Opisujemy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej dla enzymów, które generują fosforan dinukleotydu nikotynoatmidadeninowego (NAD(P)H) + H+ bezpośrednio w próbkach tkanek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mapowanie aktywności enzymatycznej w czasie i przestrzeni jest kluczowe dla zrozumienia molekularnych podstaw zachowania komórek w normalnych tkankach i chorobach. Testy aktywności metabolicznej in situ mogą dostarczyć informacji na temat przestrzennego rozkładu aktywności metabolicznej w tkance. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół monitorowania aktywności enzymu dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w próbkach tkanek. Dehydrogenaza mleczanowa jest ważnym wyznacznikiem tego, czy spożyta glukoza zostanie przekształcona w energię w procesie glikolizy tlenowej czy beztlenowej. Roztwór zawierający mleczan i NAD dostarcza się do zamrożonego wycinka tkanki. Komórki o wysokiej aktywności dehydrogenazy mleczanowej przekształcają dostarczony mleczan w pirogronian, jednocześnie przekształcając dostarczony dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) w NADH i proton, który można wykryć na podstawie redukcji błękitu nitrotetrazolowego do formazanu, który jest wizualizowany jako niebieski osad. Opisujemy szczegółowy protokół monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w skórze myszy. Stosując ten protokół, odkryliśmy, że aktywność dehydrogenazy mleczanowej jest wysoka w spoczynkowych komórkach macierzystych mieszków włosowych w skórze. Zastosowanie protokołu do hodowanych embrionalnych komórek macierzystych myszy wykazało wyższe barwienie w hodowanych embrionalnych komórkach macierzystych niż w mysich fibroblastach embrionalnych. Analiza świeżo wyizolowanej aorty myszy ujawniła barwienie w komórkach mięśni gładkich prostopadłych do aorty. Przedstawiona metodologia może być wykorzystana do przestrzennego mapowania aktywności enzymów, które generują proton w zamrożonej lub świeżej tkance.
Wprowadzenie
Zrozumienie miejsc w tkankach, w których enzymy mają wysoką lub niską aktywność, jest niezbędne do zrozumienia rozwoju i fizjologii. Poziomy transkryptu lub białka są często używane jako substytuty aktywności enzymatycznej. Chociaż takie badania mogą być pouczające, nie dostarczają informacji, które mogą być krytyczne dla określenia aktywności enzymu, takich jak modyfikacje potranslacyjne, obecność kompleksów białkowych lub subkomórkowa lokalizacja enzymu. Gdy aktywność enzymatyczna jest mierzona bezpośrednio, często jest monitorowana w homogenizowanych lizatach białkowych, które nie zawierają już informacji o poszczególnych komórkach w mieszaninie lub rozmieszczeniu przestrzennym komórek o wysokiej lub niskiej aktywności w tkance.
Udostępniamy tutaj szczegółowy protokół mapowania przestrzennego rozkładu aktywności enzymatycznej w próbce tkanki. Metodologia opiera się na wcześniejszych badaniach wykazujących, że sole tetrazolium mogą być stosowane do lokalizacji aktywności dehydrogenaz, reduktaz i oksydaz w zamrożonych tkankach1. Dzięki tym metodom nierozpuszczalny w wodzie formazan powstaje, gdy protony są przenoszone do soli tetrazolowej2,3. Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa generuje NADPH i proton i została wykryta z aktywnością tetrazolową. Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa była monitorowana w europejskich hepatocytach flądry4, w komórkach pęcherzyków płucnych typu 2 płuc5 i nefronach klasy nerki5. Sole tetrazolium były również używane do monitorowania aktywności transketolazy w zamrożonych tkankach6. Podobne podejście zastosowano ostatnio do monitorowania aktywności wielu dehydrogenaz w tej samej tkance na sąsiednich szkiełkach7.
Opisujemy tutaj metodę wykorzystania soli tetrazolium do monitorowania przestrzennego rozkładu aktywności dehydrogenazy mleczanowej (Rysunek 1). Dehydrogenaza mleczanowa może przekształcać pirogronian generowany przez glikolizę w mleczan i reakcję odwrotną. Aktywność dehydrogenazy mleczanowej jest zatem ważnym czynnikiem determinującym wejście pirogronianu do cyklu kwasu trikarboksylowego w porównaniu z jego wydzielaniem w postaci mleczanu. Poziom mleczanu we krwi jest często używany do diagnozowania wielu chorób, w tym raka8,9,10, ponieważ może sygnalizować, że choroba lub uraz uszkodziły komórki i enzym został uwolniony.
