Gerontology, 4Graduate School of Brain Science, Doshisha University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Streszczenie

Neuropatologia choroby Alzheimera (AD) charakteryzuje się akumulacją i agregacją peptydów β amyloidowych (Aβ) w zewnątrzkomórkowych blaszkach mózgu. Peptydy Aβ, składające się z 40 aminokwasów, są wytwarzane z białek prekursorowych amyloidu (APP) przez β- i γ-sekretazy. Aβ odkłada się nie tylko w miąższu mózgu, ale także w ścianach opon mózgowo-rdzeniowych i naczyń mózgowych, co jest znane jako mózgowa angiopatia amyloidowa (CAA). Chociaż zidentyfikowano różne peptydy Aβ, szczegółowa produkcja i dystrybucja poszczególnych peptydów Aβ w tkankach patologicznych AD i CAA nie została w pełni rozwiązana. W tym miejscu opracowujemy protokół spektrometrii mas z obrazowaniem wspomaganym matrycą/jonizacją (MALDI-IMS) na tkankach mózgowych z autopsji człowieka w celu uzyskania kompleksowego mapowania białek. W tym celu pobrano próbki ludzkiej kory mózgowej z Banku Mózgu w Metropolitalnym Instytucie Gerontologii w Tokio. Zamrożone kriosekcje są cięte i przenoszone na szkiełka podstawowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO). Widma pozyskiwane są za pomocą systemu MALDI z rozdzielczością przestrzenną do 20 μm. Kwas sinapinowy (SA) jest równomiernie osadzany na szkiełku za pomocą automatycznego lub ręcznego opryskiwacza. Przy obecnych zaletach technicznych MALDI-IMS, typowy zestaw danych różnych gatunków Aβ w tych samych sekcjach ludzkich mózgów poddanych autopsji może być uzyskany bez specjalnych sond. Co więcej, obrazowanie mózgu w wysokiej rozdzielczości (20 μm) i próbka z ciężkim CAA wyraźnie pokazują, że Aβ1-36 do Aβ1-41 były zdeponowane w naczyniach opon mózgowo-rdzeniowych, podczas gdy Aβ1-42 i Aβ1-43 były zdeponowane w miąższu mózgu jako blaszka starcza (SP). Możliwe jest przyjęcie MALDI-IMS jako standardowego podejścia w połączeniu z obserwacjami klinicznymi, genetycznymi i patologicznymi w zrozumieniu patologii AD, CAA i innych chorób neurologicznych w oparciu o obecną strategię.

Wprowadzenie

Aby postawić diagnozę i zrozumieć patogenezę zaburzeń neurodegeneracyjnych, niezbędna jest precyzyjna identyfikacja molekularna złogów patologicznych1. W przebiegu choroby Alzheimera Aβ jest wytwarzany w celu wytworzenia SP w miąższu mózgu i odkłada się w naczyniach na długo przed wystąpieniem choroby2,3,4,5,6. Podczas gdy Aβ1-42 jest dominującym peptydem w SP mózgów AD, inne warianty Aβ, takie jak N-końcowe lub C-końcowe skrócone lub zmodyfikowane Aβs, są również identyfikowane w mózgach dotkniętych AD7,8,9,10. Pełny obraz szerokiego zakresu gatunków Aβ w ludzkich mózgach, zwłaszcza w przypadku AD i mózgowej angiopatii amyloidowej (CAA)11, pomoże naukowcom zrozumieć produkcję, metabolizm i odkładanie Aβ.

Jako klasyczne podejście neuropatologii, immunohistochemia (IHC) była najbardziej przekonującą metodą określania lokalizacji Aβs w tkankach mózgu12,13,14,15. Ogólnie rzecz biorąc, IHC nie może rozróżnić cząsteczek, gdy kilka epitopów współistnieje jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, pojawiająca się analiza proteomiczna oparta na spektrometrii mas jest cennym podejściem, szczególnie do analizy różnych gatunków Aβ w tkankach mózgowych, których nie można odróżnić za pomocą przeciwciał16,17. Konwencjonalna analiza lizatów mózgu i próbek wytrąconych immunologicznie oparta na spektrometrii mas nie wykrywa mniejszych peptydów Aβ i traci informacje o dystrybucji Aβ w tkance mózgowej.

We wcześniejszych pracach, wizualizacja złogów Aβ w mózgach myszy zakończyła się sukcesem przy użyciu transgenicznego modelu zwierzęcego AD, takiego jak APP23. Jednak proces ten nadal wymaga postępu technicznego, aby porównać IMS i IHC pod względem rozdzielczości i czułości18,19,20. Neuropatologia AD powinna być badana na ludzkich mózgach, a my użyliśmy technologii MALDI-IMS na ludzkich tkankach mózgowych z autopsji, aby uzyskać kompleksowe mapowanie białek21. W tym celu opracowaliśmy protokół zaawansowanego typu spektrometrii mas, który ma zalety w postaci szybkości, czułości i odtwarzalności.

