Artykuł metodologiczny

Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

DOI:

10.3791/57656

⸱

25 września 2019

 , 
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z tym artykułem związana jest aktualizacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć aktualizację.

Przewlekłe rany powstają z ostrych ran na mysim modelu cukrzycowym poprzez wywołanie wysokiego poziomu stresu oksydacyjnego po pełnej grubości rany skórnej. Rana jest leczona inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, co powoduje upośledzenie gojenia i rozwoju biofilmu przez bakterie obecne w mikrobiomie skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekłe rany powstają w wyniku wadliwej regulacji w jednym lub więcej złożonych procesach komórkowych i molekularnych związanych z prawidłowym gojeniem. Dotykają one ~6,5 mln ludzi i kosztują ~40 mld USD rocznie w samych Stanach Zjednoczonych. Chociaż włożono wiele wysiłku w zrozumienie, w jaki sposób rozwijają się rany przewlekłe u ludzi, podstawowe pytania pozostają bez odpowiedzi. Niedawno opracowaliśmy nowatorski mysi model przewlekłych ran cukrzycowych, które mają wiele cech charakterystycznych dla ludzkich ran przewlekłych. Używając myszy db/db-/-, możemy generować przewlekłe rany, wywołując wysoki poziom stresu oksydacyjnego (OS) w tkance rany natychmiast po zranieniu, stosując jednorazowe leczenie inhibitorami specyficznymi dla enzymów przeciwutleniających katalazy i peroksydazy glutationowej. Rany te mają wysoki poziom OS, naturalnie rozwijają biofilm, stają się w pełni przewlekłe w ciągu 20 dni po leczeniu i mogą pozostać otwarte dłużej niż 60 dni. Ten nowatorski model ma wiele cech przewlekłych ran cukrzycowych u ludzi, a zatem może znacząco przyczynić się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób rany stają się przewlekłe. Jest to duży przełom, ponieważ przewlekłe rany u ludzi powodują znaczny ból i niepokój u pacjentów, a w przypadku nierozwiązania skutkują amputacją. Co więcej, rany te są bardzo kosztowne i czasochłonne w leczeniu oraz prowadzą do znacznych strat w dochodach osobistych pacjentów. Postęp w tej dziedzinie badań dzięki zastosowaniu naszego modelu ran przewlekłych może znacznie poprawić opiekę zdrowotną dla milionów osób cierpiących na tę wyniszczającą chorobę. W tym protokole bardzo szczegółowo opisujemy procedurę, która ma na celu spowodowanie, że ostre rany staną się przewlekłe, co nie było wcześniej wykonywane.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gojenie ran obejmuje złożone procesy komórkowe i molekularne, które są regulowane czasowo i przestrzennie, zorganizowane w sekwencyjne i nakładające się na siebie etapy, które obejmują wiele różnych typów komórek, w tym, ale nie ograniczając się do odpowiedzi immunologicznej i układu naczyniowego1. Natychmiast po tym, jak skóra dozna urazu, czynniki i komórki krwi gromadzą się w miejscu rany i inicjują kaskadę krzepnięcia, tworząc skrzep. Po osiągnięciu homeostazy naczynia krwionośne rozszerzają się, aby wpuścić do miejsca rany tlen, składniki odżywcze, enzymy, przeciwciała i czynniki chemotaktyczne, które chemoprzyciągają polimorfonukleocyty, aby oczyścić łożysko rany z obcych zanieczyszczeń i wydzielać enzymy proteolityczne2. Aktywowane płytki krwi wydzielają różne czynniki wzrostu, które stymulują keratynocyty na brzegu rany w celu ponownego nabłonkowania zranionego obszaru. Monocyty zrekrutowane do miejsca rany różnicują się w makrofagi, które fagocytozą bakterie i martwe neutrofile oraz wydzielają dodatkowe czynniki w celu utrzymania sygnałów proliferacyjnych i promigracyjnych keratynocytów. W fazie proliferacji, podczas gdy trwa reepitelializacja, nowa tkanka ziarninowa złożona z fibroblastów, monocytów/makrofagów, limfocytów i komórek śródbłonka kontynuuje proces odbudowy2. Angiogeneza jest stymulowana przez promowanie proliferacji i migracji komórek śródbłonka, co skutkuje rozwojem nowych naczyń. Nabłonek i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej budują barierę przed środowiskiem. W miarę gojenia się rany i ziarniny tkanki przekształcającej się w bliznę, apoptoza eliminuje komórki zapalne, fibroblasty i komórki śródbłonka, nie powodując dodatkowych uszkodzeń tkanek. Wytrzymałość tkanki na rozciąganie jest zwiększana przez fibroblasty przebudowujące różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak kolagen, dzięki czemu nowo powstała tkanka jest prawie tak mocna i elastyczna jak niezraniona skóra2.

