Opisujemy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej dla enzymów, które generują fosforan dinukleotydu nikotynoatmidadeninowego (NAD(P)H) + H+ bezpośrednio w próbkach tkanek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mapowanie aktywności enzymatycznej w czasie i przestrzeni jest kluczowe dla zrozumienia molekularnych podstaw zachowania komórek w normalnych tkankach i chorobach. Testy aktywności metabolicznej in situ mogą dostarczyć informacji na temat przestrzennego rozkładu aktywności metabolicznej w tkance. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół monitorowania aktywności enzymu dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w próbkach tkanek. Dehydrogenaza mleczanowa jest ważnym wyznacznikiem tego, czy spożyta glukoza zostanie przekształcona w energię w procesie glikolizy tlenowej czy beztlenowej. Roztwór zawierający mleczan i NAD dostarcza się do zamrożonego wycinka tkanki. Komórki o wysokiej aktywności dehydrogenazy mleczanowej przekształcają dostarczony mleczan w pirogronian, jednocześnie przekształcając dostarczony dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) w NADH i proton, który można wykryć na podstawie redukcji błękitu nitrotetrazolowego do formazanu, który jest wizualizowany jako niebieski osad. Opisujemy szczegółowy protokół monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w skórze myszy. Stosując ten protokół, odkryliśmy, że aktywność dehydrogenazy mleczanowej jest wysoka w spoczynkowych komórkach macierzystych mieszków włosowych w skórze. Zastosowanie protokołu do hodowanych embrionalnych komórek macierzystych myszy wykazało wyższe barwienie w hodowanych embrionalnych komórkach macierzystych niż w mysich fibroblastach embrionalnych. Analiza świeżo wyizolowanej aorty myszy ujawniła barwienie w komórkach mięśni gładkich prostopadłych do aorty. Przedstawiona metodologia może być wykorzystana do przestrzennego mapowania aktywności enzymów, które generują proton w zamrożonej lub świeżej tkance.
Wprowadzenie
Zrozumienie miejsc w tkankach, w których enzymy mają wysoką lub niską aktywność, jest niezbędne do zrozumienia rozwoju i fizjologii. Poziomy transkryptu lub białka są często używane jako substytuty aktywności enzymatycznej. Chociaż takie badania mogą być pouczające, nie dostarczają informacji, które mogą być krytyczne dla określenia aktywności enzymu, takich jak modyfikacje potranslacyjne, obecność kompleksów białkowych lub subkomórkowa lokalizacja enzymu. Gdy aktywność enzymatyczna jest mierzona bezpośrednio, często jest monitorowana w homogenizowanych lizatach białkowych, które nie zawierają już informacji o poszczególnych komórkach w mieszaninie lub rozmieszczeniu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.
1. Generuj slajdy z zamrożoną skórką myszy
- Eutanazja myszy zgodnie z polityką instytucji.
Uwaga: Postępuj zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą odzieży ochronnej. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami. - Usuń sierść myszy za pomocą trymera do sierści zwierzęcej.
- Wykonaj nacięcia w skórze za pomocą nożyczek. Za pomocą kleszczy odsuń skórę od myszy. Za pomocą nożyczek odetnij czę....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniej przedstawiliśmy wyniki analiz aktywności in situ w skórze myszy20. Jak pokazano na Rysunku 3, przy zastosowaniu opisanych powyżej procedur zaobserwowaliśmy wysoki poziom aktywności dehydrogenazy mleczanowej w komórkach macierzystych mieszka włosowego u podstawy mieszka. Wyniki te zostały potwierdzone poprzez sortowanie komórek skóry metodą FACS w celu wyizolowania komórek macierzystych mieszka włosowego oraz potwierd.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda może być stosowana do monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej lub innych enzymów metabolicznych, które generują NADH lub NADPH, w różnych typach komórek w tkance lub w różnych częściach tkanki w czasie. Dehydrogenaza mleczanowa jest ważnym enzymem dla zrozumienia biologii komórek macierzystych i nowotworów, a możliwość monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w poszczególnych komórkach może dostarczyć ważnych informacji na temat funkcji tego enzymu.
Je.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
HAC był stypendystą Fundacji Rity Allen (http://www.ritaallenfoundation.org) Miltona E. Cassela. Praca ta została sfinansowana z grantów dla HAC z National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of General Medical Sciences R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine & Stem Cell Research (nagrody Rose Hills i Hal Gaba), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124. Towarzystwo Chłoniaka Białaczkowego, nagrody Impact od Jonsson Comprehensive Cancer Center dla WEL i HAC. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Hea....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Narzędzia | Do pobierania skóry od myszy poddanych eutanazji | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | Do zamrażania skóry myszy |
| Związek Tissue-Tek O.C.T. | Fisher Scientific | NC9638938 | Do montażu krioform |
| Wiadro na lód | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Suchy lód | |||
| Szkiełko adhezyjne polisynowe | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalina | Fisher Scientific | 23-245-684 | Rozcieńczony w wodzie |
| roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, pH 7,4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Metosiarczan fenazyny | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Niebieski chlorek nitrotetrazolu | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| L-mleczan litu | Sigma-Aldrich | L2250 | Podłoże |
| 37° Inkubator C (lub inkubator do hodowli tkankowych) | |||
| Brazylijczyk! Przeciwplama | Anatech | 861 | Przeciwplama |
| Medium montażowe | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Szkiełka nakrywkowe do szkiełek | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Mikroskop |
Bibliografia
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan syste....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