Protokół

Tutaj próbki tkanek zostały pobrane w Szpitalu Geriatrycznym w Tokio, który świadczy usługi medyczne dla osób starszych w Japonii. Próbki z autopsji mózgu wykorzystane w badaniu zostały zarejestrowane w Brain Bank for Aging Research (BBAR) za świadomą zgodą krewnych zmarłego. BBAR jest zatwierdzony przez komisję etyczną Metropolitalnego Szpitala Geriatrycznego i Instytutu Gerontologii w Tokio. Dla wszystkich mózgów zarejestrowanych w banku mózgów uzyskaliśmy pisemne świadome zgody na ich wykorzystanie do badań medycznych od pacjentów lub ich rodzin. Pacjentów umieszczono w zimnym (4 °C) pomieszczeniu w ciągu 2 godzin po śmierci, aby zmniejszyć pośmiertne zmiany w mózgu. Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Doshisha i Bank Mózgu Badań nad Starzeniem się, Metropolitalny Szpital Geriatryczny w Tokio i Instytut Gerontologii.

1. Przygotowanie przekrojów tkanek dla IMS

  1. Przetwarzanie próbki tkanki ludzkiego mózgu poddanego autopsji
    Uwaga: Należy upewnić się, że etap przygotowania próbki do IMS zachowuje oryginalny stan tkanki. Unikaj zanieczyszczenia i zmian poubojowych. Następny krok jest kluczowy.
    1. Pobranie próbek kory mózgowej człowieka do IMS z mózgów, które zostały usunięte, przetworzone i przechowywane w temperaturze -80 °C w ciągu 8 godzin po sekcji zwłok. Weźmy próbkę mózgu z kory potylicznej pacjentów z AD i grupy kontrolnej dopasowanej do wieku21.
  2. Przygotowanie zamrożonych skrawków tkanek
    1. Wytnij skrawki tkanki na kriostacie. Umieść przewodzące szkiełka mikroskopowe z powłoką ITO wewnątrz kriostatu21.
    2. Ogrzej próbkę mózgu z autopsji od -80 °C do -22 °C wewnątrz kriostatu.
    3. Do każdego eksperymentu należy przymocować nowe jednorazowe ostrze do kriostatu. Zawsze staraj się używać czystej części ostrza.
    4. Umieść zamrożone mózgi z autopsji na scenie wraz z niewielką ilością związku OCT (wystarczająco, aby pokryć środkową część sceny; patrz Tabela Materiałów).
    5. Wybierz warunki do cienkiego przekroju. W przypadku IMS należy użyć grubości 10–12 μm dla przekrojów ludzkiego mózgu. W przypadku IMS i IHC należy wyciąć od pięciu do sześciu odcinków z każdej próbki tkanki.
    6. Gdy ostrze dopiero zaczyna ciąć tkankę, obróć koło i "skieruj" się w stronę bloku, aż cała tkanka zostanie odsłonięta. Jeśli w poprzek sekcji znajduje się niewielka smuga lub rozdarcie, poczekaj trochę dłużej w kriostatu, aż regulacja temperatury automatycznie ją naprawi. Policz kilka sekund przed otwarciem anti-rolla z chusteczką pod spodem.
    7. Natychmiast umieść plasterek chusteczki po stronie szkła pokrytej ITO. Rozmrozić plasterek tkanki, wkładając palec pod szkiełko po stronie niepokrytej ITO. Tkanka przyklei się do szkiełka; Upewnij się, że tkanka jest tak płaska, jak to możliwe, bez zmarszczek. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Noś rękawiczki, maski i fartuch laboratoryjny, ponieważ próbki ludzkie mogą zawierać zanieczyszczenia biologiczne. Gdy wszystkie sekcje zostaną wykonane na dany dzień, wyczyść kriostat, szczotki i uchwyty chusteczkami laboratoryjnymi i 200 ml 100% etanolu.
  3. Płukanie skrawków tkanek
    1. Zanurz próbki w 40–100 ml 70% etanolu na 30 sekund, aby usunąć endogenne lipidy i sole nieorganiczne. Użyj szklanego słoika do barwienia.
    2. Płucz próbki 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s, 40–100 ml roztworu Carnoya przez 3 minuty, 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s, 40–100 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) przez 1 minutę i 40–100 ml 100% etanolu przez 30 s. Użyj szklanego słoika do barwienia.
      Uwaga: Roztwór Carnoya jest utrwalaczem składającym się z sześciu części etanolu, trzech części kwasu octowego i jednej części chloroformu.
    3. Suszyć w próżni przez 30 min.
  4. Traktowanie skrawków tkanek parą kwasu mrówkowego w celu lepszej jonizacji białek Aβ z tkanek mózgowych z autopsji