Każde odchylenie od tego wysoce skoordynowanego postępu w kierunku zamykania ran prowadzi do upośledzenia i/lub przewlekłych ran3. Rany przewlekłe charakteryzują się zwiększonym stresem oksydacyjnym, przewlekłym stanem zapalnym, uszkodzoną mikrokrążeniem i nieprawidłową macierzą kolagenową w ranie4. Stres oksydacyjny, zwłaszcza w ranie, może opóźnić zamknięcie rany2,5. Kiedy w pierwszym etapie gojenia się ran faza zapalna staje się nieuregulowana, tkanka gospodarza ulega rozległym uszkodzeniom z powodu ciągłego napływu komórek zapalnych5, które uwalniają enzymy cytotoksyczne, wzrost wolnych rodników tlenowych i nieuregulowane mediatory stanu zapalnego, co prowadzi do śmierci komórki6,7.

W tym destrukcyjnym mikrośrodowisku, bakterie tworzące biofilm wykorzystują składniki odżywcze gospodarza i przyczyniają się do uszkodzenia tkanki gospodarza2. Te biofilmy są trudne do kontrolowania i usuwania, ponieważ uwodnione zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe złożone z białek, DNA, RNA i polisacharydów pozwalają bakteriom znajdującym się w środku być tolerancyjnymi na konwencjonalne antybiotyki i unikać wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza2,8,9.

Badanie ran przewlekłych jest kluczowe, ponieważ dotykają one ~6,5 miliona ludzi i kosztują ~40 miliardów dolarów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych10. Pacjenci z cukrzycą mają zwiększone ryzyko rozwoju przewlekłych ran, które wymagają amputacji w celu powstrzymania rozprzestrzeniania się infekcji. U tych pacjentów ryzyko śmiertelności w ciągu 50 lat po amputacji jest przypisywane mechanizmowi patofizjologii cukrzycy11. Związek między układem odpornościowym gospodarza a mikrobiomem w gojeniu się ran jest istotnym tematem trwających badań, ponieważ konsekwencje ran przewlekłych, jeśli nie są leczone, obejmują amputację i śmierć12.

Chociaż włożono wiele wysiłku w zrozumienie, jak rozwijają się rany przewlekłe u ludzi, nadal nie jest jasne, jak i dlaczego powstają rany przewlekłe. Eksperymenty mające na celu zbadanie mechanizmów upośledzonego gojenia są trudne do przeprowadzenia u ludzi, a specjaliści zajmujący się gojeniem ran widzą tylko pacjentów z przewlekłymi ranami, które osiągnęły już przewlekłość przez tygodnie lub miesiące. W związku z tym specjaliści nie są w stanie zbadać, jakie procesy poszły nie tak, co doprowadziło do tego, że rana rozwinęła się w przewlekłą2. Brakuje modeli zwierzęcych, które oddawałyby złożoność ludzkich ran przewlekłych. Dopóki nie opracowaliśmy naszego modelu, nie istniał żaden model do badań nad ranami przewlekłymi.

Model ran przewlekłych został opracowany u myszy, które mają mutację w receptorze leptyny (db/db-/-)13. Te myszy są otyłe, chorują na cukrzycę i mają upośledzone gojenie, ale nie rozwijają przewlekłych ran14. Średni poziom glukozy we krwi wynosi około 200 mg/dl, ale może sięgać nawet 400 mg/dl15. Gdy wysoki poziom stresu oksydacyjnego (OS) w tkance rany zostanie wywołany natychmiast po zranieniu, rana staje się przewlekła16. Rany db/db-/- są uważane za przewlekłe przez 20 dni i pozostają otwarte przez 60 dni lub dłużej. Biofilm wytwarzany przez bakterie rozwija się od trzech dni po zranieniu; Dojrzały biofilm jest widoczny 20 dni po zranieniu i utrzymuje się do zamknięcia każdej z ran. Bakterie tworzące biofilm, które znajdujemy u tych myszy, znajdują się również w ludzkich przewlekłych ranach cukrzycowych.

