Artykuł metodologiczny

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57750

⸱

5 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Streszczenie

Glikoproteiny na powierzchni komórek odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek, w tym w sygnalizacji, adhezji i transporcie. Na leukocytach kilka z tych glikoprotein posiada fałdy immunoglobuliny (Ig) i ma kluczowe znaczenie dla rozpoznawania i regulacji immunologicznej. W tym miejscu prezentujemy platformę do projektowania, ekspresji i biofizycznej charakterystyki domeny zewnątrzkomórkowej receptora ludzkich komórek B CD22. Proponujemy, aby podejścia te miały szerokie zastosowanie w charakterystyce ektodomen glikoprotein ssaków zawierających domeny Ig. Dwie zawiesinowe linie komórkowe ludzkiej nerki embrionalnej (HEK), HEK293F i HEK293S, są wykorzystywane do ekspresji glikoprotein zawierających odpowiednio glikany złożone i glikany o wysokiej zawartości mannozy. Te rekombinowane glikoproteiny z różnymi glikoformami pozwalają na badanie wpływu wielkości i składu glikanów na wiązanie ligandów. Omawiamy protokoły badania kinetyki i termodynamiki wiązania glikoprotein z biologicznie istotnymi ligandami i kandydatami na przeciwciała terapeutyczne. Rekombinowane glikoproteiny wytwarzane w komórkach HEK293S są podatne na krystalizację ze względu na jednorodność glikanów, zmniejszoną elastyczność i podatność na leczenie endoglikozydazą H. Przedstawiamy metody nasączania kryształów glikoproteiny ciężkimi atomami i małymi cząsteczkami odpowiednio do oznaczania faz i analizy wiązania ligandów. Omówione tutaj protokoły eksperymentalne są obiecujące dla charakterystyki glikoprotein ssaków, aby dać wgląd w ich funkcję i zbadać mechanizm działania środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

Białka powierzchniowe odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu komórek. Poprzez swoje domeny zewnątrzkomórkowe, te białka błonowe mogą modulować interakcje komórka-komórka, adhezję, transport i sygnalizację1,2. Zewnątrzkomórkowa lokalizacja tych białek sprawia, że są one atrakcyjnym celem dla rozwoju terapii w leczeniu szerokiego zakresu chorób, w tym nowotworów i chorób autoimmunologicznych3,4,5,6,7. Jednym z najczęstszych fałdów ektodomen białek błonowych człowieka jest fałd podobny do immunoglobuliny (Ig), który składa się z siedmiu lub więcej nici β ułożonych w dwa β-arkusze8,9. Zazwyczaj glikoproteiny zawierające Ig są strukturami wielodomenowymi z domenami Ig ułożonymi sekwencyjnie na zewnątrzkomórkowej części białka błonowego10. Wykazano, że potranslacyjne modyfikacje tych białek na powierzchni komórki, w szczególności glikozylacja sprzężona z N i O, odgrywają istotną rolę w ich regulacji, fałdowaniu, wydzielaniu i funkcjonowaniu11. Aby lepiej zrozumieć ich funkcję i lepiej zaprojektować terapie, które mogą być na nie ukierunkowane, potrzebne są techniki, które pozwolą na ich szczegółową charakterystykę molekularną. W tym miejscu przedstawiamy kombinację technik, które pozwalają na biofizyczną (interferometria biowarstwowa (BLI) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)) i strukturalną (krystalografia rentgenowska) charakterystykę domeny zewnątrzkomórkowej glikoprotein błonowych zawierających Ig, samodzielnie i w kompleksie z ich biologicznie istotnymi ligandami i cząsteczkami terapeutycznymi (Rysunek 1).

N związana z glikozylacją jest jedną z najczęstszych modyfikacji potranslacyjnych białek ssaków i występuje podczas dojrzewania białek w retikulum endoplazmatycznym i Golgi12,13. Linie komórkowe, takie jak 293 komórki ludzkiej embrionalnej nerki (HEK), zostały opracowane do rekombinowanej ekspresji dużych ilości glikozylowanych białek ssaków14,15. Ta linia komórkowa została opracowana w formie zawiesiny, co pozwala na łatwe zwiększenie produkcji białka do większych ilości w porównaniu z przylegającymi liniami komórkowymi. Tutaj wykorzystujemy dwie linie komórkowe HEK293: HEK293F i HEK293 Gnt I-/- (HEK293S), które różnią się brakiem N-acetyloglukozaminylotransferazy I (Gnt I) w tej ostatniej. Z kolei produkcja złożonych glikanów (jak widać na HEK293F) nie jest możliwa, a zamiast tego glikany o wysokiej zawartości mannozy (głównie Man5GlcNAc2) znajdują się w miejscach glikanów sprzężonych z N18,19,20. Równoległe wykorzystanie tych dwóch linii komórkowych pozwala na badanie wpływu wielkości i złożoności glikanów na funkcje biologiczne i celowanie terapeutyczne. Rzeczywiście, glikoproteiny wytwarzane w HEK293F komórkach będą miały większe, bardziej złożone glikany w porównaniu z tą samą glikoproteiną wytwarzaną w HEK293S komórkach. Glikoproteiny wytwarzane w komórkach HEK293S są bardziej podatne na krystalizację ze względu na zmniejszoną niejednorodność chemiczną i konformacyjną ich glikanów połączonych z N. Aby jeszcze bardziej poprawić krystalizowalność, glikoproteiny wytwarzane w HEK293S (ale nie HEK293F) komórkach mogą być traktowane enzymem endoglikozydazą H (Endo H), co powoduje rozszczepienie glikanów o wysokiej zawartości mannozy w taki sposób, że tylko jedno ugrupowanie N-acetyloglukozaminy (GlcNAc) pozostaje w każdym miejscu glikozylacji sprzężonej z N21,22. Inne metody mogą być również stosowane w celu ograniczenia przetwarzania N-glikanów w komórkach, takie jak dodawanie inhibitorów glikozylotransferazy podczas ekspresji glikoproteiny, w tym kifunensine23. Alternatywne podejścia obejmują ekspresję natywnych glikoprotein (w komórkach HEK293F), a następnie enzymatyczną deglikozylację przy użyciu peptydu N-glikozydazy F (PNGaseF). Wykazano jednak, że deglikozylacja za pomocą PNGaseF jest mniej skuteczna w warunkach natywnych i zwiększa agregację niektórych białek; W przypadkach, gdy białko pozostaje rozpuszczalne po poddaniu działaniu substancji, uzyskuje ładunki ujemne na swojej powierzchni w wyniku deamidacji reszty asparaginy do kwasu asparaginowego24, co może być szkodliwe dla jego krystalizacji. Przewidywane miejsca N-glikozylacji mogą być również zmutowane, najczęściej do reszt alaniny lub glutaminy, aby zapobiec glikozylacji sprzężonej z N w tych miejscach i wytworzyć próbki glikoprotein o wysokiej jednorodności. Alternatywnie, glikoproteiny mogą być wytwarzane w innych hodowlach komórek eukariotycznych, w tym w systemach drożdżowych, owadzich i roślinnych lub innych liniach komórkowych ssaków, takich jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO)16,17.

Wiele wektorów ekspresji ssaków, w tym pHLsec, pozwala na wydzielanie rekombinowanych ektodomen glikoproteinowych do podłoża komórkowego25. Wydzielanie glikoprotein z komórek HEK293 pozwala na szybkie i łatwe oczyszczanie bez konieczności lizy komórek. Dodanie znaczników oczyszczających (np. znacznika His, znacznika Strep, znacznika flagowego, znacznika Myc, znacznika HA) do końca N lub C docelowej glikoproteiny umożliwia oczyszczanie za pomocą jednoetapowej chromatografii powinowactwa. Następnie chromatografia wykluczania wielkości może być wykorzystana do uzyskania próbki monodyspersyjnej do charakterystyki biofizycznej i strukturalnej.

Wysoce czysta i jednorodna próbka glikoproteiny w odpowiednich warunkach może skutkować dobrze dyfrakcyjnymi kryształami. Po uzyskaniu pełnego zestawu danych dyfrakcji rentgenowskiej z takich kryształów należy określić początkowe fazy w celu obliczenia gęstości elektronowej glikoproteiny. Dzięki stale rosnącej liczbie struktur w Banku Danych o Białkach (PDB), zdecydowanie najczęściej stosowaną metodą fazowania stała się zastąpienie molekularne (MR), które wykorzystuje pokrewną strukturę białka do uzyskania początkowych faz26. Jednakże, gdy MR nie rozwiązuje problemu fazy, jak to czasami miało miejsce w przypadku glikoprotein z wieloma domenami Ig27,28,29, wymagane są alternatywne metody. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę namaczania kryształów ciężkimi atomami (HA) w celu fazowania, która była wymagana do rozwiązania struktury ektodomeny CD22 < klasy sup = "xref">28. Identyfikacja właściwego kwasu hialuronowego do fazowania jest procesem iteracyjnym, który zależy od reaktywności kwasu hialuronowego, dostępnych atomów w glikoproteinie w danej sieci krystalicznej oraz roztworu krystalizacyjnego30,31. Alternatywnie, naturalne atomy siarki w resztach cysteiny i metioniny mogą być użyte do fazowania, jeśli są obecne w wystarczająco wysokim stosunku do innych atomów w glikoproteinie i jeśli dane dyfrakcji rentgenowskiej mogą być zbierane z wystarczająco wysoką redundancją32,33.

Biologiczna funkcja glikoprotein błonowych jest często pośredniczona przez interakcje białko-białko lub białko-ligand, np. z węglowodanami. Gdy ligand jest wystarczająco mały, aby dyfundować z roztworu do miejsca wiązania glikoproteiny w sieci krystalicznej, eksperymenty z moczeniem mogą zakończyć się sukcesem w celu uzyskania struktury kokrystalicznej glikoproteina-ligand, aby lepiej zrozumieć rozpoznawanie ligandów.