    1. Przygotuj szkiełko do piekarnika i inkubacji, które zostaną użyte do późniejszej waporyzacji za pomocą 5 ml 100% kwasu mrówkowego. Aby uzyskać zadowalającą kwasowość, należy utrzymywać wilgotność powietrza w szklanym naczyniu inkubacyjnym na poziomie nasycenia przez cały ten etap i utrzymywać temperaturę na poziomie 60 °C. Umieścić szkiełka tkankowe w szklanym naczyniu do inkubacji, unikając zanurzania w kwasie mrówkowym i leczyć przez 6 minut.
    2. Wykonaj obraz optyczny próbek za pomocą skanera do filmów, skanera żelowego, mikroskopu cyfrowego itp. Wykonaj ten krok w temperaturze pokojowej. Wyrównanie obrazu optycznego próbek jest konieczne, gdy cel próbki jest umieszczony wewnątrz urządzenia. Zazwyczaj nie będzie możliwe rozpoznanie odcinka tkanki znajdującego się pod warstwą matrycy.
      nuta: Najwygodniejszym sposobem wykonania obrazu optycznego jest użycie skanera biurowego. Dobrym pomysłem jest zapisanie obrazu w folderze przechowywania danych obrazowania.
    3. Aby skorelować obrazy optyczne z próbkami, należy wykonać znaki prowadzące, które są widoczne zarówno na obrazie optycznym, jak i pod warstwą matrycy w optyce kamery. Najprostszym sposobem jest dostrzeżenie co najmniej trzech śladów płynu korekcyjnego wokół próbki przed wykonaniem obrazu optycznego.
  5. Aplikacja Matrix
    1. Przygotowanie roztworu matrycowego
      1. W mikroprobówce tolerującej rozpuszczalniki organiczne przygotować roztwór SA o stężeniu 10 mg/ml w 50% acetonitrylu (ACN) i 0,1% TFA. Dokładnie rozpuścić związek SA przez wirowanie lub krótką sonikację przez 10 minut. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
        nuta: Istnieją trzy różne opcje natryskiwania matrycy: za pomocą aerografu, opryskiwacza ultradźwiękowego lub opryskiwacza automatycznego.
    2. Natryskiwanie matrycy aerografem
      1. Operację należy wykonywać w stałej temperaturze pokojowej (20–23 °C) i wilgotności (40–60%). Parametry, które należy dostosować w celu optymalnego oprysku, obejmują wielkość kropli, ilość mgły, kąt i odległość między dyszą natryskową a sekcją tkanki oraz temperaturę i wilgotność w laboratorium. Dostosuj te warunki, sprawdzając wyniki mikroskopii.
        Uwaga: Ponieważ czynniki ograniczające obejmują wielkość kryształów i jednorodność pokrycia matrycą oraz niepożądaną migrację/dyfuzję analitów, im mniejsza, tym lepsza dla wielkości kropli. Jednorodność jest również punktem kontroli.
    3. Natryskiwanie matrycy za pomocą opryskiwacza ultradźwiękowego
      1. Wyjąć tkankę przeznaczoną do rozpylenia z eksykatora i umieścić ją w komorze. Upewnij się, że chusteczka nie zakrywa okienka czujnika.
      2. Rozpocznij przygotowanie, naciskając przycisk Start; zwykle czas przygotowania wynosi około 90 minut. Przygotowanie będzie regulowane automatycznie poprzez monitorowanie grubości warstwy matrycy i wilgotności. Po zakończeniu przygotowania należy wyjąć szkiełko i przechowywać je w eksykatorze przez 15 minut przed odczytaniem w przyrządzie MALDI.
      3. Wyczyść opryskiwacz 2–3 ml 100% MeOH, aż głowica natryskowa będzie wyglądać na czystą.
        Uwaga: Drobna mgiełka kropelek matrycy może zanurzyć się w tkance za pomocą arkusza grawitacyjnego. Generowana jest średnia wielkość kropli 20 μm; Wszystkie średnice kropel są mniejsze niż 50 μm.
    4. Natryskiwanie matrycy za pomocą automatycznego opryskiwacza
      1. Rozpyl roztwór matrycy na powierzchnię tkanki za pomocą automatycznego opryskiwacza. Stały przepływ podgrzanego gazu w osłonie (N2, ustawiony na 10 psi i 75 °C) będzie dostarczany razem z natryskiwaniem roztworu matrycy. Użyj systemu pompowania rozpuszczalnika (ustawionego na 10 psi i 0.15 ml/min), aby dostarczyć roztwór matrycy.
        Uwaga: Co najważniejsze, pracuj pod szafką bezpieczeństwa, aby uniknąć wdychania aerozoli matrycowych. Kontroluj temperaturę i wilgotność w pomieszczeniu, aby odtworzyć jednorodną krystalizację matrycy.