Istnieją cztery geny dehydrogenazy mleczanowej: LDHA, LDHB, LDHC i LDHD11. Uważa się, że LDHA i LDHB powstały w wyniku duplikacji wczesnego genu LDHA 12. LDH jest aktywny jako tetramer, a LDHA i LDHB mogą tworzyć ze sobą homotetramery i heterotetramery. Stwierdzono, że LDHA ma wyższe powinowactwo do pirogronianu, podczas gdy LDHB ma wyższe powinowactwo do mleczanu i preferencyjnie przekształca mleczan w pirogronian13. Promotor LDHA zawiera miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych HIF1α, cMYC i FOXM111. Ponadto, podobnie jak wiele innych enzymów glikolitycznych 14,15, LDH może być modyfikowany przez modyfikacje potranslacyjne. Receptor czynnika wzrostu fibroblastów 1 może fosforylować LDHA w Y10, co sprzyja tworzeniu tetrameru, lub Y83, co sprzyja wiązaniu substratu NADH16. LDHA może być również acetylowany17. Z tych powodów pełne zrozumienie aktywności LDH wymaga monitorowania nie tylko poziomu białka LDH, ale także aktywności enzymu.
Oprócz metody, którą tutaj prezentujemy, do monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej zastosowano inne podejścia. Aktywność dehydrogenazy mleczanowej można monitorować spektrofotometrycznie w homogenizowanym lizacie białkowym. Wytwarzanie NADH, gdy mleczan jest przekształcany w pirogronian, można mierzyć na podstawie absorbancji przy 340 nm, podczas gdy zanik NADH można monitorować, gdy pirogronian jest przekształcany w mleczan18. Aktywność dehydrogenazy mleczanowej monitorowano również za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). 13Można podawać C-pirogronian i monitorować konwersję pirogronianu do mleczanu jako stosunek [1-13C]mleczanu / [1-13C]pirogronianu. Podwyższone proporcje [1-13C]mleczanu/[1-13C]pirogronianu zaobserwowano w tkance nowotworowej19. Podczas gdy podejścia oparte na MRI mogą dostarczyć informacji na temat aktywności dehydrogenazy mleczanowej w tkankach prawidłowych i chorobowych, metodologie nie mają rozdzielczości potrzebnej do określenia poziomu aktywności w określonych komórkach. Przedstawiona tutaj metodologia może dostarczyć informacji na temat aktywności dehydrogenazy mleczanowej w obszarach tkanek, a nawet w pojedynczych komórkach.
Korzystając z testów aktywności in situ, stwierdziliśmy, że aktywność dehydrogenazy mleczanowej jest wysoka w komórkach macierzystych mieszków włosowych skóry myszy20. Zastosowaliśmy również tę metodę do monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w hodowanych embrionalnych komórkach macierzystych i stwierdziliśmy, że aktywność jest wyższa w komórkach macierzystych niż w warstwie zasilającej. Na koniec monitorowaliśmy aktywność dehydrogenazy mleczanowej w świeżej aorcie myszy i zaobserwowaliśmy barwienie w komórkach mięśni gładkich. Opisujemy tutaj szczegółowy protokół monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w zamrożonej skórze myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.
1. Generuj slajdy z zamrożoną skórką myszy
- Eutanazja myszy zgodnie z polityką instytucji.
Uwaga: Postępuj zgodnie z polityką instytucjonalną dotyczącą odzieży ochronnej. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami. - Usuń sierść myszy za pomocą trymera do sierści zwierzęcej.
- Wykonaj nacięcia w skórze za pomocą nożyczek. Za pomocą kleszczy odsuń skórę od myszy. Za pomocą nożyczek odetnij część skóry.
- Napełnij kriomold odczynnikiem do zamrażania (patrz Tabela materiałów).
- Umieść skrawki skóry w wypełnionych krioformach za pomocą kleszczy z igłami. Ustaw skórę tak, aby plastry tkanki generowały przekrój skóry od naskórka do skóry właściwej, tkanki podskórnej i mięśni (Rysunek 2).