Przedstawione tutaj protokoły są również istotne dla zrozumienia interakcji glikoprotein powierzchniowych z syntetycznymi ligandami terapeutycznymi34,35 i terapie przeciwciałami36,37. W połączeniu z informacjami strukturalnymi, kinetyka wiązania i termodynamika mogą być skuteczne w zrozumieniu i poprawie ich mechanizmów działania. Jedną z technik, która pozwala na analizę kinetyczną przeciwciał terapeutycznych wiążących się z glikoproteiną, jest BLI38,39. BLI wykorzystuje bioczujniki z unieruchomionym ligandem do pomiaru kinetyki asocjacji i dysocjacji z partnerem wiążącym, ostatecznie określając stałą dysocjacji równowagi (KD). BLI jest atrakcyjnym podejściem, ponieważ wymagane są niewielkie ilości glikoprotein (<100 μg), czas eksperymentu jest szybki (~10-15 minut na przebieg) i można go zautomatyzować. ITC jest również przydatny do badania powinowactwa między glikoproteinami a partnerami wiążącymi40,41,42,43. Chociaż ITC jest bardziej czasochłonne i wymaga użycia odczynników, można uzyskać cenne informacje dotyczące termodynamiki oddziaływania (ΔG, ΔH, ΔS i stechiometria). ITC jest również bardzo przydatny do badania słabych oddziaływań, które często są związane z przejściowym wiązaniem glikoprotein powierzchniowych z ligandami. Co więcej, techniki te mogą być stosowane w połączeniu do oceny wiązania różnych konstruktów i oceny wpływu różnych glikoform połączonych z N otrzymanych z ekspresji glikoproteiny w różnych liniach komórkowych. Wykonywanie BLI i ITC z glikoproteinami wytwarzanymi w HEK293F, HEK293S i leczonych Endo H może zapewnić dogłębny wgląd w rolę glikanów w aktywności biologicznej i zaangażowaniu terapeutycznym.

Udało nam się scharakteryzować te protokoły do scharakteryzowania domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) ludzkiej klasy CD2228, glikoproteiny należącej do rodziny lektyn ig-podobnych wiążących kwas sjalowy (Siglecs), która jest niezbędna do utrzymania homeostazy komórek B44. Przeprowadziliśmy dogłębny projekt konstrukcji, aby ułatwić krystalizację i podzieliliśmy zestaw danych rentgenowskich na etapy poprzez nasąkanie HA Hg. Nasączyliśmy również kryształy CD22 jego ligandowym kwasem sjalowym (α2-6 sjallaktoza), aby uzyskać strukturę kompleksu receptor-ligand immunologiczny, a tym samym dostarczyliśmy plany dla projektu mimetyki glikanów kierowanego strukturą45,46. Ponadto wygenerowaliśmy wiązanie antygenu fragmentacyjnego (Fab) przeciwciała terapeutycznego anty-CD22 epratuzumabu - kandydata terapeutycznego obecnie w III fazie badań klinicznych dla chłoniaka nieziarniczego47- w celu określenia jego powinowactwa wiązania przez BLI i ITC do różnie glikozylowanych konstruktów ECD CD22. Badania te ujawniły kluczową rolę glikozylacji sprzężonej z N w zaangażowaniu epratuzumabu, z potencjalnymi implikacjami dla rozpoznawania CD22 na dysfunkcyjnych komórkach B.

Protokół

1. Projekt konstrukcji domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) glikoproteiny

  1. Przeanalizuj sekwencję aminokwasową ludzkiego CD22 (Uniprot) przy użyciu serwerów InterPro i Phyre2 w celu zidentyfikowania przewidywanych elementów domen i ich granic zlokalizowanych w białku48,49.
  2. Sklonuj sekwencję ludzkiego CD22, pozbawioną peptydu sygnałowego, domen transbłonowych i cytozolowych (reszty 20-687, dalej jako domena zewnątrzkomórkowa CD22, CD22 ECD), do ssaczego wektora ekspresyjnego pHLsec25 przy użyciu enzymów restrykcyjnych AgeI i KpnI (Rysunek 2A)50.
    UWAGA: Wektor pHLsec jest zoptymalizowany do nadekspresji rozpuszczalnych, wydzielanych białek w komórkach ssaków25. Wektor ten zawiera sygnał sekrecji, aby umożliwić zewnątrzkomórkowe wydzielanie rozpuszczalnych glikoprotein. pHLsec posiada znacznik (His)6x na końcu C-terminalnym, co ułatwia oczyszczanie powinowactwa z supernatantów komórkowych przy użyciu metod chromatografii powinowactwa do zunieruchomionych jonów metali.
  3. Sklonuj skrócone konstrukty CD22 ECD z sekwencyjnymi delecjami domen Ig na końcu C-terminalnym: domeny 1-6 (reszty 20-687), domeny 1-5 (reszty 20-592), domeny 1-4 (reszty 20-504) oraz domeny 1-3 (reszty 20-330) (Rysunki 2B i 2C)50.
  4. Przeanalizuj sekwencję pierwotną CD22 ECD przy użyciu serwera NetNGlyc w celu zidentyfikowania przewidywanych miejsc glikozylacji typu N obecnych w konstrukcie51.
  5. Stosując mutogenezę celowaną zgodnie ze standardowymi protokołami52 lub metodą nakładającej się PCR53, zmutuj każde przewidywane miejsce glikozylacji typu N (Asn na Gln i/lub Asn na Ala), aby stworzyć konstrukty CD22 ECD zawierające pojedynczą lub kilka mutacji miejsc glikozylacji typu N.
  6. Po weryfikacji sekwencji sklonowanych konstruktów, przeprowadź transformację do kompetentnych komórek E. coli DH5α54 i wykonaj maxi-prep DNA (zgodnie z instrukcjami producenta) w celu przygotowania do transfekcji.

2. Hodowla linii komórkowych HEK293F i HEK293S

UWAGA: Wszystkie manipulacje z komórkami HEK293F lub HEK293S przy użyciu niezbędnych odczynników i sprzętu muszą być wykonywane w laboratorium o 2. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) w odpowiedniej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zewnętrzne powierzchnie wszystkich przedmiotów muszą zostać wysterylizowane 70% roztworem etanolu lub równoważnym odczynnikiem.

  1. Należy pozyskać zawiesiny komórek HEK293F i HEK293S (patrz Tabela materiałów) i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  2. Podgrzewać pożywki (patrz Tabela materiałów) przez 1 h w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść 24 mL podgrzanej pożywki do 125 mL kolby do hodowli komórkowej z przegrodami i wentylowaną zakrętką.
  3. Wyjąć 1 mL alikwotu komórek z temperatury -80 °C i przenieść na lód.
  4. Inkubować komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez około 1 min, aby częściowo je rozmrozić. Przenieść 1 mL komórek z fiolki do 125 mL kolby do hodowli komórkowej z przegrodami zawierającej pożywkę.
  5. Zamknąć kolbę do hodowli komórkowej wentylowaną zakrętką i umieścić kolbę w inkubatorze shakingowym ustawionym na 37 °C, 130 rpm, 70% wilgotności i 8% CO2.

3. Hodowla i utrzymanie komórek HEK293

UWAGA: Gęstość i żywotność komórek należy sprawdzić około 24 h po rozmrożeniu. Krok ten pozwala upewnić się, że komórki regenerują się po inokulacji; początkowa żywotność powinna wynosić >80%.

  1. Ostrożnie pobrać 10 µL komórek z kolby o pojemności 125 mL zawierającej świeżą zawiesinę komórek i przenieść je do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 mL. Zamknąć kolbę i umieścić ją ponownie w inkubatorze.
  2. Do mikroprobówki 1,5 mL z komórkami pipetować 10 µL roztworu błękitu Trypan, dokładnie wymieszać, a następnie przenieść 10 µL do komory liczniczej szkiełka do liczenia.
  3. Umieścić szkiełko do liczenia w automatycznym liczniku komórek i odczytać wartości gęstości komórek (w jednostkach cells mL-1) oraz żywotności komórek (w procentach).
  4. Obliczyć objętość zawiesiny komórek niezbędną do zaszczepienia świeżej hodowli o objętości 200 mL, aby uzyskać końcową gęstość ~0,8 x 106 cells mL-1, korzystając z następujących równań:
    figure-protocol-1    (1)
    figure-protocol-2   (2)
    UWAGA: Uzyskanie odpowiedniej gęstości komórek do zaszczepienia w kulturze o objętości 200 mL może zająć ~ 5 d.
  5. Po osiągnięciu gęstości komórek wystarczającej do zaszczepienia hodowli 200 mL, ogrzewać pożywkę przez 1 h w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie przenieść podgrzaną pożywkę do komory z laminarnym przepływem powietrza.
  6. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieść wymaganą objętość pożywki (obliczoną zgodnie z równaniem 2) do 500 mL baflowanej kolby do hodowli komórek  z nakrętką z filtrem.
  7. Za pomocą pipety serologicznej przenieść wymaganą objętość zawiesiny komórek (obliczoną zgodnie z równaniem 1) do 500 mL baflowanej kolby do hodowli komórek  zawierającej pożywkę.
  8. Zakręcić nową zapasową hodowlę utrzymującą o objętości 200 mL i umieścić ją ponownie w inkubatorze. Hodować komórki do osiągnięcia gęstości około 3 x 106 cells mL-1. Przesiewać komórki przy gęstości 0,8 x 106 cells mL-1 co 2-3 d w celu utrzymania stabilnej kultury komórek (zgodnie z opisem w sekcjach 3.4-3.7). Nie dopuszczać do przekroczenia gęstości ~4 x 106 cells mL-1.

4. Transfekcja komórek HEK293 w celu ekspresji glikoprotein

  1. Oblicz objętość komórek i pożywki niezbędną do przygotowania 200 ml hodowli do transfekcji przy gęstości 0,8 x 10^66 komórek/ml-1 (korzystając z równań 1 i 2 z sekcji 3.4).
    UWAGA: Liczba możliwych do wykonania transfekcji w objętości 200 ml zależy od gęstości komórek w zapasie podtrzymującym.
  2. Przenieś wymaganą objętość pożywki i komórek do transfekcji do nowej kolby hodowlanej o pojemności 500 ml z filtrowanym zakrętką, a zapas komórek umieść z powrotem w inkubatorze.
  3. Inkubować komórki przez 1 h przed transfekcją, aby umożliwić im aklimatyzację po pasażowaniu.
  4. Transfer 50 µg DNA do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i rozcieńczyć w 5 ml pożywki. Rozcieńczony DNA przefiltrować za pomocą filtra próżniowego przy użyciu 0.22 µm system filtracyjny do drugiej sterylnej probówki.
  5. Wymieszać rozcieńczony, przefiltrowany DNA z odczynnikiem do transfekcji w stosunku masy do objętości 1:1. Delikatnie zamieszać roztwór DNA i odczynnika do transfekcji w celu wymieszania, a następnie inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Dodaj roztwór DNA i odczynnika do transfekcji bezpośrednio do komórek. Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 130 obr./min, 70% wilgotności i 8% CO22 w inkubatorze wytrząsającym przez 5–7 dni.