2. MALDI-IMS

  1. Wykonaj ultraszybką spektrometrię mas.
    1. Wykonuj eksperymenty obrazowania o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą MALDI-IMS wyposażonego w laser Nd:YAG 10 kHz (355 nm).
    2. W przypadku pomiarów spektrometrii mas należy zdefiniować obszary tkanek za pomocą oprogramowania sterującego MALDI i oprogramowania do analizy danych.
    3. Pozyskiwanie widm w dodatnim trybie liniowym o zakresie mas m/z 2 000–20 000 i rozdzielczości przestrzennej 20 i 100 μm.
    4. Aby uzyskać wzorzec kalibracyjny, rozpuść wzorzec kalibracyjny peptydu i wzorzec kalibracji białka w stosunku 1:4 z kwasem alfa-cyjano-4-hydroksylocynamonowym (CHCA) w roztworze TA30 (ACN:0,1% TFA = 30:70), a następnie rozcieńczyć go 10x. Umieść 1 μl wzorca kalibracyjnego na szkiełku w czterech różnych miejscach.
  2. Korzystając z oprogramowania do histologii molekularnej (patrz tabela materiałów), nałóż wiele pojedynczych obrazów, aby znaleźć korelację przestrzenną różnych sygnałów, takich jak różne peptydy Aβ kolokalizujące się w SP i ścianach tętnic.

3. Przetwarzanie danych

  1. Aby wyrównać spektralnie, wyrównaj wszystkie widma do wybranej listy m/z z poprzedniej publikacji21.
  2. Zaimportuj zestaw danych MALDI-IMS do oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Tabela materiałów) z odejmowaniem linii bazowej.
  3. Śledź obszary zainteresowania (ROI) w oparciu o wiedzę histologiczną.
    1. Wykonaj analizę jednoczynnikową dla średnich intensywności, odchyleń standardowych, odkrycia dyskryminacyjnych markerów m/z (analiza ROC), testów hipotez i odkrycia kolokalizowanych wartości m/z.
  4. Utwórz mapę segmentacji.
    1. Wykonaj nienadzorowaną analizę wielowymiarową w celu segmentacji przestrzennej dużych zbiorów danych oraz analizę składową w celu wyodrębnienia podstawowych trendów.
    2. Wybierz anatomiczne ROI na podstawie cech histologicznych, takich jak miąższ i przestrzeń podpajęczynówkowa.
    3. Przypisz struktury jako indywidualne ROI i skoreluj je z przetworzonymi danymi MS w celu zidentyfikowania powiązanych peptydów, które umożliwiły segmentację obrazu regionu.

Wyniki

Analizie poddano pacjentów z rzadkimi przypadkami AD z CAA (n = 5; średni wiek = 83,2 y) oraz osoby starsze bez blaszek starczych (SP O) i z CAA (n = 5; średni wiek = 7,2 y) (Tabela 1). W niniejszym badaniu fenotypy CAA u pacjenta nr 3 były najbardziej wyraźne. Rozmieszczenie złogów Aβ1-40 i Aβ1-42 w tkance mózgowej pacjenta nr 3 zwizualizowano za pomocą MALDI-IMS (Rysunek 1). W niepatologicznych mózgach kontrolnych (pacjenci nr 9 i nr 10) nie stwierdzono istotnych sygnałów, co przedstawiono na Rysunku 1. Tutaj MALDI-IMS wyraźnie wykazało, że Aβ1-42 odkładało się preferencyjnie w formie SP w parenchymie mózgu. W przeciwieństwie do tego, krótsze formy Aβ, takie jak Aβ1-36 do 1-41, odkładały się preferencyjnie w obszarach naczyniowych opon miękkich (Rysunek 1).

Rozkłady Aβ40 i Aβ42 zostały dodatkowo zweryfikowane za pomocą IHC z wykorzystaniem przyległych mrożonych skrawków tkanek. Przeciwciało anty-Aβ40 wybarwiło CAA (strzałki na Ryc. 2B), co stanowi wyraźny kontrast w stosunku do rozkładu Aβ42 w parenchymie mózgowym w formie SPs. W przypadku Aβ1-41 jesteśmy pierwszymi, którzy wykryli ten fragment w ludzkich mózgach; opracowaliśmy specyficzne przeciwciała, które pozwalają odróżnić Aβ41 od Aβ40 i Aβ4221.

Rozdzielczość przestrzenna metody MALDI-IMS jest zazwyczaj najważniejszym czynnikiem wymagającym poprawy. Rysunek 1 oraz Rysunek 2 przedstawiają obrazowanie MALDI-IMS o rozdzielczości 10 µm, co pozwala uzyskać ogólny profil rozkładu dla stosunkowo szerokiego obszaru21. Trudno jest dokładnie określić odложения amyloidu w przestrzeni podpajęczynówkowej, w tym w obrębie struktur naczyniowych. Aby zobrazować drobne struktury tkankowe naczyń podpajęczynówkowych oraz powierzchnię kory, przeprowadzono wysokorozdzielcze obrazowanie MALDI (40 µm: Rysunek 3; 20 µm: Rysunek 4 i Rysunek 5). W rezultacie MALDI-IMS wyraźnie wykazało, że krótsze formy Aβ, takie jak Aβ1-36 do 1-41, rozmieszczone są w ścianach tętnic, co jest zbieżne z wynikami IHC.