Stres oksydacyjny jest wywoływany przez leczenie ran dwoma inhibitorami enzymów antyoksydacyjnych, katalazą i peroksydazą glutationową, dwoma enzymami o zdolności rozkładu nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru jest reaktywną formą tlenu i może powodować uszkodzenia komórek poprzez utlenianie białek, lipidów i DNA. Katalaza katalizuje rozkład nadtlenku wodoru na mniej szkodliwe substancje chemiczne, tlen i wodę. 3-amino-1,2,4-triazol (ATZ) hamuje katalazę poprzez specyficzne i kowalencyjne wiązanie się z aktywnym centrum enzymu, dezaktywując go17,18,19. ATZ został wykorzystany do badania skutków stresu oksydacyjnego zarówno in vitro, jak i in vivo poprzez hamowanie katalazy20,21,22,23,24. Peroksydaza glutationowa katalizuje redukcję nadtlenku wodoru poprzez przeciwutleniacz, glutation, i jest ważnym enzymem, który chroni komórkę przed stresem oksydacyjnym25. Kwas merkaptobursztynowy (MSA) hamuje peroksydazę glutationową poprzez wiązanie się z miejscem aktywnym selenocysteiny enzymu z tiolem, dezaktywując go26. MSA został wykorzystany do badania skutków stresu oksydacyjnego również in vitro i in vivo20,27,28.

Ten nowatorski model ran przewlekłych jest potężnym modelem do zbadania, ponieważ ma wiele cech obserwowanych w ludzkich przewlekłych ranach cukrzycowych, w tym przedłużony stan zapalny spowodowany zwiększonym OS i naturalne tworzenie biofilmu z mikrobiomu skóry. Rany mają upośledzoną interakcję skórno-naskórkową, nieprawidłowe odkładanie się macierzy, słabą angiogenezę i uszkodzone naczynienie. Przewlekłe rany rozwijają się zarówno u samców, jak i samic myszy, więc obie płcie mogą być wykorzystane do badania ran przewlekłych. W związku z tym model ran przewlekłych może znacząco przyczynić się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat tego, jak takie rany się zaczynają. Korzystanie z tego modelu ran przewlekłych może dostarczyć odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące tego, w jaki sposób przewlekłość jest inicjowana/osiągana dzięki wkładowi fizjologii upośledzonego gojenia się ran i mikrobiomu gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały zakończone zgodnie z przepisami federalnymi oraz polityką i procedurami Uniwersytetu Kalifornijskiego, które zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski, Riverside IACUC.

1. Zwierzę

  1. Stosuj witaminę B6 dla osób z cukrzycą i otyłością. Myszy BKS(D)-Lepr db/J do modelu ran przewlekłych. Opcje zakupu obejmują heterozygoty do hodowli lub homozygoty bezpośrednio do eksperymentów.
  2. Hoduj heterozygoty samce i samice, aby uzyskać potomstwo. Statystycznie tylko jedna czwarta miotu stanie się cukrzycą i otyłością (db/db-/-).
  3. Myszy odsadzone od piersi i domowe db/db-/- wraz z rodzeństwem z miotu 3 tygodnie po urodzeniu. Oddziel myszy db/db-/- od ich rodzeństwa z miotu 5 tygodni po urodzeniu i trzymaj je z innymi myszami db/db-/- do 5-6 miesiąca życia i mogą być wykorzystane do modelu rany przewlekłej. W tym czasie może rozwinąć się dojrzały i złożony mikrobiom skóry.
    UWAGA: Myszy db/db-/- można łatwo zidentyfikować wizualnie na podstawie rodzeństwa z miotu w wieku 3-5 tygodni. Myszy db/db-/- są otyłe, chorują na cukrzycę i będą znacznie większe i bardziej okrągłe niż dzikie i heterozygotyczne rodzeństwo z miotu. Ich brzuch może wydawać się nieco bardziej różowy, a biodra większe. Zwiększona masa ciała powinna być potwierdzona przed zabiegiem. Możliwe jest również zmierzenie wysokiego poziomu glukozy we krwi i genotypowaniu myszy w celu potwierdzenia mutacji w receptorze leptyny.

2. Wiwarium i hodowla

  1. Trzymaj myszy db / db-/- w konwencjonalnym wiwarium (nie w obiekcie wolnym od barier / specyficznych patogenów), aby na skórze myszy db / db-/- można było ustalić mikroflorę. Aby konkretnie modelować ludzi, którzy cierpią z powodu przewlekłych ran, nie należy podejmować specjalnych środków ostrożności, aby zapobiec narażeniu na patogeny.
  2. Chroń klatki za pomocą mikroizolatorów, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się infekcji w wiwarium. Dwa razy w tygodniu zmieniaj klatki na nową ściółkę i karm myszy zwykłą karmą wiwaryjną. Nie sterylizuj w autoklawie ani pościeli, ani żywności.
  3. Ustaw temperaturę w pomieszczeniu w zakresie od 21 do 24 °C, z niewielkimi wahaniami w zależności od pory roku. Wilgotność, w zależności od klimatu i lokalizacji, będzie wynosić od 19 do 70%.

