Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57673

⸱

7 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu demonstrujemy metodę separacji neutrofili bez znaczników z klinicznych wydzielin dróg oddechowych przy użyciu zamkniętej pętli spiralnej inercyjnej mikrofluidyki. Proponowana metoda rozszerzyłaby kliniczne testy in vitro dla różnych chorób układu oddechowego.

Streszczenie

Wydzieliny dróg oddechowych zawierają dużą liczbę komórek związanych z odpornością, np. neutrofile, makrofagi i limfocyty, które mogą być wykorzystane jako główne źródło do oceny różnych chorób płuc, zarówno do celów badawczych, jak i klinicznych. Jednak ze względu na niejednorodny i lepki charakter śluzu pacjenta, obecnie nie ma niezawodnej metody dysocjacji, która nie uszkadza komórek odpornościowych gospodarza w wydzielinie dróg oddechowych pacjenta. W tym badaniu wprowadzamy metodę przygotowania próbki, która wykorzystuje mikrofluidykę inercyjną do oceny immunologicznej pacjenta. Niezależnie od niejednorodnych właściwości płynnych próbek klinicznych, proponowana metoda pozwala odzyskać ponad 95% neutrofili z próbek wydzielanych przez drogi oddechowe, które są rozcieńczane 1000-krotnie mililitrami czystej soli fizjologicznej. Poprzez recyrkulację skoncentrowanego strumienia wyjściowego do początkowego zbiornika próbki zapewnia się wysokie stężenie, odzysk i czystość komórek odpornościowych; Recyrkulacja jest uważana za kompromis w stosunku do jednobiegowej operacji mikrofluidycznej opartej na strzykawce. Działanie mikrofluidyki spiralnej w pętli zamkniętej dostarcza leukocytów bez zakłóceń fizycznych lub chemicznych, jak wykazano w indukowanym przez 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) uwalnianie elastazy posortowanych neutrofili.

Wprowadzenie

Ponieważ komórki są zamknięte w dużej ilości śluzu w wydzielinach dróg oddechowych, ocena funkcjonalna leukocytów za pomocą testu in vitro została utrudniona. Ditiotreitol (DTT) jest najpowszechniejszym buforem do lizy do dysocjacji i homogenizacji plwociny w celu analizy cytologicznej i wykrywania mediatorów, zapewniając jednocześnie tolerowaną żywotność izolowanych komórek1,2. Jednak DTT może zakłócać powierzchniowe antygeny neutrofili w drogach oddechowych, powodując zakłócenie funkcji neutrofili, takich jak uwalnianie elastazy i mieloperoksydazy (MPO)2,3. W związku z tym przeprowadzono niewiele badań nad funkcją neutrofili w drogach oddechowych u ludzi, które mogą nie ujawniać fizjologicznych cech pulmonary4. Tymczasem mikrofluidyka inercyjna poczyniła postępy w izolowaniu komórek z różnych biomatryc pacjentów5,6. Równowaga między bezwładnościowymi siłami nośnymi a oporem Deana wyrównuje cząstkę/komórkę zgodnie z ich rozmiarem, co umożliwia separację cząstek bez etykiet7. Nasza grupa wcześniej wprowadziła metodę przygotowania próbki do krążących komórek nowotworowych8,9, patogeny we krwi8, komórki z hodowli zawiesinowej 10,11,12, oraz leukocyty wielojądrzaste (PMNs) z krwi13,14.