Uwaga: Jeśli to możliwe, zamontuj myszy eksperymentalne i kontrolne razem w tym samym kriomoldie, aby można je było podzielić na to samo szkiełko i przetwarzać razem. Uważaj, aby nie tworzyć bąbelków. - Umieść kriomald na płaskiej powierzchni bloku suchego lodu w wiaderku na lód i pozostaw do zamrożenia. Kontynuuj obserwację orientacji skóry. W razie potrzeby wyreguluj.
Uwaga: Podczas pracy z suchym lodem należy nosić rękawice kriogeniczne. - Przenieś krioformy do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Próbki można przechowywać w zamrażarce przez około 3 miesiące bez znaczącej utraty aktywności enzymatycznej. Nie pozwól, aby zamrożone sekcje wyschły.
- Używając kriostatu w temperaturze -20 °C, pokrój tkankę, aby utworzyć skrawki o grubości 7 - 10 μm, aby uzyskać najlepszą morfologię skóry21.
2. Przygotowanie preparatów do barwienia
- Ustal zestaw preparatów do przetestowania. Dołącz szkiełko kontrolne, na którym NAD zostanie wstrzymane, i drugie szkiełko kontrolne, na którym zostanie wstrzymany substrat, mleczan. Dołączyć szkiełko kontroli pozytywnej z wcześniej badanego zamrożonego bloku tkanki.
- Krótko utrwalić szkiełka zawierające skrawki skóry 4% formaliną przez 5 minut, pipetując 1 ml 4% formaliny na szkiełko lub, podczas przetwarzania wielu szkiełek, zanurzając szkiełka w pojemniku zawierającym 4% formaliny.
Uwaga: Utrwalenie zapewni, że skóra nie odklei się od szkiełek podczas poniższych procedur i zachowa morfologię skóry.
Uwaga: Formalina jest rakotwórcza i niebezpieczna; Załóż rękawice, nie pozwól, aby dotykał skóry i wykonaj tę czynność w okapie chemicznym. - Przemyć szkiełka solą fizjologiczną o pH 7,4 i co najmniej 1 ml roztworu soli fizjologicznej o pH 7,4 na szkiełko, pipetując lub zanurzając.
3. Przygotowanie roztworu do barwienia
- Odczynniki do barwienia aktywności dehydrogenazy mleczanowej należy mieszać (50 mM Tris pH 7,4, 750 μM NADP, 80 μM metosiarczanu fenazyny (PMS), 600 μM błękitnego chlorku nitrotetrazolu i 30 mM mleczanu) w probówce o odpowiedniej wielkości, w zależności od wymaganej ilości roztworu barwiącego.
Uwaga: 1 ml wystarcza do całkowitego pokrycia jednego szkiełka. - Przygotuj drugi roztwór, w którym obecne są wszystkie odczynniki z wyjątkiem NAD. Przygotować trzeci roztwór, w którym obecne są wszystkie odczynniki z wyjątkiem mleczanu.
4. Inkubuj szkiełka w roztworze barwiącym
- Delikatnie odpipetować roztwór barwiący lub roztwory kontrolne na przygotowane szkiełka podstawowe pokrywające cały skrawek (1 ml wystarcza na jedno szkiełko). Jeśli wiele szkiełek jest przetwarzanych razem, zanurz wszystkie szkiełka w roztworze barwiącym w tym samym czasie (upewnij się, że pojemnik ma wystarczającą ilość roztworu, aby całkowicie pokryć część tkanki).
- Szkiełka należy inkubować w wilgotnym środowisku w temperaturze 37 °C w ciemności. Jeśli roztwór barwiący znajduje się na szkiełku, umieść szkiełko w wilgotnym miejscu, aby zapobiec parowaniu.
5. Monitoruj slajdy
- Monitoruj przemianę roztworu barwiącego z przezroczystego na niebieski za pomocą oględzin. Gdy próbki osiągną pożądany poziom zabarwienia, zatrzymaj reakcję, usuwając roztwór barwiący.
Uwaga: W przypadku skóry wystarczy 10 minut. Czas będzie zależał od narządu i aktywności enzymatycznej. - Przepłukać szkiełka solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, pipetując (1 ml wystarcza na każde szkiełko) lub zanurzając.
Uwaga: Wszystkie próbki, które będą ze sobą porównywane, muszą być przechowywane w roztworze barwiącym przez ten sam okres czasu.
6. Przeciwbejc i montaż
- Nanieś na szkiełka bejcę, gdy szkiełka osiągną odpowiedni poziom zabarwienia.