3. Wymagania dotyczące rozwoju ran przewlekłych

  1. Do rozwoju przewlekłych ran należy używać wyłącznie samców i samic myszy, które są fenotypowo otyłe, chore na cukrzycę i mają co najmniej 5-6 miesięcy. Waga tych myszy powinna wahać się w granicach 40-80 g, średnio około 60 g.
  2. Nie używaj myszy, które są uważane za otyłe, ale ważą mniej niż 50 g.
    UWAGA: Wszystkie myszy, o których mowa w niniejszym protokole, przechodzą opisane tutaj kwalifikacje, chyba że zaznaczono inaczej.

4. Golenie i stosowanie balsamu do depilacji

UWAGA: Usuń niechciane włosy na grzbiecie myszy przed zranieniem. Poniższa procedura jest wykonywana na żywych myszach db/db-/-, które nie są pod narkozą dzień przed operacją. Podejmij środki ostrożności, aby zapobiec stresowi i szkodom dla zwierzęcia.

  1. golenie
    1. Umieść mysz na czystej powierzchni i chwyć podstawę ogona myszy kciukiem i drugim palcem, aby zabezpieczyć pozycję myszy. Mysz może skakać lub wykonywać nagłe ruchy; Jeśli tak się stanie, szybko zareaguj i odciągnij maszynkę do strzyżenia, aby zapobiec obrażeniom.
    2. Ogol włosy myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów (rysunki 1A, 1B). Ustaw ostrze równolegle do skóry myszy i ogol cały grzbiet od szyi do ogona, w tym wokół ogona, aby zapewnić wystarczająco dużą powierzchnię, aby umieścić przezroczysty opatrunek foliowy (patrz Tabela materiałów). Delikatnie przesuwaj ostrze w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów, aby uzyskać najbardziej efektywne strzyżenie. (Rysunek 1B).
      1. Nie wciskaj ostrza głęboko w skórę, ponieważ może to uszkodzić skórę przez siniaki lub skaleczenia.
  2. Stosowanie balsamu do depilacji
    UWAGA: Użyj balsamu do depilacji, aby uzyskać bardzo gładką skórę, aby przezroczysty opatrunek mógł mocno przylegać.
    1. Namocz skórę myszy wodą, aby zapobiec oparzeniom chemicznym, lekko dociskając nasączoną papierową chusteczkę do ogolonej skóry z wystarczającym naciskiem, aby zwilżyć już ścięte włosy przy skórze.
    2. Gdy skóra jest mokra, delikatnie pocieraj skórę myszy niewielką porcją balsamu do depilacji (patrz Tabela materiałów) przez 15-20 sekund (Rysunki 1C, 1D). Rozprowadź balsam całkowicie na miejscu, w którym włosy zostały krótko obcięte. Użyj więcej balsamu, jeśli mysz jest większa.
    3. Nie nakładaj balsamu na uszy myszy, ogon ani w pobliżu twarzy. Jeśli balsam dostanie się na uszy lub ogon, po prostu przetrzyj wilgotną chusteczką papierową, aż do spłukania. Jeśli balsam dostanie się na twarz myszy, natychmiast umyj mysz pod bieżącą wodą z kranu lub dejonizowaną, aby zapobiec uszkodzeniu oczu, nosa i ust.
    4. Pozostaw balsam do reakcji z włosami na dodatkowe 20-45 s po aplikacji.
    5. Przed spłukaniem sprawdź, czy reakcja depilacji została zakończona, delikatnie wycierając balsam ze skóry w różnych miejscach (Rysunek 1E) palcem w rękawiczce lub cienką metalową szpatułką. Reakcja jest zakończona, jeśli skóra jest różowa bez obecności czarnych włosów. Najlepiej jest szybko sprawdzić, czy włosy zostały rzeczywiście usunięte przed spłukaniem, niż przedwcześnie spłukiwać, a następnie ponownie nakładać balsam.
  3. Płukanie
    UWAGA: Po zweryfikowaniu zakończenia reakcji usuwania włosów umyj mysz bieżącą wodą z kranu lub wodą dejonizowaną, aby usunąć płyn do depilacji i zapobiec poparzeniom chemicznym.
    1. Umieść mysz na lewej dłoni w rękawiczce i lewym kciukiem dociśnij podstawę ogona do dłoni, aby zapobiec poruszaniu się myszy. Zamknij i wyprostuj pozostałe lewe palce, aby zapobiec gryzieniu myszy.
    2. Ustaw mysz tak, aby obszar twarzy/głowy znajdował się z dala od strumienia wody, a strumień letniej wody mógł spaść za głowę i tylko na plecy. Szybko, ale delikatnie przetrzyj grzbiet myszy prawą ręką w rękawiczce, aby zmyć balsam.
    3. Gdy skóra myszy zostanie wolna od balsamu, szybko przetrzyj mysz ręcznikiem papierowym, aby wchłonąć większość wody (Rysunek 1F).
  4. Pielęgnacja po goleniu i depilacji
    1. Sprawdź i wyczyść wszelkie resztki balsamu do depilacji, które mogą pozostać na uszach i ogonie, wilgotną chusteczką papierową.
    2. Umieść mysz z powrotem w indywidualnej klatce i umieść klatkę na poduszce grzewczej (40-45 °C) na około 30 minut. Mysz powinna wrócić do normalnego zachowania, biegać i pielęgnować się w ciągu kilku minut.
    3. Umieść każdą mysz w osobnej klatce przez cały czas trwania eksperymentu. Skóra myszy nie jest już chroniona i może być łatwo podrapana i ugryziona przez inne myszy.
    4. Ponieważ balsam do depilacji może mieć lekkie działanie drażniące, które może zakłócać lub zmieniać proces gojenia się ran, odczekaj 18-24 godziny przed zabiegiem, aby skóra myszy uspokoiła się, a mysz przyzwyczaiła się do braku włosów na grzbiecie.
  5. Usuwanie włosów ze skóry z ciemną pigmentacją
    UWAGA: Niektóre myszy db / db-/- mogą mieć ciemne plamy na skórze, które będą miały włosy odrastające szybciej i mocniej niż skóra bez tych plam. (Rysunek 2A). Te ciemne obszary skóry wydają się ciemniejsze z powodu mieszków włosowych w średnim stadium anagenu i/lub nietrzymania moczu pigmentowego29,30.
    1. Jeśli zauważysz ciemne plamy, ponownie nałóż balsam do depilacji, ale tylko w tych miejscach i powtórz kroki 4.2 i 4.3 (ryc. 2B, 2C).
      UWAGA: Ciemne plamy skóry będą rosły szybciej przez cały czas trwania eksperymentu, więc w razie potrzeby przycinaj włosy na krótko co 3-5 dni. Dopuszczalna jest jedna lub dwie łatki od pożądanego miejsca rany. Jeśli grzbiet myszy jest znacznie pokryty tymi ciemnymi plamami, nie używaj tej myszy do modelu ran przewlekłych.