5. Optymalizacja warunków transfekcji komórek

UWAGA: Aby zoptymalizować warunki transfekcji komórek w celu uzyskania maksymalnej wydajności glikoproteiny, należy transfectować komórki przy różnych początkowych gęstościach komórek i ocenić wydajność białka w czasie (Rysunek 3A). Komórki należy transfectować zgodnie z opisem w sekcji 4, przy początkowych gęstościach komórek w zakresie od 0,5 x 106 do 2 x 106 komórek mL-1 55. W celu oszczędności miejsca i odczynników, transfekcje próbne można przeprowadzić w całkowitej objętości 25 mL (w 125 mL kolbie do hodowli komórek z przegrodami  ), używając 6 µg DNA. Ilość DNA również może zostać zoptymalizowana55.

  1. każdego dnia po transfekcji (dni 1-7) przenieś 500 µL alikwotu z hodowli komórkowej do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 mL (w komorze z laminarnym przepływem powietrza).
  2. Odwirować alikwoty komórek z prędkością 12 000 x g przez 5 min w mikrocentry fudze natychmiast po pobraniu. Przenieść supernatant do nowej mikroprobówki 1,5 mL i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania wszystkich próbek.
  3. Ilościowe oznaczenie wydzielonego glikoproteiny metodą densytometrii
    1. Po uzyskaniu wszystkich próbek, odmierzyć 20 µL każdej z nich do nowej mikroprobówki 1,5 mL i wymieszać z 6 µL nieredukującego 4x buforu Laemmli do próbek.
    2. Gotować próbki przez 5 min w temperaturze 95 °C w termobloku. Wirować próbki przez 1 min przy 12 000 x g w mikrocentry fudze.
    3. Nanieść 20 µL każdej próbki na każdą studzienkę w 10-dołkowym żelu SDS-PAGE z gradientem 4-15%. Wyznaczyć jedną ścieżkę dla markerów wielkości białek. Prowadzić elektroforezę przy 250 V przez 20 min w buforze Tris/Glicyna/SDS.
    4. Po zakończeniu elektroforezy przenieść żel do barwnika Coomassie (patrz Tabela materiałów) na 20 min. Odbarwić żel w ddH2O przez 20 min. Wykonać obrazowanie żelu.
    5. Przeprowadzić densytometrię za pomocą programu ImageJ, zgodnie ze standardowymi protokołami57,58.
    6. Zestawić i narysować dane, wpisując „dni po transfekcji” na osi X oraz „wartości densytometryczne” na osi Y (Rysunek 3A).
      ​Uwaga: Alternatywnie, jeśli ekspresja białka jest niewystarczająca do wizualizacji za pomocą SDS-PAGE, można zastosować techniki takie jak Western blotting56.
  4. Ilościowe oznaczenie wydzielonego glikoproteiny metodą BLI
    1. Używając biosensorów Ni-NTA, oznaczyć ilość wydzielonej glikoproteiny za pomocą BLI59.
    2. Zestawić i narysować dane, wpisując „dni po transfekcji” na osi X oraz „stężenie białka (µg/mL)” na osi Y (Rysunek 3A).

6. Oczyszczanie rozpuszczalnej glikoproteiny z supernatantu komórek HEK293

  1. Zbiór komórek przeprowadzić poprzez wirowanie przy 6,371 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Zachować nadsącz zawierający wydzielone CD22 ECD i przefiltrować go za pomocą filtra 0,22 µm.
  2. Nadsącz nanieść z prędkością 4 mL min-1 na uprzednio equilibriumizowaną (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazolu) kolumnę Ni-NTA (objętość 5 mL), używając laboratoryjnego systemu chromatograficznego.
    UWAGA: Można zastosować inne techniki oczyszczania oparte na powinowactwie, w zależności od znaczników powinowactwa zawartych w konstrukcji opisanej w sekcji 1.
  3. Po naniesieniu nadsączu przemyć kolumnę powinowactwa 3-4 objętościami kolumny (CV) buforu do płukania (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazolu).
  4. Eluować oczyszczone glikoproteinę z kolumny, stosując gradient 4-100% (4 CV) buforu do elucji (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazolu), zbierając frakcje (Rycina 3B).
  5. Frakcje zawierające eluowany pik połączyć w odwirującym urządzeniu do filtracji o nominalnej granicy odcięcia masy cząsteczkowej (NMWL) 10 kDa i zagęścić poprzez wirowanie przy 4,000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min lub do momentu, aż objętość próbki osiągnie 500 µL.
  6. Zagęszczoną glikoproteinę wprowadzić do pętli próbkowej o objętości 500 µL i nanieść z prędkością 0,5 mL min-1 na uprzednio equilibriumizowaną (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl) wysokosprawną kolumnę do wykluczania żelowego (objętość około 24 mL) w systemie szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) w temperaturze 4 °C, zbierając frakcje (Rycina 3C).
  7. Przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE eluowanych frakcji, aby zidentyfikować frakcje zawierające glikoproteinę, a następnie połączyć odpowiednie frakcje. Żel SDS-PAGE można przeprowadzić zgodnie z opisem w sekcji 560.

7. Deglikozylowanie oczyszczonej glikoproteiny

  1. Zmierzyć stężenie oczyszczonego białka po chromatografii wykluczania cząsteczkowego, wykorzystując absorbancję przy 280 nm podzieloną przez współczynnik ekstynkcji (np. 1,418 M-1 cm-1 dla CD22 ECD).
    UWAGA: Teoretyczny współczynnik ekstynkcji białek zainteresowania można obliczyć za pomocą serwerów takich jak ExPASy ProtParam61.
  2. Inkubować oczyszczone białko z Endo H przez 1 h w temperaturze 37 °C, zachowując stosunek 1 mg oczyszczonego białka do 10 µL komercyjnego enzymu w 1X buforze Endo H (zgodnie z instrukcjami producenta).
    UWAGA: Endo H rozszczepia glikany o wysokiej zawartości mannozy produkowane w komórkach HEK293S, pozostawiając pojedynczą jednostkę GlcNAc w każdym miejscu glikozylacji21. Endo H nie rozszczepia glikanów w białkach produkowanych w komórkach HEK293F22, jednak w tym celu można zastosować inne enzymy (np. PNGaseF24).
  3. Skoncentrować deglikozylowane ECD do 500 µL i przeprowadzić chromatografię filtracyjną na kolumnie do wysokosprawnej chromatografii wykluczania cząsteczkowego (objętość około 24 mL) z przepływem 0,5 mL min-1 na systemie FPLC, aby usunąć Endo H i oddzielić powstałe agregaty.
  4. Przechowywać deglikozylowane białko w temperaturze 4 °C do czasu użycia w dalszych eksperymentach.

8. Krystalizacja glikoprotein

UWAGA: Próby krystalizacji należy przeprowadzić z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych zestawów przesiewowych, a eksperymenty metodą siedzącej kropli przygotować przy użyciu robota do krystalizacji.

  1. Skoncentrować czystą, deglikozylaną domenę zewnątrzkomórkową (ECD) do stężenia 10 mg mL-1, używając urządzenia do filtracji odśrodkowej z NMWL 10 kDa przy 4 000 x g (4 °C) aż do uzyskania pożądanej koncentracji.
  2. Wyznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm i dzieląc wynik przez współczynnik ekstynkcji.
  3. Przed próbami krystalizacji odwirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia kurzu lub innych zanieczyszczeń z próbki.
  4. Wypełnić dołki zbiorcze 96-dołkowych płytek do krystalizacji metodą wiszącej kropli (sitting drop) 80 µL roztworu krystalizacyjnego z komercyjnego zestawu do przesiewania (screen).
    UWAGA: Stosujemy komercyjne zestawy typu sparse-matrix, które zostały zaprojektowane w oparciu o najskuteczniejsze warunki krystalizacji dla struktur zdeponowanych w bazie PDB.
  5. Za pomocą robota do krystalizacji nanieść krople do dołków płytki krystalizacyjnej, tak aby całkowita objętość kropli wynosiła 200 nL, przy stosunku oczyszczonego białka do roztworu krystalizacyjnego 1:1.
  6. Po wypełnieniu całej płytki, zapieczętować ją taśmą i umieścić w obrazowniku płytek w celu inspekcji w świetle widzialnym i ultrafioletowym.
  7. Kontrolować płytki krystalizacyjne bezpośrednio po przygotowaniu oraz w kolejnych tygodniach, używając światła widzialnego i ultrafioletowego, aby zidentyfikować warunki dające pierwsze kryształy glikoproteiny.
  8. Dalszą optymalizację kryształów uzyskanych z pierwszych trafień krystalizacyjnych przeprowadzić, stosując dokładne przesiewanie (fine screens) w oparciu o warunki uzyskania kryształu lub metody losowego mikrosiania matrycowego (random matrix micro-seeding)62,63,64,65.
  9. Kryoprotektować wszystkie kryształy, które nie posiadają wystarczającej ilości krioprotektanta w warunkach krystalizacji, poprzez namaczanie kryształu w roztworze cieczy macierzystej uzupełnionym o 20% (v/v) roztwór glicerolu (lub równoważny krioprotektant, taki jak glikol etylenowy lub glikol polietylenowy 400).
  10. Zamontować kryształy w pętlach kriogenicznych (cryoloops) i zamrozić je gwałtownie w ciekłym azocie przed zbieraniem danych na dyfraktometrze laboratoryjnym lub z wykorzystaniem promieniowania synchrotronowego.

9. Fazowanie przy użyciu pochodnych ciężkich atomów

UWAGA: Przed jakąkolwiek manipulacją związkami HA należy rozważyć kwestie bezpieczeństwa. Związki HA stosowane w krystalografii białek są dobierane ze względu na ich silne powinowactwo do cząsteczek biologicznych i stanowią zagrożenie dla zdrowia ludzi przy długotrwałej ekspozycji. Należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa w przypadku związków HA, zgodnie z informacjami zawartymi w ich Kartach Charakterystyki Substancji.