Technika MALDI-IMS wykazała szczegółowy rozkład zarówno Aβx-40, jak i Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oraz 1pE) w mózgu z chorobą Alzheimera (AD) przebiegającą z umiarkowaną angiopatią amyloidową mózgu (CAA). Na przykład, podczas gdy gatunki Aβx-40 wykazywały profil rozkładu podobny do Aβ1-40, gatunki Aβx-42 wykazywały inny wzorzec rozkładu niż Aβ1-4221. Zgodnie z obecnym protokołem, pojedyncze obrazy jonowe poszczególnych peptydów Aβ obserwowane za pomocą MALDI-IMS są przypisywane do konkretnych gatunków Aβ. W przeciwieństwie do tego, nabyte dane obrazowe mogą być badane przy użyciu nienadzorowanej statystyki wielowymiarowej w celu uzyskania segmentacji obrazu obszarów anatomicznych interesujących dla dalszej analizy nieokreślonych białek. Rysunek 5 przedstawia mapę segmentacji uzyskaną za pomocą analizy bisecting k-means zastosowanej do tego samego przekroju od pacjenta nr 321. Ta metoda klastrowania skutecznie zidentyfikowała struktury przypominające blaszki w parenchymie (kolor niebieski na Rysunku 5C) oraz struktury naczyniowe w przestrzeni podpajęczynowej (kolor zielony na Rysunku 5C). Interesujące jest znalezienie niewielkiego okrągłego obszaru w parenchymie, wykrytego bezpośrednio wokół małej tętniczki w parenchymie, a także w przestrzeni podpajęczynowej (kolor fioletowy na Rysunku 5C). Zostało to potwierdzone na pojedynczych obrazach jonowych tych poszczególnych peptydów Aβ na Rysunku 5D-5F.