5. Konfiguracja odczynnika

UWAGA: Rozwój przewlekłych ran u myszy db/db-/- jest osiągany poprzez leczenie specyficznymi inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, odpowiednio 3-amino-1,2,4-triazolu (ATZ) i kwasu merkaptobursztynowego (MSA)16. Poniższa procedura zawiera szczegółowe informacje na temat dawki i podawania środków przeciwbólowych i inhibitorów w zależności od masy myszy.

  1. Lek przeciwbólowy Buprenex należy wstrzykiwać dootrzewnowo w dawce 0,05 mg/kg myszy w sterylnym PBS. Wstrzyknąć objętość 120 μl dla myszy o wadze 60 g około 30 minut przed zabiegiem. Kolejną dawkę należy podać 6 godzin po zabiegu. W razie potrzeby można podać dodatkową dawkę.
  2. Wstrzyknąć ATZ dootrzewnowo w dawce 1 g/kg myszy w sterylnym PBS. Wprowadzić objętość 480 μl dla myszy o wadze 60 g na około 20 minut przed zabiegiem. Wstrzyknąć połowę objętości po lewej stronie brzucha, a drugą połowę po prawej stronie.
  3. Umieścić MSA miejscowo na ranie między przezroczystym opatrunkiem a tkanką rany w dawce 150 mg/kg myszy w sterylnym PBS. Podać objętość 60 μl dla myszy o wadze 60 g w ciągu 10 minut po zabiegu.