  1. Aby przetestować różne związki HA, stężenia i czasy inkubacji, odtwórz dobrze dyfraktujące kryształy uzyskane w Rozdziale 8 na 24-dołkowej płytce krystalizacyjnej, stosując metodę dyfuzji pary w kropli wiszącej66.
  2. Zdecyduj, który HA zostanie użyty do derywatyzacji kryształów. Serwery (np. Heavy-atom Database System67) mogą pomóc w wyborze związku HA, zapewniając, że jest on odpowiedni dla danego białka i warunków krystalizacji.
    UWAGA: Komercyjnie dostępne są również zestawy do przesiewu HA, co ułatwia identyfikację najskuteczniejszych związków HA do fazowania. Wcześniej opisano zestaw siedmiu związków HA („magic seven”), które wykazują wysoką skuteczność w derywatyzacji HA68.
  3. Przygotuj stanowisko do namaczania w HA (Rysunek 4A). Używając pętli kriogenicznej, szybko przenieś kryształy do kropli o objętości 0,2 µL na przykrywce szkiełkowej o średnicy 22 mm, zawierającej roztwór HA rozcieńczony w warunkach krystalizacji w taki sposób, aby końcowe stężenie HA wynosiło od 1-20 mM. Zamknij kroplę i inkubuj przez różne odcinki czasu (Rysunek 4B). Dobrym punktem wyjścia są odstępy 5, 10, 60 i 90 min oraz inkubacja przez noc.
  4. Obejrzyj kryształy pod mikroskopem świetlnym, aby zidentyfikować ewentualne pęknięcia lub zmiany barwy, które mogą wskazywać na niekorzystny wpływ na kryształ glikoproteiny lub przebieg derywatyzacji kryształu.
  5. Zamocuj kryształy w pętlach kriogenicznych i przeprowadź tzw. back-soaking przez 30 s w trzech kolejnych kroplach o objętości 0,2 µL zawierających roztwór cieczy macierzystej z dodatkiem 20% (v/v) glicerolu (lub innego krioprotektanta)69. Back-soaking pozwala usunąć niespecyficznie związane związki HA i zmniejsza problem częściowego obsadzenia miejsc wiązania spowodowanego słabym wiązaniem HA. Zamroź kryształy gwałtownie w ciekłym azocie (Rysunek 4B).
  6. W celu zbierania danych, ich przetwarzania, rozwiązania struktury oraz rafinacji zastosuj wcześniej opisane protokoły26,70,71,72.

10. Nasączanie kryształów glikoprotein ligandem

  1. Odtworzyć dobrze dyfrakcyjne kryształy uzyskane w sekcji 8 w 24-dołkowej płytce do krystalizacji, stosując metodę dyfuzji par w kropli wiszącej.
  2. Przygotować roztwór zapasowy liganda o stężeniu 50 mM w 20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl.
    UWAGA: Stężenie liganda powinno zostać przygotowane zgodnie z jego powinowactwem do glikoproteiny. Jeśli powinowactwo jest nieznane, przed rozpoczęciem eksperymentów z namaczaniem może być konieczne zastosowanie metody takiej jak ITC (sekcja 12.2) w celu jego wyznaczenia. Należy upewnić się, że ligand jest rozpuszczalny w pożądanym stężeniu w wymaganym buforze.
  3. Dodać różne stężenia liganda do kropli zawierającej kryształy ECD i szczelnie zamknąć kroplę w celu inkubacji przez czas od 5 min do 5 d.
  4. Monitorować wizualnie kryształy za pomocą mikroskopu świetlnego, aby zidentyfikować ewentualne zmiany w morfologii.
  5. Zamontować kryształy w pętlach kriogenicznych i poddać je krioprotekcji w roztworze cieczy macierzystej uzupełnionym o 20% (v/v) glicerolu (lub innego krioprotektanta, np. glikolu etylenowego lub niskocząsteczkowego glikolu polietylenowego 400)69.
  6. W celu zbierania, przetwarzania danych, wyznaczenia struktury i jej udoskonalenia zastosować wcześniej opisane protokoły73,74,75.

11. Produkcja fragmentu wiążącego antygen (Fab)

  1. Wykonaj subklonowanie genów odpowiadających sekwencjom ciężkiego łańcucha (HC) i lekkiego łańcucha (LC) fragmentu Fab przeciwciał anty-ECD, np. epratuzumabu.
    ​UWAGA: Alternatywnie IgG można przeciąć enzymem papainą w celu wygenerowania fragmentów Fab76.
  2. Wykonaj transfekcję komórek zgodnie z opisem w Sekcji 4, z następującymi modyfikacjami:
    1. Użyj całkowitej masy DNA do transfekcji fragmentów Fab wynoszącej 90 µg na 200 mL hodowli.
    2. Transfekuj plazmidy HC i LC w stosunku 2:1, aby zmniejszyć ilość tworzących się dimerów LC.
  3. Po 7 dniach inkubacji zbierz komórki, zachowaj supernatant i przefiltruj go za pomocą urządzenia do filtracji próżniowej o rozmiarze porów 0,22 µm.
  4. Równoważ kolumny powinowactwa anty-LC (kappa lub lambda) w buforze PBS, korzystając z laboratoryjnego systemu chromatograficznego.
    UWAGA: Jeśli tworzenie dimerów LC stanowi problem podczas oczyszczania, alternatywą dla oczyszczania powinowactwem do LC kappa/lambda może być chromatografia powinowactwa do białka G.
  5. Nałóż supernatant na kolumnę powinowactwa z przepływem 4 mL min-1. Po nałożeniu próbki przemyj kolumnę 3-4 objętościami kolumny (CV) PBS.
  6. Eluuj białko z kolumny, stosując elucję izokratyczną 100 mM glicyną, pH 2,2, natychmiast neutralizując eluat w każdej frakcji poprzez dodanie 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9,0.
    UWAGA: Eluowany Fab można dodatkowo oczyścić za pomocą chromatografii wymiany jonowej i/lub chromatografii wykluczania żelowego, korzystając z systemu FPLC w temperaturze 4 °C.

12. Charakterystyka wiązania fragmentów Fab i małych cząsteczek z glikoproteidą

  1. Interferometria warstwy biologicznej
    1. Przygotuj 50 ml 1x buforu kinetycznego (1x PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (w/v) BSA).
    2. Nawodnić sześć biosensorów Ni-NTA w 200 µL buforu kinetycznego 1x przez 10 min w płytce wstępnie zwilżonej.
    3. Rozcieńczyć ECD z tagiem His w 1 ml 1x buforu kinetycznego do końcowego stężenia 25 ng µL-1Pipetować rozcieńczenia seryjne oczyszczonego fragmentu Fab do 200 µL buforu kinetycznego 1x, z wysokim stężeniem 500 nM oraz następczymi rozcieńczeniami seryjnymi: 250 nM, 125 nM i 62,5 nM.
    4. Przenieś alikwoty odczynników do czarnej polipropylenowej mikropłytki 96-dołkowej z płaskim dnem, zgodnie z ilustracją w Rysunek 5A, gdzie każda studnia zawiera 200 µL wskazanego roztworu.
    5. Zbierz dane, korzystając z testów kinetycznych (Kinetics Assays) w oprogramowaniu do akwizycji danych (Data Acquisition), zgodnie z wcześniejszym opisem.38,39,77 (Rysunek 5A).
      1. Krótko mówiąc, przenieś biosensory do dołków zawierających 1x bufor kinetyczny, aby ustalić linię bazową przez 60 s przed naniesieniem 25 ng µL-1 glikoproteiny przez 240 s (lub do osiągnięcia progu 1,0 nm) przy 1000 obr./min.
      2. Po drugim pomiarze bazowym trwającym 60 s w 1x buforze kinetycznym, należy przenieść biosensory do dołków zawierających seryjne rozcieńczenia Fab. Następnie po fazie asocjacji trwającej 180 s następuje 180-sekundowy etap dysocjacji w 1x buforze kinetycznym.
        Uwaga: Biosensory mogą zostać użyte ponownie, jeśli powyższemu protokołowi towarzyszy etap regeneracji, który polega na trzech cyklach płukania biosensorów w buforze strippingowym (PBS z 500 mM imidazolu) przez 5 s, a następnie przez 5 s w 1x buforze kinetycznym w celu neutralizacji. Biosensory można wykorzystywać ponownie do około 10–20 razy w ciągu jednego dnia lub do momentu zaobserwowania niskiej jakości danych.
    6. Przeanalizuj dane, korzystając z oprogramowania analitycznego (Rycina 5A):
      1. W zakładce Tab 1 zaimportuj i zaznacz dane.
      2. W zakładce 2, Krok 1: Wybór danych (Data Selection), wybierz „Wybór czujnika” (Sensor Selection) i zaznacz studzienki referencyjne (wiersze E i F, Rysunek 5A), kliknij prawym przyciskiem myszy i ustaw jako studzienkę referencyjną. W Kroku 2: Subtraction (odejmowanie) wybierz „Reference Wells” (studzienki referencyjne). W Kroku 3: Align Y-axis (wyrównanie osi Y) wybierz „Baseline” (linia bazowa) dla zakresu czasu od 0,1 do 59,8 s. W Kroku 4: Inter-step Correction (korekcja międzyetapowa) wybierz „Align to dissociation” (wyrównaj do dysocjacji). W Kroku 5: Process (przetwarzanie) wybierz „Savitzky-Golay filtering” (filtrowanie Savitzky’ego-Golaya) i naciśnij Process Data (przetwórz dane).
      3. W zakładce 3, w sekcji „Step to Analyze”, wybierz opcję „Association and Dissociation” dla modelu 1:1. Wybierz „Global fitting” oraz „Group by Color”. Kliknij prawym przyciskiem myszy na krzywe, wybierz „Change color” i ustaw dla wszystkich krzywych wybrany kolor. Wybierz „Fit Curves”. Jeśli dane są dobrze dopasowane, raport można wyeksportować, wybierając opcję „Save Report”.
    7. Powtórz eksperyment z glikoproteiną produkowaną w komórkach HEK293F i HEK293S (Sekcja 5) oraz po traktowaniu Endo H (Sekcja 7), aby ocenić wpływ, jeśli taki istnieje, różnych glikoform na rozpoznawanie przez Fab. Ponadto powtórz eksperyment z użyciem wariantów z uciętą domeną ECD, aby uzyskać informacje o domenie lub domenach wiązanych przez Fab.
  2. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa oddziaływania Fab-glikoproteina
    ​Uwaga: Opisane tutaj eksperymenty ITC są przeprowadzane przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia ITC. Eksperymenty są realizowane w bloku 96-dołkowym z okrągłym dnem o objętości 1 ml.
    1. Przeprowadzić dializę ECD i Fab w jednym becherze o objętości 4 l zawierającym 20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl w temperaturze 4 °C przez noc z użyciem mieszadełka magnetycznego.
    2. Skoncentrować dializowane ECD oraz Fab do 5 µM i 50 µModpowiednio, przy użyciu filtra odśrodkowego o progu odcięcia masy cząsteczkowej (NMWL) 10 kDa, pamiętając o trzykrotnym przemyciu membran koncentratora 5 ml buforu do dializy przy 4000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C przed użyciem.
      UWAGA: Jakiekolwiek niezgodności w składzie buforu między próbkami w komórce a próbką w strzykawce mogą spowodować uwalnianie niepożądanego ciepła podczas eksperymentu ITC, co doprowadzi do uzyskania danych słabej jakości.
    3. Do eksperymentu 1: dodać 400 µL ilości ECD do A1, które należy wprowadzić do ogniwa, oraz 120 µL fragmentu Fab do dołka A2 w celu pobrania go strzykawką. Dołek A3 pozostaje pusty, aby umożliwić powrót zmieszanej próbki po zakończeniu eksperymentu. Każdy kolejny eksperyment można dodać na płytkę w tej samej kolejności (t. j. eksperyment 2: komórka – A4, strzykawka – A5, pusty dołek – A6; Rycina 5B).
      Uwaga: Na początku i na końcu każdego pomiaru należy uwzględnić kontrole buforu do buforu (aby potwierdzić prawidłowe działanie urządzenia), a także kontrole liganda (w strzykawce) do buforu (w komórce), aby obliczyć ciepło rozcieńczenia próbki znajdującej się w strzykawce. Obliczone ciepło rozcieńczenia powinno następnie zostać odjęte od surowych danych eksperymentalnych podczas analizy danych (Rycina 5B).
    4. Wykonaj łącznie 16 wstrzykiwań o objętości 2.5 μL dla każdego wtrysku. Czas trwania wtrysku wynosi 5 s, z odstępem 180 s między wtryskami. Ustawić temperaturę komory na 25 °Cprzy prędkości mieszania 750 obr./min i czasie filtrowania 5 s.
      UWAGA: W zależności od powinowactwa i termodynamiki oddziaływania ECD:Fab konieczna może być zmiana stężenia próbki, liczby wstrzyknięć lub temperatury komórki.
    5. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania analitycznego, zgodnie z wcześniejszym opisem.40,41,43 (Rycina 5B).
    6. Powtórzyć eksperyment co najmniej w dwóch powtórzeniach, obliczając średnią wartość K.D wartości i błędy standardowe. Powtórzono eksperyment z ECD wynoszącym różne glikoformy (sekcje 5 i 6), aby ocenić wpływ, jeśli taki istnieje, glikoform na termodynamikę oddziaływania Fab:glikoproteina.
  3. W celu przeprowadzenia izotermicznej kalorymetrii miareczkowania oddziaływań ligand-glikoproteina, przygotować eksperyment ITC zgodnie z opisem w sekcji 12.2, wprowadzając następujące zmiany:
    1. Dializować ECD w 4 l buforu do dializy przez noc. Po zakończeniu dializy rozpuścić ligand w buforze do dializy.
    2. Przeprowadź eksperymenty ITC przy znacznie wyższych stężeniach, aby umożliwić wykrycie oddziaływań o niskim powinowactwie. W przypadku oddziaływania ECD z ligandem przeprowadź eksperymenty ITC przy stężeniach wynoszących 100 µM ECD w komórce oraz 1 mM liganda w strzykawce.