Tutaj wprowadzamy protokół do przygotowania komórek odpornościowych z wydzielin z dróg oddechowych pacjenta za pomocą mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej do dalszego testu in vitro, takiego jak test elastazy neutrofilowej (NE). Metoda ta zapewnia zarówno wysokie stężenie, jak i odzysk, zwłaszcza gdy występuje znaczne zachodzenie na siebie w kierunku bocznym komórki/cząstki, z której ma zostać usunięta komórka/cząstka będąca przedmiotem zainteresowania, co jest powszechnie obserwowane w próbkach klinicznych. Poprzez recyrkulację dużych cząstek lub komórek skoncentrowanych na ścianie wewnętrznej (IW) z powrotem do probówki z próbką wejściową, cząstka lub komórka będąca przedmiotem zainteresowania koncentruje się w pierwotnym zbiorniku, podczas gdy płyny tła z małymi agregatami mucyny przechodzą przez zbiornik odpadów. Pomimo niejednorodnych właściwości płynnych próbek klinicznych, proponowana metoda pozwala na konsekwentne odzyskiwanie ponad 95% neutrofili z próbek wydzielanych z dróg oddechowych, które są rozcieńczane 1000-krotnie czystym roztworem soli fizjologicznej (~1 ml). Natomiast metoda lizy charakteryzuje się szerokim zakresem wskaźników odzysku PMN w zależności od stanu próbki. Proponowany protokół wychwytuje leukocyty w sposób bezznacznikowy, bez zakłóceń fizycznych lub chemicznych, co daje możliwość pobierania delikatnych komórek z klinicznie trudnych danych biometrycznych za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobranie próbki zostało zatwierdzone przez University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB# PRO16060443, PRO10110387). Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.

1. Produkcja urządzeń i litografia miękka

UWAGA: Standardowe techniki miękkiej litografii15,16 zostały użyte do stworzenia mikrokanału polidimetylosiloksanu (PDMS).

  1. Wymieszaj prekursor PDMS w stosunku 10:1 zasady i utwardzacza.
  2. Wlać 30 g mieszaniny prekursorów PDMS na mikroobrabianą formę aluminiową (patrz Rysunek 1 dla wymiarów) i 20 g mieszaniny prekursorów PDMS na 100 mm szalkę Petriego.
    UWAGA: Szalka Petriego służy do wytwarzania grubej warstwy PDMS (~3 mm) na warstwę nośną. Warstwa nośna PDMS zapewnia jednolite właściwości fizyczne powierzchni w całej mikrofluidyce. Alternatywnie można użyć cienkiej folii PDMS na szkiełku podstawowym. Forma wzorcowa o określonych wymiarach kanału została zaprojektowana i wykonana metodą mikrofrezowania na blasze aluminiowej. Kanał spiralny zastosowany w tym badaniu był spiralnym mikrokanałem z 8 pętlami z jednym wlotem i dwoma wylotami, o promieniu rosnącym z 8 mm do 24 mm w celu efektywnej separacji na podstawie rozmiaru.
  3. Umieść formę i szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym w celu odgazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne pęcherzyki, zwykle 5 - 10 minut. Użyj odkurzacza domowego do eksykatora.
  4. Zwolnij próżnię i umieść formę oraz szalkę Petriego w piekarniku o temperaturze 90 °C na 1 godz
    UWAGA: Zamiast piekarnika można użyć płyty grzejnej lub innych narzędzi grzewczych.
  5. Wyjmij formę i szalkę Petriego z piekarnika i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  6. Ostrożnie wytnij kontur i przebij otwory dostępu do płynów w urządzeniu za pomocą dziurkacza 2 mm.
    UWAGA: Rozmiar stempla może się różnić w zależności od rozmiaru rurki lub prowadnicy płynu.
  7. Przyklej taśmę do strony kanału urządzenia i grubej folii PDMS i ostrożnie odklej kleszczykami, aby usunąć kurz.
  8. Potraktuj zarówno stronę kanałową urządzenia, jak i zwykły PDMS plazmą powietrzną i połącz z przygotowaną warstwą nośną zwykłego PDMS (Rysunek 1A).
  9. Umieść wiór na szkiełku podstawowym o wymiarach 50 mm x 70 mm i umieść go w piekarniku o temperaturze 70 °C na co najmniej 30 minut, aby zwiększyć siłę wiązania.