6. Chirurgia

UWAGA: Sukces modelu ran przewlekłych zależy od warunków niesterylnych. Myszy te nie są wolne od zarazków i są trzymane w konwencjonalnym wiwarium. Mikrobiom bakteryjny, który znajduje się w skórze, ma kluczowe znaczenie dla późniejszej inicjacji i rozwoju przewlekłych ran po leczeniu inhibitorami enzymów przeciwutleniających. Dlatego tradycyjne przedoperacyjne przygotowanie miejsca jest przeciwwskazane.

  1. Iniekcja dootrzewnowa
    1. Zamocuj mysz na pochyłej części stojaka na klatkę i trzymaj ogon tak, aby mysz wygodnie stała z głową niżej niż korpus myszy. Gwarantuje to, że staramy się przesunąć narządy wewnętrzne jak najdalej od miejsca wstrzyknięcia.
    2. Wprowadzić igłę w prawy dolny kwadrant jamy brzusznej, aby uniknąć wstrzyknięcia do pęcherza moczowego lub innych narządów jamy brzusznej.
    3. Odessać igłę przed wstrzyknięciem.
  2. Leczenie i znieczulenie
    1. Lek Buprenex należy podawać 30 minut i ATZ 20 minut przed zabiegiem chirurgicznym, zgodnie z opisem w krokach 5.1 i 5.2.
    2. Umieść mysz w małym plastikowym pojemniku na ciepłej poduszce grzewczej, jak pokazano na Rysunek 3A na około 15-20 minut. Zapewnienie wsparcia cieplnego przed zabiegiem chroni przed potencjalną śmiertelnością.
    3. Umieść chusteczkę papierową lub ręcznik papierowy na wierzchu małego pojemnika, aby lepiej zatrzymać ciepło. Mysz powinna się uspokoić, gdy się ogrzeje. Rysunek 3B pokazuje materiały niezbędne do operacji.
    4. Umieść mysz w zamkniętym pojemniku, który jest podłączony do waporyzatora izofluranu w kapturze chemicznym, jeśli używasz systemu otwartego.
    5. W systemie otwartym podawać 5% izofluranu przez 1-2 minuty przy natężeniu przepływu 2-3,5 l/min. Stale monitoruj stan myszy.
      1. Gdy mysz jest nieprzytomna lub już się nie rusza, umieść ją na białej podkładce chirurgicznej i dopasuj do głowy stożek nosowy, który jest przymocowany do waporyzatora, aby umożliwić ciągłe podawanie izofluranu podczas operacji.
    6. W systemie otwartym należy podawać 2-3% izofluranu przy tej samej szybkości przepływu podczas operacji i dostosować się do przepływu izofluranu, aby utrzymać głębokość znieczulenia.
    7. Zminimalizuj zarówno stężenie, jak i czas trwania izofluranu podawanego podczas zabiegu. Myszy DB/DB-/- są bardzo wrażliwe na znieczulenie, dlatego najlepiej jest ograniczyć ekspozycję na izofluran do minimum. Jeśli mysz nadal reaguje po 2 minutach po 5% izofluranu, zabezpiecz stożek nosowy i podawaj 3-5% izofluranu przez 15-30 s przed rozpoczęciem operacji.
      1. Potwierdź prawidłowe znieczulenie przed zranieniem. Głębokość znieczulenia potwierdza brak reakcji na bodźce fizyczne, takie jak silne uszczypnięcie palca. Czas przebywania myszy w znieczuleniu wziewnym wynosi poniżej 5 minut, więc na oczy nie nakłada się maści weterynaryjnej.
  3. Postrzelaj
    1. Spryskaj chusteczkę papierową 70% etanolem lub chusteczką kliniczną na bazie etanolu i wytrzyj tył myszy, aby oczyścić obszar rany. Oczyść powierzchnię skóry, aby przezroczysty opatrunek mógł mocno przylegać, ponieważ kurz z pościeli, jedzenia lub skóry może uniemożliwić prawidłowe przyleganie opatrunku (Rysunek 4A). Nie wycieraj nadmiernie, ponieważ istnieje ryzyko zabicia bakterii obecnych na skórze.
    2. Określ położenie miejsca rany. Najlepszym miejscem do wykonania rany jest grzbietowa strona myszy, wyśrodkowana i z dala od plam skóry o wyższej pigmentacji.
      UWAGA: Ustaliliśmy z doświadczenia, że te myszy mogą wytrzymać ciężar tylko jednej rany.
    3. Stwórz ranę w ciągu 30-45 s za pomocą stempla do biopsji skóry o średnicy 7 mm, pęsety i nożyczek chirurgicznych. Lekko dociśnij stempel do biopsji w żądane miejsce rany i przekręć go na tyle głęboko, aby pozostawić lekkie wrażenie stempla (Ryc. 4B). Wytnij zarysowaną skórę, pociągając środek stempla pęsetą i przecinając wzdłuż konturu nożyczkami chirurgicznymi (ryc. 4C-4E).
    4. Przykryj ranę mocno połową kawałka przezroczystego opatrunku filmowego (6 cm x 3,5 cm).
    5. Przerwać podawanie 2% izofluranu myszy (Rysunek 4F).