Mikroskopia fluorescencyjna lokalizacji peptydów beta-amyloidu (Aβ) w przekrojach tkanki mózgowej.
Rysunek 1: MALDI-IMS zamrożonego przekroju mózgu z AD/CAA. Różne peptydy Aβ z trunkacją C-końcową w chorobie Alzheimera współistniejącej z ciężką CAA (pacjent nr 3) są widoczne na lewym panelu, a grupy kontrolne (pacjent nr 9 po prawej i pacjent nr 10 po lewej na wszystkich obrazach) na prawym panelu. Peptydy od Aβ1-36 do Aβ1-41 są odkładane preferencyjnie w naczyniach krwionośnych opon miękkich, natomiast Aβ1-42 i Aβ1-43 odkładają się w miąższu mózgu w formie blaszek starczych w przypadku nr 3, podczas gdy w mózgach pacjentów z grupy kontrolnej (przypadki nr 9 i 10) nie stwierdzono sygnału. Rozdzielczość = 100 μmSkala = 5 mm. Figura została zmodyfikowana za zgodą Kakuda et al.21. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Mikroskopia fluorescencyjna złogów amyloidu; wyniki immunohistochemiczne w analizie biopsji.
Rycina 2: MALDI-IMS zamrożonych przekrojów mózgu z AD/CAA oraz sąsiadujących przekrojów kory potylicznej z mózgów z AD. (A - C) zamrożone przekroje mózgu w AD/CAA oraz (D i E) sąsiednie sekcje kory potylicznej z mózgów pacjentów z AD poddano barwieniu immunologicznemu, koncentrując się na tętniczkach i miąższu mózgowym, z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko Aβ40 (D: BA27) lub Aβ42 (E: poliklonalne anty-Aβ42). Obie analizy wykazały, że Aβ40 odkłada się preferencyjnie w naczyniach krwionośnych opon miękkich (strzałki na panelu D) oraz tętniczki w przestrzeni podpajęczynówkowej i w miąższu mózgu, tworząc CAA. W przeciwieństwie do tego, Aβ42 odkłada się głównie w blaszkach amyloidowych (SPs). Dla IMS rozdzielczość wynosi = 100 μmSkala = 5 mm (A, B, i C) = 5 mm, 50 (D i E). Rysunek zmodyfikowano za zgodą autorów Kakuda i wsp.21. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy mikroskopowe gęstości optycznej; schemat przedstawia markery białkowe I-40/I-42; wyniki analizy widmowej.
Rycina 3: MALD-IMS mrożonych przekrojów mózgu z AD/CAA (pacjent nr 3) przy rozdzielczości 40 µm. Różne peptydy Aβ z trunkacjami i modyfikacjami na C- i N-końcu w przebiegu choroby Alzheimera z towarzyszącą ciężką CAA (pacjent nr 3). Peptydy Aβ1-36 do Aβ1-41 odkładały się preferencyjnie w naczyniach krwionośnych opon mózgowych, natomiast Aβ1-42 i Aβ1-43 odkładały się w miąższu mózgu w postaci blaszek starczych. Paski skali = 1 mm (A-B), 2 mm (lewy górny róg). Rozdzielczość = 40 μm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Obrazy mikroskopowe wykazujące czerwoną i zieloną fluorescencję w próbkach biologicznych; analiza komórkowa.
Rycina 4: MALDI-IMS zamrożonych przekrojów mózgu z AD/CAA (pacjent nr 3) przy rozdzielczości 20 µm. Ten panel przedstawia różne ucięte z końca C- oraz N-końcowego i zmodyfikowane peptydy Aβ w chorobie Alzheimera z towarzyszącą ciężką CAA (pacjent nr 3). Peptydy od Aβ1-36 do Aβ1-41 odkładać się preferencyjnie w naczyniach krwionośnych oponiopłucnych, podczas gdy Aβ1-42 i Aβ1-43 odkładają się w miąższu mózgowym w postaci blaszek starczych. Paski skali = 200 μm (a, b, c), 1 mm (lewy górny róg). Rozdzielczość = 20 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki analizy widmowej z diagramem klastrowania danych i mapami ciepła w eksperymentalnym badaniu spektroskopowym.
Rysunek 5: Mapa segmentacji, uzyskana za pomocą MALDI-IMS z zamrożonego przekroju mózgu z chorobą Alzheimera, wykazuje domniemaną blaszkę starczą, struktury dużych naczyń podpajęczynówkowych oraz małe arteriole miąższowe. (A) Mapa segmentacji uzyskana z wielowymiarowej analizy obrazów danych MALDI-IMS. (BAnaliza klastrowania oparta na bisekcyjnej metodzie k-średnich pozwoliła zidentyfikować struktury przypominające blaszki oraz naczynia w korze potylicznej. Klastry, podstruktury oraz zależności między nimi przedstawiono jako węzły (np. 1-0-0).C) Wyraźne wzorce lokalizacji peptydów Aβ przypominające struktury blaszek (kolor niebieski), naczyń podpajęczynowych (kolor zielony) oraz tętniczek (kolor czerwony). Należy zauważyć, że kilka czerwonych skupisk jest również rozproszonych w przestrzeni podpajęczynowej. Zostało to potwierdzone za pomocą obrazowania pojedynczych jonów tych poszczególnych peptydów Aβ przy 20 µm rozdzielczość: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 oraz (F) Aβ 1-42. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

PrzypadekPłećWiek w chwili śmierciBraak SPCAA
1M83C0.5
2M8C1
3M84C2
4M78C1
5M83C1
6M84O0
7M78O0
8M70O0
9M73O0
10M81O0

Tabela 1: Dane kliniczne i patologiczne przypadków AD z CAA oraz osób starszych z SP O. Ludzkie preparaty kory do IMS i IHC pobrano z Banku Mózgów w Tokijskim Instytucie Gerontologii (Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology). Każdy preparat mózgu pobrano z kory potylicznej pięciu pacjentów z AD i pięciu dopasowanych wiekowo osób z grupy kontrolnej. Zakres odkładania amyloidu, wykazany za pomocą przeciwciała monoklonalnego Aβ, określono według stadiów Braaka SP (amyloid). W stadium O w izokorze niemal nie występują blaszki starcze. W stadium C zajęte są praktycznie wszystkie obszary izokory. Mózgi osób z AD niezmiennie znajdują się w stadium C. Tabela została zmodyfikowana za zgodą Kakudy i wsp.21.

Dyskusja

Tutaj zademonstrowaliśmy szczegółowy protokół i wyniki wizualizacji Aβ i jego izoform z kilku autopsyjnych mózgów z AD i CAA z MALDI-IMS. Profil osadzania Aβs został drastycznie zmieniony z Aβ1-42 na jego warianty N- i C-końcowe. Aβ1-41 został po raz pierwszy zidentyfikowany i uwidoczniony w ludzkich mózgach za pomocą obecnego protokołu, a następnie został zweryfikowany za pomocą IHC21. Biorąc pod uwagę, że morfologia zdeponowanych Aβ przez IMS z analizą o wysokiej rozdzielczości (20 μm) musi być zgodna z IHC, IMS i IHC w równym stopniu przyczyniają się do rozróżnienia osadów Aβ na podstawie ich lokalizacji i zawartości białka, a także na podstawie ich morfologii. Ponieważ cały opisany tutaj eksperyment został przeprowadzony w korze potylicznej, badanie lokalizacji różnych gatunków beta-amyloidu we wszystkich regionach mózgu zostanie uogólnione w przyszłych eksperymentach z wykorzystaniem obecnego protokołu.