Wyniki

Kilka konstruktów ECD CD22 zostało pomyślnie sklonowanych do wektora ekspresyjnego pHLsec i nadmiernie wyekspresowanych w ssaczych liniach komórkowych HEK293F oraz HEK293S (Rycina 2 oraz 3A). Wszystkie konstrukty oczyszczono pod kątem jednorodności wielkości za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczek, co pozwoliło uzyskać wysoce czystą próbkę do badań krystalizacyjnych (Rysunek 3B oraz 3C). Konstruktem CD22, który doprowadził do uzyskania kryształów dobrze dyfrakcyjnych, była truncacja d1-d3 (reszty 20-330), z pięć z sześciu przewidywanych miejsc glikozylacji typu N, w których dokonano mutacji Asn na Ala (N67A, N112A, N135A, N164A i N231A), otrzymanych w komórkach HEK293S, w taki sposób, aby zachowano jedynie miejsce glikozylacji na pozycji N101 (konstrukt ten nazwano CD2220-330, 5A). Kryształy uzyskano w kilku warunkach ekranowania rzadkiej macierzy MCSG-1, jednak najlepsze kryształy otrzymano w warunkach zawierających 30% (w/v) glikolu polietylenowego 4000, 0,2 M chlorku litu i 0,1 M Tris, pH 8,5. Te natywne kryształy dyfrakowały do 2,1 Å rozdzielczość; wykorzystanie znanych struktur domen Ig pokrewnych białek Siglec nie przyniosło żadnych rozwiązań w poszukiwaniach MR.

Aby uzyskać informacje o fazach, namaczaliśmy natywne kryształy w panelu związków HA, który obejmował Hg, Pt, Os, Ta i Br w stężeniach od 1-20 mM związku HA przez czas inkubacji od 5 min do 1 d (Rysunek 4). Monitorowaliśmy kryształy pod kątem zmian morfologii i stwierdzono, że namaczanie kryształów w związku HA o stężeniu 20 mM prowadziło do szybkiego pękania i rozpuszczania się kryształu. Zamrozono łącznie 63 kryształy, które zachowały swój kształt po określonych czasach inkubacji i były namaczane w klastrze bromku tantalu, chlorku platyny, octanie rtęci oraz chlorku rtęci. Kryształy namaczane 7 mM chlorku rtęci przez 30 min wykazały sygnał anomalny podczas skanowania fluorescencyjnego na linii wiązki 08-BM w Canadian Light Source (CLS) (Saskatoon, Kanada), co umożliwiło wielodługościową dyspersję anomalną (MAD) podczas zbierania danych rentgenowskich z pojedynczego kryształu. Zbiory danych te pozwoliły nam rozwiązać podstrukturę rtęci dla CD2220-330, 5A, co ujawniło pojedynczy atom rtęci związany z wolną cysteiną w pozycji C308 i ostatecznie umożliwiło zbudowanie struktury CD2220-330, 5A w mapie gęstości elektronowej z rozwiązaną fazą przy użyciu programu AutoBuild78.

Po rozwiązaniu struktury nieprzypiętej do liganda, postanowiliśmy rozwiązać strukturę CD22 związanego z jego ligandem, α2-6 siallylaktozą. W celu charakterystyki termodynamiki wiązania tej interakcji, najpierw obliczyliśmy powinowactwo CD22 do α2-6 siallylaktozy za pomocą ITC. Zaobserwowaliśmy powinowactwo na poziomie ~280 µM i wykorzystaliśmy tę informację do ustalenia początkowego stężenia liganda (~ 100 x KD) do namaczania naszych natywnych kryształów CD2220-330,5A . Kryształy CD2220-330, 5A namaczano w 25 mM siallylaktozie przez 5 min, 2 h, 14 h, 40 h i 5 d, monitorując zmiany w morfologii kryształów. Łącznie zamrożono ~75 kryształów z różnych punktów czasowych i wysłano je do linii wiązki 08-ID synchrotronu CLS (Saskatoon, Kanada) w celu zdalnego gromadzenia danych. Zebrano łącznie sześć zestawów danych rentgenowskich z kryształów wykazujących dobre dyfrakcje. Strukturę z każdego zestawu danych rozwiązano metodą MR , wykorzystując strukturę nieprzypiętą do liganda CD2220-330, 5A jako początkowy model poszukiwania. Następnie sprawdzono powstałą gęstość elektronową dla wszystkich zestawów danych pod kątem dodatniej gęstości na mapie Fo-Fc, która odpowiadałaby związaną α2-6 siallylaktozie w obrębie miejsca wiązania CD22. Co niezwykłe, wszystkie zebrane zestawy danych, nawet te z kryształów namaczanych przez zaledwie 5 min czasu inkubacji, zawierały dodatnią gęstość odpowiadającą ligandowi w miejscu wiązania. Ogólne struktury CD22 nieprzypiętego i związanego z ligandem były bardzo podobne, z minimalnymi zmianami konformacyjnymi, co może wyjaśniać sukces eksperymentów z namaczaniem w α2-6 siallylaktozie.

Następnie scharakteryzowano powierzchnię antygenową CD22 rozpoznawaną przez przeciwciało terapeutyczne epratuzumab w eksperymentach BLI i ITC (Rysunek 5). Profile kinetyczne i termodynamiczne wiązania Fab epratuzumabu z konstruktami CD22 o różnych glikoformach wykazały wzrost powinowactwa do CD22 wraz ze zmniejszeniem rozmiaru glikanów N-łańcuchowych, z maksymalną 14-krotną poprawą powinowactwa dla mniejszych glikanów (327 nM vs 24 nM w BLI; 188 nM vs 58 nM w ITC). Glikan N-łańcuchowy CD22 ograniczający dostęp przeciwciała do jego epitopu został zidentyfikowany metodą BLI przy użyciu pojedynczych mutantów punktowych CD22 oraz poprzez rozwiązanie struktury kokryształu Fab epratuzumabu z CD22 d1-d328.