7. Leczenie pooperacyjne i rekonwalescencja

  1. Leczenie MSA należy podać po zakończeniu operacji i nałożeniu przezroczystego opatrunku zgodnie z opisem w kroku 5.3. Umieścić MSA na miejscu rany pod opatrunkiem.
  2. Umieść mysz z powrotem w małym pojemniku na poduszce grzewczej na 30 minut, aby pomóc w regeneracji. Gdy mysz się rozgrzeje, umieść ją z powrotem w klatce. Działanie izofluranu jest tymczasowe, a wkrótce potem mysz powinna zacząć się poruszać.
  3. Nie pozostawiaj myszy bez opieki ani nie zwracaj ich do wiwarium, dopóki myszy nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżącą mostek.
    UWAGA: Znieczuleniem z wyboru podczas pracy z tymi myszami jest izofluran właśnie ze względu na jego szybką indukcję, a następnie wychodzenie ze znieczulenia.
    1. Myszy domowe, które przeszły operację indywidualnie, aby uniknąć ingerencji jednej myszy w przewlekłą ranę drugiej. Jak wspomniano powyżej, nie wracają do wiwarium, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.
  4. Drugą dawkę leku Buprenex należy podać 6 godzin po zabiegu.
  5. Uważnie obserwuj myszy przez pierwsze 48 godzin po zabiegu.
    UWAGA: Operacja, w połączeniu z inhibitorami tworzącymi przewlekłą ranę, jest bardzo stresująca dla zwierzęcia, które jest już zarówno chore na cukrzycę, jak i otyłe. Myszy, które przeżyją pierwsze kilka dni po operacji, zwykle przetrwają czas trwania eksperymentu.

8. Zbieranie danych, strategie przetrwania, postępowanie z myszami po zranieniu i dodatkowe wskazówki

  1. Gromadzenie danych
    1. Rób zdjęcia już bezpośrednio po zabiegu. Biofilmy obserwuje się od 5 do 10 dni po zranieniu i już po 3 dniach.
    2. Jeśli przedmiotem analizy są bakterie, należy zwinąć sterylną podmienkę z lekkim naciskiem wokół rany przez 10-15 sekund. Przechowywać wacik w odpowiednim podłożu do zamrażania do hodowli lub wysuszyć bez żadnych pożywek do analizy sekwencjonowania niezależnej od hodowli, w temperaturze -80 °C. Zebrać zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe za pomocą sterylnej metalowej szpatułki do probówki mikrowirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C przed analizą.
    3. Nie podawać znieczulenia myszy podczas pracy z biofilmem lub robienia zdjęć. Podczas tych procedur umieść kawałek jedzenia przed myszą, aby uspokoić mysz i zapobiec jej spływaniu. Większość myszy wspina się na jedzenie, siada na nim i nie porusza się.
  2. Ponieważ wtórne infekcje i niezamierzone przewlekłe rany lub owrzodzenia mogą się rozwinąć, jeśli mysz nie porusza się prawidłowo lub jeśli opatrunek nie jest prawidłowo nałożony, okresowo sprawdzaj aktywność myszy i strony brzusznej pod kątem owrzodzeń. Tarcie między skórą a mokrą ściółką (myszy db/db-/- są poliuryczne) może naruszyć skórę, jeśli klatki nie są często zmieniane.
    UWAGA: Nagromadzenie płynu pod opatrunkiem może spowodować, że klej straci swoją lepkość i dojdzie do wycieku płynu. Martwe komórki skóry, ściółka i kał mogą następnie przyklejać się do skóry i twardnieć. Te wysuszone plamy i zagłady na skórze należy natychmiast usunąć, aby zapobiec wtórnej infekcji.
  3. Jeśli myszy stoją lub siedzą na tylnych łapach, przenieś je do klatki, w której dostęp do jedzenia i wody jest znacznie mniejszy. Jeśli pozycja jedzenia i wody w klatce jest wysoka, mysz może stać lub siedzieć na tylnych łapach, aby do niej dotrzeć. Większość myszy nie będzie miała problemu z jedzeniem i piciem, jeśli będą mogły to zrobić przed operacją, chociaż istnieje możliwość, że niektóre myszy mogą przewrócić się na plecy. Te "płetwy" mogą mieć duże trudności z przewróceniem się, więc będą potrzebować pomocy i dalszego monitorowania.
  4. Pozostaw przezroczysty opatrunek na skórze do 20 dni, jeśli skóra jest wolna od zanieczyszczeń, łuszczącej się skóry i włosów. Jeśli którykolwiek z nich wystąpi na skórze, usuń stary opatrunek i nałóż nowy kawałek.
    1. Aby zdjąć opatrunek, należy delikatnie uszczypnąć skórę bezpośrednio za głową, a następnie jednym płynnym ruchem odciągnąć opatrunek od głowy.
    2. Aby bezpiecznie założyć opatrunek, spraw, aby mysz pozostała tak nieruchomo, jak to możliwe. Ważne jest, aby skóra była czysta i wolna od łuszczących się martwych komórek naskórka, kurzu z pościeli i kawałków jedzenia. Umieścić, a następnie wcisnąć opatrunek w skórę wokół rany, aby zabezpieczyć.
    3. Jeśli umieszczenie kawałka jedzenia przed myszą nie ogranicza jej ruchów, umieść mysz na drucianej klatce. Gdy mysz chwyci szynę na klatce, przytrzymaj ogon jak najbliżej ciała i ciągnij z minimalną siłą. Gdy mysz ciągnie do przodu, tył rozciąga się i prostuje, co ułatwia aplikację; W tym miejscu bezpiecznie umieść opatrunek.
    4. Nigdy nie używaj ponownie starego opatrunku. Zawsze nakładaj nowy opatrunek na plecy, aby uzyskać najlepszą przyczepność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 5 przedstawia przykład rany bez leczenia inhibitorów postępujących w kierunku zamknięcia rany oraz rany z leczeniem inhibitorów postępujących w kierunku przewlekłości. Przezroczysty opatrunek pozostawiono na miejscu na ranie przewlekłej, tak aby można było zobaczyć nagromadzenie biofilmu i płynu.