Krytycznymi etapami w ramach protokołu są etapy przygotowania tkanek w celu uzyskania skutecznej jonizacji zagregowanych białek w tkankach mózgu człowieka. Warstwa matrycy jest wymagana do pochłaniania energii lasera oraz indukowania desorpcji i jonizacji analitów. W tym procesie cały wycinek tkanki jest jednorodnie pokryty małymi kryształami. Jednorodna kokrystalizacja analitu z matrycą ma kluczowe znaczenie dla obrazowania o wysokiej czułości i bez artefaktów. Każda z trzech metod natryskiwania ma swoje zalety. Ręczne powlekanie natryskowe jest jedną z najczęściej stosowanych metod. Aerograf jest wygodny; Wymaga to jednak umiejętnego działania. Ponieważ niezbędna jest precyzyjna i powtarzalna technika eksperymentalna, zaleca się stosowanie opryskiwacza ultradźwiękowego i/lub opryskiwacza automatycznego, zgodnie z opisem w obowiązujących protokołach. W przypadku opryskiwacza ultradźwiękowego wilgotność i temperatura w pomieszczeniu nie będą miały na niego wpływu, ponieważ jest on rozpylany do komory. Tymczasem w przypadku opryskiwacza automatycznego uzyskuje się stosunkowo zachowaną rozdzielczość przestrzenną o dobrej odtwarzalności. Ogólnie rzecz biorąc, rozdzielczość przestrzenna uzyskana za pomocą trzech metod wzrasta w kolejności: 1) aerograf, 2) urządzenie automatyczne i 3) opryskiwacz ultradźwiękowy.

Co najważniejsze, protokół ten został pierwotnie wygenerowany w celu wykrywania i wizualizacji Aβ w próbkach ludzkiego mózgu poddanych autopsji. Wizualizacja Aβs za pomocą MALDI-IMS dla myszy APP23, która jest generowana jako zwierzęcy model AD oparty na szwedzkiej mutacji typu ludzkiego APP, została wcześniej opisana przez innych z istniejącą metodą18,19. Jednak poprzedni protokół zastosowany do APP23 nie był wystarczający do wizualizacji Aβ w jego rozdzielczości bocznej i czułości. We wcześniejszych pracach omówiono, że wysokie stężenia Aβ poza granicą tkanki są wyraźnie artefaktami w obrazowaniu APP23 z ich protokołem18,19. Oznacza to, że tak zwane "rozmycie" między rzeczywistymi obrazami SP i IMS spowodowane etapem ekstrakcji matrycy było nieuniknione w przypadku obrazowania typu MALDI. Jednak w obecnym protokole rozmycie zniknęło, a każde widmo reprezentowało każdy pojedynczy SP w miąższu mózgu.

Jak pokazano tutaj, możemy po raz pierwszy prześledzić Aβ1-41 w mózgach osób z chorobą Alzheimera i CAA z MALDI-IMS, a także z IHC, ze specyficznym przeciwciałem naszej własnej generacji21. Zgodnie z modelem przetwarzania Aβ, Aβ1-38 pochodzi od Aβ1-45 przez Aβ1-42, podczas gdy Aβ1-41 pochodzi od Aβ1-45 przez stopniowe cięcie γ-sekretazy 27,28,29,30,31. Oznacza to, że obecny protokół obsługuje ten model. Jeśli chodzi o ograniczenia tej techniki, musimy wziąć pod uwagę niejednorodność próbek z ludzkiego mózgu z autopsji. Najważniejszym krokiem, w pewnym sensie, jest ocena kwalifikowanej tkanki mózgowej z autopsji za pomocą dowodów etycznych. Dzięki obecnemu protokołowi na tych zakwalifikowanych tkankach mózgowych z autopsji, MALDI-IMS może indywidualnie śledzić całą dystrybucję złożonych cząsteczek z wieloma modyfikacjami, a także nieznanymi czynnikami regulującymi patogenezę choroby Alzheimera, które nie zostały jeszcze zdefiniowane. Ponadto, aby zrozumieć ogólną patogenezę różnych neuropatologii w starzejących się mózgach ludzkich, musi być możliwe przyjęcie MALDI-IMS jako standardowego podejścia, w połączeniu z obserwacjami klinicznymi, genetycznymi i patologicznymi w chorobach neurologicznych.

