Artykuł metodologiczny

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57649

⸱

3 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Streszczenie

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są niezwykle cenne w odkrywaniu nowych biologicznych spostrzeżeń na temat mechanizmów inicjacji i progresji ludzkich chorób, takich jak rak. Myszy transgeniczne i z warunkowym nokautem były często wykorzystywane do nadekspresji lub ablacji genów w określonych tkankach lub typach komórek in vivo. Jednak generowanie modeli myszy linii zarodkowej może być czasochłonne i kosztowne. Niedawne postępy w technologiach edycji genów i możliwość dostarczania plazmidów DNA przez infekcję wirusową umożliwiły szybkie wygenerowanie modeli autochtonicznego raka myszy niebędących linią zarodkową dla kilku narządów. Pęcherz moczowy jest narządem, do którego wektory wirusowe mają utrudniony dostęp ze względu na obecność warstwy glikozaminoglikanu pokrywającej nabłonek dróg moczowych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowaną w laboratorium w celu skutecznego dostarczania plazmidów DNA do nabłonka moczowego myszy in vivo. Poprzez dopęcherzowe wkraplanie plazmidu DNA pCAG-GFP i elektroporację chirurgicznie odsłoniętego pęcherza, pokazujemy, że plazmid DNA może być dostarczony specyficznie do komórek urotelialnych pęcherza moczowego w celu przejściowej ekspresji. Nasza metoda zapewnia szybki i wygodny sposób na nadekspresję i knockdown genów w pęcherzu myszy i może być stosowana do budowy GEMM raka pęcherza moczowego i innych chorób urologicznych.

Wprowadzenie

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) odgrywają istotną rolę w poszerzaniu naszej wiedzy na temat rozwoju zwierząt, funkcji genów in vivo i mechanizmów progresji chorób1,2. GEMM linii zarodkowej są tradycyjnie rozwijane na dwa sposoby. Pierwszym z nich jest stworzenie transgenicznych myszy poprzez wstrzyknięcie plazmidu DNA do przedjądrza, a następnie przeszczepienie zygot samicom w rzekomej ciąży. Drugim jest wytwarzanie myszy typu knock-out/knock-in poprzez rekombinację homologiczną w embrionalnych komórkach macierzystych i rozwój chimer. Warunkowy nokaut genów w określonym typie tkanki lub komórki obejmuje hodowlę genetycznie zmodyfikowanych alleli z miejscami Cre i flox przez wiele pokoleń. Cały proces może być kosztowny i czasochłonny, zwłaszcza jeśli celem jest celowanie w wiele genów specyficznych dla tkanki. Ostatnio technologie edycji genów, takie jak zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), zostały zastosowane do kilku narządów myszy w celu wywołania specyficznych tkankowo zmian genetycznych w celu modelowania raka autochtonicznego3,4,5,6,7 lub popraw mutacje choroby in situ8,9. W tych badaniach dostarczanie wektorów gRNA było zwykle osiągane poprzez adenowirusowe lub lentiwirusowe zakażenie narządu lub hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej. Względna łatwość dostarczania składników CRISPR do płuc i wątroby znacznie poprawiła wygodę i wydajność modelowania raka w tych narządach w porównaniu z tradycyjnymi modelami mysimi opartymi na Cre-Lox.

Nabłonek dróg moczowych jest miejscem, z którego pochodzi większość guzów pęcherza moczowego. Dostarczanie wektorów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza moczowego w celu modelowania raka lub terapii genowej jest utrudnione przez warstwę glikozaminoglikanu na wierzchołkowej powierzchni nabłonka dróg moczowych, która działa jako bariera dla przylegania zakaźnych wirusów10,11. Zastosowano kilka środków do obróbki wstępnej, takich jak Syn3 i dodecyl-β-d-maltozyd, aby przełamać tę barierę i zwiększyć skuteczność infekcji adenowirusem12,13,14. Nie podano, czy wirusy związane z adenowirusami (AAV) mogą skutecznie infekować pęcherz moczowy. Ogólnie rzecz biorąc, pożądana byłaby metoda dostarczania nieoparta na wirusach. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowaną w laboratorium w celu skutecznego dostarczania plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych myszy poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Ponieważ nasze podejście nie obejmuje chemicznej obróbki wstępnej warstwy glikozaminoglikanu ani produkcji wirusa, znacznie upraszcza dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka moczowego pęcherza myszy i powinno ułatwić różne badania in vivo chorób pęcherza moczowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz.

1. Przygotowanie plazmidu i narzędzi

  1. Dla każdego pęcherza moczowego do transfekcji przygotuj co najmniej 20 μl plazmidu DNA (1 μg/μl).
  2. Dodać 1 μl błękitu trypanowego do 20 μl roztworu plazmidu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować do dobrego wymieszania.
  3. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem. Często spryskuj narzędzia chirurgiczne i rękawice 70% etanolem lub używaj sterylizatora z kulkami szklanymi podczas wykonywania poniższych czynności, aby utrzymać sterylne warunki.