Uwaga: Barwienie przeciwstawne, które zmieniają jądra na czerwone lub zielone, zapewni dobry kontrast z niebieskim kolorem utworzonym przez środek strącający formazan. - Zamontuj za pomocą wodnego lub niewodnego medium montażowego22. Wystarczy jedna do trzech kropli (40 - 50 μl) podłoża montażowego, w zależności od rozmiaru szkiełka nakrywkowego.
7. Slajdy graficzne i kwantyfikacja
- Obraz przesuwa się pod mikroskopem świetlnym. Zrób zdjęcia próbek eksperymentalnych i kontrolnych oraz wszystkich kontroli ujemnych w powiększeniu 10x, 20x i 40x.
- Określ intensywność niebieskiego zabarwienia w różnych obszarach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniej przedstawiliśmy wyniki analiz aktywności in situ w skórze myszy20. Jak pokazano na Rysunku 3, przy zastosowaniu opisanych powyżej procedur zaobserwowaliśmy wysoki poziom aktywności dehydrogenazy mleczanowej w komórkach macierzystych mieszka włosowego u podstawy mieszka. Wyniki te zostały potwierdzone poprzez sortowanie komórek skóry metodą FACS w celu wyizolowania komórek macierzystych mieszka włosowego oraz potwierd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda może być stosowana do monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej lub innych enzymów metabolicznych, które generują NADH lub NADPH, w różnych typach komórek w tkance lub w różnych częściach tkanki w czasie. Dehydrogenaza mleczanowa jest ważnym enzymem dla zrozumienia biologii komórek macierzystych i nowotworów, a możliwość monitorowania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w poszczególnych komórkach może dostarczyć ważnych informacji na temat funkcji tego enzymu.
Je...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
HAC był stypendystą Fundacji Rity Allen (http://www.ritaallenfoundation.org) Miltona E. Cassela. Praca ta została sfinansowana z grantów dla HAC z National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute of General Medical Sciences R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine & Stem Cell Research (nagrody Rose Hills i Hal Gaba), Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124. Towarzystwo Chłoniaka Białaczkowego, nagrody Impact od Jonsson Comprehensive Cancer Center dla WEL i HAC. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P50CA092131. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. HAC jest członkiem Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine & Stem Cell Research, Instytutu Biologii Molekularnej UCLA oraz UCLA Bioinformatics Interdepartmental Program.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Narzędzia | Do pobierania skóry od myszy poddanych eutanazji | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | Do zamrażania skóry myszy |
| Związek Tissue-Tek O.C.T. | Fisher Scientific | NC9638938 | Do montażu krioform |
| Wiadro na lód | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Suchy lód | |||
| Szkiełko adhezyjne polisynowe | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalina | Fisher Scientific | 23-245-684 | Rozcieńczony w wodzie |
| roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, pH 7,4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Metosiarczan fenazyny | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Niebieski chlorek nitrotetrazolu | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| L-mleczan litu | Sigma-Aldrich | L2250 | Podłoże |
| 37° Inkubator C (lub inkubator do hodowli tkankowych) | |||
| Brazylijczyk! Przeciwplama | Anatech | 861 | Przeciwplama |
| Medium montażowe | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Szkiełka nakrywkowe do szkiełek | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Mikroskop |
Bibliografia
- Boonacker, E., Van Noorden, C. J. Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis. J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).
- Seidler, E. The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).
- Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods. , Bios. (1992).
- Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects. J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).
- Negi, D. S., Stephens, R. J. An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues. J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).
- Boren, J., et al. In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells. J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).
- Miller, A., et al. Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments. Cell Metab. , (2017).
- Shen, J., et al. Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. PLoS One. 11, e0166482(2016).
- Zhang, X., et al. Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis. Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).
- Petrelli, F., et al. Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies. Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).
- Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor. Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).
- Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation. Science. 189, 102-114 (1975).
- Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase. Proteins. 43, 175-185 (2001).
- Holness, M. J., Sugden, M. C. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation. Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).
- Yi, W., et al. Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism. Science. 337, 975-980 (2012).
- Fan, J., et al. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).
- Zhao, D., et al. Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer. Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).
- Vanderlinde, R. E. Measurement of total lactate dehydrogenase activity. Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate. Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).
- Flores, A., et al. Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation. Nat Cell Biol. , (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).
- Espada, J., et al. Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors. J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