Kolejnym krytycznym krokiem MALDI-IMS jest proces eksploracji danych z uzyskanego zestawu danych, który zawsze jest czasochłonny. Ręczna eksploracja danych każdego rozkładu pików wymaga od użytkowników przeklikiwania się przez każdy obraz i szukania rozkładów, które mogą korelować z morfologią analizowanej próbki. Automatyczna segmentacja przestrzenna może być wykorzystana jako pierwszy krok eksploracji danych, zapewniając przegląd zbioru danych i umożliwiając szybkie wykrycie widocznych cech. W tym podejściu podobieństwa między widmami danego regionu są wyznaczane statystycznie, a podobne widma grupowane są w jeden klaster. Wszystkie piksele są oznaczone kolorami zgodnie z ich przypisaniem do klastra (Rysunek 5). W niniejszym badaniu AD/CAA obszarem zainteresowań jest przestrzeń odkładania się Aβ w blaszce miąższowej oraz podpajęczynówkowych i miąższowych strukturach naczyniowych. Dwa charakterystyczne piki, które zostały następnie zweryfikowane za pomocą IHC, to wartości m/z z od Aβ1-40 i Aβ1-4221. W ten sposób łatwo jest znaleźć kolokalizowane m/z z Aβ1-40 i Aβ1-42, które było już przypisane do N- i C-końcowego skróconego Aβ, a także nieznanych peptydów, do dalszej analizy.

Weller i współpracownicy poinformowali, że Aβ gromadzi się w ścianach naczyń, bardziej wokół tętnic niż wokół żył21. Ponadto zaproponowano, że płyn śródmiąższowy (ISF) zawiera Aβs wydalane z miąższu mózgu do węzła chłonnego drogą drenażu okołonaczyniowego 22,23,24,25,26. Obecny protokół generowania mapy segmentacji na podstawie zestawu danych MALDI-IMS o rozdzielczości 20 μm potwierdza możliwe istnienie ścieżek drenażu okołonaczyniowego mózgu (ryc. 5), które znacząco przyczyniają się do CAA w AD21,32. Co więcej, możemy odkryć białka markerowe kolokalizowane z blaszką miażdżycową i naczyniem podpajęczynówkowym, obliczając korelację każdej wartości m / z. Aby zrozumieć ogólną patogenezę różnych neuropatologii w starzejących się mózgach ludzkich, musi być możliwe przyjęcie MALDI-IMS jako skutecznego podejścia w połączeniu z ustalonymi danymi IHC z obserwacji klinicznych, genetycznych i patologicznych w chorobach neurologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Grant-in-Aid na badania naukowe w innowacyjnych obszarach (Brain Protein Aging and Dementia Control 26117004; dla M.I. i T.M.). Badania te były częściowo wspierane przez Strategiczny Program Badawczy dla Nauk o Mózgu Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CryostatLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyCM1950
Szkiełko mikroskopowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO)Bruker Daltonics#237001
Blade (jednorazowe)Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy#117394
O.C.T. CompoundLeica Microsystems, Wetzlar, NiemcyNiebieski
skanerFSC 22EPSONGT-980
Szczotka powietrznaGSI CreosPS274
KompresorMRHOBBYMr.Linear kompresor L5
Opryskiwacz ultradźwiękowyBruker DaltonicsImagePrep
Automatyczny opryskiwaczHTX TechnologiesTM Opryskiwacz
koncentryczny skaningowy laserowy CarlZeiss Inc.LSM 700
Ultraszybki instrument MALDIBruker DaltonicsrapifleX MALDI Tissuetyper
Oprogramowanie sterujące MALDIBruker DaltonicsFlexControl 3.8
Oprogramowanie do analizy danychBruker DaltonicsFlexImaging 5.0
Oprogramowanie do histologii molekularnejSCiLS, Brema, NiemcySciLS Lab 2016a
Oprogramowanie statystyczneSCiLS, Brema, NiemcySciLS Lab 2016a
Biotynylowane przeciwciała anty-królicze IgGVector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin i biotynylowany kompleks HRP.Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CAVectastain Elite ABC
3,3-diaminobenzydyna (DAB)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CAVectastain Elite zestaw
Kwas sinapinowy (SA)Nacalai tesque 30494-91 Kwas alfa-cyjano-4-hydroksylo-cynamonowy (CHCA)Wako 037-19261 Wzorzec kalibracji Bruker Daltonics Biotynylowane przeciwciała anty-mysie IgG Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA Zestaw ABC

Bibliografia

  1. Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189(2016).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
  3. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
  6. Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
  7. Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
  8. Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24(2016).
  9. Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
  10. Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
  11. Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
  12. Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
  13. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
  14. Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
  15. Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
  16. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
  17. Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
  18. Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
  19. Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
  20. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
  21. Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73(2017).
  22. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
  23. Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
  24. Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
  25. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
  26. Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
  27. Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
  28. Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
  29. Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
  30. Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
  31. Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
  32. Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

złogi beta-amyloiduobrazowanie masą spektrometryczną MALDItkanka mózgu człowiekaobróbka wstępna kwasem mrówkowymwykrywanie blaszek starczychmózgowa angiopatia amyloidowarozdzielczość przestrzenna 20 mikronówmatryca z kwasu sinapinowegostandard kalibracyjny peptydówoprogramowanie do histologii molekularnej
Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.