figure-results-1
Rycina 1. Przegląd charakterystyki glikoprotein, od projektu konstruktu po charakterystykę biofizyczną i strukturalną. (1) Analiza sekwencji pierwotnej reprezentatywnej glikoproteiny. Na szaro: domena zewnątrzkomórkowa (ECD); na zielono: segment transbłonowy (TM); na niebiesko: domena cytozolowa glikoproteiny. Oznakowano przewidywane glikany typu N. (2) Klonowanie konstruktów ECD. (3) Ekspresja konstruktów ECD w komórkach ssaków. (4) Oczyszczanie glikoprotein. Białka wyekspresjonowane w komórkach HEK293F będą zawierać glikany złożone, natomiast białka wyekspresjonowane w komórkach HEK293S będą posiadać glikany wysokomannozowe. Traktowanie enzymatyczne glikoprotein otrzymanych z komórek HEK293S za pomocą Endo H prowadzi do powstania glikoprotein z jedynie resztą GlcNAc w miejscach glikozylacji typu N. (5a) Glikoproteiny są testowane pod kątem wiązania z przeciwciałami za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowania (ITC). Za pomocą ITC można również zmierzyć powinowactwo do małych ligandów. (5b) Próby krystalizacji glikoprotein z jednorodnymi glikanami typu N, takich jak białka wyekspresjonowane w HEK293S i deglikozylowane za pomocą Endo H. (6) W niektórych przypadkach konieczna jest mutacja miejsc glikozylacji typu N w celu uzyskania kryształów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2. Projekt konstruktów DNA ektodomeny CD22 do ekspresji w komórkach ssaków. A) Przedstawienie plazmidu pHLsec wykorzystanego do przejściowej transfekcji konstruktów CD22 ECD. Miejsca AgeI i KpnI wykorzystane do klonowania zaznaczono czerwonymi ramkami. B) CD22 ECD zawiera siedem domen Ig (d1-d7) oraz 12 przewidywanych miejsc glikozylacji typu N (na niebiesko). Zaprojektowano cztery konstrukty na podstawie CD22 ECD. C) Gel agarozowy 1% przedstawiający amplikony PCR konstruktów CD22 ECD do klonowania w wektorze ekspresyjnym dla ssaków pHLsec. Pierwsza ścieżka zawiera marker DNA 1 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Ekspresja i oczyszczanie glikoprotein. A) Wpływ gęstości komórek na wydajność ekspresji. Ekspresja glikoprotein w małoscaleowej kulturze 25 mL zawiesiny komórek HEK293F transfekowanych przy trzech różnych gęstościach początkowych komórek (0,5 x 106 cells mL-1, 1,0 x 106 cells mL-1 oraz 1,5 x 106 cells mL-1). Ilościowe oznaczenie wykonano metodą densytometrii z SDS-PAGE na lewym panelu oraz ilościową BLI na prawym panelu. Wartości są reprezentatywne dla jednej preparacji glikoprotein. B) Chromatogram pierwszego etapu oczyszczania konstruktu CD2220-330, 5A z 600 mL supernatantu przy użyciu kolumny powinowactwa Ni-NTA. Glikoproteinę elukowano przy użyciu gradientu imidazolu (szara linia), gdzie 100% odpowiada buforowi elucyjnemu zawierającemu 500 mM imidazolu. Połączone frakcje zaznaczono pionowymi liniami. C) Chromatogram wykluczania sizerowego dla konstruktu CD2220-330,5A z wykorzystaniem wysokowydajnej kolumny do filtracji żelowej. Połączone frakcje z piku elucji zaznaczono pionowymi liniami. Wstawka: żel SDS-PAGE barwiony Coomassie, wykazujący czystość glikoproteiny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Namaczanie kryształów w ciężkich atomach. A) Stanowisko próbkowania do namaczania kryształów natywnych w związkach HA. Wszystkie niezbędne narzędzia są opisane. B) Kroki postępowania przy namaczaniu kryształów konstrukcji CD2220-330, 5A w związkach HA. Krok 1, otwórz studzienkę zawierającą kryształy i przenieś kryształy za pomocą pętliczki do kropli 0,2 µL na szkiełku nakrytym, zawierającej roztwór HA rozcieńczony w warunkach krystalizacji w taki sposób, aby końcowe stężenie HA wynosiło od 1-10 mM. Krok 2, zabezpiecz kroplę w płytce do krystalizacji i inkubuj kryształy ze związkiem HA przez różne okresy czasu. Krok 3, zamocuj namoczony kryształ w pętliczce i przeprowadź ponowne namaczanie (back-soaking) przez 30 s w trzech kolejnych kroplach 0,2 µl zawierających roztwór cieczy macierzystej uzupełnionej o 20% (v/v) glicerolu, naniesionych na szkiełko nakryte. Krok 4, zamroź błyskawicznie kryształ zamontowany w pętliczce ciekłym azotem i umieść go w uchwycie (puck) do transportu na linię wiązki synchrotronu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5. Pomiary metodą interferometrii warstw biologicznych (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). A) Reprezentatywny eksperyment BLI. Górny panel: przykład ustawienia płytki dla eksperymentu kinetycznego, gdzie oznaczone są następujące elementy: bufor kinetyczny 1x (B), ładowanie glikoproteiny z tagiem His6x (L), reprezentatywne stężenia Fab (500, 250, 125,  62,5 nM), bufor regeneracyjny PBS + 500 mM (R) oraz neutralizujący bufor kinetyczny 1x (B). Każda studzienka zawiera 200 µL roztworu. Numer kroku dla eksperymentu kinetycznego jest wskazany na górze płytki. Środkowy panel: Reprezentatywne surowe dane eksperymentu BLI przeprowadzonego przy użyciu biosensorów Ni-NTA i płytki opisanej w górnym panelu. Numery kroków odpowiadają linii bazowej (1), ładowaniu glikoproteiny His6x (2), linii bazowej (3), asocjacji w szeregu rozcieńczeń Fab (4) oraz dysocjacji (5). Kroki regeneracji nie są przedstawione (Kroki 6-7). Dolny panel: Reprezentatywne przeanalizowane dane pokazujące surową asocjację i dysocjację (niebieska linia) wraz z odpowiadającym dopasowaniem 1:1 (czerwona linia). B) Górny panel: Reprezentatywne ustawienie płytki dla pojedynczego pomiaru ITC na zautomatyzowanym urządzeniu ITC z siedmioma eksperymentami w bloku 96-dołkowym o okrągłym dnie. Każdy eksperyment składa się z trzech studzienek. Pierwsza studzienka (czerwona) odpowiada próbce do komory pomiarowej (400 µL), druga studzienka (zielona) odpowiada próbce do strzykawki (120 µL). Trzecia studzienka pozostaje pusta; zmieszane próbki zostaną do niej zwrócone po zakończeniu eksperymentu. Eksperymenty 1, 2 i 7 są kontrolami bufor-do-bufora. Eksperymenty 3-5 reprezentują pomiary w trzech powtórzeniach z glikoproteiną (P) w komorze i Fab lub ligandem (L) w strzykawce. Eksperyment 6 stanowi kontrolę ciepła rozcieńczenia ligandu i powinien zostać odjęty od eksperymentów 3-5 podczas analizy danych. Dolny panel: Reprezentatywne surowe (góra) i przetworzone (dół) dane ITC pokazujące wiązanie Fab (epratuzumab) do CD22 ECD produkowanego w komórkach HEK293F. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Glikoproteiny zakotwiczone w błonie mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania komórek i są atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. W tym miejscu przedstawiamy protokół strukturalnej i biofizycznej charakterystyki ECD glikoprotein błonowych, zarówno samodzielnie, jak i w kompleksie z ligandami drobnocząsteczkowymi i fragmentami Fab. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ten protokół do określenia struktury krystalicznej trzech N-końcowych domen Ig zewnątrzkomórkowej części ludzkiego CD2228, krytycznego koreceptora na komórkach B zaangażowanych w utrzymanie odporności humoralnej w ryzach79. Scharakteryzowaliśmy również miejsce wiązania CD22 z jego naturalnym ligandem α2-6 sjallaktozą oraz określiliśmy tryb rozpoznawania przeciwciała terapeutycznego wobec ludzkiego CD22. Wyniki te dostarczają informacji na temat zależności między strukturą a funkcją kluczowego członka rodziny Siglecs, który ma ograniczoną ekspresję na komórkach B, a także molekularnego planu działania w kierunku opracowania nowych leków małocząsteczkowych i opartych na przeciwciałach ukierunkowanych na CD22. Chociaż protokół ten został z powodzeniem zastosowany w przypadku receptora komórek B zawierającego Ig, proponujemy, że nasze podejście można zastosować do strukturalnej i biofizycznej charakterystyki dowolnej glikoproteiny błonowej z wyraźną organizacją domeny. W takich przypadkach projekt konstruktu i kombinatoryczne mutacje glikanów sprzężonych z N (do Gln lub Ala) mogą być oceniane w celu znalezienia konstruktu odpowiedniego do wzrostu kryształów i dyfrakcji o wysokiej rozdzielczości.

Uzyskanie jednorodnej i czystej próbki glikoproteiny ma kluczowe znaczenie dla wzrostu kryształów i dyfrakcji rentgenowskiej, a także dla dalszej charakterystyki biofizycznej. Glikany sprzężone z N obecne na glikoproteinach są z natury niejednorodne i mogą powodować konformacyjną i chemiczną niejednorodność w glikoproteinie, co może hamować tworzenie się kryształów. Aby zmniejszyć tę mikroheterogeniczność, strategie wprowadzające mutacje punktowe w celu usunięcia reszt Asn, które zgodnie z przewidywaniami zawierają glikany sprzężone z N, lub wykorzystujące zmutowane linie komórkowe (takie jak HEK293S), a następnie leczenie endoglikozydazami (takimi jak EndoH) mogą znacznie poprawić sukces krystalizacji 15,21,22. W tym protokole omawiamy oczyszczanie rozpuszczalnych glikoprotein i Fabs, które są wydzielane do supernatantu komórki. Wydzielanie glikoproteiny zapewnia stosunkowo prostą drogę do czystości, bez konieczności lizy komórek lub dodawania ostrych chemikaliów lub detergentów. Supernatant komórkowy, uzyskany po zebraniu komórek, jest następnie przepuszczany bezpośrednio przez kolumnę, która ma powinowactwo do białka będącego przedmiotem zainteresowania (np. Ni-NTA dla glikoprotein znakowanych Hisem lub powinowactwo LC do fragmentów Fab). Jednakże, w zależności od kolumny, w której jest stosowany, i warunków panujących w supernatance komórki (np. pH), zdolność wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania z kolumną może być zaburzona. W takim przypadku może być konieczna koncentracja i wymiana buforowa supernatantu komórkowego w celu poprawy wiązania z kolumną. Ponadto zdecydowanie zaleca się stosowanie etapów kontroli jakości podczas oczyszczania, aby pomóc w ocenie czystości białka. Przeprowadzenie SDS-PAGE żelu lub Western blot wszystkich próbek (przed, w trakcie i po etapach oczyszczania) może dostarczyć informacji na temat tego, czy proponowany schemat oczyszczania jest odpowiedni dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli na SDS-PAGE widoczne są pasma zanieczyszczające lub jeśli podczas oczyszczania uzyskuje się kilka gatunków (np. kilka pików przy wykluczeniu wielkości), należy rozważyć dodatkowe etapy oczyszczania, np. chromatografię jonowymienną, w celu uzyskania czystości i zwiększenia szans na dalszą krystalizację80.

W przypadku krystalizacji makromolekularnej często kluczowe jest uzyskanie wysokiej wydajności białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby umożliwić badanie przesiewowe dużej liczby potencjalnych warunków krystalizacji przy wysokich stężeniach białka w celu znalezienia odpowiednich trafień kryształów. Ogólnie rzecz biorąc, omawiane tutaj linie komórkowe HEK293 (HEK293F i HEK293S) są solidnymi systemami ekspresji i można je łatwo skalować w celu uzyskania większej próbki w razie potrzeby. Możliwe jest jednak, że białko będące przedmiotem zainteresowania może nie wykazywać wystarczającej ekspresji w tych liniach komórkowych. W takich przypadkach stwierdzono, że inne linie komórkowe, takie jak komórki Expi29381,82, wykazują wyższy poziom ekspresji białka i powinny być brane pod uwagę jako alternatywa.