2. Zwierzę znieczulające

  1. Użyj stołowego systemu anestezjologicznego, aby znieczulić zwierzę izofluranem. Włącz zbiornikO2 i ustaw przepływomierz tlenu na 1 l/min.
  2. Umieść dorosłą samicę myszy C57BL/6J w komorze indukcyjnej. Włącz i ustaw waporyzator izofluranu na 3% w celu indukcji. Mysz powinna być w znieczuleniu w ciągu 2 minut. Podać podskórnie buprenorfinę przeciwbólową (0,1 mg/kg) po wyjęciu myszy z komory indukcyjnej w celu prewencyjnego znieczulenia.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystywane są samice myszy, ponieważ są one łatwiejsze w obsłudze podczas cewnikowania cewki moczowej. Protokół działa również w przypadku samców myszy, ale podczas wykonywania kroku 3 należy zachować szczególną ostrożność.
  3. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Połóż znieczuloną mysz przodem do góry na poduszce grzewczej, tak aby jej nos znajdował się w stożku nosowym. Przekręć przełącznik obwodu powietrza, aby izofluran mógł przejść przez stożek nosowy.
  4. Umocuj głowę i stożek nosowy taśmą klejącą. Dostosuj parownik izofluranu do 2% w celu konserwacji.
  5. Unieruchomić kończyny taśmą klejącą. Wykonaj testy szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że zwierzę jest w głębokim znieczuleniu, a następnie ogol okolice brzucha.

3. Wyczerpanie moczu i płukanie pęcherza moczowego

  1. Nałóż lubrykant na cewnik (24G, długość 2,11 cm, średnica zewnętrzna 0,045 cm) i upewnij się, że jego zewnętrzna powierzchnia jest całkowicie pokryta.
  2. Włóż cewnik do otworu cewki moczowej i powoli dociśnij go, aż dotrze do pęcherza, po czym mocz powinien wypłynąć przez cewnik. Delikatnie uciskaj brzuch, aby pomóc w odprowadzaniu moczu.
    1. Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo wprowadzony do pęcherza, obserwując automatyczny odpływ moczu. Unikaj przekłuwania cewki moczowej i ściany pęcherza, a w razie potrzeby nałóż smar wiele razy.
  3. Wylać mocz za pomocą pipety do zlewki na odpady.
  4. Odpipetować 80 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zewnętrznego końca cewnika, tak aby drugi koniec nadal znajdował się w pęcherzu moczowym. Ostrożnie przymocować strzykawkę o pojemności 1 ml do cewnika. Delikatnie wepchnąć strzykawkę, aby wstrzyknąć PBS do pęcherza moczowego. Pozostaw trochę PBS w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu.
  5. Wyjąć strzykawkę. Poczekaj, aż PBS spłynie z pęcherza. Delikatnie naciśnij brzuch, aby ewakuować PBS.
  6. Wyrzucić PBS z cewnika za pomocą pipety do zlewki na odpady.
  7. Powtórz mycie PBS (kroki 3.4 - 3.6) jeszcze dwa razy.
    UWAGA: Podczas tych etapów prania należy pracować delikatnie. Krew w cewniku lub niewydolność automatycznego odpływu płynu zwykle wskazuje na przekłucie cewki moczowej. Ważne jest również, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ obniżą one wydajność elektroporacji.

4. Dostarczanie plazmidu

  1. Nałóż 70% etanol na brzuch myszy i za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie 1 cm, aby otworzyć skórę brzucha nad pęcherzem.
  2. Pobrać pipetę z co najmniej 20 μl plazmidu i roztworu błękitu trypanowego do zewnętrznego końca cewnika i podłączyć strzykawkę.
  3. Wstrzyknąć roztwór plazmidu do pęcherza moczowego. Jeśli pęcherz zmieni kolor na niebieski, wstrzyknięcie się powiedzie. Pozostaw trochę płynu w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu.
  4. Chwyć zewnętrzny otwór cewki moczowej za pomocą pęsety, a następnie wyjmij cewnik i strzykawkę. Użyj sznurka, aby zacisnąć zewnętrzny otwór cewki moczowej. Zrób dwie pętle ze sznurka, a następnie zawiąż dwoma węzłami.
    UWAGA: Zaciśnięcie cewki moczowej jest ważne dla zapobiegania cofaniu się płynu plazmidowego.
  5. Włącz generator elektroporacji o następujących parametrach: 33 V, czas pracy 50 ms i czas interwału 950 ms.
  6. Przytrzymaj pęcherz pęsetą i uszczypnij pęcherz dwiema elektrodami. Naciśnij pedał nożny, aby wykonać elektroporację.
    UWAGA: Impulsy elektryczne są ustawione tak, aby pojawiały się 5 razy w krótkich odstępach czasu po każdym naciśnięciu pedału. Mysz może drgać w tym procesie. Naciśnięcie pedału nożnego więcej niż raz może zwiększyć wydajność podawania, ale zbyt wiele impulsów elektrycznych może uszkodzić integralność tkankową nabłonka dróg moczowych.
    1. Unikaj kontaktu pęsety z elektrodami, ponieważ spowoduje to wytworzenie iskry.