Początkowanie rany przewlekłej następuje w czasie krótszym niż 6 godzin, a brzeg rany jest widoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po utworzeniu przewlekłych ran na myszach, model można wykorzystać do badania upośledzonych procesów gojenia się ran związanych z inicjacją przewlekłości. Model może być również wykorzystany do testowania skuteczności szerokiej gamy substancji chemicznych i leków, które mogą odwrócić przewlekły rozwój ran i upośledzone gojenie oraz prowadzić do zamykania i gojenia się ran. Można badać różne punkty czasowe po wystąpieniu przewlekłości : np. dni 1-5 po zranieniu w przypadku wczesnego początku przewlekłości i 20 dn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klasa B6. BKS(D)-Leprdb/J Laboratorium Jacksona 00697Dostępne homozygoty i heterozygoty 
Nair Emulsja do depilacji z kojącym aloesem i lanolinąNairchemiczny środek do depilacji
Buprenex (buprenorfina HCl)Henry Stein Zdrowie zwierząt0591220,3 mg/ml, klasa 3
3-amino-1,2,4-triazol (ATZ)TCIA0432
Kwas merkaptobursztynowy (MSA)Aldrich88460
Bufor fosforanowy (PBS)sterylizowany w autoklawie
IsofluraneHenry Schein Animal Health029405NDC 11695-6776-2
Butla tlenumusi być kompatybilna z systemem waporyzacji
Waporyzator izofluranowyJA Baulch & Współpracownicy 
Maszynka do strzyżenia włosów WahlLithium Ion Pro
Acu Punch 7mm dziurki do biopsji skóryAcuderm Inc.P750
Tegaderm 3MNr ref.: 1624WPrzezroczysty opatrunek foliowy (6 cm x 7 cm)
Poduszka grzewczaConairMoist Dry Poduszka grzewcza
Strzykawkiinsulinowe BD3294610,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")
70% etanolu
Pęseta
Kimwipes
Ostre nożyczkichirurgiczne
Cienka metalowa szpatułka
Rurka
Stożek
Rękawiczki
małe plastikowe pojemniki
nosowy myszy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23(2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462(2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326(2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model przewlek ej ranyindukcja stresu oksydacyjnegoproces gojenia rantworzenie biofilmuinhibicja enzym w antyoksydacyjnychmyszy db dbprocedura zak adania opatrunku na ranPseudomonas aeruginosaEnterobacter cloacae

Powiązane artykuły