Jeśli dobrze uporządkowane, dyfrakcyjne kryształy nie zostaną uzyskane po przetestowaniu kilku konstruktów białka będącego przedmiotem zainteresowania pomimo wysokiej czystości, może być konieczne rozszerzenie technik krystalizacji w celu pobudzenia tworzenia kryształów. Wykazano, że fragmenty Fab przeciwciał i nanociał mogą być doskonałymi wzmacniaczami krystalizacji i sprzyjać dobrze uporządkowanemu upakowaniu kryształów 83,84,85. Fragmenty te mogą być wyrażane i oczyszczane do jednorodności oraz stosowane w kompleksie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w celu promowania krystalizacji. Co ważne, fragmenty Fab wytworzone w sposób opisany w sekcji 10 mogą mieć tendencję do tworzenia niefunkcjonalnych dimerów LC86. Te dimery są zanieczyszczeniami i powinny być usuwane podczas oczyszczania. Z naszego doświadczenia wynika, że dimery LC często mają różną objętość retencji przy wykluczeniu wielkości lub eluują jako wyraźny pik w chromatografii jonowymiennej, a zatem mogą być usunięte z oczyszczania Fab - jednak nie zawsze tak jest. Jeśli te techniki są niewystarczające do usunięcia dimerów LC z oczyszczania Fab, można zastosować dodatkowe metody oczyszczania, takie jak oczyszczanie powinowactwa do białka G, w celu poprawy czystości.

Alternatywą dla kokompleksowania z fragmentami Fab, dobrze udokumentowane techniki, takie jak losowe mikroziarno matrycy, mogą zwiększyć szanse na uzyskanie dobrze uporządkowanych kryształów 63,70. Metoda ta polega na dodaniu niewielkich ilości pokruszonych, nieoptymalnych kryształów do warunków krystalizacji, zapewniając zarodek kryształu w celu pobudzenia wzrostu kryształów. Można to zrobić za pomocą kryształów białka będącego przedmiotem zainteresowania lub kryształów o podobnej architekturze domeny i strukturze trzeciorzędowej. Co więcej, losowe mikrowysiewanie matrycy można przeprowadzić w próbach krystalizacji białka samodzielnie lub w kompleksie z fragmentem Fab lub małą cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Ostatnie postępy w mikroskopii krioelektronowej sprawiają, że technika ta jest również atrakcyjną alternatywą dla krystalografii rentgenowskiej w celu uzyskania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości dla cząsteczek o odpowiednich cechach 87,88,89,90,91.

Gdy fazowanie zestawów danych dyfrakcji rentgenowskiej nie powiedzie się przez MR, może być konieczne wygrzewanie HA w celu rozwiązania problemu fazowego przez anomalną dyspersję lub izomorficzną substytucję. Badanie sekwencji aminokwasów białka może dostarczyć wskazówek na temat strategii derywatyzacji HA, w tym optymalnego pH do wiązania. W szczególności niesparowane cysteiny w białku mogą specyficznie wiązać związki HA zawierające rtęć. Moczenie natywnych kryształów związkami HA jest procesem iteracyjnym mającym na celu określenie tożsamości optymalnego związku HA, jego stężenia i wymaganego czasu inkubacji. Jeśli początkowe próby namaczania nie dadzą dobrze dyfrakcyjnych kryształów zawierających kwas hialuronowy odpowiedni do fazowania, może być konieczne wprowadzenie podstawień aminokwasów w celu zwiększenia prawdopodobieństwa wiązania HA i poprawy sygnału anomalnego. Przykłady obejmują mutacje zawierające wolną resztę cysteiny w celu skutecznego wiązania Hg, Au, Pt lub Pb. Ekspresja białek do anomalnego fazowania w pożywce uzupełnionej selenometioniną w E. coli jest szeroko stosowana do fazowania anomalnego, jednak równoważny system, który niezawodnie zawiera selenometioninę, nie jest łatwo dostępny dla komórek ssaków w zawiesinie92,93, i jest obszarem przyszłego rozwoju.

Po uzyskaniu niezligandowanej struktury interesującej nas glikoproteiny można przeprowadzić moczenie kryształów ligandami drobnocząsteczkowymi w celu uzyskania struktury kompleksu receptor-ligand immunologiczny. Dane te stanowią plan racjonalnego projektowania bardziej specyficznych ligandów o wysokim powinowactwie, które mogą być stosowane jako terapie małocząsteczkowe, a także zapewniają wgląd w biologiczną funkcję glikoproteiny w wysokiej rozdzielczości. Podczas próby namoczenia kryształów glikoproteiny za pomocą interesujących nas ligandów małocząsteczkowych, inspekcja struktury niezligandowanych kryształów może wskazać, czy możliwe jest nasiąkanie. Jeśli wokół miejsca wiązania liganda lub wokół regionów, które mają ulegać zmianom konformacyjnym po związaniu liganda, zostaną znalezione bliskie kontakty z upakowaniem kryształów, moczenie będzie prawdopodobnie problematyczne. W takim przypadku należy przeprowadzić inne metody, takie jak kokrystalizacja kompleksu białko-ligand.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej opisane w tym artykule zostały przeprowadzone przy użyciu linii badawczych 08-ID i 08-BM w Kanadyjskim Źródle Światła, które jest wspierane przez Kanadyjską Fundację Innowacji, Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanadyjskiej Rady Badawczej, Uniwersytet Saskatchewan, Rząd Saskatchewan, Kanadyjską Narodową Radę ds. Badań Naukowych oraz Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem. Chcielibyśmy podziękować Szpitalowi dla Chorych Dzieci za dostęp do instrumentów ITC i BLI. J.E.O. był wspierany przez Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 z Canadian Institutes of Health Research. T.S. jest laureatem Canada Graduate Scholarship Master's Award oraz stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship od Canadian Institutes of Health Research. Prace te były wspierane przez grant operacyjny PJT-148811 (J.-P.J.) z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem. Badania te zostały częściowo dzięki finansowaniu z programu Canada Research Chairs (J.-P.J.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtr SteritopEMD MilliporeSCGPS02RE
10 dołków 4-15% gradient SDS-PAGE żelBio-Rad4561084
10x glikobufor 3New England BiolabsP0702SW zestawie odczynnik Endo H
10x Bufor kinetycznyPALL Forté Bio18-1092
10x Bufor Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
1 ml okrągłodenny blok 96-dołkowyThermoFisher260251
22 mm HamptonresearchHR3-231
4x Laemmli Bufor do próbekBio-Rad1610747
96-3 well INTELLIPLATE  rezerwator o małej objętościArt Robbins Instrumenty102-0001-03
AgeINew England BiolabsR0552S
Ä KTA PureGE Healthcare
Ä Początek KTA GE Healthcare
Mikroprobówka odśrodkowa Amicon Ultra 15 10KDa MWCOMilliporeUFC901008
Urządzenie do filtracji odśrodkowej Amicon Ultra 4 10KDa MWCOMilliporeUFC801008
Auto-iTC200Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1,5 mlFisher ScientificMCT150C
Szkiełka do komory liczenia komórek CountessThermo Fisher ScientificC10228
CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mmHampton researchHR4-945
CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mmHampton researchHR4-947
CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mmHampton researchHR4-970
Cyfrowa sucha kąpielBio-Rad1660562EDU
E. coli DH5αInvitrogen18258012
Endo HNew England BiolabsP0702S
Kolba Erlenmeyera (podstawa z przegrodą), poliwęglan, sterylna, 500 mL, DuoCAPTriForest LabwareFBC05000S
Kolba Erlenmeyera 125 ml (podstawa z przegrodą), poliwęglanowa, sterylna, 125 ml z wentylowaną nakrętkąVWR89095-258
Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 10 mlGreiner Bio-One607180
Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 25 mlGreiner Bio-One760180
Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 5 mlGreiner Bio-One606180
Falcon Jednorazowa sterylna pipeta serologiczna, niepirogenna, 50 mlGreiner Bio-One768180
Odczynnik do transfekcji DNA FectoPRO, PolyplusVWR10118-842
Ogniwa Freestyle 293FThermo Fisher ScientificR79007
Freestyle Expression mediumThermo Fisher Scientific12338001
Heavy Atom Screens AuHampton researchHR2-444
Ekrany ciężkich atomów HgBadania HamptonHR2-446
Ekrany ciężkich atomów M1Hampton researchHR2-448
Ekrany ciężkich atomów M2Hampton researchHR2-450
Ekrany ciężkich atomów PtHampton researchHR2-442
HEK 293SATCCATCC CRL-3022
HisTrap Affinity ColumnGE Healthcare17525501
HiTrap KappaSelect Kolumny powinowactwaGE Healthcare17545811
HiTrap LambdaSelect Kolumny powinowactwaGE Healthcare17548211
KpnINew England BiolabsR0142S
MCSG-1 Kryształowy ekran 1,7 ml BlokAnatraceMCSG-1
MCSG-2 Blok 1,7 mlAnatraceMCSG-2 MCSG-3
Kryształowyekran 1,7 mlAnatraceMCSG-3
MCSG-4 Kryształowy ekran 1,7 ml blokAnatraceMCSG-4
Chlorek rtęciSigma1044170100
Microplate, 96 dołków, polipropylen, płaskie dno, Greiner Bio-One655209
Minstrel DT UVFormulatrix
Multitron Pro shakerInfors HTMP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c SpektrofotometrThermo Fisher ScientificND-2000
Nanosep 3K Omega urządzenie odśrodkowePALL Nauki przyrodniczeOD003C33
Biosensory Ni-NTAPALL Forté Bio18-5102
Octet RED96PALL ForteBio
Oryx 4 robot krystalizacyjnyDouglas InstrumentORY-4/1
Chlorek platynySigma520632-1g
Precision Plus Protein StandardBio-Rad161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep KitInvitrogenK210006
Quick Coomassie StainProtein ArkGEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterylny 50 ml jednorazowy system filtracji próżniowej 0,22 i mikro; m Millipore ExpressEMD MilliporeSCGP00525
Superdex 200 Wzrost 10/300 GLGE Healthcare28990944
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare17517201
Klaster bromku tantaluJena biosciencePK-103
Top96Odczynniki Rigaku1009846
Tryphan BlueThermo Fisher ScientificT10282
VDX 24-studzienkowy z uszczelniaczemHampton researchHR3-172
α 2-6 sjallaktozySigma AldrichA8556-1mg
Mikroprobówki