5. Odzyskiwanie

  1. Zszyj otwór brzuszny i skórny sterylnym szwem chirurgicznym i klipsami. Nałóż jod na ranę.
  2. Usunąć zwierzę z układu izofluranu. Buprenorfinę należy podawać przeciwbólowo (0,1 mg/kg) podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
  3. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej i po pełnym wyzdrowieniu włóż je z powrotem do klatki domowej. Sprawdzaj zwierzę co najmniej raz dziennie pod kątem normalnej mobilności, zachowań związanych z piciem i karmieniem oraz braku oznak infekcji do czasu zagojenia się nacięcia, a następnie usuń klipsy. Podawaj kolejne wstrzyknięcia buprenorfiny przeciwbólowej, jeśli zwierzę wykazuje objawy bólowe, takie jak zmniejszona pielęgnacja, zwiększona agresywność i wokalizacja.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność dostarczania genów do urothelium pęcherza moczowego, do elektroporacji wykorzystaliśmy plazmid pCAG-GFP15. Przez cewkę moczową wstrzyknięto 20 µL plazmidu i roztworu błękitu trypanowego, a następnie podano 5 impulsów elektrycznych. Po 48 h wycięto pęcherz myszy i za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego zaobserwowano obszary fluorescencji GFP, podczas gdy pęcherz w grupie kontrolnej, który nie został poddany elektroporac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Elektroporacja zwiększa przepuszczalność błony komórkowej i jest potężną technologią elektrotransferu genów16. Dostarczanie genów do żywych gryzoni za pomocą elektroporacji jest często stosowane w dziedzinach neurobiologii 17,18,19,20,21. Jego potencjalne zastosowania w wielu innych narządach nie zostały szeroko zbadane. Według naszej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Bin Chenowi, dr Yue Zhangowi i Kendy Hoangowi za pomoc w ustawieniu systemu elektroporacji. Praca ta była wspierana przez granty z Santa Cruz Cancer Benefit Group i NIH dla Z.A.W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka BD 1mL TBFisher148232E
BuprenorfinaSigmaB9275-50MG
Pęseta DumontRoboz Surgical InstrRS-5005Traktuj 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym
ECM830 Elektroporator fal SQAparat Harvarda450052
Exel International Jednorazowe cewniki dożylneSafelet Fisher Scientific14-841-2124G, długość 2,11 cm, średnica zewnętrzna 0,045 cm
Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjneRoboz Surgical InstrRS-5135Traktuj 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym
IsofluraneVet one501017
K& H Podgrzewana mata spoczynkowa dla małych zwierząt, 9 na 12 caliAmazonnie dotyczyPrzykryj matę grzewczą ręcznikami papierowymi
Maść okulistycznaFisherNC0849514
PBS, pH 7,4Life Technologies10010049
Końcówki do pipet 200 i mikro; LUSA Scientific1111-0206
Końcówki do pipet, uniwersalne dopasowanie; 0,1 do 10 i mikro; LFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
plazmid CAG-GFPAddgene16664
Platynowa pęseta 5 mmAparat Harvard450489średnicy 5 mm
NożyczkiRoboz Surgical InstrRS-5880Traktuj za pomocą 70% etanol przed użyciem chirurgicznym
SznurekAmazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0,8mm 1mm skórzane szwy do szycia płaska woskowana nić sznurek sznurek
Taśma, ScotchFisher19047257
Therio-gel Weterynaryjny lubrykantPBS Zdrowie zwierząt353-736
Trypan Blue StainLife Technologies15250061
V-1 Blat stołu znieczulenie systemoweVetEquip901806
Vicryl fioletowy szew 18" FS-2 cięcie 5-0FisherNC0578475
Walgreens Povidone Jod 10%Walgreens953982
Klipsdo ran Fisher018045
Aplikator do spinania ranFisher01804

Bibliografia

  1. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  2. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  3. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  4. Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
  5. Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
  6. Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
  7. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  8. Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
  9. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
  10. Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
  11. Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
  12. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
  13. Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
  14. Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
  15. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
  16. Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  17. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  18. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883(2008).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
  21. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239(2007).
  22. Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika elektroporacjirak p cherza moczowego myszynadekspresja genuinstylacja wewn trz p cherzowaekspresja GFPbarwienie immunofluorescencyjneods oni cie chirurgicznekom rki urothelium

Powiązane artykuły