2. Pobieranie wydzieliny tchawicy od pacjentów wentylowanych mechanicznie

UWAGA: Wydzieliny tchawicy mogą być uzyskane od pacjentów wentylowanych mechanicznie podczas normalnej, rutynowej pielęgnacji dróg oddechowych, przy użyciu protokołu zmodyfikowanego z konwencjonalnych metod, aby dostosować się do standardowego, dorosłego pacjenta wentylowanego. Próbki zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i natychmiast wysłane do przetworzenia.

  1. Jeśli wskazana jest aspiracja tchawicy, użyj cewnika do ekstrakcji wydzieliny z dróg oddechowych.
  2. Ostrożnie przesunąć cewnik do połowy rurki dotchawiczej i wkroplić 5 ml 0,9% sterylnej normalnej soli fizjologicznej z ampułko-strzykawki o pojemności 10 ml.
  3. Gdy cewnik jest w pełni zaawansowany lub napotkany jest opór, odessać wydzieliny i zebrać do sterylnego pojemnika na plwocinę.
  4. Zbierz 10 ml wydzieliny tchawicy do sterylnego pojemnika na plwocinę i umieść go na lodzie. Natychmiast wyślij próbki do przetworzenia.

3. Przygotowanie próbki wydzieliny tchawicy

UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod kolerą bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.

  1. Rozproszyć 1 ml próbek wydzieliny z dróg oddechowych w 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml (do 10-krotnego rozcieńczenia). Użyj pipety, aby homogenizować próbkę śluzu.
  2. Odcedź rozcieńczalnik za pomocą nylonowego sitka komórkowego o wielkości 40 μm, aby usunąć duże kawałki lub skrzepy krwi, które mogą blokować otwór dostępowy do mikroprzepływów lub kanał. Po przetworzeniu umieścić próbkę na lodzie.
  3. Rozcieńczalnik każdej próbki należy rozcieńczyć przy użyciu 100-krotnie większej objętości buforu PBS, co daje 1,000-krotnie rozcieńczoną zawiesinę. Umieścić próbkę na lodzie podczas całej operacji dysocjacji.

4. Konfiguracja eksperymentalna

UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod kolerą bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.

  1. Zmontuj chip PDMS z prowadnicą płynu, aby zapewnić równomierny przepływ do każdego z czterech spiralnych mikrokanałów (Rysunek 1B).
    UWAGA: Zastosowano cztery kanały w celu zwiększenia przepustowości poprzez zrównoleglenie, a także optymalizacji objętości i gęstości komórek powstałej zawiesiny. Prowadnica płynu została zaprojektowana i wykonana za pomocą drukarki 3D typu stereolitografia z przezroczystą żywicą. Port wlotowy i wylotowy prowadnicy płynu wykorzystuje żeńskie złącza Luer, co ułatwia podłączanie i stabilne uszczelnienie podczas pracy.
  2. Podłącz męskie złącze Luer 1/16 cala do wlotu, wylotu ściany wewnętrznej (IW) i portu wylotowego ściany zewnętrznej (OW) prowadnicy płynu i podłącz silikonową rurkę do zawiesiny próbki.
  3. Włóż końcówki do każdego końca wlotu i wylotu, aby dotrzeć do dna zbiornika na próbkę.
  4. Połączyć pompę perystaltyczną z rurką wlotową.
  5. Umieść koniec rurki doprowadzającej i rurki wylotowej IW w zbiorniku próbki i umieść koniec rurki wylotowej OW w zbiorniku na odpady (Rysunek 1C, D).
  6. Umieścić 50 ml probówkę przefiltrowanego PBS bez wapnia i magnezu w zbiorniku na próbkę.
  7. Rozpocznij pompowanie przy niskim natężeniu przepływu (~1 ml/min), aby zalać urządzenie.
    UWAGA: Gdy pęcherzyki zostaną przechwycone w kanale, popchnij górną część kanału pęsetą, aby zdestabilizować i wyeliminować pęcherzyki powietrza. Gdy urządzenie jest całkowicie napełnione roztworem buforowym, wymień probówkę PBS, aby przygotować probówkę z próbką wydzieliny z dróg oddechowych.
  8. Po umieszczeniu próbki w zbiorniku na próbkę włącz pompę perystaltyczną i ustaw natężenie przepływu na 4 ml/min ( Rysunek 1C, D).
  9. Gdy objętość próbki osiągnie wyznaczoną objętość (~1 ml), przerwij operację i odłącz silikonową rurkę.
    UWAGA: Proponowana metoda jest bardziej skuteczna w zmniejszaniu dużej objętości rozcieńczalnika (>50 ml) do objętości probówki mikrowirówki (~1 ml) (Rysunek 2).

5. Analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Do porównania metod dysocjacji (mikrofluidyka i liza) użyto cytometrii przepływowej z immunofluorescencją.

  1. Dodać mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD66b sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD45 sprzężone z allofikocyjaniną (APC) do zawiesin początkowych (etap 3.3) i otrzymanych zawiesin (etap 4.9) (200 μl każdego przeciwciała) w stosunku 1:25 v/v.
  2. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.
  3. Przeanalizować obie próbki za pomocą cytometru przepływowego w celu ilościowego określenia PMNs.
    UWAGA: Populacja, która jest podwójnie dodatnia FITC-APC, CD66b dodatnia i CD45-dodatnia, została uznana za neutrofile. Odzysk obliczono na podstawie stosunku całkowitej liczby komórek wejściowych do wynikowego zawieszenia.

6. Analiza wydania NE

UWAGA: Aby porównać funkcjonalność wyizolowanych neutrofili metodą mikrofluidyczną i metodą lizy, użyto zestawu do oznaczania NE.

  1. Dodać PMA (znajdujący się w zestawie do oznaczania) do każdej otrzymanej zawiesiny (otrzymanej w kroku 4.9) do końcowego stężenia 50 nM.
  2. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  3. Odwirować zawiesiny o sile 300 x g przez 10 min.
  4. Przenieść 10 μl każdego supernatantu na 96-dołkową płytkę (znajdującą się w zestawie do oznaczania).
    UWAGA: Można również użyć 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem i czarnym polistyrenem.
  5. Dodać 90 μl rozcieńczonego buforu do oznaczania (dostarczonego w zestawie do testów) do każdego dołka.
  6. Dodać 10 μl substratu elastazy (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, znajdującego się w zestawie do oznaczania).
  7. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
  8. Odczytaj 96-dołkową płytkę za pomocą fluorometru o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 525 nm.
    UWAGA: Poziom NE podzielono przez liczbę PMN z analizy cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Uzyskano przejrzyste zawiesiny komórek odpornościowych zarówno przy zastosowaniu mukolizy z użyciem DTT, jak i dysocjacji mikrofluidycznej (Rysunek 3A). Metoda dysocjacji mikrofluidycznej pozwoliła na odzyskanie średnio 4.40 x 105 PMN (od 2.1 x 104 do 5.60 x 105 PMN, n = 6) z próbek wydzieliny z dróg oddechowych rozcieńczonych 1000-krotnie (całkowita objętość 50 mL) w 1 mL czystej zawiesiny. W porównaniu z początkowym rozcieńc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W mikrofluidyce inercyjnej cząstki i komórki lokalizują się w określonej pozycji bocznej w mikrokanale na podstawie ich wielkości 5,18,19,20. Ze względu na łączny wpływ siły oporu Deana i bezwładnej siły nośnej w zakrzywionym mikrokanale, duże cząstki lub neutrofile (>10 μm) znajdują się wewnątrz kanału, a małe cząstki, agregaty śluzu i zanieczyszczenia mniejsze niż 6 μm są umieszczane na zewną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy dokonali zgłoszenia patentowego na opisywaną tu technologię.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH/NIAID (R21AI119042) oraz program NIH U24 Sample Sparing assay (U24-AI118656).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Prekursor PDMSDow corning184 SIL ELAST KIT 3,9KGStosunek 10:1 bazy i utwardzacza
Piec konwekcyjny grawitacyjnyVWRVWR 414005-128Prekursor PDMS do utwardzania w 90 stopniach.
Szalka Petriego 100 mmVWR89000-324Wykonanie PDMS Warstwa nośna
Dziurkacz Harris Uni-coreSigma-aldrichWHAWB100076średnicy 2 mm lub innej w zależności od rozmiaru rurki
Maszyna plazmowaFemto ScienceCuteSurface obróbka plazmowa dla urządzenia PDMS do dolnej podstawy.
Prowadnica szklana 2" x 3"TED PELLA, INC.2195Do obsługi urządzenia PDMS
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex ze szpulą, L/S 14Cole-ParmerEW-96410-14Rurka do pompy mikroprzepływowej i perysplowej