Bibliografia

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
  2. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. J Membr Biol. 248 (4), 611-640 (2015).
  3. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. J Clin Invest. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  4. Hyde, C. A. C., et al. Targeting extracellular domains D4 and D7 of vascular endothelial growth factor receptor 2 reveals allosteric receptor regulatory sites. Mol Cell Biol. 32 (19), 3802-3813 (2012).
  5. Tai, W., Mahato, R., Cheng, K. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery. J Control Release. 146 (3), 264-275 (2010).
  6. Zarei, O., Benvenuti, S., Ustun-Alkan, F., Hamzeh-Mivehroud, M., Dastmalchi, S. Strategies of targeting the extracellular domain of RON tyrosine kinase receptor for cancer therapy and drug delivery. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (12), 2429-2446 (2016).
  7. Rosman, Z., Shoenfeld, Y., Zandman-Goddard, G. Biologic therapy for autoimmune diseases: an update. BMC Med. 11 (1), 88(2013).
  8. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  9. Barclay, A. N. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - A master superfamily of interaction molecules. Semin Immunol. 15 (4), 215-223 (2003).
  10. Barclay, A. N. Ig-like domains: evolution from simple interaction molecules to sophisticated antigen recognition. Proc Natl Acad Sci. 96 (26), 14672-14674 (1999).
  11. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833 (11), 2430-2437 (2013).
  12. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  13. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S., Al, E. Glycosylation in the ER and Golgi complex. Mol Cell Biol. (4), Section 17.7 (2000).
  14. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  15. Lee, J. E., Fusco, M. L., Ollmann Saphire, E. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nat Protoc. 4 (4), 592-604 (2009).
  16. Betenbaugh, M. J., Tomiya, N., Narang, S., Hsu, J. T. A., Lee, Y. C. Biosynthesis of human-type N-glycans in heterologous systems. Curr Opin Struct Biol. 14 (5), 601-606 (2004).
  17. Yang, Z., et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nat Biotechnol. 33 (8), 842-844 (2015).
  18. Bláha, J., Kalousková, B., Skořepa, O., Pažický, S., Novák, P., Vaněk, O. High-level expression and purification of soluble form of human natural killer cell receptor NKR-P1 in HEK293S GnTI-cells. Protein Expr Purif. 140, 36-43 (2017).
  19. Bláha, J., Pachl, P., Novák, P., Vaněk, O. Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through high-density transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr Purif. 109, 7-13 (2015).
  20. Chaudhary, S., Pak, J. E., Gruswitz, F., Sharma, V., Stroud, R. M. Overexpressing human membrane proteins in stably transfected and clonal human embryonic kidney 293S cells. Nat Protoc. 7 (3), 453-466 (2012).
  21. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: Solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  22. Davis, S. J., Crispin, M. Solutions to the glycosylation problem for low- and high-throughput structural glycoproteomics. Funct Struct Proteomics Glycoproteins. , 127-158 (2011).
  23. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  24. Zheng, K., Bantog, C., Bayer, R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 3 (6), 568-576 (2011).
  25. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 62 (10), 1243-1250 (2006).
  26. Adams, P. D., et al. The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 55 (1), 94-106 (2011).
  27. May, A. P., Robinson, R. C., Vinson, M., Crocker, P. R., Jones, E. Y. Crystal structure of the N-terminal domain of sialoadhesin in complex with 3' sialyllactose at 1.85 Å resolution. Mol Cell. 1 (5), 719-728 (1998).
  28. Ereño-Orbea, J., et al. Molecular basis of human CD22 function and therapeutic targeting. Nat Commun. 8 (1), 764(2017).
  29. Yu, X. -L., et al. Crystal structure of HAb18G/CD147: implications for immunoglobulin superfamily homophilic adhesion. J Biol Chem. 283 (26), 18056-18065 (2008).
  30. Garman, E., Murray, J. W. Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr - Sect D Biol Crystallogr. 59 (11), 1903-1913 (2003).
  31. Agniswamy, J., Joyce, M. G., Hammer, C. H., Sun, P. D. Towards a rational approach for heavy-atom derivative screening in protein crystallography. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (4), 354-367 (2008).
  32. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (20), 431-440 (2015).
  33. Olieric, V., et al. Data-collection strategy for challenging native SAD phasing. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 421-429 (2016).
  34. Rillahan, C. D., et al. Disubstituted sialic acid ligands targeting Siglecs CD33 and CD22 associated with myeloid leukaemias and B cell lymphomas. Chem Sci. 5 (6), 2398-2406 (2014).
  35. Mesch, S., et al. From a library of MAG antagonists to nanomolar CD22 ligands. ChemMedChem. 7 (1), 134-143 (2012).
  36. Chiu, M. L., Gilliland, G. L. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 38, 163-173 (2016).
  37. Elgundi, Z., Reslan, M., Cruz, E., Sifniotis, V., Kayser, V. The state-of-play and future of antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 122 (2016), 2-19 (2017).
  38. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms. J Vis Exp. (122), e55659(2017).
  39. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  40. Brautigam, C. A., Zhao, H., Vargas, C., Keller, S., Schuck, P. Integration and global analysis of isothermal titration calorimetry data for studying macromolecular interactions. Nat Protoc. 11 (5), 882-894 (2016).
  41. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J Vis Exp. (55), e2796(2011).
  42. Livingstone, J. R. Antibody characterization by isothermal titration calorimetry. Nature. 384 (6608), 491-492 (1996).
  43. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  44. Macauley, M. S., Crocker, P. R., Paulson, J. C. Siglec-mediated regulation of immune cell function in disease. Nat Rev Immunol. 14 (10), 653-666 (2014).
  45. Zaccai, N. R., et al. Structure-guided design of sialic acid-based Siglec inhibitors and crystallographic analysis in complex with sialoadhesin. Structure. 11 (5), 557-567 (2003).
  46. Pantophlet, R., et al. Bacterially derived synthetic mimetics of mammalian oligomannose prime antibody responses that neutralize HIV infectivity. Nat Commun. 8 (1), 1601(2017).
  47. Leonard, J. P., et al. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 antibody, in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: phase I/II clinical trial results. Clin Cancer Res. 10 (16), 5327-5334 (2004).
  48. Finn, R. D., et al. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Res. 45, 190-199 (2017).
  49. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  50. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  51. Gupta, R., Jung, E., Brunak, S. NetNGlyc: Prediction of N-glycosylation sites in human proteins. , (2004).
  52. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91(2008).
  53. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  54. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  55. Akula, I., Julien, J. -P. Optimization of glycoprotein expression by transient transfection in HEK293 F/S suspension cells. , Available from: https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/FectoPRO-Technical-Note-031716.pdf (2015).
  56. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  57. Tan, H. Y., Ng, T. W. Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Opt Commun. 281 (10), 3013-3017 (2008).
  58. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  59. Jonnalgadda, K., Markley, L., Estes, S., Prajapati, S., Takkar, R., Kumaraswamy, S. Rapid, reliable quantitation of Fc-fusion protein in cell culture supernatants. , Available from: https://www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf (2018).
  60. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology: Separating protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2018).
  61. Wilkins, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 112, 531-552 (1999).
  62. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. J Vis Exp. (78), e50548(2013).
  63. Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R., Gilliland, G. L. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (8), 927-933 (2010).
  64. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallogr Sect F, Struct Biol Commun. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  65. Luft, J. R., et al. Efficient optimization of crystallization conditions by manipulation of drop volume ratio and temperature. Protein Sci. 16 (4), 715-722 (2007).
  66. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), e2285(2011).
  67. Sugahara, M., Asada, Y., Ayama, H., Ukawa, H., Taka, H., Kunishima, N. Heavy-atom Database System: A tool for the preparation of heavy-atom derivatives of protein crystals based on amino-acid sequence and crystallization conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (9), 1302-1305 (2005).
  68. Boggon, T. J., Shapiro, L. Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure. 8 (7), 143-149 (2000).
  69. Vera, L., Stura, E. A. Strategies for protein cryocrystallography. Cryst Growth Des. 14 (2), 427-435 (2014).
  70. Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, crystallization and structure determination of C. difficile PPEP-1 via microseeding and Zinc-SAD. J Vis Exp. (118), e55022(2016).
  71. Leslie, A. G. W., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  72. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 303-318 (2016).
  73. Cooper, D. R., Porebski, P. J., Chruszcz, M., Minor, W. X-ray crystallography: Assessment and validation of protein-small molecule complexes for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (8), 771-782 (2011).
  74. Hassell, A. M., et al. Crystallization of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 63 (1), 72-79 (2006).
  75. Muller, I., et al. Guidelines for the successful generation of protein-ligand complex crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 73 (2), 79-92 (2017).
  76. Zhao, Y., et al. Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells. Protein Expr Purif. 67 (2), 182-189 (2009).
  77. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383(2014).
  78. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (1), 61-69 (2008).
  79. Walker, J. A., Smith, K. G. C. CD22: An inhibitory enigma. Immunology. 123 (3), 314-325 (2008).
  80. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  81. Jain, N. K., et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr Purif. 134, 38-46 (2017).
  82. Fang, X. T., Sehlin, D., Lannfelt, L., Syvänen, S., Hultqvist, G. Efficient and inexpensive transient expression of multispecific multivalent antibodies in Expi293 cells. Biol Proced Online. 19 (1), 11(2017).
  83. Löw, C., et al. Nanobody mediated crystallization of an archeal mechanosensitive channel. PLoS One. 8 (10), 77984(2013).
  84. Hunte, C., Michel, H. Crystallization of membrane proteins mediated by antibody fragments. Curr Opin Struct Biol. 12 (4), 503-508 (2002).
  85. Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Carson, J., Hermans, P., Julien, J. -P. Structural basis of enhanced crystallizability induced by a molecular chaperone for antibody antigen-binding fragments. J Mol Biol. 430 (3), 322-336 (2018).
  86. Spooner, J., et al. Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1472-1477 (2015).
  87. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: The nuts and bolts. Curr Opin Struct Biol. 46, 1-6 (2017).
  88. Merk, A., et al. Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  89. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  90. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  91. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  92. Hendrickson, W. a, Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  93. Walden, H. Selenium incorporation using recombinant techniques. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (4), 352-357 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Charakterystyka glikoproteinlinie kom rkowe HEK293chromatografia powinowactwachromatografia wykluczania cz steczekinterferometria warstwy biologicznejprzesiewanie krystalizacjianaliza wi zania ligand whomogeniczno glikan w

Powiązane artykuły