Złącze Luer 1/16 cala, męskieAparat HarvardPC2 72-1443Złącze do prowadnicy płynu
50 ml rurka FalconCorning21008-940pobieranie i przygotowanie próbek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X bez wapnia i magnezuCorning45000-446 Roztwór buforowy do rozcieńczenia próbki
Halyard Zamknięty cewnik ssący, łokieć, 14F/ kanał 4,67mmHALYARD HEALTH22113Cewnik ssący do seceacji tchawicy
0,9% Sterylny sól fizjologiczna normalna, 10 ml ampułkostrzykawkaBD PosiFlushNHRIC: 8290-306547Do pobierania próbek tchawicy od pacjentów
SecurTainer™ III Pojemniki na próbki, 20 mlSimport1176R36Sterylny pojemnik na plwocinę (wydzielinę z dróg oddechowych)
Strzykawka z końcówką Luer-Lok, 10 mlBDBD309604Aby pipetować homogenizację próbki śluzu i dotrzeć do dna probówki z próbką
BD  igła do napełniania, z BD Luer-Lok  KońcówkaBDDo pipetowania homogenizować próbkę śluzu i dotrzeć do dna probówki z próbką
40&mikro; M Nylonowe sitko komórkowe Falcon21008-949Do usuwania dużych kawałków lub skrzepów krwi, które mogą blokować otwór dostępowy do mikrofluidyki lub kanał.
Pompa perystaltyczna (napęd cyfrowy Masterflex L/S)Cole-ParmerHV-07522-30Działanie mikrofluidyki
Cytometr przepływowy BD LSR IICytometr przepływowy BDBioscienceKwantyfikacja współczynnika odzysku komórek
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD66b sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)BD Bioscience561927Barwienie immunologiczne neutrofili do analizy cytometrem przepływowym
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD45 sprzężone z allofikocyjaniną (APC)BD Bioscience561864Barwienie immunologiczne neutrofili do analizy cytometrem przepływowym
Czytnik płytekThermo Fisher scientificVarioskanCzytnik płytek do testu elastazy neutrofilowej, ex485/em525
Zestaw do oznaczania elastazy neutrofilowejCayman Chemical600610Ocena funkcjonalności neutrofili
Mikrosfery fluoresbrite YG 10,0 i mikro; mPolyScience, Inc.18140-2Cząstki fluorescencyjne do wyrażania trajektorii białych krwinek w mikrofluidyce
LSR II

Bibliografia

  1. Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
  2. van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
  3. Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
  4. Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
  5. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
  6. Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001(2012).
  7. Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
  8. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
  9. Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
  10. Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018(2015).
  11. Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
  12. Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703(2017).
  13. Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
  14. Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475(2013).
  15. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319(2007).
  16. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  17. Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
  18. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
  19. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
  20. Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
  21. Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
  22. Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
  23. Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
  24. Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
  25. Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
  26. Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Praca w obiegu zamkniętymspiralne mikrokanałyizolacja bez znakowaniaodzyskiwanie komórekstymulacja PMAuwalnianie elastazyprzetwarzanie próbek klinicznych
Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.